Espectroscopa Luminiscente:

ESPECTROSCOPA LUMINISCENTE:Existen tres tipos de mtodos pticos relacionados entre s llamados: fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las molculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisin suministra informacin para el anlisis cualitativo y cuantitativo.

Los mtodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacin se consigue mediante la absorcin de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenmenos con el trmino ms general de fotoluminiscencia.

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrnicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espn del electrn. Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estn acompaadas por un cambio en el espn del electrn, que hace que la radiacin se mantenga durante un tiempo fcilmente detectable, despus de haber acabado la irradiacin a menudo varios segundos despus o ms. En la mayora de los casos, la emisin fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la radiacin utilizada para su excitacin.Uno de los aspectos ms atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad, con lmites de deteccin que suelen ser de uno a tres rdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorcin. Los lmites de deteccin caractersticas son del orden de partes por billn. Debido a su alta sensibilidad, los mtodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.Por esta razn las medidas luminiscentes se suelen combinar con las extraordinarias tcnicas de cromatografa y electroforesis.

En general los mtodos luminiscentes se aplican menos que los mtodos de absorcin en los analitos cuantitativos debido a que el nmero de especies que absorben radiacin ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan fotoluminiscencia tras la absorcin de radiacin en esta regin del espectro.

Teora de la Fluorescencia y de la Fosforescencia

La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, lquidos y slidos, tanto sencillos como complejos.

El tipo ms sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atmicos diluidos. Por ejemplo:

Los electrones 3s de los tomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la absorcin de radiacin de longitudes de onda de 5 896 a 5 890 . Despus de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiacin de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiacin absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se conoce como radiacin de resonancia o fluorescencia de resonancia.Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenmenos de fotoluminiscencia se requiere una revisin del spn del electrn y de los estados excitados singulete / triplete. Espn del electrn

El principio de exclusin de Pauli establece que en un tomo no puede haber dos electrones con los cuatro nmeros cunticos iguales. Esta restriccin requiere que no haya ms de dos electrones en un orbital, y adems, los dos deben tener los estados de espn opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines estn apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayora de las molculas no presentan un campo magntico neto y se dice, por tanto, que son diamagnticas, es decir, no son atradas ni repelidas por campos magnticos permanentes.

Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un momento magntico y, consecuentemente, son atrados cuando se encuentran en un campo magntico; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnticosEstados excitados singulete/triplete

Un estado electrnico molecular en el cual todos los espines de los electrones estn apareados se llama singulete y cuando la molcula se expone a un campo magntico no se produce un desdoblamiento de niveles de energa. Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre, es un estado doblete, porque el electrn impar puede tomar dos orientaciones en un campo magntico, lo que comunica ligeras diferencias de energa al sistema.

Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado a un nivel de energa superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el espn del electrn promocionado continua apareado con el electrn del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete los espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto, estn paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas representan la direccin del espn.

Velocidades de absorcin y de emisinLa velocidad a la cual se absorbe un fotn de radiacin es enorme, el proceso requiere del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisin fluorescente, tiene lugar a una velocidad significativamente ms lenta. El tiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente con la absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso de excitacin. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 103 y 105, los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7 s. Para sistemas dbilmente absorbentes, donde la probabilidad del proceso de transicin es ms pequea, los tiempos de vida pueden ser tan largos como de 10-6 a 10-5 s. Como se ha sealado, la velocidad promedio de una transicin triplete a singulete es menor que la correspondiente transicin singulete a singulete. Por ello, la emisin fosforescente requiere tiempos comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores.Procesos de desactivacin

Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinacin de varias etapas mecansticas. Como muestran las flechas verticales rectas de la Figura, dos de estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, conllevan la emisin de un fotn de radiacin. Las otras etapas de desactivacin, indicadas por flechas onduladas, son procesos no radiantes. El camino ms propicio hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si la desactivacin por fluorescencia es ms rpida que los procesos no radiantes, se observa tal emisin.

Por otro lado, si la desactivacin no radiante tiene una constante de velocidad ms favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensaLa fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajacin desactivacin no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la reaccin de emisin puede competir cinticamente con ellos. La informacin referente a los procesos de emisin es suficientemente completa para permitir un clculo cuantitativo de estas velocidades. Sin embargo, la comprensin de los otros caminos de desactivacin es, en el mejor de los casos, rudimentaria; para estos procesos, slo se pueden realizar afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los mecanismos.

Fosforescencia

La desactivacin del estado electrnico excitado tambin puede incluir la fosforescencia. Despus del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la desactivacin posterior puede tener lugar por conversin interna o externa o por fosforescencia.

Una transicin triplete ( singulete es mucho menos probable que una conversin singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio de un estado triplete excitado respecto a la emisin oscila entre 10-4 y 10 s o ms. Por tanto, la emisin causada por una transicin de este tipo puede persistir durante algn tiempo despus que la irradiacin se haya interrumpido.

Las conversiones externas e internas compiten con tanto xito con la fosforescencia que este tipo de emisin se observa normalmente slo a bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por molculas que estn adsorbidas sobre superficies slidas.Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia

Tanto la estructura molecular como el entorno qumico van a influir en que una sustancia sea o no luminiscente; estos factores tambin determinan la intensidad de emisin cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.

En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.

Rendimiento cuntico

El rendimiento cuntico, o la eficacia cuntica, de fluorescencia de fosforescencia es simplemente la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto al nmero total de molculas excitadas. Para molculas altamente fluorescentes como la fluorescena, la eficacia cuntica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies qumicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.

Tipos de transiciones en fluorescencia

Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorcin de radiacin ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que tal radiacin es suficientemente energtica como para producir la desactivacin de los estados excitados por predisociacin o disociacin. Por ejemplo, una radiacin de 200 nm corresponde a aproximadamente 140 kcal/mol; la mayora de las molculas tienen al menos algn enlace que se puede romper con energas de esta magnitud.

Como consecuencia, rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones (*( (, en cambio, este tipo de emisin est asociada a los procesos menos energticos (*( ( y (*( n.

Fluorescencia y estructura

La fluorescencia ms intensa y la ms tiles la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromticos con transiciones (( (* de baja energa. Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas y alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados tambin pueden presentar fluorescencia, pero el nmero de estos compuestos es pequeo comparado con el nmero de sistemas aromticos.

La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin, la eficacia cuntica normalmente aumenta con el nmero de anillos y con su grado de condensacin. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol,

no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con stas normalmente s la presentan. En los heterociclos con nitrgeno, se cree que la transicin electrnica de ms baja energa implica a un sistema n( (* que rpidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.

Sin embargo, la condensacin de anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos, da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorcin. En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as, se observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.

Efectos de la temperatura y del disolvente

La eficacia cuntica de fluorescencia disminuye en la mayora de las molculas al aumentar la temperatura, ya que al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin externa. Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la probabilidad de la conversin externa y conduce al mismo resultado.

La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de disolventes que contienen tomos pesados o de solutos con dichos tomos en su estructura; como por ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo. El efecto es similar al observado cuando se introducen, por sustitucin, tomos pesados en compuestos fluorescentes; las interacciones espn-orbital desembocan en un aumento en la velocidad de formacin del triplete y en la correspondiente disminucin de la fluorescencia.

Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a los disolventes compuestos que contienen tomos pesados

Efecto del oxgeno disuelto

La presencia de oxgeno disuelto suele reducirla intensidad de fluorescencia de una disolucin. Este efecto puede ser el resultado de una oxidacin de las especies fluorescentes inducida fotoqumicamente.

Sin embargo, con ms frecuencia la amortiguacin (quenehing) tiene lugar como consecuencia de las propiedades paramagnticas del oxgeno molecular, que favorecen el cruce entre sistemas y la conversin de las molculas excitadas al estado triplete. Otras especies paramagnticas tambin tienden a amortiguar la fluorescencia.

Efecto de la concentracin en la intensidad de fluorescencia

La potencia de la emisin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitacin absorbido por el sistema. Esto es,F = K'(Po- P)Donde Po es la potencia del haz que incide sobre la disolucin y P es su potencia despus de atravesar una longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuntica del proceso de fluorescencia.

Con el objeto de relacionar F con la concentracin de la especie fluorescente, se escribe la ley de Beer de la forma INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotmetros o espectrofotmetros ultravioleta/visible. La siguiente grfica muestra una configuracin caracterstica de estos componentes en los fluormetros y los espectrofluormetros. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan pticas de doble haz tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.

El haz de la muestra pasa primero a travs de un filtro o un monocromador de excitacin, que transmite la radiacin que provocar la fluorescencia pero excluye o limita la radiacin de la longitud de onda de la emisin fluorescente.La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo ms conveniente es observar la que forma un ngulo recto con el haz de excitacin; a otros ngulos, la dispersin producida en la disolucin y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiacin emitida llega a un fotodetector despus de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que asla la fluorescencia para su medida.

El haz de referencia pasa a travs de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiacin fluorescente (normalmente la potencia se reduce en un factor de 100 o ms. Las seales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condicin se consigue con atenuadores pticos o elctricos. Los instrumentos ms modernos utilizan un circuito divisor analgico o un sistema de adquisicin de datos digital seguido de tratamiento de los datos para obtener la relacin entre la intensidad de la emisin fluorescente y la intensidad de la fuente de radiacin.

Componentes de los fluormetros y de los espectrofluormetros

Los componentes de los fluormetros y de los espectrofluormetros difieren slo en detalles de los que componen los fotmetros y los espectrofotmetros; slo es necesario considerar estas diferencias.

Fuentes

En la mayora de las aplicaciones se necesitan fuentes ms intensa que las lmparas de wolframio o hidrgeno utilizadas en las medidas de absorcin.

De hecho, la magnitud de la seal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente PoLmparas.La lmpara ms comn para los fluormetros de filtro es la lmpara de arco de mercurio a baja presin equipada con una ventana de slice fundida. Esta fuente emite lneas tiles para producir la excitacin previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las lneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia o absorcin adecuados. Ya que, en la mayora de los compuestos fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes de onda, al menos una de las lneas del mercurio suele resultar adecuada.

Lseres. Desde los comienzos de los aos setenta, se utilizan tambin diversos tipos de lseres como fuentes de excitacin para medidas de fotoluminiscencia.

Un particular inters tienen los lseres sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un lser de nitrgeno pulsante o un lser de Nd:YAG.

La mayora de los espectrofluormetros comerciales utilizan lmparas (ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de lser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2) en los sensores de control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de radicales hidroxilo en la atmsfera de clorofila en seres vivos acuticos, donde la naturaleza colimada de los haces de lseres vital: o (3) cuando se requiere una radiacin de excitacin altamente monocromtica para minimizar los efecto de las interferencias fluorescentes.Filtros y monocromadores

Tanto los filtros de interferencia como los de absorcin se han utilizado en los fluormetros para la seleccin de la longitud de onda del haz de excitacin y de la radiacin fluorescente resultante, mayora de los espectrofluormetros estn equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.Detectores

La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores ms utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relacin seal/ruido. Tambin se utiliza, a veces, la refrigeracin de los detectores para mejorar la relacin seal/ruido. Tambin se han propuesto, para los espectrofluormetros, los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el registro rpido de los espectros de excitacin y de emisin y particularmente son tiles en cromatografa y en electroforesis Cubetas y compartimentos para las cubetas

Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con slice. Se debe tener cuidado en el diseo del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiacin dispersada que llega hasta el detector. Con este propsito, a menudo se introducen deflectores en el compartimento incluso ms importante que en las medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas y, a que la grasa de la piel con frecuencia flurese.Diseos de instrumentosFluormetrosLos fluormetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a cabo anlisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha sealado para seleccionar las longitudes de onda de la radiacin de excitacin y de emisin se utilizan filtros de interferencia y de absorcin. Generalmente, los fluormetros son compactos, robustos y fciles de usar.La Figura muestra un esquema de un fluormetro de filtros caracterstico que consta de una lmpara de mercurio para la excitacin de la fluorescencia y un par de tubos fotomultiplicadores como detectores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de ella en un haz de referencia y en un haz de muestra. El haz de referencia se atena mediante el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma que la intensidad de fluorescencia. Ambos haces pasan a travs del filtro primario y a continuacin el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de referencia.

El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la emisin de fluorescencia. La radiacin emitida pasa a travs de un segundo filtro que posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Las seales de salidas elctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analgico, para obtener la relacin entre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve como parmetro analtico.

Espectrofluormetros

Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluormetros capaces de obtener los espectros de excitacin y los de emisin. En la Figura se muestra el diseo ptico de uno de ellos, que utiliza dos monocromadores de red. La radiacin que procede del primer monocromador se divide en dos, una parte se dirige hacia el fotomultiplicador de referencia y la otra hacia la muestra. La radiacin fluorescente resultante, despus de ser dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo fotomultiplicador.

Un instrumento como el que se muestra en la Figura suministra perfectamente espectros satisfactorios para el anlisis cuantitativo. Sin embargo, los espectros de emisin obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos, ya que la seal de salida depende no slo de la intensidad de fluorescencia sino tambin de las caractersticas de la lmpara, del detector y de los monocromadores. Todas estas caractersticas instrumentales varan con la longitud de onda y difieren de un instrumento a otro. Se han desarrollado varios mtodos para obtener el espectro corregido, que es el verdadero espectro de fluorescencia, libre de efectos instrumentales; muchos de los instrumentos comerciales modernos y ms sofisticados estn preparados para obtener directamente los espectros corregidos.Fosformetros

Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseos similares a los fluormetros y a los espectrofluormetros antes considerados, slo difieren en que requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo que irradia alternativamente la muestra y, despus de un retraso en el tiempo adecuado, mide la intensidad de fosforescencia. El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la emisin fosforescente de larga vida de la emisin fluorescente de corta vida que podran originarse en la misma muestra. Se utilizan dispositivos mecnicos y electrnicos y muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen accesorios para medidas de fosforescencia. Un ejemplo de un tipo de dispositivo mecnico se muestra en la Figura.APLICACIONES Y MTODOS FOTOLUMINISCENTESEs inherente a los mtodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a intervalos de concentracin ms bajos que las medidas espectrofotomtricas de absorcin y se encuentran entre las tcnicas analticas ms sensibles de las que puedan disponer los cientficos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el parmetro relacionado con la concentracin en fluorimetra y en fosforimetra F se puede medir independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluacin de Po y de P, ya que la absorbancia, que es proporcional a la concentracin, depende de la relacin entre estas dos cantidades. La sensibilidad de un mtodo fluorimtrico puede mejorarse aumentando Po o mediante la amplificacin adicional de la seal de fluorescencia. Por el contrario, en espectrofotometra, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P y, por ello, no afecta a la A. Por tanto, los mtodos fluorimtricos tienen, generalmente, sensibilidades que son de uno a tres rdenes de magnitud superiores a los correspondientes de absorcin. Por otro lado, la precisin y la exactitud de los mtodos fotoluminiscentes son habitualmente ms pobres que las de los procedimientos espectrofotomtricos en un factor entre, quizs, dos y cinco. Generalmente, los mtodos fosforescentes son menos precisos que sus correspondientes mtodos fluorescentes.Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicasLos mtodos inorgnicos fluorimtricos son de dos tipos. Los mtodos directos que conllevan la formacin de un quelato fluorescente y la medida de su emisin. Un segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la accin amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.

La ltima tcnica se ha utilizado ms en la determinacin de aniones.Reactivos fluorimtricos

Los reactivos fluorimtricos de ms xito en el anlisis de cationes son los que presentan estructuras aromticas con dos o ms grupos funcionales dadores que permitan la formacin de quelatos con el ion metlico. A continuacin se muestranDeterminacin fluorimtrica de especies orgnicas

El nmero de aplicaciones del anlisis fluorimtrico a especies orgnicas y bioqumicas es impresionante.

Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los mtodos para la determinacin de ms de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de compuestos orgnicos, enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones ms importantes de la fluorimetra se encuentran en el campo del anlisis de productos alimentarios, farmacuticos, muestras clnicas y productos naturales. La sensibilidad y la selectividad del mtodo hacen que sea una herramienta particularmente valiosa en estos campos.Mtodos fosforimtricos

Los mtodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser complementarios, ya que los compuestos fuertemente fluorescentes presentan una dbil fosforescencia y viceversa. Por ejemplo, entre los hidrocarburos aromticos con anillos condensados, aquellos que contienen tomos pesados como halgeno s o azufre, con frecuencia presentan una fuerte fosforescencia; por otro lado, los mismos compuestos sin la presencia del tomo pesado tienden a presentar fluorescencia en lugar de fosforescencia.

La fosforimetra se ha utilizado para determinar una gran variedad de especies orgnicas y bioqumicas que incluyen sustancias como cidos nucleicos, aminocidos, pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petrleo y pesticidas. Sin embargo, el mtodo no ha alcanzado el uso tan difundido de la fluorimetra, quizs debido a la necesidad de bajas temperaturas y a la, generalmente, peor precisin de las medidas fosforescentes. Por otro lado, es atractiva la mayor selectividad potencial de los procedimientos de fosforescencia. La razn de estas diferencias de comportamiento se debe a que la fosforescencia eficaz necesita el cruce entre sistemas rpido para poblar el estado triplete excitado, que, vuelve a reducir la concentracin de molculas en el singulete excitado y, por tanto, aumenta la intensidad de fosforescencia.