espectroscopia de impedancia electroquimica

Autor de correspondencia

Espectroscopía de impedancia electroquímica, herramientaeficaz para el diagnóstico rápido microbiológico

Nardo Ramírez1, Angel Regueiro2, Olimpia Arias3, Rolando Contreras1

1Dirección de Diagnóstico Microbiológico, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, CNICAve. 25 esq. 158, Cubanacán, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba

2Centro de Bioingeniería, CEBIO3Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales,Universidad de La Habana, UH

E-mail: [email protected]

RESUMENLa espectroscopia dieléctrica o espectroscopia de impedancia electroquímica es empleada tradicionalmente en elregistro y estudio de los procesos de corrosión y electrodeposición, en la evaluación de recubrimientos y en lacaracterización de muchos tipos de sensores y semiconductores. En la última década se han ampliado notablementesus aplicaciones en la Biotecnología para la caracterización de células biológicas, el diagnóstico de enfermedades yla caracterización del cultivo de células. Como principio de transducción, la técnica de impedancia ha sido aplicadaen el campo de la microbiología como un medio para detectar y cuantificar microorganismos patógenos. El presentetrabajo revisa el estado del arte de la microbiología de impedancia, el progreso y las aplicaciones en la detecciónde microorganismos patógenos incluido el uso de los microelectrodos interdigitados, el desarrollo de la miniaturizaciónde la microbiología de impedancia y la integración de los biosensores de impedancia con otras técnicas como ladielectroforesis y la electropermeabilización. Se hace referencia a conceptos básicos, definiciones y fundamentosde esta técnica, así como se abordan los componentes, principios para el diseño del medio de cultivo y uso decircuitos equivalentes para el análisis de los sistemas basados en esta alternativa.

Palabras clave: detección de bacterias, diagnóstico, impedancia, microbiología

Biotecnología Aplicada 2009;26:65-71

ABSTRACTElectrochemical impedance spectroscopy: an effective tool for rapid microbiologic diagnosis. Dielectricspectroscopy, also called electrochemical impedance spectroscopy, is traditionally used in monitoring corrosion andelectro-deposition processes in the coating and characterization assessment of many kinds of sensors and semi-conductors. Its application in biotechnology for the characterization of cell cultures has, however, been notablyexpanded in the last decade. As a transductional principle, impedance has been applied in the field of microbiologyas a means of detecting and quantifying pathogenic bacteria. This paper reviews the state-of-the-art of ImpedanceMicrobiology, its progress and its applications for the detection of foodborne pathogenic bacteria, including the useof interdigitated microelectrodes, the development of chip-based impedance microbiology and the integration ofimpedance biosensors along with other techniques such as dielectrophoresis and electropermeabilization. Referenceis made to basic components, definitions and principles of this technique, as well as to the explanation of thecomponents and principles for cell culture design and the use of equivalent circuits for the analysis of the systemsbased on this alternative.

Keywords: bacteria detection, diagnosis, impedance, microbiology

IntroducciónEl uso creciente de los sensores electroquímicos enaplicaciones ambientales, en la industria y en el ámbitomédico ha creado la imperiosa necesidad de compren-der las propiedades de la superficie y del conjunto engeneral de tan importantes sistemas analíticos. Todoparece indicar que la comunidad científica ha seleccio-nado la espectroscopia de impedancia para caracterizarun gran número de sistemas electroquímicos. La in-formación obtenida a partir del empleo de esta técnicaha sido utilizada para la fabricación de sensores elec-troquímicos con excelentes propiedades (linealidad,estabilidad térmica y temporal, entre otros).

La espectroscopia de impedancia constituye unaherramienta poderosa para lograr un rápido diagnósticobiomolecular y para el análisis en cultivos de células.Su superioridad sobre otras técnicas de laboratorio ra-dica en que utiliza una pequeña señal, generalmente enmodo de tensión, que minimiza las alteraciones de laspropiedades del medio, es decir, que el estímulo aplica-do no altera las condiciones de equilibrio del sistema.

La señal aplicada a las muestras permite relacionarlas propiedades del líquido o sólido que se estudia,con las variaciones o cambios obtenidos en su impe-dancia característica. Ello se debe a la estructura físicadel material, a los procesos químicos que ocurren en élo a la combinación de ambos. Consecuentemente, laespectroscopia de impedancia electroquímica es unatécnica no destructiva que proporciona medicionesrobustas.

Microbiología de impedanciaclásica: definición y conceptosbásicosLa impedancia eléctrica como principio de transduc-ción ha sido aplicada en una gran variedad de problemasbiológicos, fisiológicos y médicos [1, 2].

Antes de comenzar a introducir en el tema de refe-rencia es importante analizar algunos conceptos bá-sicos. Se conoce que la resistencia eléctrica R, es lahabilidad de un elemento del circuito de resistir el flujo

ENFO

QUE

1. Geddes LA, Baker LE. Principles ofapplied biomedical instrumentation. NewYork: John Wiley & Sons. 1989.

2. Eden G, Eden R. Enumeration of mi-croorganisms by their dynamic AC con-ductance patterns. IEEE Trans Biomed Eng.1984;31(2):93-8.

Nardo Ramírez y col. Espectroscopía de impedancia para el diagnóstico microbiológico

Biotecnología Aplicada 2009; Vol.26, No.166

de la corriente eléctrica. La ley de Ohm define esta re-sistencia como la relación entre la tensión y la corriente.

La MI es el registro temporal de la variabilidad de laimpedancia durante el crecimiento de microorganismosen una muestra y se realiza colocando un arreglo deelectrodos metálicos, los cuales son sumergidos en unmedio de cultivo inoculado (Figura 1A), de este modose logra la medición entre los electrodos (impedanciabipolar) mientras crecen los microorganismos pre-sentes. La técnica consiste en realizar mediciones delas componentes de impedancia, por ejemplo: conduc-tancia, capacidad, módulo de impedancia o ángulo defase y otras, mediante el método bipolar o el tetrapolar,con electrodos sumergidos en una celda que contieneun medio de cultivo inoculado mantenido a temperaturaconstante. Estas mediciones permiten registrar, detec-tar, cuantificar y aun identificar determinados micro-organismos presentes en las muestras provenientesde la industria o de la práctica clínica.

Bases de la microbiología deimpedanciaEn MI, los cambios de impedancia son medidos típi-camente con el empleo de un par de electrodos sumer-gidos en el medio de crecimiento o solución reactante(Figura 1A).

La medición puede realizarse en dos formas, directao indirectamente. En la técnica directa, un par de elec-trodos metálicos son sumergidos en el medio inocula-do con la bacteria que se desea medir. Los productosmetabólicos creados durante el crecimiento de mi-croorganismos modifican la composición del medio,cambiando el contenido iónico, lo cual a la vez originaun cambio de la conductividad del medio de cultivo.Estos cambios son registrados en el tiempo al produ-cirse variaciones en la interfaz electrodo-electrolito-muestra. Tales modificaciones son proporcionales a laconcentración de microorganismos vivos, que puedeser registrada mediante técnicas impedimétricas.

La liberación del ión por la bacteria a su medio decrecimiento (Figura 2) se debe a dos mecanismos prin-cipales [3]. El primer mecanismo está relacionado conel metabolismo energético (catabolismo) en el cual, labacteria consume oxígeno y carbohidratos, y producedióxido de carbono y ácidos orgánicos. Ejemplos sim-ples indican que la conversión de glucosa de un sustrato

Donde:V se corresponde con el valor de la tensión e I, con

el valor de la corriente eléctrica.El uso de la ecuación 1 se limita solamente a un

elemento del circuito: el resistor ideal, el cual poseevarias condicionantes: 1) cumple con la ley de Ohm entodos los niveles de tensión y corriente, 2) su valor deresistencia es independiente de la frecuencia y 3) lasseñales de tensión y corriente a través de un resistorestán en fase.

El mundo real contiene elementos que presentan uncomportamiento mucho más complejo. Estos elemen-tos obligan a desechar el simple concepto de resistencia.En su lugar se utiliza el de impedancia, que es un pa-rámetro del circuito mucho más general. Al igual que laresistencia, la impedancia es una medida de la habilidadde un circuito para resistir el flujo de la corriente eléc-trica. A diferencia de la resistencia, la impedancia noestá limitada por ninguna de las condicionantes ex-puestas anteriormente.

La impedancia electroquímica usualmente se obtie-ne aplicando un potencial de corriente alterna a unacelda electroquímica y midiendo la corriente a travésde la celda. La respuesta a este potencial sinusoidal deexcitación es una señal de corriente alterna que puedeser analizada como la suma de funciones sinusoidales(series de Fourier).

Otro concepto a tener presente es el de la capacidado capacitancia, la cual expresa la habilidad de un ca-pacitor para almacenar carga eléctrica. Esta propiedadrige la relación existente entre la diferencia de potencialexistente entre las placas del capacitor y la carga eléctri-ca almacenada en este,mediante la siguiente ecuación:

(1)

C = V Q

Donde:C es la capacidad, medida en faradios; unidad rela-

tivamente grande que suele utilizarse en submúltiploscomo el microfaradio o picofaradio.

V es la diferencia de potencial, medida en voltios.Q es la carga eléctrica almacenada, medida en

culombios.Por otra parte, la conductancia está directamente

relacionada con la facilidad que ofrece un materialcualquiera al paso de la corriente eléctrica. La conduc-tancia G y la resistencia son inversamente propor-cionales. El valor de la conductancia de un material seindica en siemens y se identifica con la letra S. Unsiemens equivale a 1/Ω o también a ohm-1.

Una aplicación, con auge creciente, es el registroautomático de impedancia en Microbiología. La mi-crobiología de impedancia (MI) está compuesta pordos grandes técnicas: la MI clásica basada en lasmediciones de impedancia bipolar o la resistencia delmedio (sin considerar el fenómeno de dispersión) y laespectroscopia de impedancia, también llamada es-pectroscopia dieléctrica, que basa sus mediciones pre-cisamente en la dispersión del medio.

Figura 1. (A) Configuración típica de dos electrodos para la medición de impedancia (B) Circuito equivalentesimplificado para un sistema de dos electrodos. Cdl - Impedancia del electrodo; Rs - Resistencia delelectrodo. (C) Curva de impedancia vs. frecuencia.

3. Owicki J, Parce J. Biosensors based onthe energy metabolism of living cells: thephysical chemistry and cell biology of ex-tracellular acidification. Biosens Bioelec-tron 1992;7:257-72.

R = V I

(2)

(A)

(B)

Cdl Rs Cdl

Impe

da

nce

(Oh

m)

1E+6

1E+5

1E+4

1E+3

1E+2

1E+11E+1 1E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6

(C)

Frequency (Hz)

+ Measurement - Adjustment

Cdl

Rs



no ionizado en dos moléculas de ácido láctico incre-mentará la conductividad del medio de cultivo. Además,el metabolismo tomará el ácido láctico y tres moléculasde oxígeno para producir ácido carbónico. El máspequeño y móvil ión bicarbonato es un conductor ióni-co más efectivo que el ión lactato. Los iones hidrógenosson casi siete veces más efectivos como conductoriónico que los iones sodio todo lo cual propicia la va-riación de impedancia a causa de esta acción de labacteria [2]. El segundo mecanismo está relacionadocon el intercambio de iones a través de la membranacelular (transporte activo). Iones como el sodio y el po-tasio, son activamente transportados a través de loscanales iónicos de la membrana celular (doble capa delípidos), los cuales sirven para regular el potencial demembrana y la diferencia de presión osmótica entre elinterior y el exterior de las células.

A pesar de que el metabolismo energético es la causaprincipal de la liberación de iones desde la célula a suambiente, el proceso de intercambio de iones tambiénaporta una pequeña contribución. Lo que sí está esclare-cido es que estos procesos de liberación de iones pro-ducen cambios en la composición iónica del medio decultivo y en su conductividad, los cuales constituyen lasbases para la medición de los cambios de impedancia.

A diferencia de la técnica directa, la técnica indirectano mide directamente los cambios de impedancia en elmedio de crecimiento bacteriano. Los electrodos, enlugar de ser sumergidos en el medio de crecimientoinoculado, se introducen en una solución separada(usualmente una solución de hidróxido de potasio).Los gases producidos por el metabolismo bacteriano(principalmente el CO2) son absorbidos por la solu-ción de hidróxido de potasio, lo cual provoca un de-cremento en la conductancia de la solución alcalina.

Para detectar bacterias, los sistemas de impedanciamiden los cambios absolutos o relativos en la conduc-tancia, capacitancia o impedancia, a intervalos regula-res de tiempo durante el crecimiento de las bacterias auna temperatura y humedad controlada. Las señaleseléctricas medidas son representadas gráficamente(amplitudes en el eje de las ordenadas vs tiempo deincubación en el eje de las abscisas) y se producen lascurvas de variabilidad de impedancia.

La figura 3 muestra una curva de impedancia típicadonde se aprecia que el valor de impedancia es bastanteestable en la región inicial de la curva y luego, comienzaa decrecer. El tiempo correspondiente al punto en elcual el valor de impedancia decrece y cruza determinadovalor umbral se define como tiempo de detección, td.Generalmente, el tiempo de detección no aparece hastaque el número de bacterias alcanza aproximadamenteentre 106-107 u.f.c./mL. El valor de impedancia final-mente alcanza su límite, en este punto las bacteriashan alcanzado una alta concentración, aproximada-mente 108 u.f.c./mL o más, y todos los recursos delmedio han sido metabolizados y convertidos en pro-ductos finales. La forma de la curva de impedanciacorresponde muy bien con las tres fases de crecimientobacteriano típico: Fase I, donde la bacteria metabolizapero no se multiplica; Fase II de crecimiento expo-nencial o logarítmico, donde la bacteria se multipli-ca exponencialmente, y Fase III estacionaria, dondela concentración celular se mantiene relativamenteconstante [4].

Figura 2. Representación esquemática de los dos mecanismos principales responsables de la liberación deespecies iónicas por células vivas: metabolismo energético (catabolismo) e intercambio de iones a través dela membrana celular.

Un simple análisis teórico, confirmado por la ob-servación experimental, muestra que el tiempo de de-tección td (tiempo necesario para que la impedanciacruce un umbral arbitrario) se relaciona con la con-centración inicial de células Co por medio del modelorepresentado [5]:

log ( = C0) - + α βtd(3)

Figura 3. Curva de crecimiento de impedancia con el umbral y eltiempo de detección conjuntamente con las fases típicas delcrecimiento bacteriano.

Fase de demora

Núm

ero

s d

e cé

lula

s

106

td Tiempo de crecimiento

107

108

109

1010

Curva de impedancia

FaseestacionariaUmbral

Faselogarítmica

Fase demuerte

Imp

edan

cia

4. Talaro KP. Foundations in microbio-logy. 5th ed. New York: McGraw-Hill. 2005.

5. Gómez R, Bashir R, Bhunia A. Micro-scale electronic detection of bacterial me-tabolism. Sensor Actuators B. 2002;86:198-208.

Célula

Otrosprocesos

Energíametabólica

Canaliónico

Azúcar

Oxígeno

Ácido carbónico

H2OK+

Na+

Ácido láctico

CO2

ATP

En esta expresión, α (t > 0) y β son constantes quedependen del tipo de microorganismo en particular,sus condiciones de crecimiento, etc. Eden y cola-boradores [2] obtuvieron valores experimentales deestas constantes: α = 0.96 y β = 7.75, para td en horas,y Co en ufc/mL en el medio de incubación.

La figura 4 muestra la representación del modelo(3) para los valores de las constantes anteriores, lacual indica que el intervalo del tiempo de detecciónva desde una hora para Co, aproximadamente igual a



107 unidades formadoras de colonias por mililitro(u.f.c./mL), hasta ocho horas para Co, aproximada-mente igual a 1 u.f.c./mL. Se entiende por unidadformadora de colonias al número mínimo de célulasseparables sobre la superficie (o dentro de ella) de unmedio de agar semisólido que da lugar al desarrollo deuna colonia visible del orden de decenas de millonesde células descendientes.

Microbiología de impedanciaclásica: medio de cultivo y detecciónde salmonellaEn el transcurso del tiempo, se han realizado muchostrabajos con el propósito de optimizar el desarrollo demedios de cultivo a causa de que la MI directa se basaen la observación de sus cambios de impedancia. Losprincipios para el diseño del medio de cultivo, tanimportantes para la microbiología tradicional, sonigualmente importantes para la MI. En primer lugar,el medio debe ser seleccionado acorde al crecimientode la bacteria que se desea analizar, lo cual propor-ciona selectividad a los métodos microbiológicos deimpedancia. En segundo lugar, el medio debe ser for-mulado de forma tal, que se pueda obtener óptimavariabilidad de impedancia.

La bacteria Salmonella es la principal causa de lasintoxicaciones alimentarias reportadas con mayorfrecuencia. La salmonelosis es la infección causadapor esta bacteria. De acuerdo con los centros de controly prevención de enfermedades (CDC), la salmonelosiscausa solo en los Estados Unidos, un estimado de 1.4millones de casos de intoxicaciones alimentarias ymás de 600 muertes anualmente. Estas infeccionesprovocan, en gastos médicos directos e indirectos, unmillón de millones de dólares al año [6]. Los métodosmicrobiológicos convencionales para la detección deSalmonella spp. necesitan de tres a cuatro días paraobtener un resultado presuntivo y de cinco a siete díaspara su confirmación. Considerando los datos an-teriores, la detección de Salmonella spp. ha sido unode los temas principales de estudio de la MI.

Componentes de la impedanciaMientras la mayor parte de los métodos microbio-lógicos de impedancia miden solamente la conduc-

tancia del medio a una frecuencia fija, usando un parde electrodos sumergidos en un medio inoculado,varios estudios han encontrado que la impedanciatotal durante el crecimiento bacteriano está compues-ta por dos elementos que pueden medirse en interva-los de frecuencias diferentes: uno se refiere al medio,llamado impedancia del medio o del electrolito, y elotro es atribuido al electrodo y a la interfaz electrodo-electrolito, denominado impedancia de la interfaz odel electrodo [7].

Circuito equivalente para loscomponentes de impedanciaLa impedancia del medio y la del electrodo así comosus contribuciones a la impedancia total, en depen-dencia de la frecuencia empleada, pueden ser bieninterpretadas por medio de un circuito equivalente delsistema.

Los elementos del circuito equivalente, para quesean útiles, siempre deben tener su fundamento enla electroquímica física del sistema. Básicamente, laimpedancia entre dos electrodos (Figura 1A) puedeser representada por un simple circuito en serie mos-trado en la figura 1B, compuesto por la resistencia dela solución entre los dos electrodos (Rs) y los capa-citores de la interfaz metal-muestra (uno para cadaelectrodo: Cdl).

Yang y col. en el 2003 [8] demostraron la factibi-lidad de usar un circuito equivalente para analizar elsistema de detección de impedancia para el crecimien-to bacteriano. Ellos mostraron que el espectro deimpedancia obtenido en un medio de crecimiento con1.1 x 103 u.f.c./mL de Salmonella typhimurium corres-ponde con el espectro ajustado, representado en lafigura 1C, lo que ratifica la validez del circuito equi-valente utilizado para justificar los cambios de im-pedancia en el sistema.

Basado en el circuito equivalente, cuando un po-tencial sinusoidal de corriente alterna se aplica alsistema bajo estudio, la impedancia (z) de la secciónentre los electrodos es una función de su resistencia(Rs), de su capacitancia (Cdl) y además, de la frecuen-cia aplicada (f), como se expresa en la ecuación 4:

Figura 4. Relación entre el tiempo de detección (Td) y laconcentración inicial de células (C0).

6. Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF,Bresee JS, Shapiro C et al. Food-relatedillness and death in the United States.Emerg Infect Dis 1999;5:607-25.

7. Felice CL, Valentinuzzi ME. Mediumand interface components in impedancemicrobiology. IEEE Trans Biomed Eng.1999;46:483-7.

8. Yang L, Ruan C, Li Y. Detection of viableSalmonella typhimurium by impedancemeasurement of electrode capacitanceand medium resistance. Biosens Bioelec-tron 2003;19:495-502.

C0 (

UFC

/mL)

101

Td (h)

102

103

104

106

100

105

107

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

El modelo anterior explica lo que se observa en lacurva de variabilidad de la impedancia (Figura 3), dondeésta siempre disminuye cuando la concentración debacterias crece en el medio de cultivo. El decrementode la impedancia es ocasionado por dos causas: la dis-minución de Rs y el incremento de Cdl. Se entiende quelas bacterias metabolizan moléculas grandes y sin car-ga en moléculas pequeñas y cargadas, lo cual ocasionauna disminución de la resistencia del medio (Rs). Elaumento en la capacitancia de la interfaz electrodo-muestra se relaciona con el cambio de la composicióniónica del medio en la vecindad más cercana a la su-perficie metálica, la cual fortalece la formación de unadoble capa. El valor de capacitancia depende de muchosfactores entre los que se incluyen el potencial delelectrodo, la temperatura, la concentración iónica delmedio, los tipos de iones y las propiedades de la

(4)/z/ = R( s) 2

Cdl

12

π f



superficie del electrodo (rugosidad del electrodo, ab-sorción, etc.). En este caso, la capacitancia en la doblecapa formada puede ser expresada de forma simplecomo:

de circulación y el volumen cardíaco de eyección [9].En julio de 1898, Stewart presentó ante la AsociaciónMédica Británica con sede en Edimburgo, el artículotitulado Los cambios provocados por el crecimientode bacterias en la concentración molecular y en la ac-tividad eléctrica del medio de cultivo, que dio origen ala bacteriometría de impedancia y fue publicado al añosiguiente [10]. Las curvas de crecimiento que él obtuvofueron muy similares a las que se obtienen en laactualidad con los sistemas de impedancia disponibles(Figura 5), con la notable diferencia de la extraordinariarapidez de los sistemas actuales, mientras que Stewartestuvo midiendo por más de 30 días.

En 1957, el investigador Schwan publica un trabajomuy importante sobre las propiedades eléctricas delos tejidos y células en suspensión [11]; pero no fuehasta la década del 70 que la MI comenzó a expandirse,a partir de un número creciente de publicaciones quele dieron gran impulso y difusión internacional. Eneste período aparecieron trabajos muy notables de Ur[12, 13] y Cady [14, 15]. El trabajo de los grupos deEdens y Torry en los Estados Unidos fue el que sentólas bases de la MI, resultando en la introducción de lossistemas de medición Bactometer y Malthus, respec-tivamente [2, 16].

Desde 1975 hasta 1999 aparecieron nuevos trabajossobre el tema y se destacaron los aportes de Felice yValentinuzzi [7]. En este período, el número de publi-caciones sobre aplicaciones prácticas del método es-tuvieron principalmente dirigidas a la industria dealimentos y derivados lácteos, donde fue utilizado comouna herramienta para el control de la calidad. Algunasde estas aplicaciones de detección y cuantificación serealizaron en leche cruda de vaca o pasteurizada. Cadyy col. [17] y Gnan-Luedecke [18], fueron de los pri-meros en proponer emplear la medición de impedanciacomo método alternativo de cuentas en placa.

La medición de impedancia también fue aplicadacon éxito en el estudio y registro de la carga microbia-na de una amplia gama de productos alimenticios:vegetales [19], cereales [20-21], dulces [22] y carne[23], por nombrar sólo algunos. Además, la técnicatambién se empleó para identificar grupos de micro-organismos entre los que se incluyeron coliformes encarne [24], gram negativos en leche pasteurizada [25]

DER

IV (

-% /

hr)

1

Tiempo (h)

2

3

00 1 2 3 4 5 6 7 8 9

4

5

6

Salmonella

Proteus

Klebsiella

Stafilococo

E. coli

10

Figura 5. Se muestra la derivada de las curvas del módulo deimpedancia para distintas bacterias de origen clínico en creci-miento en caldo BHI a 37 ºC (Felice CJ, PhD Thesis, INSIBIO-UNT, Tucumán, Argentina, 1995).

9. Stewart GN. Researches on circulationtime and on the influences which affect it.IV. The output of the heart. J Physiol(London). 1897;XXII:25.

10. Stewart GN. The changes producedby the growth of bacteria in the molecularconcentration and electrical conductivi-ty of culture media. J Exp Med 1899;4:235-43.

11. Schwan HP. Electrical properties oftissue and cell supensions. Adv Biol MedPhys 1957;5:147-209.

12. Ur A. Determination of blood coagu-lation using impedance measurements.Biomed Eng 1970;5:342-5.

13. Ur A. The changes in the electricalimpedance of blood during coagulation.Nature 1970;226:269-70.

14. Cady P. Instrumentation in foodmicrobiology. Food Product Development.1977;April:80-5.

15. Cady P. Progress in impedance mea-surements in microbiology. In: Mechani-zing Microbiology: Sharp AN, Clark DSeds. Springfield (IL):1978. p.199-239.

16. Richards JCS, Jason AC, Hobbs G,Gibson DM, Christie RH. Electronic mea-surement of bacterial growth. J Phys E: SciInstrum 1978;11:560-8.

17. Cady P, Hardy D, Martins S, DufourSW, Kraeger SJ. Automated impedancemeasurements for rapid screening of milkmicrobial content. J Food Prot 1978;41(4):277-83.

18. Gnan S, Luedecke LO. Impedancemeasurements in raw milk as an alternati-ve to the standard plate count. J Food Prot1982;45(1):4-7.

19. Hardy D, Kraeger SJ, Dufour SW, CadyP. Rapid Detection of Microbial Contami-nation in Frozen Vegetables by AutomatedImpedance Measurements. Palo Alto (Ca-lifornia): Bactomatic, Inc. 94303. 1977.

20. Sorrells KM. Rapid detection of bac-terial content in cereal grain. J Food Prot1981;44:832-4.

21. Coppola K, Firstenberg-Eden R. Impe-dance based rapid method for detectionof spoilage organisms in UHT low-acidfoods. J Food Sci 1988;53:1521-7.

(5)εCdlA dl

d=

Donde:εdl es la permisividad dieléctrica de la doble capa

cargada; εdl =ε0 εp, ε0 es la permisividad del espaciolibre, y εp es la constante dieléctrica efectiva de la capaque separa las cargas iónicas del electrodo.

A es el área del electrodod es el grosor de la doble capa.Antes del crecimiento de las bacterias, el medio con-

tiene sustratos sin carga o débilmente cargados comola lactosa. En el crecimiento, estos compuestos sontransformados en pequeños iones altamente cargados.Como resultado, el número de moléculas polares y elde pequeñas moléculas cargadas en la doble capaaumenta, lo cual incrementa la permisividad dieléctri-ca εdl, y al mismo tiempo disminuye el grosor (d) de ladoble capa. Estos cambios combinados provocan unincremento en la capacitancia y como resultado, la im-pedancia disminuye.

La expresión (4) también da la mejor explicación sobrelas propiedades de la medición de impedancia duranteel crecimiento bacteriano, el cual depende de la frecuen-cia. Como se aprecia en la figura 1C, la impedancia totaldisminuye con el aumento de la frecuencia en el intervalode bajas frecuencias, desde 10 Hz hasta 10 kHz, mientrasque la impedancia se torna independiente de la frecuen-cia en el intervalo de altas frecuencias (entre 10 kHz y1 MHz). En la zona de bajas frecuencias (f < 10 kHz),la capacitancia de la doble capa, en esencia, ofrece altaimpedancia y la convierte en la fuente principal quecontribuye a la impedancia total del sistema, de estaforma la resistencia del medio puede ser ignorada. Estaregión se define como la región capacitiva de la doblecapa, en la cual la impedancia del electrodo puede serdetectada (Figura 1C, región Cdl).

Por otra parte, en el intervalo de altas frecuencias(f > 10 kHz) no existe una contribución apreciable dela capacitancia de la doble capa. Así, la contribuciónmás importante en la impedancia total del sistema a lasaltas frecuencias se relaciona con la resistencia del me-dio, la cual es independiente de la frecuencia. Esta re-gión se define como la región resistiva en la cual, laconducción de iones en el medio es dominante (Figura1C, región Rs).Por lo tanto, los cambios en la doble ca-pa del electrodo y los cambios en el medio durante elcrecimiento bacteriano pueden ser detectados mediantela medición de impedancia en diferentes frecuencias, loque constituye un motivo de la investigación actual pa-ra desarrollar nuevos sistemas, capaces de mejorar losprocesos de detección microbiológicos, en cuanto a re-solución y tiempo de diagnóstico.

Antecedentes históricosy aplicaciones en la biotecnologíaPuede considerarse que la última década del siglo XIXmarca el inicio de la MI. Ya en 1890, el investigadornorteamericano GN Stewart comenzó una serie deexperimentos que introducían la conductancia y la con-ductividad como parámetros para estimar el tiempo



y salmonella [26-28]; así como en la evaluación deantibióticos [29].

Las aplicaciones de detección y cuantificación hanincluido también cerveza [30], vino [31], pescados[32], productos farmacéuticos y cosméticos [33] asícomo jugo de frutas [34]. También hubo aplicacionesen efluentes cloacales para detectar bacterias coliformes[35] y para detectar infecciones urinarias [36] o ensangre humana [37]. Una aplicación poco común hasido en la investigación de antibiogramas [2]. En elcaso de los antibiogramas, la turbidimetría ya disponede equipos y experiencia al nivel comercial [38]; peroaún no existe ningún sistema comercial automatizadobasado en la medición de impedancia que realiceantibiogramas.

Varios instrumentos analíticos comerciales estánbasados en el principio de la MI clásica, por ejemplo:Malthus System (Malthus Instruments, Crawley, WestSussex, UK), Bactometer (bioMerieux, Hazelwood,MO, USA), técnica rápida automatizada para la medi-ción de la impedancia bacteriana (RABIT) (Don WhitleyScientific Ltd., Shipley, UK) y BacTrac (Sy-Lab, Pur-kersdorf, Austria) [29, 39-41], respectivamente.

Las técnicas de impedancia también pueden serutilizadas para supervisar la forma de crecimiento delas bacterias. En 1998, Fehlhaber y Kruger encontraronque diferentes especies de bacterias, bajo condicionesdiferentes, presentaban curvas de crecimiento de im-pedancia específicas [42].

La aparición de los microelectrodos interdigitadosha revolucionado radicalmente las investigaciones enespectroscopia de impedancia (Figura 6A). Los micro-electrodos poseen grandes ventajas sobre los electrodosconvencionales para realizar mediciones analíticas, porsu baja resistencia y alta relación señal-ruido, por al-canzar el estado estacionario más rápido y por utilizarpequeños volúmenes de solución [43]. En la última dé-cada, los microelectrodos en forma de arreglos inter-digitados han recibido gran atención en las áreas debiosensores e inmunosensores impedimétricos [44-47].

La tendencia en las investigaciones actuales en ladetección de elementos patógenos está centrada en lafabricación de biosensores para la medición de es-pectros de impedancia. Estos biosensores han sido

capaces de detectar uno en particular y las respuestasobtenidas han sido mucho más rápidas.

Aplicaciones que incluyen la determinación rápidade S. typhimurium han mostrado la factibilidad del usode los microelectrodos interdigitados para realizarmediciones de impedancia con el objetivo de supervisarel crecimiento de bacterias [48]. El volumen de la muestraanalizada puede ser reducido desde 10-15 mL a 1-2 mL.Además, el tiempo de detección para igual concentra-ción inicial de bacterias se reduce a 3 ó 4 horas cuandose compara con el empleo del sistema de electrodos con-vencionales (Figura 7).

La miniaturización de los sistemas de impedanciaconocidos como biochip o lab-on-a-chip para detectarbacterias, ha aumentado la esperanza de lograr unarápida detección del crecimiento bacteriano (Figura6B). Gómez y col. [49] estuvieron entre los primerosen fabricar tales dispositivos para detectar los cambiosde impedancia provocados por el metabolismo mi-crobiano. La idea básica es confinar pocas células vivasen un volumen del orden de los nanos a los picolitros,de forma tal, que pocas células vivas en una solucióntampón de baja conductividad puedan ser rápidamentedetectadas por medio de la medición de impedanciamediante microelectrodos interdigitados. Otros tra-bajos abordan la aplicación de este novedoso métodoconocido como MI Dielectroforética (DEPIM), com-binado con la electropermeabilización que utiliza comosoporte un chip. La dielectroforesis (DEP) es el movi-miento electrocinético de partículas polarizadas die-léctricamente en un campo eléctrico “no uniforme”[50]. El progreso en el desarrollo de los arreglos demicroelectrodos ha hecho de la DEP una técnica muyútil en la manipulación de las células biológicas endispositivos microfluídicos, biochips y biosensores.Con este método, 102 ufc/mL fueron detectados en 3horas [51-53].

La mayor parte de las aplicaciones de la MI hansido ampliamente revisadas por destacados inves-tigadores [54-60].

Direcciones futurasTeniendo en cuenta los resultados obtenidos en ladetección de microorganismos patógenos al combinarla espectroscopia de impedancia con técnicas nove-

Figura 6. Microscopia de barrido electrónico de un microelectrodointerdigitado (A) y de los canales de un biochip de un dispositivomicrofluídico (B).

A B

Tiem

po

de

det

ecci

ón (

h)

1.0E+0 1.0E+1 1.0E+2 1.0E+3 1.0E+4 1.0E+6

Concentración de (Log ufc/mL)Salmonella1.0E+5

0

Interdigitado

Convencional

Figura 7. Comparación entre los tiempos de detección obtenidosa partir de un sistema de microelectrodos interdigitados y elsistema de electrodos convencionales para el crecimientobacteriano.

22. Davda C, Pugh SJ. An improved proto-col for the detection and rapid confirmationwithin 48h of Salmonellas in confectionaryproducts. Lett Appl Microbiol 1991;13:287-90.

23. Firstenberg-Eden R. Rapid estimationof microorganisms in raw meat by impe-dance measurement. Food Technol 1983;37:64-70.

24. Martins SB, Selby MJ. Evaluation of arapid method for the quantitative esti-mation of coliforms in meat by impedime-tric procedures. Appl Environ Microbiol1980;39:518-24.

25. Nieuwenhof FFJ, Hoolwerf JD. Detec-tion of post-pasteurization contaminationof pasteurized milk with the Bioscreen, Ne-derlands Instituut voor Zuivelonderzoek,NIZO-EDE Report. 1205. Nov 1986:10.

26. Easter MC, Gibson DM. Rapid andautomated detection of Salmonella byelectrical measurement. J Hyg 1985;94:245-62.

27. Gibson MD. Some modification to themedia for rapid automated detection ofSalmonellas by conductance measure-ment. J Appl Bacteriol. 1987;63:299-304.

28. Ogden ID. A conductance mediumto distinguish between Salmonella andCitrobacter spp. Int. J Food Microbiol1988;7:287-97.

29. Gould IM, Jason AC, Milne K. Use ofthe Malthus Microbial Growth Analyser tostudy the post antibiotic effect of antibio-tics. J Antimicrob Chemother 1989;24(4):523-31.

30. Evans HAV. A note on two uses for im-pedimetry in brewing microbiology. J ApplBacteriol 1982;53:423-6.

31. Henschke PA, Thomas DS. Detectionof wine yeast by electronic methods. J ApplBacteriol1988;64:123-33.

32. Van Spreekens KJA, Stekelenburg FK.Rapid estimation of the bacteriologicalquality of fresh fish by impedance measu-rements. Appl Microbiol Biotechnol 1986;24:95-6.



dosas para la manipulación de células, y el empleo devolúmenes reducidos, se considera que la mayor li-mitación de esta técnica estriba en su corta edad. Avan-ces en la microfabricación de dispositivos y biochips,capaces de almacenar volúmenes del orden de los na-no y los picolitros donde se confinen muy pocas bacte-rias, son posibles; pero necesitarán al menos una déca-da para materializarse. Otro problema sería la masi-ficación de estos dispositivos al punto de que no fuerauna técnica exclusiva para una pequeña élite. Un au-mento de la sensibilidad de esta técnica es factible conel empleo de biosensores que tengan como base nuevasgeometrías de electrodos interdigitados, unidos a uncambio en el procesamiento matemático de los datos.

ConclusionesComo hemos podido apreciar, la MI y sus aplicacionesen la detección de microorganismos patógenos, juntocon el uso actual de los microelectrodos interdigitados,el desarrollo de la miniaturización y la integración delos biosensores con otras técnicas como la dielec-troforesis y la electropermeabilización, permitirán

desarrollos futuros. Dicha integración tiene como ob-jetivo principal aumentar la sensibilidad de la detec-ción mediante el empleo de un reducido volumen demuestra. Otros aspectos a implementar comprendenel replanteo de sus fundamentos teóricos, el desarrollode nuevos componentes, principios para el diseño delmedio de cultivo y el uso de circuitos equivalentes pa-ra el análisis de los sistemas de impedancia.

La técnica de impedancia como principio de trans-ducción se ha convertido en un área promisoria parael desarrollo de métodos rápidos y efectivos con elobjetivo de detectar el crecimiento microbiológico. Apesar de que la MI fue establecida hace más de 100años, actualmente está entrando en una nueva etapabasada en dispositivos miniaturizados (nanocienciasy nanoelectrónica). Los avances en la microfabrica-ción han creado las condiciones para el desarrollo demicrodispositivos y biochips, los cuales han probadosu eficacia en maximizar la señal de impedancia, in-crementar la sensibilidad y disminuir los tiempos deensayo para la detección de los microorganismos pa-tógenos. Esta tendencia corrobora que los métodos

33. Connolly P, Bloomfield SF, Denyer SP. Theuse of impedance for preservative effi-cacytesting of pharmaceuticals and cos-meticproducts. J Appl Bacteriol 1994;76: 68-74.

34. Deak T, Beuchat LR. Comparison of con-ductimetric and traditional plating techniquesfor detecting yeasts in fruit juices. J Appl Bac-teriol 1993;75:546–50.

35. Silverman MP, Munoz EF. Automated elec-trical impedance technique for rapid enu-meration of fecal coliforms in effluents fromsewage treatment plants. Appl Environ Mi-crobiol 1979;37:521-6.

36. Cady P, Dufour SW, Lawless P, Nunke B,Kraeger SJ. Impedimetric screening for bac-teriuria. J Clin Microbiol 1978;7:273-8.

37. Buckland A, Kessock-Philip S, BascombS. Early detection of bacterial growth in bloodculture by impedance monitoring with a Bac-tometer model 32. J Clin Pathol 1983;36:823-8.

38. Contreras OR, Roura G, Novo F, Hernán-dez S, Ramírez N, Ramírez I et al, inventors.Equipment, kit and method for microbiolo-gical diagnosis. US patent 6537772. 2003;March:25.

39. Bactometer.2008. [http://industry. biome-rieux-usa.com/industry/food/bactometer/index.htm, 24 oct 2008].

40. Don Whitley Scientific. 2008. [http://www.dwscientific.co.uk/, 24 oct 2008.

41. BacTrac.2008. [http://www.sylab.com/bactrac.htm, 24 oct 2008].

42. Fehlhaber K, Kruger G. The study of Sal-monella enteritidis growth kinetics using rapidautomated bacterial impedance technique. JAppl Microbiol 1998;84:945-9.

43. Stulik K, Amatore C, Holub K, Marecek V,Kutner W. Microelectrodes. Definitions, cha-racterization, and applications. Pure ApplChem 2000;72:1483-92.

44. Van Gerwen P, Laureyn W, Laureys W,Huyberechts G, Op De Beeck M, Baert K et al.Nanoscaled interdigitated electrode arrays forbiochemical sensors. Sens Actuators B. 1998;49:73-80.

45. Laureyn W, Nelis D, Van Gerwen P, BaertK, Hermans L, Magnee R et al. Nanoscaledinterdigitated titanium electrodes for impedi-metric biosensing. Sens Actuators B. 2000;68:360-70.

46. Ruan C, Yang L, Li Y. Immunobiosensorchips doe detection of Escherichia coliO157:H7 using electrochemical impedancespectroscopy. Anal Chem 2002;74:4814-20.

47. Varshney M, Li Y. Interdigitated arraymicroelectrode based impedance biosensorcoupled with magnetic nanoparticle-anti-body conjugates for detection of Escherichiacoli O157:H7 in food samples. Biosens Bio-electron 2007;22:2408-14.

48. Yang L, Li Y. Detection of viable Salmone-lla using microelectrode-based capacitancemeasurement coupled with immunomagneticseparation. J Microbiol Methods 2006;64:9-16.

49. Gómez R, Bashir R, Sarikaya A, Ladisch M,Sturgis J, Robinson J et al. Microfluidic biochipfor impedance spectroscopy of biologicalspecies. Biomed Microdev 2001;3:201-9.

50. Pohl HA. Dielectrophoresis. London:Cambridge University Press. 1978.

51. Medoro G, Manaresi N, Leonardi A,Altomare L, Tartagni M, Guerrieri R. A lab-on-a-chip for cell detection and manipula-tion. Orlando ( FL), USA: Sensors IEEE. 2002. p.472-5.

Recibido en junio de 2008. Aprobadoen febrero de 2009.

52. Sengupta S, Battigelli DA, Chang HC. Amicro-scale multi-frequency reactance mea-surement technique to detect bacterial growthat low bio-particle concentrations. Lab Chip2006;6:682-92.

53. Suehiro J, Shutou M, Hatano T, Hara M.Improvement of electric pulse shape for elec-tropermeabilization-assisted dielectrophoreticimpedance measurement for high sensitivebacteria detection. Sens Actuator B 2005;109:209-15.

54. Silley P, Forsythe S. Impedance micro-biology-a rapid change for microbiologists. JAppl Bacteriol 1996;80:233-43.

55. Valentinuzzi ME, Morucci JP, Felice CJ.Monitoring of physiological events by impe-dance. Bioelectrical Impedance Techniques inMedicine. In: Bourne JR, ed. CRC Reviews inBiomedical Engineering. New York: BegellHouse. 1996:427-66.

56. Wawerla M, Stolle A, Schalch B, EisgruberH. Impedance microbiology: applications infood hygiene. J Food Prot 1999;62:1488-96.

57. Guan JG, Miao YQ, Zhanga QJ. Impedi-metric biosensors. J Biosci Bioeng 2004;97(4):219-26.

58. K’Owino IO, Omowunmi AS. Impedan-ce spectroscopy: a powerful tool for rapidbiomolecular screening and cell culturemonitoring. Electroanalysis 2005;17(23):2101-13.

59. Pejcic B, De Marco R. Impedance spec-troscopy: Over 35 years of electrochemicalsensor optimization. Electrochim Acta 2006;51(28):6217-29.

60. Yang L, Bashir R. Electrical/electrochemi-cal impedance for rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Biotechnol Adv2008;26:135-50.

espectroscopia de impedancia electroquimica

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