Espectrofotometría y curva estandar

Objetivos

-Medir la concentración de pro-

teina en una muestra

-Conocer el manejo de los equi-

pos que se usarán

-Construir curvas de calibración

y comprender su importancia

Utilizamos los métodos espectrofotométri-cos para medir la concentración de proteína(s) en una muestra problema

Según la región del espectro absorbida, puede ser:

-Visible (colorimetría)

-UV (ultravioleta)

Color Longitud de onda(nm)Violeta 380-430Azul 430-500Cian 500-520Verde 520-565Amarillo 565-590Naranja 590-625Rojo 590-740

ESPECTROFOTÓMETRO

Ley de Beer & LambertEstablece que la absorbancia es proporcional al

número de moléculas absorbentes

A = ε·c·lA = absobancia

c= concentración

l=longitud de la celda

ε= coeficiente de extinción o absortividad molar

C

Coeficiente de extinción o absortividad molar

Es una propiedad intrínseca de los compuestos. Es una medida de absorción de las sustancias a una determinada longitud de onda

Y o Tir 275nm

W o Trp 295 nm

Unidades: ε[=]M-1cm-1

F o Phe 260nm

Métodos para determinar la concentraciónde proteína en una muestra problema

-Absorbancia a 280 nm

-Reacción del Biuret

- Método de Lowry

- Método de Bradford

Determinación de la concentración de proteína

Método de absorbancia a 280nm

-Absorción de los residuosde tirosilo y triptofanilo

-Se lee a 280nm

-Sensibilidad: 0.05-2.0mg(prot)/ml

-Método no destructivo.

-Absorción de los residuosde tirosilo y triptofanilo

-Se lee a 280nm

-Sensibilidad: 0.05-2.0mg(prot)/ml

-Método no destructivo.

Método Biuret

-Formación del complejo (violeta-prupura)

Cu-Proteína ---------->

-Condiciónes alcalinas

-Se lee a 540 nm

-Sensibilidad: 1.0-6.0 mg(prot)/ml.

Método Lowry

--El complejo proteína-Cu (reacción de Biuret) se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteu o

-Reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico (incrementa la intensidad del color azul)

-Se lee a 750 nm

-Sensibilidad: 0.1-2.0 ug(prot)/ml

Método Bradford

-Unión del colorante azul de Coomasie a proteína

-Condiciones de reacciónfuertemente ácidas

-Se lee a 595nm

-Sensibilidad: 1.0-10.0 ug (prot)/ml

Método Ventajas DesventajasAlta especificidad por proteínasPocas interferenciasBarato

Distintas proteínas reaccionan diferente

Interferencia con sulfato de amonioBradford Muy sensible Interferencia con detergentes

Directo Interferencia con ácidos nucléicos No se pierde la muestra t1/2 (lámpara UV) 1000h/hombre

Biuret Poco sensible

LowryMayor sensibilidad que Biuret

A 280nm

Curva PatrónEs un gráfico que permite

conocer la cantidad de proteí-

na en muestras problema a

partir de concentraciones co-

nocidas de proteína, utilizan-

do la ecuación de la recta o

interpolando las absorban-

cias obtenidas

1. Rotular los tubos de microfuga2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la tabla ycompletar con agua.3. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de ladeterminación yseleccionar la λ de 280 ηm.4. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones.5. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua.6. Realizar las lecturas.7. Llenar la tabla con los datos de absorbancia.8. Calcular la concentración de proteína de acuerdo al volumen añadido de lasolución estándar.

Determinación de proteínas por absor-bancia a 280 ηm