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Enzimas
Determinación de su
actividad catalítica en
distintos materiales
biológicos
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¿Qué son ?La mayoría son proteínas
( existe ARN catalítico ).
¿ que función cumplen?
Catalizadores biológicos
Sus propiedades son….-elevada especificidad.
-aceleran más rápido las reacciones
químicas.
-no se modifica en la catálisis.
-están sujetas a controles celulares,
genéticos y alostèricos.-son termolábiles y sensibles a cambios
de pH.
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Modelos de acción
Modelo llave y
cerradura: rigidez.Modelo de ajuste
inducido: flexibilidad.
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Nomenclatura
Nombre común: Sufijo - asa al nombre del sustrato sobre el cual actúan: amilasa
Nombres arbitrarios: pepsina, catalasa
Nombre recomendado: creatín-quinasa
Nombre sistemático: sustrato utilizado y tipo reacción: ATP-creatin-fosfotransferasa
Número de clasificación: EC 2.7.3.2 clase, subclase, grupo y subgrupo
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TP. Enzimas: determinación de su
actividad catalítica en distintos
materiales biológicos.
Objetivo:
Poner en evidencia enzimas mediante su
actividad frente a sustratos específicos.
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Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Leche entera 10 ml 10 ml 10 ml
Pancreatina 1 ml 1 ml (hervida) 1 ml
Rojo Fenol 10 gotas 10 gotas 10 gotas
Incubación 37°C si si no
Preparar 3 tubos de ensayo:
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Sacarasa:
enzima hidrolasa
cataliza hidrólisis
de sacarosa
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Extracción de sacarasa a partir de levadura
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Preparar 3 tubos de ensayo:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Agua destilada 1 ml 1 ml ---
Sol. Enzima 1 ml --- 1 ml
Sacarosa 1% --- 1 ml 1 ml
Incubación 37°C 30 minutos 30 minutos 30 minutos
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con sacarasa
sacarasa
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Amilasa salival:
Hidrolasa segregada por las glándulas salivales
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Saliva 1:9 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Almidón 1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Temperatura 0°C 37°C 0°C 37°C
Tiempo 10 min. 10 min. 10 min. 10 min.
Reacción Lugol Lugol Fehling Fehling
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Amilasa pancreática:
Hidrolasa liberada por el páncreas
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Pancreatina 2% 1,5 ml --- 1,5 ml ---
Almidón 1% 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml
Temperatura 37°C 37°C 37°C 37°C
Tiempo 10 min. 10 min. 10 min. 10 min.
Reacción Lugol Lugol Fehling Fehling
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Cinética enzimática
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El estudio de una enzima en un medio
biológico involucra 2 análisis:
1- detección de la enzima: estudio cualitativo.
2- concentración de la enzima: estudio
cuantitativo.
Para la detección de la enzima se evalúa la
reacción química que cataliza
específicamente, observando la desaparición
de los reactivos o la aparición de los
productos.
La cinética química estudia la velocidad de
transformación de los reactivos en productos.
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La velocidad se expresa en términos del cambio en la concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo
A + B --------- C + D
V= - dA o dC = K.[A].[B]dt dt
La velocidad de reacción depende de:
pH
Temperatura
Concentración de reactantes.
Presión
Presencia de catalizadores: enzimas
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Unidades de Actividad enzimática:
Actividad que transforma 1 umol de sustrato por
minuto a temperatura y presión dados.
Katal:
Transformación de 1 mol de sustrato/ seg
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E + S ES E + P
Vmax[S]
Km + [S]
v=
Ecuación de Michaelis Menten
La forma característica de la curva de saturación de la enzima por el sustrato se
expresa matemáticamente por la ecuación:
k-1 + k2
k1
Km =
k1
k-1
k2
Km concentración de sustrato
a la cual la velocidad de
reacción es ½ de su
velocidad máxima
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En las reacciones enzimáticas en que
participan más de un sustrato, cada uno de
ellos posee su propia Km
La Km representa una medida inversa de la
afinidad de la enzima por el sustrato.
Cuanto mayor es el valor de Km menor será
la afinidad de la enzima por el sustrato.
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Vmax[S]
Km + [S]v0 =
Vmax[S]
Km + [S]
v0
=1
Ecuación de Lineweaver-Burk
Vmax
Km
v0
=1
+Vmax[S]
1 1
Vmax[S]
Km
v0
=1
+Vmax[S]
[S]
La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica
de los dobles recíprocos o de Linneweaver-Burk y se utiliza
para el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx.
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El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centro
activo de la enzima
Similitud estructural con el sustrato
Al aumentar la concentración de sustrato se desplaza
al inhibidor
Inhibición competitiva
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La velocidad máxima permanece constante
El valor de Km aumenta
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E + S ES
EI + S ESI
II
+ +
E + P
Ki Ki
Ks
Ks
E + S ES
EI + S ESI
II
+ +
E + P
Ki Ki
Ks
Ks
El inhibidor se une en un sitio diferente al sitio activo
de la enzima de manera
que se puede unir a la enzima o al complejo ES
pero en ninguno de los casos
obtendremos productos.
No se revierte por agregado de más sustrato
Inhibición no competitiva
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Los inhibidores no competitivos disminuyen la Vmax de la reacción
Km permanece constante
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y = 75,431x + 11,8
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
30,000
35,000
40,000
45,000
-0,20 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
1/V
1/[S]
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0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 0,05 0,1 0,15 0,2
V
[S]
Vel., sin inhibidor
Vel., con inhibidor
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0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15
V
[S]
Vel., sin inhibidor (mmol
min-1)
Vel., con inhibidor (mmol
min-1)