Ensayo por InmunoabsorciónLigado a Enzimas

Marcos E. Mendoza R.

Se trata de unatécnica delaboratorio que fuediseñada porcientíficos suecos yholandeses en 1971,que permite detectarpequeñas partículasllamadas antígenos,que habitualmenteson fragmentos deproteínas.

Para poderidentificar losantígenos se utilizanmoléculas con doscomponentesacoplados:un anticuerpo (quese une al antígeno deforma específica) yuna enzima (que seactiva y señala launión al antígeno).

Antes deldescubrimiento delELISA se utilizabanmoléculasradioactivas en vezde enzimas, lo quesuponía un riesgoañadido innecesarioen el laboratorio y unmayor costo.

Es un ensayo de bioquímica analítica que permite detectar ycuantificar cantidades muy pequeñas de analitos en solución, pormedio de un anticuerpo conjugado a una enzima .

Los ensayos de ELISA se utilizan como una potente herramientade control de calidad en diversos sectores y de diagnóstico enenfermedades humanas y animales (por ejemplo, metabólica ocardiovascular); detección de toxinas, drogas o contaminantesen los alimentos.

Se basan en la interacción antígeno-anticuerpo, que esanalizada a través del marcaje con una enzima (en la mayoría delos casos con HRP). Esta enzima cataliza una reacción en la queun sustrato se transforma generando un producto coloreado quepuede cuantificarse mediante un espectrofotómetro.

Se usa en muchos laboratorios paradeterminar si un anticuerpo particularesta presente en la muestra de sangre depaciente.

Aunque el procedimiento es rutinario ysencillo, involucra a un gran numero devariables, tales como:

Selección de reactivo, temperatura,medición de volumen y tiempo, que sino se ajusta correctamente pude afectarlos resultados de la prueba.

La interacción de antígeno-

anticuerpo en el laboratorioPuede ser utilizada para

determinar si un paciente

tienen una infección o una

enfermedad autoinmune

1. Un resultado positivo que confirma la presencia de

anticuerpos no significa necesariamente que el

paciente esté enfermo.

El cuerpo de una persona que ha estado enferma y

que ya se ha recuperado puede seguir produciendoanticuerpos. Esto originaría un falso positivo.

2. hay personas que producen una

baja cantidad de anticuerpos, por lo

que estos pueden pasar

desapercibidos y no ser medidos,

dando lugar a un falso negativo.

Sería el caso, por ejemplo, de

personas que padezcan una

inmunodeficiencia, o que se

encuentren en el periodo ventana

de la infección en el momento de

realizar la prueba, o que esténinfectadas por una cepa extraña.

3. pueden aparecer falsos

positivos cuando se da

inespecificidad entreantígeno-anticuerpo.

Fases de un ensayo ELISA

• El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en losensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígenomarcado se emplea en ensayos de competición deantígeno.

1.Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una

enzima

• La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.

2.Unión del antígeno (o del

anticuerpo) a los pocillos

• En el caso del antígeno unido a la placa, se puededetectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado(ELISA directo) o empleando un anticuerpo primarioanti-antígeno y un secundario anti-primario marcado(ELISA indirecto). Este segundo método permite laamplificación de la señal al poderse unir uno o másanticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.

3.Formación de una o más capas

de inmunocomplejos

4. Revelado de la reacción

enzimática

•

•Después de un lavado para eliminar todas lasmoléculas marcadas no fijadas en forma deinmunocomplejos; se añade el sustrato enzimáticoen solución. Se deja reaccionar y se lee la densidadóptica mediante espectrofotometría

ELISA competitivo

• En este método, el anticuerpo de lamuestra va a competir con elconjugado por un numero limitado desitios de unión del antígeno. Habráausencia de color en una muestrapositiva debido a que el sustrato noencontrara a la enzima porque elconjugado ha sido desplazado poranticuerpo presente en la muestra.

ELISA no competitivo

• Consiste en enfrentar la muestra conel antígeno o anticuerpo que esta enla fase solida. Si una muestra espositiva se formara el complejoantígeno-anticuerpo y al agregar elconjugado reaccionara con elrespectivo sustrato desarrollandocolor.

Tipo de ELISA

ELISA directo

• Si la prueba sediseña paradetectar unantígeno, es unELISADIRECTO,porque estabuscandosustancia extraña.

ELISA indirecto

• En cambio unELISAINDIRECTO, porsu parte se diseñapara detectar losanticuerpos que elpaciente ha creadocontra el antígeno.

ELISA NO COMPETITIVO

ELISA directo

• Es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste enrecoger una muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (unrecipiente pequeño) en frente de una muestra igual perocontaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en laque se sabe que no hay germen.

ELISA indirecto

• Se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en estecaso se añade primero un anticuerpo sin enzima y despuésuno con enzima. De esa forma, la señal que emite el enzimaes mucho más potente y la prueba es más sensible.

ELISA

sándwich

• En este caso en los pocillos primero se añade un anticuerpo ydespués la muestra, para que los antígenos queden yaretenidos en el fondo del pozo. Después se añade elanticuerpo con la enzima.

Cúando se hace una ELISA

Diagnóstico de VIH:

• Es la primera prueba que se realiza para descartar una infecciónpor VIH. Se trata de una prueba muy sensible, así que prácticamentedetecta todos los casos. Sin embargo, puede dar falsos positivos, porlo que se suele repetir de nuevo un ELISA y se confirma conun Western-Blot.

Diagnóstico de hepatitis B:

• Al igual que con el VIH, el virus de la hepatitis B puede ser reconocidofácilmente mediante un ELISA en sangre.

Detección de antígenos en orina:

• Es una prueba muy útil y sencilla para identificar gérmenes causantesde neumonías. En las infecciones respiratorias las bacterias pasan ala sangre y de ahí a la orina, por lo que se pueden identificarantígenos fácilmente con un ELISA, que orienta el tratamientoantibiótico directamente.

Cómo se hace una ELISA

1. Una vez depositada la muestra se añadenlos anticuerpos que detectan los antígenos si los hay. Enel otro extremo de los anticuerpos hay enzimas acopladas.

2. Si es un ELISA indirecto se pueden añadir otrosanticuerpos que detecten los anticuerpos previos; así seamplía la señal.

3. Se realiza un lavado de los pocillos; así se eliminan los anticuerpos que no estén unidos a antígenos.

4. Se añade un sustrato, es decir, una sustancia química que reacciona con las enzimas de los anticuerpos que queden. Al reaccionar se forman metabolitos.

5. Por último, se mide la cantidad de metabolito que hay mediante diferentes técnicas, como la espectrofotometría.

Tipos de reactivo que

generan color

• Peroxidasa,

• Fosfatasa alcalina,

• Beta-glucosidasa,

• Glucosa oxidasa) para todos los ELIASA

Resultados de la prueba de ELISA

Cuando el ELISA es positivo quiere decir que se han detectadoantígenos en la muestra recogida, y por tanto hay gérmenespresentes. Cuando es negativa, no se han podido detectarantígenos y se considera que la muestra no está contaminada.

En las situaciones en las que el ELISA sea determinante y cambie radicalmente la actitud del médico, es habitual realizar la prueba dos veces seguidas;

Es el caso de la prueba del VIH: su diagnóstico esdeterminante para una persona, y por eso se realizan dosELISA seguidos y otra técnica más que permite confirmar eldiagnóstico con mucha más fiabilidad.

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