elisa y lfd para alimentos

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIN

Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012

Centro Nacional de Alimentacin

Deteccin de Alrgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de

Alimentacin

DetecciDeteccin de Aln de Alrgenos en Alimentos. rgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de Actuaciones del Centro Nacional de

AlimentaciAlimentacinn

M Isabel Prieto SantosServicio de BiotecnologaMM Isabel Prieto SantosIsabel Prieto SantosServicio de BiotecnologServicio de Biotecnologaa



LosalLosalrgenosalimentariossonrgenosalimentariossonproteprotenasoglicoprotenasoglicoprotenasnaspresentesdeformanaturalenpresentesdeformanaturalenlosalimentos,tantodeorigenlosalimentos,tantodeorigenvegetalcomoanimalvegetalcomoanimal

ALALRGENOSALIMENTARIOSRGENOSALIMENTARIOS



PROTEPROTENAS ALERGNAS ALERGNICAS NICAS

Alimento Protenas Totales Protena Alergnica PM

Cacahuete 29%Arah1Arah2Otras(arah3aarah8)

6364kD17kD

20%(protenasdelsuero)

lactoglobulinaslactoglobulinas

18kD1314kDLeche

80%casena ,,,casenas 1933kD

Huevo 1113%

Ovomucoide(Gald1)Ovoalbumina(Gald2)Ovotransferrina(Gald3)Lisozima

Trigo(Gluten)

1015% ,,GliadinasyGluteninas Nuez

Bere1 93kD

Soja 70%GlicininaConglicininaInhibidordelatripsina

1314kD2225kD

Mostaza Sina1Braj1

15kD16kD

Crustceos Tropomiosina(Pena1,Mete1,SaIySaII)

36kD

Pescado Parvalbmina(Gadc1oalergenoM) 12kD


A)MA)MtodosInmunoltodosInmunolgicosgicosDeteccindelasprotenasalergnicasmedianteanticuerposespecficos

B)MB)MtodosbasadosenBiologtodosbasadosenBiologaMolecularaMolecularDeteccindesecuenciasdianadeADNmediantePCR

C)MC)MtodostodoscromatogrcromatogrficosficosUtilizadoseninvestigacin

ANANLISISDEALLISISDEALRGENOSENALIMENTOSRGENOSENALIMENTOS



Mtodosbasadosenladeteccindeunaomsprotenasofragmentosproteicos(alrgeno),mediantelauninespecificaantgenoanticuerpo

A)MA)MTODOSINMUNOLTODOSINMUNOLGICOSGICOS

a)Enzimoinmunoensayo ELISAELISAsandwichELISAcompetitivoELISAdirecto

b)Mtodosrpidos(tirasinmunocromatogrficas)



SISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVASSISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVASSISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVAS

Sistemascualitativos(puedeserutilizadoscomosemicuantitativosconprecaucin)Utilidadparamuestreoambiental,verificacinzonasdelimpieza,screeningDisponiblesparamuchosalrgenosRpidosSencillosSensibilidaddeclarada(5mg/kg (ppm))



MMtodoELISAtodoELISASandwichSandwich :Etapas:EtapasExtractodelaExtractodelamuestramuestra

IncubacinAnticuerpoAnticuerpoconjugadoconjugado

lavado

SustratoSustrato

FrenadoFrenado




TEPNEL BIOKITS

SISTEMASELISASISTEMASELISASISTEMASELISA

AgraQuantMtodosdirectos:DETECTANLASPROTEDETECTANLASPROTENASNAS

ALERGALERGNICASNICAS

Cuantitativos Rpidos Norequiereequiposdemasiadocomplejos(lectordeplacas)

ALTA SENSIBILIDADALTA SENSIBILIDAD: La mayora de los ELISA declaran unasensibilidad suficiente para detectar concentraciones relativamentepequeasdealrgenos(adecuadosparaprotegeralconsumidor)

(Lmitededeteccin:entre0,5mg/kg (ppm)a5mg/kg (ppm))


LimitacionesanalLimitacionesanalticasenelcontroldealticasenelcontroldealrgenos:rgenos:

A) Extraccindeprotenasalergnicas

B) DiferenciasenlosdistintossistemasELISA

C) NodisponibilidaddeMRcertificados

A)A) ExtracciExtraccindeprotendeprotenasalergnasalergnicasnicas

B)B) DiferenciasenlosdistintossistemasELISADiferenciasenlosdistintossistemasELISA

C)C) NodisponibilidaddeMRcertificadosNodisponibilidaddeMRcertificados



A)Dificultaddelaextraccindeprotenasalergnicasenlosalimentos

A)A) DificultaddelaextracciDificultaddelaextraccindeprotendeprotenasalergnasalergnicasnicasenlosalimentosenlosalimentos

a) Influenciadelprocesadoenlaspropiedadesdelasprotenasalergnicas

b)ComplejidaddelamatrizquecontieneelalrgenoPolifenolesytaninosGrasaspH

c)Distribucinenelalimento

a) Influenciadelprocesadoenlaspropiedadesdelasprotenasalergnicas

b)ComplejidaddelamatrizquecontieneelalrgenoPolifenolesytaninosGrasaspH

c)Distribucinenelalimento

Lafacilidady/odificultaddelaextraccindepende:



Desarrollodeadecuadosprocedimientosdeextraccin

9Kits comerciales suministran sus propios tampones de extraccin9Procesos rpidos y fciles de realizar

Composicin desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)Similares para todos los alrgenos

Necesidad de aditivos especiales: gelatina de pescado leche en polvo sustancias reductoras ( -mercaptoetanol) urea 6 mol/litro agentes surfactantes (1% Tween 20 0,4% Triton X-100,

4% SDS)Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012

RETORETO



ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)

Efectodelamatrizenalimentosricosentaninosypolifenoles

Cacao,chocolateyderivados Caf yT Frutasricasentaninos: Uvas,platano,manzana,pera Frutossecosconpiel:

castaa..


Efectodematrizricaentaninos(muestrasconaltocontenidoeEfectodematrizricaentaninos(muestrasconaltocontenidoenchocolate)nchocolate)enladeteccienladeteccindeglutenenalimentos.ndeglutenenalimentos.

OBJETIVOOBJETIVO:MejorarelrendimientodelaextracciMejorarelrendimientodelaextraccinn


Valoresperado20Valoresperado20mgmg//kgkgdeglutendegluten

MuestraextraMuestraextradacondaconsolucisolucinncocktailcocktailRecuperaciRecuperacin80%

m

g

/

k

g

d

e

G

l

u

t

e

n

Datos:ProcedentesdelosEstudiosdeValidaciDatos:ProcedentesdelosEstudiosdeValidacindelprocedimientodendelprocedimientodeDeterminaciDeterminacindeglutenndeglutenenalimentosenalimentos realizadosenelCNArealizadosenelCNA


LainfluenciadelospolifenolesenladetecciLainfluenciadelospolifenolesenladeteccindeglutenenalimentosinfantilesndeglutenenalimentosinfantileshidrolizadosabasedefruta.Efectosdelamatrizenlaextrachidrolizadosabasedefruta.Efectosdelamatrizenlaextraccicindelasprotendelasprotenasdelnasdelglutengluten

OBJETIVOOBJETIVO:ComprobarelefectoinhibidordelospolifenolespresentesenalComprobarelefectoinhibidordelospolifenolespresentesenalimentosconimentosconaltocontenidoenfrutaenlaextraccialtocontenidoenfrutaenlaextraccindegluten.ndegluten.

PROCEDIMIENTO:PROCEDIMIENTO:ComprobaciComprobacindelRendimientodeextraccindelRendimientodeextraccindediferentestiposdendediferentestiposdesolucionesenalimentosinfantilesricosenfruta(papillasinfasolucionesenalimentosinfantilesricosenfruta(papillasinfantilesdefrutas):ntilesdefrutas):

1.1. SoluciSolucinnCocktailCocktail conEtanolal80%conEtanolal80%2.2. SoluciSolucindendeGuanidinaGuanidina //mercaptoetanolmercaptoetanol //IsopropanolIsopropanol3.3. SoluciSolucin1conGelatinadepescadon1conGelatinadepescado4.4. SoluciSolucin1conlechedesnatadan1conlechedesnatada



RESULTADOSRESULTADOS:

1.1. SoluciSolucinnCocktailCocktail conEtanolal80%conEtanolal80% 2.2. SoluciSolucindendeGuanidinaGuanidina //mercaptoetanolmercaptoetanol //IsopropanolIsopropanol3.3. SoluciSolucin1conGelatinadepescadon1conGelatinadepescado 4.4. SoluciSolucin1conlechedesnatadan1conlechedesnatada

Muestrasadicionadascon40Muestrasadicionadascon40mgmg//kgkg deGlutendeGluten



Detectandiferentesprotenas(Diferentesistemasantgenoanticuerpo)

Utilizandiferentescalibrantes

Diferentesunidadesdeexpresinderesultados

B)DiferenciaderesultadosentredistintossistemasELISAB)DiferenciaderesultadosentredistintossistemasELISA


ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DEESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DELOS DISTINTOS SISTEMASLOS DISTINTOS SISTEMAS


ESPECIFICACIONESDELOSKITSDEDETECCIESPECIFICACIONESDELOSKITSDEDETECCINDEPROTENDEPROTENASDEHUEVONASDEHUEVO

SISTEMAELISA ESPECIFICIDADUNIDADESDE

MEDIDACALIBRANTE

RANGODECUANTIFICACIONmg/kg (ppm)

LMITEDECUANTIFICACIN

LCmg/kg (ppm)

AAnticuerpopoliclonalOvomucoide(Gald1)

Protenablancadehuevo(EWP)

NISTSRM8445(Huevosecoenteroenpolvo)

0,5 10 0,5

B HuevoenteroenpolvoProtenatotaldehuevo 2,5 25 2,5

CAnticuerposOvomucoide(Gald1)

Huevoenteroenpolvo

1 10 1

DOvoalbminayovomucoide(Gald 1yGald 2)

Huevoenteroenpolvo

NISTSRM8445(Huevosecoenteroenpolvo)

0,5 13,5 0,5

DIFERENTES

PROTEIN

AS

DIFERENTES

PROTEIN

AS

DIFERENTES

UNIDA

DESD

EMEDIDA

DIFERENTES

UNIDA

DESD

EMEDIDA

DIFERENTECALIB

RANTE

DIFERENTECALIB

RANTE

DIFEREN

TELC

DIFEREN

TELC



PreparacindemuestrascargadasconNISTSRM8445(HuevoenteroenPolvo,Valordereferencia48% 1%ProtenatotaldeHuevo)

1 2 3 4MUESTRAS

ValorEsperado

mg/kg (ppm)protenablancade

huevo

mg/kg (ppm)Huevoenteroen

polvo


polvo


polvo

Galleta3mg/kg huevoenteroenpolvo 1,1 5,6 3,15 4

Pasta6mg/kg huevoenteroenpolvo 2,6 8,2 5,58 8

Bollo3mg/kg huevoenteroenpolvo 1,21 6,8 3,05 3

Helado1,5mg/kg huevoenteroenpolvo 0,53 3,4 1,72 1,6

Vino1,5mg/kg huevoenteroenpolvo 1,35 2,4 1,7 1,6

EstudioComparativokitsELISAdeterminaciEstudioComparativokitsELISAdeterminacindeprotendeprotenasdehuevonasdehuevo

ResultadosconmuestrasdevalorconocidoResultadosconmuestrasdevalorconocido



Valoresperadoenmg/kg dehuevoenteroenpolvo 1 2 3 4

Resultadoexpresadoenmg/kg dehuevoenteroenpolvo




EstudioComparativokitsELISAdeterminaciEstudioComparativokitsELISAdeterminacindeAvellanandeAvellana

SistemaELISASistemaELISA ExpresiExpresinderesultadonderesultadoLimitedeLimitede

cuantificacicuantificacinn

1 Protenadeavellana 0,5mg/kg

2 Avellana 1mg/kg

3 Avellana 2,5mg/kg

4 Avellana 2,5mg/kg



NdeMuestras DETECTADO NODETECTADO

Puedecontenertrazasdeavellana.Rastrosdeavellana.Trazasdefrutossecos..Frutosdecascara.NoFiguraAvellanaentresusingredientesNocontieneFrutossecosContieneavellanasConunx%deavellanaPastadeavellana

ETIQUETADOPRESENCIADEAVELLANA

10 2 8

10 9 1

10 6 4

D

U

D

O

S

A

S

D

U

D

O

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A

S

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V

A

S

P

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S

I

T

I

V

A

S

RESULTADOSINICIALESCONUNRESULTADOSINICIALESCONUNNICOKITNICOKIT



DISTINTOSSISTEMASELISA

1 2 3 4

LC0,5mg/kg(ppm)deProtenade

avellana

LC1mg/kg (ppm)deAvellana

LC2,5mg/kg (ppm)deAvellana

LC2,5mg/kg (ppm)deAvellana

MUESTRASPOSITIVAS/NOETIQUETADAS

GalletaconchocolateNofiguraavellanaentresusingredientes >5mg/kg 35mg/kg 15,5mg/kg >20mg/kg

Galletamultivitaminada

Nofiguraavellanaentresusingredientes 0,7mg/kg 2,9mg/kg 4,9mg/kg 8,3mg/kg

MUESTRASPOSITIVAS/ETIQUETADAS

Pastel Avellana2% NODETECTADO NODETECTADO 3,6mg/kg NODETECTADO

MUESTRASETIQUETADODUDOSO

Chocolate Rastrosdeavellana NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO

BarquilloPuedecontenertrazasdenueces,almendrasysoja

NODETECTADO DETECTADO NODETECTADO NODETECTADO

Turrn Trazasdefrutossecos NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO

ChocolateRastrosdecacahuete,avellana yalmendra

NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO



RecuperaciRecuperacinconmuestrasfortificadascon5nconmuestrasfortificadascon5mgmg//kgkg deavellanadeavellana

Preparacindemuestrasfortificadas,mediantemezcladevariedadesdeavellana

PreparaciPreparacindemuestrasndemuestrasfortificadas,mediantefortificadas,mediantemezcladevariedadesmezcladevariedadesdeavellanadeavellana

C)NoDisponibilidaddeMaterialesdeReferenciaC)NoDisponibilidaddeMaterialesdeReferencia



DeteccinmediantePCRdesecuenciasdeADN: especificasdelalimentoalergnico secuenciasdeADNquecodificanlaprotenaalergnica

Desarrollodekitscomerciales(Lmitedesensibilidaddeclaradomenosde2,5ppm dealimentoalergnico)

B)MB)MTODOSBIOLOGTODOSBIOLOGAMOLECULARAMOLECULAR ReacciReaccindelandelaPolimerasaenCadenaPolimerasaenCadena PCRPCR



VENTAJASVENTAJAS

9 Gransensibilidad9 Granespecificidad9 Fcildeusar9 Mayorestabilidad

9 CumpleconelReglamento(UE)1169/20119tilsinoexisteELISA9Verificarresultadoscuestionables(ej:protenashidrolizadas)9Buenocomomtodoconfirmativo

INCONVENIENTESINCONVENIENTES

NodetectanlaproteNodetectanlaprotenanaalergalergnicanica NorelaciNorelacinconstantenconstanteentrepresenciadeentrepresenciadeADNyProteADNyProtenana CualitativooCualitativoosemicuantitativosemicuantitativo(nosepuedecomparar(nosepuedecompararunidadesdemedida)unidadesdemedida)


CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACION

AlcanceactualdeacreditacindelCNAbajolaNormaUNEENISO17025,enelcampodealrgenos

Gluten,en2009Cacahuete,en2010Protenaslcteas,en2010

lactoglobulinaCasena

Protenasdehuevo,en2012 AmpliacindealcancedeAcreditacin(PrximaauditoriadeENAC,2013)

Deteccindeavellana




Centro Nacional de Alimentacin

Muchas Gracias Muchas Gracias

DirectoradelCNADirectoradelCNAMM [email protected]@msssi.esServiciodeBiotecnologServiciodeBiotecnologaaMM [email protected]@msssi.es

elisa y lfd para alimentos

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