Electroporador para investigación en biología molecular

aplicado a embriones de pollo

Ezequiel Chesini (1), Juan Cruz Bigliani (1), Juan P. Zanin (2), Roberto A.

Rovasio (2), Ricardo A. M. Taborda (1)

1)LIADE - (2)CEBICEM - FCEFyN - Universidad Nacional de Córdoba

E-mail: echesini@efn.uncor.edu

Resúmen. Una fuente generadora de pulsos de tensión fue desarrollada y construida para ser

utilizada en la electroporación de embriones de pollo. La solución empleada se basa en el uso

de una fuente de tensión continua, con control de corriente y duración de pulsos. Los pulsos

emitidos se aplican a electrodos de platino que al hacer contacto con el embrión del huevo

producen la electroporación con transferencia de la molécula previamente inyectada al interior

de las células embrionarias. Los resultados obtenidos en las pruebas validan el sistema

comprobando su capacidad para electroporar los embriones con alto porcentaje de éxitos.

Palabras clave: Electroporación, Generador de pulsos, Instrumentación, Permeabilización de la

membrana celular

1. Introducción La electroporación es un fenómeno transitorio en el que células o tejidos biológicos son expuestos a un campo eléctrico externo de suficiente intensidad como para incrementar la permeabilidad de la membrana plasmática. La exposición de células a fuertes campos eléctricos de corta duración, produce cambios en el transporte de iones y moléculas eléctricamente cargadas a través de la membrana plasmática de la célula [1]. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula[2]. En este estado de alta permeabilidad, la membrana plasmática permite que moléculas cargadas puedan introducirse en el citoplasma, aunque la membrana plasmática de la célula represente una eficiente barrera para ellas en su estado normal. Por ejemplo, el ADN exógeno, debido a su carga negativa, puede ser movilizado por electroporación al interior del núcleo de otras células.

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Ilustración 1: Generador de pulsos para electroporación.

El generador de pulsos de electroporación, se muestra en la ilustración 1. Fué construído para ser utilizado en el Centro de Biología Celular y Molecular [CEBICEM] de la FCEFyN de la UNC, donde se investiga el desarrollo embrionario normal y algunos mecanismos de las malformaciones congénitas. En ese tipo de estudios, la función de una molécula puede ser investigada mediante el bloqueo (interferencia específica) de su síntesis (expresión) y el estudio posterior para evaluar la(s) consecuencia(s) de dicho bloqueo sobre los embriones o grupos celulares que lo componen. En particular, se estudia la distribución de células embrionarias en relación al efecto de ciertas moléculas (NT-3). Para ello, se microinyectan embriones con una molécula (morfolino) con capacidad para bloquear selectivamente la síntesis del ADN correspondiente a la molécula en estudio (por ej., NT-3) y mediante la electroporación se la vehiculiza al interior del núcleo celular, donde ejercerá su acción bloqueante sobre el ADN. Luego de un tiempo, el estudio de la distribución celular en el embrión, indicará si la molécula bloqueada ejerce o no el efecto sospechado sobre esas células. Este proyecto se enmarca en una línea de trabajo que el Laboratorio de Investigación Aplicada y Desarrollo (LIADE), ha desarrollado en forma coherente e ininterrumpida en el área Aplicaciones Biológicas (no Humanas) de la Ingeniería.

2. Desarrollo

La aplicación de electroporación (y sobrevida) de embriones de pollo en etapas muy tempranas del desarrollo (30-48 horas de incubación) se hace posible mediante la selección apropiada de parámetros de voltaje, corriente, duración y/o forma de los pulsos de tensión. Se pretende lograr la penetración del ADN dentro de las células del embrión, con la mínima cantidad de muerte celular y la máxima sobrevida del lote de embriones inyectados/electroporados. Históricamente se han utilizado con este fin 2 tipos de pulsos de tensión. Uno consiste en pulsos de alto voltaje producidos por la carga y descarga de un condensador a través del embrión como se ve en la ilustración 2. Esto se consigue con un pulso que tiene una fuerte subida y un decaimiento exponencial. Para poder cambiar la longitud del pulso, debe cambiarse el tiempo de decaimiento para lo cual se varía la capacidad y la resistencias en paralelo con el capacitor. En este procedimiento la breve fase de alto voltaje, que es importante para la transferencia de la molécula inyectada (morfolino; ver Introducción), se opone a la duración del pulso muy largo y lleva a un aumento de la temperatura en el embrión, que repercute en un porcentaje alto de mortalidad. Este método es complicado y puede ser considerado obsoleto cuando se lo compara con el segundo método que consiste en generar pulsos cuadrados de tensión, con tiempo de duración y repetición variables como se ve en la ilustración 3.

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Ilustración 2. Pulso exponencial decayente

Ilustración 3. Pulso cuadrado

Este segundo método proporciona mayor facilidad para variar el campo eléctrico en forma repetible y obtener resultados consistentes y reproducibles en la inyección de ADN. Algunas ventajas de este método son que se consigue controlar el tiempo en que se aplica un voltaje predeterminado; se reduce la energía térmica disipada en el embrión; se consiguen pulsos de forma exactamente definida independientemente de la impedancia del punto de contacto de los electrodos en el huevo; se pueden definir los parámetros del pulso antes de realizar el disparo. 3. Diseño

Siguiendo los lineamientos del segundo método se construyo una fuente generadora de pulsos con capacidad para modificar los parámetros de la salida. Cuando el operador ordena un disparo, el equipo genera un tren de pulsos cuyo nivel de tensión, duración y número de repeticiones fueron programados con anterioridad.

3.1. Parámetros de diseño Teniendo en consideración la experiencia de otros investigadores [2], se fijaron como parámetros de diseño los siguientes valores:

• Alimentación: 220Vac 50Hz.

• Voltaje: programable entre 0-50V en pasos de 1V.

• τ (tiempo encendido): 0.1 – 999.9ms en pasos de 0.1ms.

• T- τ (tiempo apagado):0.1 – 999.9ms en pasos de 0.1ms.

• Número de repetición de pulsos: 1-99.

• Intensidad máxima: 1A. Una vez configurados estos parámetros el tren de pulsos generado para lograr la electroporación será de la forma como los se muestra en la ilustración 4.

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Ilustración 4. tren de pulsos con parámetros ajustables

3.2. Diagrama en Bloques El sistema consiste en un microcontrolador que maneja una fuente de tensión programable, una llave para generar pulsos y un conversor A/D. El microcontrolador incluye la interfaz de usuario que está compuesta por un display LCD, un teclado numérico y un pedal de disparo. La ilustración 5 muestra el diseño en diagrama en bloques del electroporador.

Ilustración 5: Diagrama en bloques del generador de pulsos de electroporación

La fuente de tensión programable con regulación lineal es alimentada por un circuito transformador seguido de un rectificador y filtro, desde la red de 220Vac. Se obtiene una tensión no regulada en continua de 55V. El regulador lineal es controlado por el microcontrolador con 8 bits de resolución, obteniendo una tensión variable entre 1 y 50 volt (pasos de 0.01V). La fuente está limitada en corriente, y nunca entregará más de 1A. Tanto este nivel de tensión como los tiempos que caracterizan al pulso (T y τ) son ingresados por el operador a través del teclado y visualizados en el display. El nivel de tensión programado es conmutado hacia los electrodos a través una llave electrónica de salida, manejada por el microcontrolador. En serie con los electrodos de platino que hacen contacto con el embrión se conecta un resistor para sensar la corriente de descarga. La tensión que aparece en este resistor cuando circula corriente es medida por el conversor A/D conectado al microcontrolador. El valor máximo de corriente se muestra en el display al finalizar la electroporación. Este dato es útil para que el operador verifique que se produjo la descarga del pulso a la vez que se puede utilizar como parámetro para calcular la impedancia del embrión durante la descarga.

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4. Resultados experimentales.

Se procedió a medir con un osciloscopio marca Tektronik modelo TDS2024B la forma de onda del pulso de tensión y corriente. La tensión se midió conectando el canal 1 del osciloscopio en paralelo con los electrodos de platino. La corriente se midió conectando una resistencia de 39 Ω en serie con los electrodos y midiendo con el canal 2 del osciloscopio los niveles de tensión en ella. Se emplearon cuatro cargas diferentes: un resistor de 1000 Ω, un embrión de pollo, un embrión de pollo humedecido con solución salina y un embrión de pollo inyectado con tinta y humedecido con solución salina. La primera medición se realizo sobre una resistencia de 1000 Ω simulando la impedancia del embrión para comprobar el funcionamiento del equipo. Los resultados de esta medición se muestran en la ilustración 6.

Ilustración 6: medición del disparo con una resistencia de 1K simulando la carga.

La segunda medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión de pollo y se muestra en la ilustración 7. La corriente esta en fase con la tensión.

Ilustración 7: Medición del disparo sobre el embrión sin solución salina. (5mA)

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La tercera medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión humedecido con algunas gotas de solución salina. En la ilustración 8 se observa un corriente mayor debido a la solución, y se mantiene la corriente en fase con la tensión.

Ilustración 8: Medición del disparo sobre el embrión con solucion (13mA).

La cuarta medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión de pollo inyectado con tinta china y humedecido con algunas gotas de solución salina. En la ilustración 9 se observa la corriente medida. La Ilustración 10 muestra el montaje de los electrodos sobre el embrión.

Ilustración 9: Medición del disparo sobre el embrión con solucion salina y tinta. (25mA).

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Ilustración 10: Electrodos de platino sobre embrión de

pollo

Se observó que los embriones se comportan como cargas mayormente resistivas, y la fuente puede entregar la corriente necesaria para mantener la fase entre la forma de onda de corriente y tensión. Luego de efectuadas las mediciones anteriores, se comenzó a usar el generador en la electroporación de embriones de pollos en forma rutinaria. El montaje para realizar la electroporación se muestra en la ilustración 11. El procedimiento de electroporación del huevo en que se utiliza el generador es[3]: 1) Con tijera chica, se corta un recuadro de 1 x 1,5 cm en la cáscara 2) Se retira el trozo de cáscara con pinzas finas. 3) Se humedece la membrana de la cáscara con PBS (solución salina de fosfatos). 4) Con jeringa de 1 ml y aguja 25G-5/8, se inyecta lentamente tinta china (Pelikan india ink, dilución 1:10 en SS), debajo del embrión, penetrando la membrana vitelina por fuera del área opaca, avanzando la punta de la aguja hasta 1 mm debajo del embrión, asegurándose que no queden burbujas. De esta manera se logra el contraste necesario para visualizar al embrión. 5) Se lleva el huevo al estativo de la lupa y realizan las operaciones requeridas. 6) Se coloca el embrión en posición y se efectúa la microinyección. 7) Se colocan unas gotas de PBS sobre el embrión para evitar la desecación y facilitar el paso de electricidad. 8) Se acercan los extremos de los electrodos al embrión mediante el micromanipulador. Distancia entre electrodos para embriones en etapa 10 HH: ~2-3 mm. 9) Se apoyan los electrodos a ambos lados del embrión ejerciendo una suave presión a fin de que queden los extremos de los electrodos al mismo nivel que el embrión. 10) Se disparan los pulsos de electroporación. 11) Se cierra la ventana del huevo con cinta plástica. 12) Se lleva el huevo al incubador y se re-incuba en posición horizontal por el tiempo requerido. Se ha estado utilizando el generador por 6 meses realizando este procedimiento.

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Ilustración 11: disposición del montaje de un huevo listo par a

recibir pulsos de electroporación.

5. Conclusión

Se logró desarrollar una herramienta apta para ser empleada en investigación básica en el Centro de Biología Celular y Molecular [CEBICEM] de la FCEFyN de la UNC. El equipo fue diseñado atendiendo específicamente a los requerimientos necesarios para la electroporación de embriones de pollo y por esto se logró diseñar un equipo de bajo costo y en un corto tiempo, logrando una eficacia del mismo comparable a la de equipos comerciales.

6. Referencias

[1] Nakamura H, Katahira T, Sato T, Watanabe Y, Funahashi J (2004) Mech Dev 121: 1137–1143. [2] M. Chuai, Wei Zeng, Xuesong Yang, Veronika Boychenko, James A. Glazier b, Cornelis J. Weijer Developmental Biology 296 (2006) 137–149 [3] Octavian Voiculescu, Costis Papanayotou & Claudio D Stern, Spatially and temporally controlled

electroporation of early chick embryos (2008)

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