el paradigma de la relación estructura-función

Estructura de Macromoléculas. Dpto. de Química Física. Grado en Bioquímica. UGR.

1

Tema I. Las bases estructurales de las funciones de las macromoléculas biológicas. El paradigma de la relación estructura-función en proteínas.

I.1.- INTRODUCCIÓN Un axioma fundamental de la biología es que la estructura tridimensional de las proteínas determina su función. Comprender la función a través de la estructura es un objetivo fundamental de la biología estructural. Pero esto no siempre es una tarea sencilla, en parte porque una definición útil de la función de una proteína requiere una descripción a diferentes niveles. Para el bioquímico función significa el papel bioquímico de una proteína individual: si es una enzima la función se refiere a la reacción que cataliza; si es una proteína de señalización o transporte la función se refiere a las interacciones de la proteína con otras moléculas en el proceso de señalización o transporte. Para el genético o el biólogo celular la función incluye estos aspectos pero engloba el rol celular según su fenotipo o la ruta en la que opera la macromolécula. Un fisiólogo o un biólogo ambiental pueden tener incluso un concepto más amplio de función.

La revolución de la genómica está proporcionando secuencias de genes en un número exponencialmente creciente. El desafío para la biología post-genómica es convertir la información que estas secuencias nos ofrecen en información funcional. La primera etapa para este proceso con frecuencia será la interpretación de la secuencia de una proteína en términos de la estructura tridimensional en la que se pliega.

Hay muchos niveles funcionales de proteínas y ácidos nucléicos, cubriendo un rango que va desde reorganizaciones atómicas a cambios en el desarrollo de un organismo, pero en todos los niveles los cambios van asociados a interacciones o uniones a otras moléculas, de elevado o bajo peso molecular. A veces un reconocimiento molecular específico es la única función bioquímica pero en otros casos una molécula promociona una trasformación química en otra molécula a la que se une .

Cuatro funciones bioquímicas fundamentales desarrolladas por proteínas: “Binding”

El reconocimiento específico de otra molécula es una de las funciones esenciales de las proteínas. La molécula que se une (ligando) puede ser tan pequeña como la molécula de oxigeno que forma un complejo de coordinación con el grupo hemo de la mioglobina, Fig. 1.1.A, o tan grande como una secuencia específica de ADN como la llamada caja TATA que se une y se distorsiona al unirse a la proteína “TATA binding protein” formando un complejo que inicia la transcripción de la información genética, Fig. 1.1.B. La unión específica está gobernada por la complementaridad de la forma y las interacciones no covalentes, polares y apolares. Catálisis

Prácticamente toda reacción química en la célula está catalizada y la mayoría de los catalizadores son enzimas proteicos. La eficacia catalítica de las enzimas es notable, las reacciones pueden acelerarse hasta 17 órdenes de magnitud respecto a la catálisis en ausencia del enzima. Muchas características estructurales contribuyen a esta gran eficacia: se consigue mantener próximos y en la orientación más adecuada para la reacción, se estabiliza el estado de transición, hay catálisis ácido-base, etc. Así la replicación del ADN se cataliza por una polimerasa específica que copia el material genético y controla los errores en la copia, Fig. 1.1.C. Otro ejemplo notable es la proteasa aspártica del virus del SIDA (“HIV protease”), enzima de la que depende la replicación el virus, por lo que es una diana de fármacos inhibidores, Fig. 1.1.D. Conmutación (“Switching”) Las proteínas son moléculas flexible y su conformación puede cambiar como respuesta a cambios en parámetros químicos como el pH y/o a la unión de ligandos. Tales cambios pueden usarse como conmutadores o interruptores moleculares para controlar procesos celulares.

El término GTPasa, guanosina trifosfatasa o trifosfatasa de guanosina representa a una superfamilia de enzimas con más de 100 proteínas estructuralmente relacionadas y que regulan diversas funciones biológicas. La GTPasa está activa (ON) para el crecimiento celular cuando está unida al GTP, Fig. 1.1.E, e inactiva (OFF) cuando está unida al GDP, Fig. 1.1.F. La superfamilia Ras GTPasas son un grupo numeroso de proteínas monoméricas pequeñas homólogos a la proteína Ras. Son también llamadas pequeñas GTPasas con un peso molecular de unos 21 kDa y, por lo general, sirven como interruptores moleculares para una gran variedad de rutas de transmisión de señales celulares.


2

Formación de estructuras supramacromoleculares.

Las Moléculas de proteínas constituyen algunos de los elementos estructurales principales de los sistemas vivos. Esta función depende de la asociación específica de subunidades de la proteína consigo mismo o con otras proteínas, con carbohidratos, etc. Incluso sistemas tan complejos como las fibrillas de actina, componente del músculo y del citoesqueleto de las células eucariotas, se ensamblan espontáneamente. La actina está constituida por unidades proteicas pequeñas (42 kDa) que se ensamblan para formar largos filamentos relativamente rigidos, Fig. 1.1.G. Las proteínas estructurales son también importantes fuente de biomateriales, tales como la seda, el colágeno y la keratina. La fuerza y flexibilidad de la seda es debida a su estructura, es un apilamiento gigantesco de láminas β antiparalelas , Fig. 1.1.H; la fuerza es debida a los enlaces covalentes y los enlaces de hidrógeno de las láminas β y la flexibilidad es consecuencia de las interacciones de van de Waals que mantiene unidas las láminas.


3

Figura I.1: Ejemplos de estructuras de proteínas adoptadas para realizar óptimamente una determinada función.

G H

B A

C D

Ras GDP-unido. ("OFF")

Ras GTP-unido. ("ON") E F


4

I.2.- Reconocimiento, Complementaridad, flexibilidad, localización y naturaleza de los Sitios Activos.

Las funciones de las proteínas tales como el reconocimiento molecular y la catálisis dependen de la complementaridad.

Las funciones de todas las proteínas, sea señalización, transporte o catálisis, depende de la habilidad de unir a otras moléculas o ligandos. El ligando pueden ser una molécula pequeña o una macromolécula y la unión es usualmente muy específica. La unión de un ligando implica la formación de interacciones no covalentes entre el ligando y la superficie de la proteína. La especificidad proviene de la complementaridad de la forma y la distribución de carga entre el ligando y su sitio de unión en la superficie de la proteína. Cambios conformacionales pueden ocurrir como consecuencia de la unión del ligando o para que ésta sea posible. Por el contrario, incluso pequeños cambios conformacionales en la estructura del ligando y/o proteína pueden impedir la unión.

En la mayoría de los casos la unión implica algún tipo de acción, ya sea la transformación química del ligando (catálisis), un cambio conformacional en la proteína, la translocación de la proteína a otra parte de la célula, el transporte del ligando, etc. El reconocimiento molecular depende de los microambientes especializados que resultan de la estructura terciaria de la proteína.

La unión específica se produce en sitios de la proteína que proporcionan complementaridad para el ligando. A éstos sitios se les llaman sitio de unión del ligando (“ligand-binding sites”) si su función es solamente reconocimiento, o sitio activo (“active sites”) si la unión conlleva catálisis química.

Cuando una cadena polipeptídica se pliega en una estructura tridimensional compacta se crean cavidades internas o bolsillos y hendiduras de diferentes tamaños sobre su superficie, donde el empaquetamiento de las cadenas laterales no es perfecta. Estas regiones pueden tener un entorno microscópico muy diferente al que proporciona el medio en el que se encuentra la proteína. Si en la cavidad o bolsillo de una proteína predominan los restos hidrófobos el microentorno creado en su interior se parece más al de un disolvente orgánico que al de un medio acuoso, permitiendo así que la proteína una ligandos altamente hidrófobos tales como lípidos. Si lo que predomina en la cavidad o bolsillo son restos cargados negativamente se crea un microentorno con un fuerte campo electrostático, lo que permite unir ligandos cargados como el Ca+2, tal y como ocurre en proteínas transportadoras de iones.

Los microentornos especializados de los sitios activos contribuyen a la catálisis. La mayoría de las enzimas operan, en parte, a través de de catálisis general ácido base, proceso en el

que lo protones son transferidos entre grupos donores o aceptores del sustrato y cadenas laterales básicas o ácidas del sitio activo. El microentorno en el sitio activo de una enzima puede cambiar drásticamente el comportamiento que, libres en disolución, tienen grupos ácidos tales como el carboxílico y básicos como el amino, de aminoácidos como el ácido glutámico y la lisina. Estos cambios producidos por la acción de fuertes campos eléctricos locales y/o cambios en la polaridad del medio en sitios activos donde predominan restos hidrófobos, favorecen o hacen posible la acción catalítica del sitio activo. Un caso de esto último se produce cuando un sustrato con carga eléctrica neta se desestabiliza en el sitio activo hidrófobo favoreciendo la transformación a productos sin carga.

La flexibilidad de la estructura terciaria permite a las proteínas adaptarse a sus ligandos. Para que una proteína una específicamente un ligando debe formar un sitio de unión cuya estereoquímica, configuración de carga y de grupos potenciales formadores de puentes de hidrógeno sean complementarias de los correspondientes al ligando. La clásica analogía es la de la llave(el ligando) y la cerradura(La proteína); pero esta analogía nos conduce a la idea de una proteína y un ligando como moléculas rígidas, sin embargo ambos, proteína y ligando, son moléculas flexibles de forma que un modelo más real de la interacción es el del Ajuste Inducido (“Induced Fit”): Durante la unión cada molécula puede ajustar su estructura a la presencia de la otra optimizando así la interacción entre ellas (Se dice que la proteína "acurruca" al ligando). En la figura I.2 se ilustra todo esto con el complejo Proteina-Kinasa A y un péptido análogo del sustrato natural. Podemos afirmar que la inherente flexibilidad de estas moléculas es esencial para la actividad bioquímica de las proteínas.


5

Los cambios conformacionales son posibles porque el balance entre las fuerzas que mantienen la estructura terciaria de la proteína y las nuevas fuerzas que se crean en el complejo proteína-ligando es favorable. Figure I.2: Estrecho acoplamiento entre una proteína y su ligando alcanzado por el ajuste mutuo de las dos moléculas. Representación en modelo de esferas de van der Waals del dominio catalítico Proteína-Kinasa A (azul) unida a un péptido análogo de su sustrato natural (naranja). La flexibilidad de las proteínas y los ligandos también hace posible que diferentes fármacos, que no se parecen al ligando natural, se unan con alta afinidad. El sitio de unión y el fármaco de algún modo se ajustan para acomodar las diferencias en forma de las pequeñas moléculas, con tal de que se produzcan interacciones lo suficientemente favorables para compensar el costo energético de los ajustes. Un ejemplo de esto se muestra en la figura I.3 donde se representa la proteasa aspártica del virus del SIDA unida a tres diferentes inhibidores; dos de ellos, el haloperidol y el crixivan no son ligandos peptídicos, pero se unen fuertemente induciendo el cierre de los “flaps” como ocurre con el ligando natural. Figura I.3: Proteasa Aspártica del virus del SIDA (una enzima que usa el virus para preparar su maquinaria molecular en la célula infectada), unida a tres diferentes inhibidores, haloperidol(a), crixivan(b) y un péptido análogo del sustrato natural En todos los casos, la estructura de la proteína debe ser lo suficientemente flexible para que el cambio de la energía de Gibbs producido por la unión y/o la transformación químicadel ligando pueda compensar el costo energético necesario para producir los "ajustes" estructurales de la proteína. La unión puede ser desde una interacción débil (Constante de disociación Kd ~ 10–3 M) a una muy fuerte (Constante de disociación Kd ~ o < 10–12 M ). En el caso particular de un sistema enzima-sustrato, la


6

proteína deberá sufrir una serie de ajustes para permitir la unión del sustrato, producir los cambios en la estructura de éste y su subsiguiente liberación. La flexibilidad de las proteínas es una consecuencia natural de la naturaleza de las fuerzas no covalentes, relativamente fuerzas débiles, que estabilizan la estructura terciaria. Estas interacciones, en condiciones fisiológica están frecuentemente rompiéndose y reconstruyéndose continuamente. Esta estabilidad marginal de las proteínas facilita su degradación, lo que es muy importante para la regulación celular. El grado de flexibilidad varía entre proteínas con diferentes funciones. Hay proteínas que se comportan como si fueran relativamente rígidas, es decir que al unirse el ligando se producen cambios muy pequeños en las posiciones atómicas; muchas de éstas son proteínas extracelulares de forma que su rigidez les permite sobrevivir en ambientes hostiles fuera de la célula. Otras proteínas por el contrario sufren grandes cambios cuando se une el ligando correcto, lo que es esencial para regular su función, como se muestra en el ejemplo de la figura I.4. Figura I.4: Ejemplo de un cambio conformacional grande. La enzima Adenilato Kinasa puede adoptar una conformación abierta o cerrada dependiendo de qué sustratos estén unidos. a) En presencia de solo AMP presenta la forma abierta. b) Cuando en presencia de AMP se une el cosustrato ATP se produce un cambio conformacional notable que cierra el sitio activo. Localización y geometría de los sitios de unión. En principio vamos a distinguir si se trata de la unión de una macromolécula o un pequeño ligando a una proteína. El ligando es una macromolécula: El reconocimiento específico de una macromolécula por una proteína usualmente implica interacciones sobre un área superficial grande y continua (centenares de Å2) o bien sobre varias regiones discretas (no continuas), como se ilustra en la figura I.5. Una macromolécula tendrá muchos puntos de contacto con la superficie de la proteína que conllevará una energía de unión notable, así un sito de unión puede darse en teoría en cualquier región superficial de la proteína. Como consecuencia es difícil predecir con exactitud el sitio de unión sobre la superficie de una estructura determinada experimentalmente o modelada teóricamente.


7

Figura I.5:Complejo entre la hormona del crecimiento humano(amarillo) y dos moléculas idénticas de su receptor (verde y naranja). a)Diagrama de cintas del complejo y b) Modelo de esferas de van der Waals del complejo. Kossiakoff, A.A. and De Vos, A.M.:Adv. Protein Chem. 1998, 52:67–108. Los sitios de unión más frecuentes son lazos prominentes o grandes cavidades porque estas regiones proporcionan la complementaridad específica en la forma. Por ejemplo, muchos sitios de unión a ARN y a ADN son lazos prominentes o hélices α que encajan en los surcos mayor y menor de los ácidos nucleicos, como podemos ver en la figura I.6. Pero estas regiones de las proteínas no tienen características comunes fácilmente identificables en un análisis sencillo e incluso sufren cambios conformacionales cuando se unen. El ligando es una pequeña molécula: Muchos ligandos biológicos importantes son moléculas relativamente pequeñas. Algunos ejemplos son los sustratos para la catálisis enzimática; cofactores, que se unen al sitio activo de las enzimas y son necesarios para la catálisis; y los efectores alostéricos, que unen a sitios diferente del sitio activo y modulan la actividad enzimática. Cuando el ligando es una molécula pequeña los sitios de unión son hendiduras, bolsillos o cavidades. Los bolsillos profundos permiten a las proteínas envolver al ligando y así usar la complementaridad de la forma para proporcionar especificidad, ver figura I.7,

Figura I.6: Complejo entre la proteína del gen represor de la toxina diftérica y el operador tox de la secuencia de ADN que lo reconoce. El represor es un homodímero natural y 2 dímeros se unen a la secuencia del operador. La secuencia de ADN, en el surco mayor, es reconocida por una hélice en un motivo hélice-giro-hélice, lo cual se observa con frecuencia en los complejos DNA-proteína. Marmorstein, R. et al.: Nature 1992, 356:408–414.


8

Figura I.7:Unión del sustrato al factor letal (LF)de la toxina del antrax. El LF actúa como una proteasa que corta la secuencia MAPKK-2 (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase) bloqueando el ciclo celular. Izquierda: superficie de la toxina coloreada según la carga y el péptido MAPKK-2 en modelo CPK. Derecha: lo mismo pero la proteína representada con un modelo de cinta coloreada en gris. Como podemos observar la hendidura del sitio activo es complementario en forma y distribución de carga al sustrato. Las hendiduras o cavidades pueden crear fácilmente microambientes poco comunes. Así cuando un ligando se ajusta al sitio de unión las moléculas de agua pueden ser expulsadas del sitio, lo que puede ser importante para una reacción enzimática. Las cavidades permiten a las pequeñas moléculas tener suficiente superficie molecular de contacto para unirse con alta afinidad si es preciso. Las características de este tipo de sitios de unión permite, con relativa facilidad, identificarlos en una proteína buscando sobre la superficie una cavidad o bolsillo suficientemente grande y si no se encuentra ninguno obvio, se buscará una cavidad interior que pueda acomodar al ligando. Los sitios catalíticos con frecuencia se localizan en las interfaces entre dominios o entre subunidades. Si la proteína tiene más de un dominio estructural y/o está compuesta por más de una subunidad los sitios de unión se encuentran con frecuencia en las interfaces interdominio e intersubunidades, tal como se muestra en el ejemplo de la figura I.8.

Dos dominios de una misma subunidad

Dos dominios de diferentes subunidades


9

Figura I.8: Detalle de la estructura de la enzima dimérica 3-isopropilmalato deshidrogenasa. Los dos tipos de sitios activos están indicados por la presencia del cofactor NADPH (amarillo). Imada, K. et al.: J. Mol. Biol. 1991,222:725–738. I.3.- Propiedades funcionales de las proteínas estructurales. Proteínas como armazón, conectores y andamios. Las estructuras internas en la célula están construidas con proteínas estructurales particulares que proporcionan la forma, la fuerza y la flexibilidad a estas estructuras celulares. En muchos casos las proteínas estructurales se combinan con moléculas de ADN, ARN, lípidos e hidratos de carbono; por ejemplo, los ribosomas tienen un centenar de diferentes componentes protéicos que estabilizan la forma plegada del ribosoma y ARN que realiza la función catalítica. La figura I.9 ilustra este ejemplo.

Figura I.9: Estructura del ribosoma 70S (Thermus thermophilus) cristalizada en un complejo conteniendo mARN y dos o tres tARNs unidos a los sitiios A,P y E del ribosoma. La estructura se resolvió mediante cristalografía de rayos X a una resolución de 5´5 Å. (Cate et al., 1999; Yusupov et al., 2001). http://rna.ucsc.edu/rnacenter/movies/70s_vr.mov Muchas de las estructuras subcelulares tienen un carácter dinámico. Así por ejemplo en los músculos la estructura misma puede cambiar su forma en respuesta a estímulos externos. En otros casos la proteína estructural proporciona el marco para que se realicen procesos dinámicos con la intervención de otras proteínas; por ejemplo la actina, formando microfilamentos en un proceso dinámico proporciona un andamiaje que dota a la célula de una forma con posibilidad de remodelarse rápidamente en respuesta a su entorno o a señales del organismo. Algunas proteínas estructurales forman estructuras temporales que se destruyen cuando ya no se necesitan; por ejemplo el fibrinógeno, componente primario de los coágulos sanguíneos, polimeriza para formar una densa masa fibrosa pero se disuelve cuando la herida cicatriza. La formación descontroladas de tales estructuras pueden subyacer en enfermedades humanas graves; así la coagulación no regulada puede conducir a trombosis, la agregación de proteína beta-amiloide produce fibrillas amiloides asociadas a la enfermedad de Alzheimer.

http://rna.ucsc.edu/rnacenter/movies/70s_vr.mov�


10

No obstante, muchos componentes estructurales de las células y organismos están diseñados para ser permanentes durante el tiempo de vida del organismo. Tales conjuntos pueden estar construidos con solo proteínas, como los casos de la seda, el colágeno, la elastina o la queratina, la capsula proteica de un virus; o pueden estar construidos con proteínas mas algunos otros componentes, como es el caso de los cartilagos que están compuestos de proteínas mas hidratos de carbono. ¿Cómo pueden alcanzar tanta estabilidad estas estructuras?. Hay dos posibles explicaciones: a) A través de solo interacciones proteína-proteína. b) A través de enlaces covalentes cruzados ("cross-links"). a) A través de solo interacciones proteína-proteína: Aunque las interacciones proteína-proteína son de naturaleza no covalente y como consecuencia son interaccione intrínsecamente débiles, son en estos casos tan numerosas que producen un efecto de estabilización equivalente a muchos enlaces covalente. Una forma de alcanzar un gran número de interacciones específicas débiles es ensamblar las superficies complementarias de simples elementos de estructura secundaria repetidos, tales como hélices y hebras beta; así son ensamblajes estables largas hélices enrrolladas ("coiled coils") o apilamiento de hebras beta. El colágeno, el componente fibroso de los tendones, es un ejemplo de tales estructuras, ver figura I.10.

b) A través de enlaces covalentes cruzados: La estructura del colágeno que hemos puesto como ejemplo es reforzada por enlaces covalentes cruzados; la enzima lisil-oxidasa convierte los grupos ε-amino en las cadenas laterales de lisina a δ-aldehído y estos reaccionan creando enlaces cruzados entre las cadenas, ver figura I.11. El aminoácido derivado resultante se conoce como al-lisina. La cadena lateral aldehído recién formada sufre espontáneamente reacciones de adición nucleofílica con grupos ε -amino no modificados de otras lisinas. Estas uniones covalentes pueden establecerse entre cadenas dentro de la estructura superhelicoidal, o bien entre moléculas de colágeno superhelicoidal adyacentes en una fibrilla de colágeno. Otro ejemplo basado en la misma reacción de "cross-linking" es la Elastina, la proteína que proporciona elasticidad a los tejidos pulmonares, formando una red de cadenas polipeptídicas semejante a las gomas, figura I.12.

Figura I.10: Estructura del colágeno. La triple hélice del colágeno es una estructura "coiled-coil" en la que cada una de las tres hélices están construidas de secuencias repetidas GlyXY, donde X es con frecuencia Pro e Y es también Pro. Esta característica estructural da lugar a un juego de sitios hidrofobicos regularmente espaciados y la complementaridad de estos sitios mas los enlaces de hidrógeno (líneas de puntos) son el origen de la estabilidad de esta triple hélice. Las fibras de colágeno se forman cuando múltiples triples hélices se alinean termial a terminal y lateralmete.


11

Figura I.11: Formación de enlaces de entrecruzamiento. Los residuos de Lisina (Lys) o hidroxilisina (Hyl) se convierten en los correspondientes aldehídos por acción de la lisil-oxidasa. Estos grupos pueden reaccionar para formar enlaces covalentes. La reacción entre dos aldehídos de lisina se muestra en la parte superior de la figura Figura I.12.: Micrografía de la red de elastina con una resolución de, aproximadamente, 10 μm.


12

Otra función importante de proteínas estructurales es la de proporcionar el andamio para que una secuencia de reacciones implicadas en la transducción de señales. Cuando señales externas a la célula se transmiten a su interior, las kinasas, las fosfatasas y los factores de transcripción que forman parte de la ruta de transducción de señales intercelular, deben experimentar encuentros moleculares. Para que dos proteínas, distribuidas al azar en el interior de una típica célula eucariota, sufran una colisión molecular por simple difusión el tiempo necesario sería mucho mayor de lo que se precisa en estos procesos. Muchas veces la razón de una mayor velocidad real del proceso radica en la localización de los componentes en la membrana celular, pero en otros casos se explica por la existencia de proteínas estructurales que sirven como andamio para que los componentes de la cadena de señalización formen complejos. Las cascadas o rutas de transducción de señales MAPK("Mitogen-activated protein kinase”) de células eucariotas son ejemplos de tales complejos de señalización.

el paradigma de la relación estructura-función

Documents