efecto irritante de formulaciones cosméticas con camu camu mediante het cam

8/13/2019 Efecto irritante de formulaciones cosmticas con Camu camu mediante HET CAM

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Efecto irritante in vitro de formulaciones cosmticas con extracto de camu

camu, mediante el mtodo Het Cam.

Miguel ngel Inocente Camones 1, Emily Marisol Toscano Guerra 2, Benjamn Castaeda Castaeda 3

RESUMEN

Evaluar el efecto irritante de formulaciones cosmticas con extractos de camu camu.Material y Mtodos:El presente estudio se realiz con formulaciones cosmticas de extractos de camu camu, proporcionadas frtiles de gallina (HET CAM, hens egg test chorioallantoic membrane). La implementacin de la tcnica se realiz en el Humana de la USMP.Resultados: Conclusiones:

Palabras clave:

ABSTRACT

To evaluate the irritant effect of cosmetic formulations elaborated with camu camu extracts.Material and Methods:This study was performed with cosmetic formulations containing camu camu extracts supplied by the

Results: Conclusions:

Key words:

1 2 3


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INTRODUCCIN

La tendencia europea para obtener productos cosmticos por lo cual, se busca que los ingredientes dentro de la

frmula sean de origen natural y no irritantes para el serhumano. Debido a esta tendencia, la industria cosmticase encuentra en la bsqueda de ingredientes de origenvegetal para incorporarlos en sus formulaciones. Sinembargo, en nuestro pas son escasos los estudiosrealizados con productos cosmticos a base de extractos

En el caso de la evaluacin del riesgo de los productosqumicos, se plantea la ejecucin de nuevos mtodos deevaluacin toxicolgica. Los ensayos toxicolgicos, invivo, se han empleado histricamente en la evaluacin

de la inocuidad y seguridad de los ingredientes decosmticos. Sin embargo, en aos recientes se hacriticado el empleo de tales ensayos, debido a los altoscostos de ejecucin, adems del cuestionamiento, cadavez mayor, de los grupos de defensa de conductas ticasy ambientalistas en la industria cosmtica.

El desarrollo de estos ensayos, y la actual demandasocial y legislativa, propician la implantacin de las tres y reemplazo.

En respuesta a este escenario, se ha dedicado esfuerzos

y recursos a la bsqueda de ensayos toxicolgicosalternativos, basados en anlisis in vitro, todo lo cualha motivado que exista una corriente de fomento para a disminuir la utilizacin de animales en las pruebas

Los ensayos de irritacin ocular y drmica en conejo(test de Draize), muy utilizados, son, actualmente, muy Medicina Tradicional y Farmacologa de la FMH-USMP,estamos abocados en la implementacin de otros

reemplazarlos.

El ojo del conejo, aunque similar en tamao al ojo tiene el ensayo para valorar las lesiones y a la variabilidadde resultados, encontrados al ensayar un mismo productoentre distintos laboratorios, hacen lgicas las objecionesa este ensayo.

Sin embargo, el ensayo de Draize, cuando es realizado

por personal experto, es muy preciso para evaluarsustancias irritantes del ojo humano, especialmentecuando se trata de sustancias ligeramente irritantes.

La evaluacin de la irritabilidad ocular in vivo segn el

mtodo de Draize requiere la aplicacin de la sustanciade ensayo en la conjuntiva del animal de experimentacin(conejo), sometindolo, en muchos casos al dolor,ulceracin y hasta necrosis de las estructuras oculares.

Aunque, ltimamente se ha aceptado la disminucin delnmero de animales en esta prueba, an constituye unensayo cruento y rechazado por muchos investigadoresy personal relacionado, que ven en los mtodos in vitrouna alternativa til no slo para evitar la exposicininnecesaria de los animales a productos potencialmentetxicos sino que, adems, logran una mayor correlacinde los resultados obtenidos con el humano que con losensayos en animales (6-11).

Actualmente, numerosos laboratorios en el mundo hanincorporado el ensayo de la membrana corioalantoideadel huevo de gallina (hens egg test chorioallantoicmembrane, HET-CAM) para la evaluacin de la irritacinocular producida por cosmticos; por su rapidez,simplicidad, sensibilidad, fcil ejecucin y su relativobajo costo (12-20).

En el Per, la utilizacin de mtodos alternativos paraevaluar toxicidad es escasa; sin embargo, la normatividad

toxicidad o funcionalidad de los productos cosmticos,evaluada con mtodos alternativos al uso de animales deexperimentacin.

El mtodo HET CAM para evaluar irritabilidad, an noha sido implementado en los laboratorios peruanos deinvestigacin, por lo cual consideramos que el presentetrabajo es pionero en nuestro medio, y la implementacinde la tcnica para productos cosmticos en el Centro de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad SanMartn de Porres sirva como referencia de control de

MATERIAL Y MTODOS

La crema, gel y locin evaluados, fueron elaborados

La composicin de estas se expone a continuacin,Tabla 1.

Efecto irritante in vitro de formulaciones cosmticas con extracto de camu camu, mediante el mtodo Het Cam.


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Tabla 1.Composicin y usos de los cosmticos de origen naturalevaluados

(especie resistente a enfermedades) suministrados por del trabajo de investigacin para exclusividad de laproduccin.

Prueba HET CAM, mediante el mtodo observacionalo cualitativo:

El proceso de incubacin de los huevos comenz, mximo,dos das despues de ovado, los que se mantuvieron bajo dcimo da en que se determin el potencial irritante.(Laignier, 2009) (16).

El dcimo da se evalu la viabilidad de los huevos en los que se distingue la disposicin de venas de tamao

regular.

la zona de la cmara de aire, dejando expuesta lamembrana corioalantoidea (los huevos con la membranacorioalantoidea lesionada no fueron aceptados, niaquellos que presentaban un desarrollo embrionario para humedecer la capa que cubre la membrana

Luego se procedi a retirar la capa con una pinza

metlica. Despus se aplic 0,3 mL de la crema, gel olocin, sobre la membrana corioalantoidea expuesta,de tres huevos por cada muestra problema. Como

necesarios 2 huevos por patrn.

El tiempo (segundos) de la aparicin de hemorragia, lisisy coagulacin se anotaba dentro de los 300 segundos y seingresaba los datos a la siguiente formulacin:

I.I. = ((301TH)/300) x 5) + ((301TL)/300) x 7) + ((301 TC)/300) x9)

Donde:I.I. = Indice de irritacinTH = Tiempo de aparicin de hemorragiaTL = Tiempo de aparicin de lisisTC = Tiempo de aparicin de coagulacin

Una vez obtenido los ndices de irritacin de las muestrasy controles, se compara con la tabla 2 para determinar siel producto era irritante:

Prueba HET CAM, mediante el mtodo de coloranteAzul de Tripn

Para la prueba con el colorante azul de tripn (HET-CAM nm) para conocer el punto de mxima absorbancia del

Una vez concluida la observacin de la membranacorioalantoidea y registrado los signos descritosanteriormente, se procedi de la siguiente manera:

La membrana se lav con agua destilada y se deposit fosfato, dejndola actuar durante 1 minuto. Luego, seretir el colorante con agua destilada y la membranase cortaba y pesaba en balanza analtica. La membranalavada, se pes para eliminar el sesgo de la diferencia enel tamao de cada muestra.

RANGO CATEGORA IRRITANTE

HET CAM

0,0 0,9 NO IRRITANTE

1,0 4,9 IRRITANTE LEVE

5,0 8,9 IRRITANTE MODERADO

9,0 21,0 IRRITANTE SEVERO

Tabla 2.

Crema de camucamu con filtrossolares

Extracto decamu camu 15%Benzofenoma 3,Benzofenoma 4Preservante:cido srbicoExcipiente csp.

HumectanteRegenerativapara la pielAntioxidanteFiltro solar



Extracto decamu camu 25%Benzofenoma 3Preservante:cido srbicoExcipiente csp.

Extracto decamu camu 40%Benzofenoma 3Preservante:cido srbicoExcipiente

PRODUCTO COMPOSICIN PROPIEDADES

Gel de camucamu con filtrosolar

Locin de camucamu con filtrosolar

Miguel ngel Inocente Camones , Emily Marisol Toscano Guerra, Benjamn Castaeda Castaeda


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CA = b X 5/1000 x 10 9nmoles

Tabla 4. Control de caracterstica del producto.

* Resultados expresados en Promedio Desviacin estndar

Figura 1. Evaluacin del efecto del Hidrxido de sodio 0,1 N en lamembrana corioalantoidea.1A. Adicin de NaOH 0,1 N, se observa cogulos y hemorragia;1B. Sin adicin de sustancia.

Tabla 3. Resultados de la prueba HET CAM, mtodo observacional retiraba la membrana

Se midi la absorbancia de la formamida teida frente

a una recta patrn con concentraciones conocidas del indica prdida de la integridad de la membranacorioalantoidea.

La determinacin del potencial irritante de la sustanciade ensayo se realiz segn la frmula:

La comparacin se realiz entre los embriones tratadoscon las sustancias de ensayo y los controles positivoy negativo. Con el dato obtenido se determin la

En el caso del ensayo HET CAM con el colorante azul del colorante. Se realiz la curva de calibracin delcolorante azul de tripn para determinar la ecuacin de

la recta, Figura 4, para la obtencin de la concentracinde colorante absorbido detallado en las Tablas 3 y 4.

Segn la tabla 2, el ndice de irritacin obtenido parala crema, gel y locin elaborados con extracto de camu hidrxido de sodio y lauril sulfato de sodio, resultan ser

Donde:

CA = Cantidad de colorante absorbidob = Concentracin de colorante (obtenido por

ploteo de la curva patrn) /mg de membrana.

PRODUCTO H * L * C * I.I

CREMA >300 >300 >300 0

GEL >300 >300 >300 0

LOCIN >300 >300 >300 0

NaOH (control) 125 12 14 18,29

LSS (control) >300 19 94 12,79

PRODUCTO ABS. PESO membrana Concentracin Colorante(mg) colorante absorbido *

Moles/mg

CREMA 0,0205 82,05 6,266 x 10 -9 0,031 0,002GEL 0,0220 66,95 8,350 x 10 -9 0,042 0,007

LOCIN 0,0240 83,03 7,464 x 10 -9 0,037 0,015

Suero fisiolgico 0,0230 133,6 4,427 x 10 -9 0,022 0,000

NaOH 0,1 N 0,1240 85,05 4,273 x 10 -8 0,214 0,080

Lauril sulfato 0,0475 51,35 2,727 x 10 -8 0,136 0,0141de sodio 1%



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absorbido por la formamida, luego de ocurrido el daocelular en la membrana corioalantoidea; la crema, gel y la tabla 2.

Figura 2. membrana corioalantoidea. 2D. Sin adicin de sustancia.

Figura 4. Curva de calibracin del colorante Azul de Tripn enformamida

Figura 3. Evaluacin del efecto de la crema, gel y locin con camucamu, en la membrana corioalantoidea.

de sustancia;3D. Adicin de gel; 4E. Sin adicin de sustancia; 4F. Adicin delocin.

La utilizacin de la Membrana Corioalantoidea de de evaluar la irritacin producida por un cosmtico sobrela mucosa ocular y nasal se basa en que la MembranaCorioalantoidea presenta un epitelio similar a la mucosaocular y nasal, con una amplia red vascular que permiteevaluar las lesiones de hemorragia, lisis y coagulacin queocurren en dichos vasos, as como la desnaturalizacinde las protenas extravasculares, lo cual indica diversosgrados de irritacin (7-22).

Adems, estos embriones de 10 das no poseen un sistemanervioso desarrollado y por lo tanto no estn sometidosal sufrimiento que pudiera producir una irritacinsevera, cumplindose as con el principio de las 3Rs quedeben tener los mtodos alternativos en toxicologa: animal, reemplazamiento y reduccin en el nmero de

animales de laboratorio a emplear (23).

entre los resultados alcanzados por este mtodoalternativo y las pruebas in vivo, por el mtodo de Draize.

La industria de los cosmticos ha sido una de las ms estos productos estn diseados para tener poca oninguna penetrabilidad y por tanto su aval de seguridaddebe contemplar las pruebas de irritabilidad drmica yoftlmica (14,20,24-27).


3C 3D

4A

4C

4E

4B

4D

4F


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Los resultados de la investigacin realizada son similares al; en el cual se ha evaluado la irritabilidad oftlmica detres cremas cosmticas mediante la tcnica alternativain vitro en membrana corioalantoidea utilizando la

prueba subjetiva HET CAM y la prueba objetiva HET CAM

El ensayo HET CAM, se basa en cambios macroscpicosproducidos en la membrana corioalantoidea del huevode gallina, como son la hemorragia, lisis y coagulacin, un sistema de puntuacin subjetivo, por lo tanto se el colorante azul de tripn, como un medio de contrastepara distinguir clulas vivas y muertas. En este ensayo, por la membrana corioalantoidea daada. La prueba es

de camu camu, mostr ruptura de la membrana biolgica, seguridad de estos productos cosmticos para continuar

histopatolgica.

AGRADECIMIENTO

Al Decano de la Facultad de Medicina Humana Dr. FrankLizaraso Capar por haber hecho posible la realizacin de SAC por los productos cosmticos y a la Criandera el trabajo de investigacin.

Porres.

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Correspondencia

Correo electrnico: [email protected]


Recibido: 12 de Marzo de 2013Aprobado: 03 de Junio de 2013

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