efecto del consumo de soja en la longevidad de

FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA

EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA EN LA

LONGEVIDAD DE RATONES OF1 MACHOS

TESIS DOCTORAL

Presentada por:

Kheira Mohamed Abdelaziz

Dirigida por:

Prof. D. Jos Via Ribes

Prof. Da. Consuelo Borrs Blasco

Prof. D. Juan Gambini Buchn

Valencia, 2013

La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiacin obtenida

del siguiente proyecto y beca:

Ministerio de Ciencias e Innovacin. Plan Nacional de I+D+I 2008-

2011. Proyectos de Investigacin Fundamental (113819516-19516-4-10).

Titulado: Modulacin de los genes de longevidad y su importancia en la

prevencin de enfermedades asociadas al envejecimiento.

Beca de la Agencia Espaola de Cooperacin Internacional para el

Desarrollo (AECID).

FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA

Prof. D. Jos Via Ribes, Catedrtico del Departamento de Fisiologa de la

Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de Valencia.

Prof. Da. Consuelo Borrs Blasco, Profesora del Departamento de

Fisiologa de la Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de

Valencia.

Prof. D. Juan Gambini Buchn, Profesor del Departamento de Fisiologa de

la Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de Valencia.

CERTIFICAN:

Que Da Kheira Mohamed Abdelaziz, Graduada en Nutricin Humana y

Diettica por la Universidad de Alicante, ha realizado bajo su direccin la

presente tesis titulada:

EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA EN LA

LONGEVIDAD DE RATONES OF1 MACHOS

Para la obtencin del ttulo de Doctor

Y para que conste a los efectos oportunos, firman la presente certificacin.

Valencia, 2013

Fdo. D. Jos Via Ribes Fdo. Da. Consuelo Borrs Blasco Fdo. D. Juan Gambini Buchn

A MI FAMILIA EN PARTICULAR

AL PUEBLO SAHARAUI EN GENERAL

Me hara falta el espacio equivalente a esta tesis para poderle agradecer a tanta gente, con sus nombres propios, el haberme

brindado su apoyo.

As que simplemente, de todo corazn, gracias a todos los que de alguna manera habis hecho posible la realizacin de este

sueo.

En definitiva, gracias a Dios por la oportunidad y la bendicin de contar con las mejores personas tanto en lo personal

como en lo profesional.

NDICE GENERAL

ndice

III

1 INTRODUCCIN ...................................................................................... 1

1.1 LONGEVIDAD .................................................................................................... 3

1.2 EL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ....................................................... 7

1.2.1 Concepto de envejecimiento ............................................................................ 7

1.2.2 Consecuencias del envejecimiento ................................................................... 9

1.3 TEORAS DEL ENVEJECIMIENTO ........................................................... 10

1.4 TEORA DE LOS RADICALES LIBRES EN EL ENVEJECIMIENTO11

1.4.1 Radicales libres .................................................................................................. 12

1.4.1.1 Concepto y origen de radical libre ........................................................ 12

1.4.1.2 Clases de Radicales libres ....................................................................... 14

1.4.2 Gnesis de ROS ................................................................................................ 17

1.4.3 Estrs oxidativo ................................................................................................ 18

1.4.3.1 Concepto .................................................................................................. 18

1.4.3.2 Estrs oxidativo y dao a biomolculas ............................................... 19

1.4.3.3 Indicadores de estrs oxidativo ............................................................. 22

1.5 TEORA MITOCONDRIAL DE LOS RADICALES LIBRES EN EL

ENVEJECIMIENTO ....................................................................................................... 24

1.5.1 Historia ............................................................................................................... 24

1.5.2 La mitocondria .................................................................................................. 26

1.5.2.1 La mitocondria: estructura y funcin ................................................... 26

1.5.2.2 Produccin de radicales libres en los distintos estados

mitocondriales ............................................................................................................ 29

1.5.2.3 Otras acciones de las mitocondrias ...................................................... 31

1.6 ANTIOXIDANTES FISIOLGICOS ........................................................... 32

ndice .

IV

1.6.1 Antioxidantes enzimticos .............................................................................. 34

1.6.1.1 Superxido dismutasa (SOD) ................................................................ 34

1.6.1.2 Glutatin peroxidasa (GPx) ................................................................... 35

1.6.1.3 Catalasa ..................................................................................................... 35

1.6.2 Antioxidantes no enzimticos ........................................................................ 35

1.6.2.1 Flavonoides .............................................................................................. 36

1.6.3 Efecto de los antioxidantes sobre la longevidad ......................................... 37

1.7 ESTRGENOS ................................................................................................... 38

1.7.1 Definicin, tipos y mecanismo de accin ..................................................... 38

1.7.2 Accin de los estrgenos sobre las mitocondrias ........................................ 40

1.7.3 Propiedades antioxidantes de los estrgenos ............................................... 41

1.7.4 Teraputica hormonal sustitutiva ................................................................... 43

1.7.5 La doble cara de los estrgenos: efectos beneficiosos y perjudiciales ..... 43

1.7.6 Estrgenos y longevidad ................................................................................. 45

1.7.7 SERMs: moduladores selectivos del receptor de estrgeno ...................... 46

1.8 FITOESTRGENOS ......................................................................................... 47

1.8.1 Definicin y clasificacin ................................................................................ 47

1.8.2 Isoflavonas ......................................................................................................... 49

1.8.3 Historia ............................................................................................................... 49

1.8.4 Epidemiologa ................................................................................................... 50

1.8.5 Mecanismo de accin ....................................................................................... 51

1.8.6 Farmacocintica de los fitoestrgenos .......................................................... 53

1.8.7 Fitoestrgenos como antioxidantes ............................................................... 56

ndice

V

1.8.8 Potenciales efectos de los fitoestrgenos sobre la salud ............................ 57

1.8.9 Fitoestrgenos y longevidad ........................................................................... 62

2 OBJETIVOS ...............................................................................................63

2.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 65

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................ 65

3 MATERIALES Y MTODOS ...................................................................67

3.1 MATERIALES ..................................................................................................... 69

3.1.1 Animales de experimentacin ......................................................................... 69

3.1.2 Aparatos ............................................................................................................. 71

3.1.3 Reactivos ............................................................................................................ 76

3.2 MTODOS ........................................................................................................... 78

3.2.1 Curva de longevidad en ratones OF1 machos ............................................. 78

3.2.2 Control de la ingesta de comida y del peso corporal .................................. 78

3.2.3 Sacrificio de los animales. Extraccin y conservacin de muestras ......... 79

3.2.4 Determinacin de la concentracin de isoflavonas en plasma .................. 80

3.2.5 Aislamiento de mitocondrias hepticas ......................................................... 83

3.2.6 Determinacin del perfil metablico en plasma y en mitocondrias

hepticas aisladas, mediante resonancia magntica nuclear (1H RMN) ................. 85

3.2.7 Determinacin de la tasa de produccin mitocondrial de perxido de

hidrgeno ......................................................................................................................... 88

3.2.8 Determinacin de los niveles de peroxidacin lipdica en mitocondrias

hepticas aisladas ............................................................................................................ 92

3.2.9 Determinacin de la concentracin de protenas ........................................ 96

3.2.9.1 Mtodo de Lowry .................................................................................... 96

ndice .

VI

3.2.9.2 Mtodo de Bradford ............................................................................... 98

3.2.10 Western blotting .................................................................................................... 99

3.2.11 Western blotting de protenas oxidadas ........................................................... 104

3.2.12 Aislamiento de RNA ...................................................................................... 107

3.2.13 Retrotranscripcin-Amplificacin del RNA (RT-PCR) en tiempo real. 109

3.2.13.1 Sntesis de cDNA: Retrotranscripcin (RT) ..................................... 110

3.2.13.2 Amplificacin cuantitativa del RNA (RT-PCR a tiempo real) ....... 112

3.2.14 Actividad enzimtica ...................................................................................... 117

3.2.14.1 Glutatin peroxidasa ............................................................................. 117

3.2.14.2 Manganeso superxido dismutasa ...................................................... 120

3.2.15 Determinacin del consumo de glucosa in vivo mediante Tomografa de

Emisin de Positrones (PET) .................................................................................... 123

3.2.16 Test de Tolerancia a la Glucosa Oral (TTGO) .......................................... 128

3.2.17 Aclaramiento heptico ................................................................................... 129

3.2.18 Test de reconocimiento de objetos nuevos ................................................ 130

3.2.19 Coordinacin motora ..................................................................................... 132

3.2.20 Fuerza de agarre de los miembros anteriores............................................. 133

3.2.21 Anlisis estadstico de los resultados ........................................................... 135

4 RESULTADOS......................................................................................... 137

4.1 CURVA DE SUPERVIVENCIA DE RATONES OF1 MACHOS

ALIMENTADOS CON DIETA RICA O SIN SOJA .............................................. 139

4.2 CONCENTRACIN DE ISOFLAVONAS EN PLASMA ..................... 142

4.3 PERFIL METABLICO EN PLASMA Y MITOCONDRIAS

HEPTICAS MEDIANTE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR (1H

RMN) ................................................................................................................................ 145

ndice

VII

4.4 CONSUMO Y PESO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS

CON DIETA RICA EN SOJA O SIN SOJA ............................................................ 147

4.5 PRODUCCIN DE PERXIDO DE HIDRGENO EN

MITOCONDRIAS AISLADAS DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS

ALIMENTADOS CON O SIN SOJA ........................................................................ 149

4.6 NIVELES DE PEROXIDACIN LIPDICA EN MITOCONDRIAS

AISLADAS DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS

CON O SIN SOJA ........................................................................................................... 153

4.7 PROTENAS CARBONILADAS EN MITOCONDRIAS AISLADAS

DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN

SOJA ................................................................................................................................ 156

4.8 ANLISIS DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN HGADO DE

RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN SOJA..................... 159

4.8.1 Glutatin peroxidasa ...................................................................................... 159

4.8.1.1 Niveles del mRNA de la GPx ............................................................. 159

4.8.1.2 Niveles de la protena GPx .................................................................. 161

4.8.1.3 Actividad de la enzima GPx ................................................................ 164

4.8.2 Superxido dismutasa .................................................................................... 166

4.8.2.1 Niveles del mRNA de MnSOD .......................................................... 166

4.8.2.2 Niveles de la protena MnSOD ........................................................... 169

4.8.2.3 Actividad enzimtica de MnSOD ....................................................... 171

4.9 DETERMINACIN DEL CONSUMO DE GLUCOSA CEREBRAL IN

VIVO MEDIANTE PET .............................................................................................. 173

4.10 TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL EN RATONES OF1

MACHOS ALIMENTADOS CON DIETA CON O SIN SOJA .......................... 176

4.11 ACLARAMIENTO HEPTICO EN RATONES OF1 MACHOS

ALIMENTADOS CON O SIN SOJA ........................................................................ 177

ndice .

VIII

4.12 RECONOCIMIENTO DE OBJETOS NUEVOS DE RATONES OF1

MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN SOJA .................................................... 179

4.13 COORDINACIN MOTORA DE RATONES OF1 MACHOS

ALIMENTADOS CON DIETA CON O SIN SOJA .............................................. 181

4.14 FUERZA DE AGARRE DE LOS MIEMBROS ANTERIORES DE

RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADO CON O SIN SOJA ....................... 182

5 DISCUSIN ............................................................................................. 183

5.1 JUSTIFICACIN DEL ESTUDIO ............................................................... 185

5.2 CONCENTRACIN DE ISOFLAVONAS EN PLASMA ..................... 187

5.3 PERFIL METABLICO ................................................................................. 188

5.4 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA LONGEVIDAD . 189

5.5 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA INGESTA DE

ALIMENTOS Y EL PESO CORPORAL .................................................................. 191

5.6 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE

PARMETROS DE ESTRS OXIDATIVO ........................................................... 193

5.6.1 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la produccin de H2O2 en

mitocondrias hepticas aisladas .................................................................................. 193

5.6.2 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la peroxidacin lipdica en


5.6.3 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la oxidacin proteica en


5.7 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE

ANTIOXIDANTES ENZIMTICOS ....................................................................... 197

5.7.1 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre los niveles del mRNA

niveles proteicos y actividad enzimtica de GPx .................................................... 197

5.7.2 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre los niveles del mRNA,

niveles proteicos y actividad enzimtica de MnSOD ............................................. 198

ndice

IX

5.8 EFECTO DE LA EDAD Y LA SOJA SOBRE EL CONSUMO

CEREBRAL DE GLUCOSA IN VIVO ..................................................................... 200

5.9 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA TOLERANCIA A

LA GLUCOSA Y LA FUNCIN HEPTICA ........................................................ 201

5.9.1 Efecto de la edad y la soja sobre la tolerancia a la glucosa ...................... 201

5.9.2 Efecto del consumo de soja sobre la funcin heptica ............................ 202

5.10 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA

MEMORIA Y EL APRENDIZAJE ............................................................................. 203

5.11 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA COORDINACIN

MOTORA Y FUERZA MUSCULAR ......................................................................... 204

5.12 LIMITACIONES DEL ESTUDIO ................................................................ 205

6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSSION .................................... 207

6.1 BACKGROUND AND JUSTIFICATION OF STUDY .......................... 209

6.2 PLASMA CONCENTRATION OF ISOFLAVONES .............................. 210

6.3 METABOLIC PROFILE BY NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE

(1H NMR) .......................................................................................................................... 213

6.4 THE EFFECT OF LIFELONG SOYA FEEDING ON LONGEVITY216

6.5 FOOD INTAKE AND BODY WEIGHT ................................................... 217

6.6 EFFECT OF AGING AND SOYA INTAKE ON OXIDATIVE

DAMAGE ......................................................................................................................... 220

6.6.1 Hydrogen peroxide production by isolated liver mitochondria .............. 221

6.6.2 Oxidative damage to macromolecules ........................................................ 223

6.7 EFFECT OF AGING AND SOYA INTAKE ON ANTIOXIDANT

DEFENSE......................................................................................................................... 229

6.7.1 Glutathione peroxidase .................................................................................. 230

6.7.2 Manganese superoxide dismutase ................................................................ 235

ndice .

X

6.8 EFFECT OF AGING AND SOYA CONSUMPTION ON GLUCOSE

UPTAKE BY THE BRAIN IN VIVO ....................................................................... 240

6.9 EFFECT OF SOYA ON GLUCOSE TOLERANCE AND HEPATIC

FUNCTION...................................................................................................................... 243

6.9.1 Oral glucose tolerance ................................................................................... 243

6.9.2 Hepatic function ............................................................................................. 245

6.10 BEHAVIORAL AND MOTOR FUNCTION TESTING........................ 246

6.10.1 Novel objects recognition ............................................................................. 246

6.10.2 Motor coordination and grip strength ........................................................ 247

6.11 LIMITATIONS OF THE STUDY ................................................................. 249

7 CONCLUSIONES ................................................................................... 251

7.1 CONCLUSIN GENERAL ........................................................................... 253

7.2 CONCLUSIONES ESPECFICAS ................................................................ 253

8 CONCLUSIONS ...................................................................................... 255

8.1 MAIN CONCLUSION ..................................................................................... 257

8.2 SPECIFIC CONCLUSIONS ........................................................................... 257

9 ANEXOS .................................................................................................. 259

9.1 ACRNIMOS Y ABREVIATURAS ............................................................. 261

10 BIBLIOGRAFA ...................................................................................... 265

NDICE DE TABLAS

ndice de tablas

XIII

1 INTRODUCCIN

Tabla 1.1.- Vida media de radicales libres. ............................................................................. 13

Tabla 1.2.- Especies activadas del oxgeno y nitrgeno. ..................................................... 14

Tabla 1.3.- Tipos de SOD y localizacin celular mayoritaria. ............................................ 34

Tabla 1.4.- Clasificacin y origen de los principales fitoestrgenos. ................................. 48

3 MATERIALES Y MTODOS

Tabla 3.1.- Composicin de las dietas. ................................................................................... 70

Tabla 3.2.- Resumen del procesamiento de los animales de la curva de longevidad. ..... 78

Tabla 3.3.- Reactivos utilizados para la realizacin de la recta patrn del nivel de

perxidos. .......................................................................................................................... 91

Tabla 3.4.- Descripcin de los anticuerpos utilizados para Western blotting. ................... 104

Tabla 3.5.- Secuencia de los oligos utilizados en la RT-PCR. .......................................... 115

Tabla 3.6.- Condiciones del termociclador para la RT-PCR. ........................................... 116

Tabla 3.7.- Recta estndar de la SOD. ................................................................................. 122

4 RESULTADOS

Tabla 4.1.1.- Concentracin de genistena, daidzena y equol en plasma de ratones

alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ............................................................. 143

Tabla 4.1.2.- Concentracin total de genistena, daidzena y equol en plasma de ratones

alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ............................................................. 144

6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSION

Table 6.1.1.- Concentration of isoflavones in plasma of male OF1 mice fed with soya-

free or soya-rich diet. ..................................................................................................... 211

Table 6.1.2.- Total concentration of isoflavones in plasma of male OF1 mice fed with

soya-free or soya-rich diet. ............................................................................................ 212

NDICE DE FIGURAS

ndice de figuras

XVII

1 INTRODUCCIN

Figura 1.1.- Modificada de CUTLER RG (1990). ................................................................... 4

Figura 1.2.- Perfil de supervivencia en distintas especies (Kaeberlein et al., 2001)............ 6

Figura 1.3.- Teoras del envejecimiento. Clasificacin (Vina et al., 2007a) ...................... 10

Figura 1.4.- Control de la longevidad por el estrs oxidativo mitocondrial (Sastre et al.,

2003). .................................................................................................................................. 25

Figura 1.5.- Esquema de la cadena de transporte electrnico mitocondrial. ................... 28

Figura 1.6.- Control respiratorio mitocondrial. .................................................................... 30

Figura 1.7.- Estructura bsica de los flavonoides. ................................................................ 37

Figura 1.8.- Distribucin de receptores estrognicos (Setchell et al., 1999). ................... 40

Figura 1.9- Mecanismo de accin propuesto por Borrs et al (Borras et al., 2005). ....... 42

Figura 1.10- Efectos beneficiosos y perjudiciales de los estrgenos. ................................ 44

Figura 1.11.- Modulador selectivo ideal del receptor estrognico. .................................... 46

Figura 1.12.- Similitud estructural entre el 17-estradiol y la isoflavona genistena. ...... 48

Figura 1.13.- Estructura qumica de las tres principales isoflavonas y sus conjugados. . 54

Figura 1.14.- Mecanismo de sobre-expresin de genes antioxidantes por fitoestrgenos.

............................................................................................................................................. 57

3 MATERIALES Y MTODOS

Figura 3.1.- Esquema de deteccin de perxido de hidrgeno. ......................................... 88

Figura 3.2.- Esquema de western blotting. ............................................................................... 103

Figura 3.3.- Modelo de amplificacin de PCR a tiempo real. ........................................... 114

Figura 3.4.- Esquema del ensayo Superxido Dismutasa. ................................................ 120

Figura 3.5.- Molcula de 18F-FDG y esquema de su consumo en la clula. .................. 124

Figura 3.6.- Esquema de deteccin de coincidencias por el equipo PET-CT Albira ARS.

........................................................................................................................................... 125

Figura 3.7.- Test de reconocimiento de objetos nuevos. .................................................. 130

Figura 3.8.- Coordinacin motora. ....................................................................................... 132

Figura 3.9.- Test de fuerza de agarre. ................................................................................... 134

ndice de figuras .

XVIII

4 RESULTADOS

Figura 4.1.- Curva de longevidad de ratones OF1 machos alimentados con dieta rica en

soja o sin soja. ................................................................................................................. 141

Figura 4.2.1.- Puntuaciones del PCA realizado para comparar el metaboloma del plasma

de ratones alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ......................................... 146

Figura 4.2.2.- Puntuaciones del PCA realizado para comparar el metaboloma de las

mitocondrias hepticas de ratones alimentados con dieta rica en soja o sin soja. 147

Figura 4.3.- Diferencias en la ingesta semanal de ratones que consumen dieta rica en

soja o sin soja. ................................................................................................................. 148

Figura 4.4.- Diferencias en el peso de los ratones alimentados con o sin soja. ............. 149

Figura 4.5.1.- Produccin de perxido de hidrgeno en mitocondrias aisladas de hgado

de ratones alimentados con dieta sin soja. ................................................................. 151


de ratones alimentados con dieta rica en soja. ........................................................... 151


de ratones alimentados con y sin soja. ........................................................................ 152

Figura 4.6.1.- Niveles de MDA en mitocondrias aisladas de hgado de ratones

alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 153


alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 154


alimentados con y sin soja............................................................................................. 155

Figura 4.7.1.- Protenas carboniladas en mitocondrias aisladas de hgado de ratones





alimentados con y sin soja............................................................................................. 158

ndice de figuras

XIX

Figura 4.8.1. a.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.1. b.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.1. c.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos. .... 161

Figura 4.8.2. a.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.2. b.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.2. c.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos

alimentados con o sin soja. ........................................................................................... 163

Figura 4.8.3. a.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.3. b.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.3. c.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos

alimentados con o sin soja. ........................................................................................... 165

Figura 4.8.4. a.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.4. b.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.4. c.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos.

........................................................................................................................................... 168

Figura 4.8.5. a.- Niveles de la protena MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.5. b.- Niveles de la protena MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.5. c.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos.

........................................................................................................................................... 170

ndice de figuras .

XX

Figura 4.8.6. a.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.6. b.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos


Figura 4.8.6. c.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos

alimentados con o sin soja ............................................................................................ 172

Figura 4.9.1.- Consumo cerebral de glucosa in vivo de ratones OF1 machos alimentados

con dieta sin soja. ........................................................................................................... 174


con dieta rica en soja. ..................................................................................................... 175


con o sin soja. ................................................................................................................. 175

Figura 4.10.1.- Test de Tolerancia a la Glucosa Oral en ratones OF1 machos

alimentados con dieta rica o sin soja. .......................................................................... 176

Figura 4.10.2.- Test de Tolerancia a la Glucosa Oral en ratones OF1 machos


Figura 4.11.- Tiempo de parlisis muscular con Zoxazolamina de ratones OF1 machos


Figura 4.12.1.- Reconocimiento de objetos nuevos a la hora. .......................................... 180

Figura 4.12.2.- Reconocimiento de objetos nuevos a las 24 horas. ................................. 180

Figura 4.13.- Coordinacin motora de ratones OF1 machos alimentados con o sin soja.

........................................................................................................................................... 181

Figura 4.14.- Test de fuerza de agarre de los miembros anteriores. ................................ 182

ndice de figuras

XXI

6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSION

Figure 6.1.1.- Scores plot for the Principal Components Analysis of NMR spectra of

plasma of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. ............................. 214

Figure 6.1.2.- Scores plot for the Principal Components Analysis of NMR spectra of

hepatic mitochondria of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. .... 215

Figure 6.2.- The survival curve of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet.

........................................................................................................................................... 216

Figure 6.3.- Differences in weekly food intake between male OF1 mice fed with soya-


Figure 6.4.- Differences in body weight between male OF1 mice fed with soya-free or

soya-rich diet. .................................................................................................................. 219

Figure 6.5.1.- Hydrogen peroxide production in isolated mitochondria from liver of

male OF1 mice fed with soya-free diet. ...................................................................... 222


male OF1 mice fed with soya-rich diet. ...................................................................... 222


male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. ................................................ 223

Figure 6.6.1.- Lipid peroxidation levels (MDA) in hepatic mitochondria from male OF1

mice fed with soya-free diet. ......................................................................................... 225


mice fed with soya-rich diet. ......................................................................................... 225


mice fed with soya-free or soya-rich diet. ................................................................... 226

Figure 6.7.1.- Protein carbonylation in hepatic mitochondria from male OF1 mice fed

with soya-free diet. ......................................................................................................... 227


with soya-rich diet. ......................................................................................................... 227


with soya-free or soya-rich diet. ................................................................................... 228

ndice de figuras .

XXII

Figure 6.8.1. a.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free diet.

........................................................................................................................................... 230

Figure 6.8.1. b.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-rich diet.

........................................................................................................................................... 231

Figure 6.8.1. c.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free or

soya-rich diet. .................................................................................................................. 233

Figure 6.8.2. a.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free

diet. ................................................................................................................................... 231

Figure 6.8.2. b.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-

rich diet. ........................................................................................................................... 232

Figure 6.8.2. c.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free

or soya-rich diet. ............................................................................................................. 234

Figure 6.8.3. a.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free

diet. ................................................................................................................................... 232

Figure 6.8.3. b.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-rich

diet. ................................................................................................................................... 233

Figure 6.8.3. c.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free

or soya-rich diet. ............................................................................................................. 234

Figure 6.8.4. a.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-free

diet. ................................................................................................................................... 235

Figure 6.8.4. b.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-rich

diet. ................................................................................................................................... 236

Figure 6.8.4. c.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-free

or soya-rich diet. ............................................................................................................. 236

Figure 6.8.5. a.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with

soya-free diet. .................................................................................................................. 237

Figure 6.8.5. b.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with

soya-rich diet. .................................................................................................................. 237

Figure 6.8.5. c.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with

soya-free or soya-rich diet. ............................................................................................ 239

ndice de figuras

XXIII

Figure 6.8.6. a.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-

free diet. ........................................................................................................................... 238

Figure 6.8.6. b.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with

soya-rich diet. .................................................................................................................. 238

Figure 6.8.6. c.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-


Figure 6.9.1.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-free diet. . 241

Figure 6.9.2.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-rich diet. . 241

Figure 6.9.3.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-free or soya-

rich diet. ........................................................................................................................... 242

Figure 6.10.1.- Blood glucose curves during OGTT in male OF1 mice fed with soya-

free and soya-rich diet, at 50% survival. ..................................................................... 244

Figure 6.10.2.- Blood glucose curves during OGTT in male OF1 mice fed with soya-

free and soya-rich diet, at 10% survival. ..................................................................... 244

Figure 6.11.- Time of recovery from the muscular paralysis male OF1 mice fed with

soya-free and soya-rich diet. ......................................................................................... 245

Figure 6.12.1.- Percentage of visits in NOR test after 1 hour. ......................................... 246

Figure 6.12.2.- Percentage of visits in NOR test after 24 hours. ..................................... 247

Figure 6.13.- Muscular coordination in male OF1 mice fed soya-free diet o soya-rich

diet. ................................................................................................................................... 248

Figure 6.14.- Grip strength in male OF1 mice fed soya-free diet o soya-rich diet. ...... 248

INTRODUCCIN1

Introduccin

Kheira Mohamed Abdelaziz 3

1.1 LONGEVIDAD

El trmino longevidad hace referencia a la esperanza de vida que tienen

los individuos de una determinada especie al nacer. ste incluye dos conceptos

diferentes: longevidad media y longevidad mxima (Lopez-Torres et al., 1991).

La longevidad media corresponde a un dato estadstico en el cual el 50% de la

poblacin permanece viva y la longevidad mxima corresponde a la edad del

individuo ms longevo de dicha especie.

Si nos referimos a la especie humana vemos que, mientras la longevidad

mxima ha permanecido sustancialmente sin cambio durante los ltimos

100.000 aos (en~125 aos), la longevidad media ha aumentado sensiblemente

(~27 aos a lo largo del siglo pasado) especialmente en los pases occidentales

(Hayflick 2000). Este aumento en la vida media, figura 1.1, se debe

principalmente, a los hbitos saludables, la adecuada nutricin e higiene, el

diagnostico precoz de enfermedades y el descubrimiento de los antibiticos y las

vacunas (Hayflick 2000).

Como consecuencia de ello se ha producido un crecimiento del

segmento poblacional de avanzada edad, hecho por el que cobran gran

importancia actual las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad

de Alzheimer, los cnceres, la aterosclerosis, y en general, todas aquellas

enfermedades que afectan con ms probabilidad a este sector de la poblacin.

Introduccin -

4 Tesis Doctoral

Figura 1.1.- Modificada de CUTLER RG (1990).

En este sentido, desde que el hombre es consciente de su evolucin ha

intentado prolongar su vida e incluso inmortalizarla. Sin embargo, una vez

desechada la quimera de la inmortalidad, se ha centrado en el objetivo de

incrementar su supervivencia con mejores condiciones fsicas y mentales.

Hasta la actualidad, existen tres regmenes conocidos que pueden

incrementar la expectativa de vida animal: (1) disminucin de la temperatura

ambiente en poiquilotermos (animales de sangre fra) y mamferos que hibernan

y (2) una disminucin de la actividad fsica en los poiquilotermos, ambos

disminuyen la tasa metablica, y (3) la restriccin calrica (Sohal et al., 1996; Lee

et al., 1999). De modo que un descenso de un 10% de la temperatura ambiente,

o bien la eliminacin de la capacidad de vuelo en la mosca comn, incrementan

la expectativa de vida en un 2.5 veces (Farmer et al., 1987). Ambas

modificaciones consiguen rebajar el consumo metablico y se acompaan de un

descenso en la produccin de radicales libres y del dao oxidativo que puedan

sufrir las protenas y el DNA.

Introduccin


Respecto a la restriccin calrica, ya en 1934, McCay y colaboradores,

revisado por Swan en 1997 (Swan 1997), describen este fenmeno. Ms

recientemente, Weindruch y Walford en 1982 descubren que se puede aumentar

la longevidad mxima con una restriccin calrica que no necesariamente debe

darse desde el nacimiento, sino que puede comenzar tardamente en la vida,

siempre y cuando no llegue a la desnutricin, mantenindose unos niveles

adecuados de vitaminas, minerales y protenas (Weindruch et al., 1982; Colman

et al., 2009). Los animales sometidos a la restriccin calrica, siempre y cuando

no presenten ningn dficit en macro ni micronutrientes, ven incrementada su

supervivencia hasta en un 50% en ratones, y en primates produce una reduccin

de la temperatura corporal y del gasto energtico (Walford et al., 1995;

Weindruch 1996b; Bordone et al., 2005). La restriccin calrica tambin podra

reducir la incidencia de enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo

diabetes, cncer, enfermedades cardiovasculares, atrofia cerebral, deficiencias

inmunitarias en los monos Rhesus (Roth et al., 2004; Colman et al., 2009).

Un estudio reciente realizado por el grupo de Rafael de Cabo rechaza el

efecto beneficioso de la restriccin calrica sobre la longevidad, al menos en

monos Rhesus. No obstante, s destaca sus efectos positivos sobre parmetros

asociados con enfermedades tpicas del envejecimiento, como las metablicas

(diabetes, obesidad), las cardiovasculares y el cncer (Mattison et al., 2012).

Posibles razones de la variacin en el efecto de la restriccin calrica

sobre la longevidad de los monos son la composicin de la dieta y la gentica de

los monos estudiados (Mattison et al., 2012).

Los investigadores que estudian la restriccin calrica en ratones se han

acostumbrado a resultados contradictorios, que atribuyen a la diversidad

gentica entre las cepas (Harper et al., 2006).

As, cabe destacar que existen factores intrnsecos y extrnsecos que

pueden afectar a las diferentes longevidades entre individuos. De modo que los

factores extrnsecos afectaran principalmente a la vida media, por ejemplo un

hbito de vida saludable est correlacionado con una mayor probabilidad de

Introduccin -

6 Tesis Doctoral

supervivencia. Sin embargo, en la vida mxima estn ms implicados los factores

intrnsecos, eso lo podemos observar en la figura 1.2 que representa la

supervivencia como un parmetro especfico de cada especie, en el que

claramente existe una implicacin gentica que explicara las diferentes tasas de

supervivencia.

Figura 1.2.- Perfil de supervivencia en distintas especies (Kaeberlein et al., 2001).

Incluso, dentro de la misma especie el factor gentico es el que

condiciona la respuesta del individuo frente a las influencias exgenas,

conduciendo a una mayor predisposicin frente a patologas y finalmente la

muerte, determinando as la longevidad del individuo (Ginaldi et al., 2000). De

ah la idea de que la alteracin de la homeostasia en el organismo envejecido es

una consecuencia gentica.

No obstante, aunque en un principio el componente gentico recibi la

mayor atencin en las diferencias de longevidad entre individuos (Begun et al.,

2000), los mecanismos epigenticos han emergido contribuyendo claramente a

Hombre Ratn

Gusano LevaduraDas Generacin

Das Das

Su

per

vive

nci

a (%

)

Su

per

vive

nci

a (%

)S

up

ervi

ven

cia

(%)

Su

per

vive

nci

a (%

)

Introduccin


las alteraciones de la estructura y funcin del genoma que acompaan al

envejecimiento (Gonzalo 2010).

En nuestro laboratorio observamos que las hembras en muchas especies,

como ratas o humanos, viven ms que los machos debido a que el estrgeno

induce la sobre-expresin de genes asociados a la longevidad (Vina et al.,

2005b).

1.2 EL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO

1.2.1 Concepto de envejecimiento

Hasta el momento no existe una definicin nica ampliamente aceptada

para este trmino. Denham Harman (Harman 1981) lo define como la

acumulacin de diversos cambios deletreos que ocurren en las clulas y los

tejidos con la edad avanzada que son responsables del aumento del riesgo de la

enfermedad y la muerte. Las principales teoras del envejecimiento son

especficas de una causa en particular, proporcionando informacin til e

importante para la comprensin de los cambios fisiolgicos relacionados con la

edad. Sin embargo, una visin global de ellas es necesaria al debate de un

proceso que todava est oscuro en algunos de sus aspectos. En este contexto, la

bsqueda de una nica causa del envejecimiento ha sido sustituida por el punto

de vista del envejecimiento como un proceso extremadamente complejo y

multifactorial. Por lo tanto, las diferentes teoras del envejecimiento no deben

considerarse como mutuamente excluyentes, sino complementarias entre s en la

explicacin de algunas o todas las caractersticas del proceso normal de

envejecimiento.

Segn Bernard Strehler (Strehler 1985), reconocido gerontlogo

americano, el envejecimiento normal se define a travs de cuatro postulados:

Introduccin -

8 Tesis Doctoral

El envejecimiento es universal, es decir, un fenmeno dado asociado al

proceso de envejecimiento debe darse en menor o mayor medida en todos

los individuos de una especie.

El envejecimiento es intrnseco, es decir, las causas que lo provocan

deben de ser de origen endgeno, no dependiendo de factores externos o

de origen ambiental.

El envejecimiento es progresivo, los cambios que conducen a envejecer

se dan de manera paulatina a lo largo de la vida.

El envejecimiento es deletreo, es decir que un determinado fenmeno

slo se considerar parte del proceso de envejecer si es daino.

Antes de examinar los factores biolgicos en la hiptesis de base del

proceso de envejecimiento, es fundamental subrayar que el envejecimiento no es

una enfermedad. Con base en este supuesto, Hayflick estima que una posible

cura de las principales causas de muerte en la tercera edad (como son,

enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares, cncer) slo

llevara a un aumento de 15 aos de la esperanza de vida humana (Hayflick

2000). Por lo tanto, incluso en esta condicin hipottica, no vamos a ser

inmortales, pero tal vez seremos capaces de experimentar cmo la muerte se

produce en ausencia de la enfermedad. Debido a que el envejecimiento se asocia

negativamente con la capacidad de responder al estrs, y positivamente

relacionado con el desequilibrio homeosttico y la incidencia de la patologa, la

muerte sigue siendo la ltima consecuencia del envejecimiento (Kowald et al.,

1996).

La idea de que envejecer requiere tratamiento se basa en la creencia de

que ser viejo no es deseable. En las ltimas dcadas, el envejecimiento ha

recibido una connotacin negativa y convertida en sinnimo de deterioro,

acercndose a la patologa, y la muerte. Si nuestra sociedad aprendiese a valorar

la vejez a la misma medida que llevan a cabo actualmente para la juventud, la

Introduccin


investigacin dirigida a frenar, detener o revertir el proceso de envejecimiento

sera tan impensable como la intervencin en los procesos de desarrollo de la

juventud. En su lugar, lo que es deseable y posible demostrar en todo momento

en la vida, es la prevencin o resolucin de la patologa (Hayflick 2004).

1.2.2 Consecuencias del envejecimiento

El proceso de envejecimiento se acompaa de una disminucin de la

capacidad para mantener la homeostasis con una prdida progresiva de

rendimiento de cada uno de los rganos, aparatos y sistemas, provocando una

mayor vulnerabilidad, que conlleva finalmente al fallecimiento del organismo

(Hayflick 1998; de Magalhaes 2005).

Por ejemplo, la mayora de los rganos vitales van a sufrir fenmenos de

atrofia o degeneracin. Esto es ms notable en aquellos rganos compuestos

por clulas postmitticas como son las neuronas, clulas miocrdicas,

musculares o las del parnquima renal (Terman et al., 2010). Adems se da una

degradacin con la edad de los materiales que se encuentran entre las clulas.

Esto ocurre debido al descenso en el nmero de fibras de elastina o al

entrecruzamiento de las fibras de colgeno en la dermis (Naylor et al., 2011).

Tambin se puede apreciar asociado al envejecimiento, un aumento en la

sensibilidad a los traumatismos, las infecciones y muchas formas de estrs, as

como un funcionamiento deteriorado del sistema inmunitario que da lugar a

enfermedades autoinmunes o amiloidosis (Alonso-Fernandez et al., 2011).

En definitiva, se dan ms casos de cncer y de enfermedades

degenerativas en ancianos, que son la mayor causa de muerte y de prdida de

una buena calidad de vida (Gilad et al., 1995).

Introduccin -

10 Tesis Doctoral

1.3 TEORAS DEL ENVEJECIMIENTO

Hay muchas teoras que tratan de explicar el complejo proceso de

envejecimiento (ver Figura 1.3) (Vina et al., 2007a). En 1990, Medvedev

(Medvedev 1990), en una excelente revisin indic que haba ms de 300 teoras

del envejecimiento y el nmero va en aumento. En dicha revisin, Medvedev

afirmaba lo siguiente: casi cada descubrimiento importante en biologa celular y

molecular ha dado lugar a una nueva familia de teoras del envejecimiento o

nuevas versiones avanzadas de teoras ms antiguas.

Figura 1.3.- Teoras del envejecimiento. Clasificacin (Vina et al., 2007a)

Sin embargo, ninguna ha sido generalmente aceptada por los

gerontlogos. Por lo contrario, estn de acuerdo con la conclusin de Medvedev

de que no es realista la expectativa de que surja una teora verdaderamente

unificada, o causa nica del envejecimiento (Medvedev 1990).

MUTACIN

GENTICA

ACUMULACIN

DE PRODUCTOS

DE DESECHO

DESGASTE

Teoras Evolutivas

Inmunologa

Regulacin Circadiana

Errores Catastrficos

Telmeros y Hayflick

Resistencia a la Insulina

Teora de Radicales

Libres

Acumulacin de Productos de Desecho

Teora Pleiotrpica Antagnica

Glicacin Avanzada

Introduccin


As, la actual investigacin gerontolgica incluye desde el anlisis de las

curvas de supervivencia de las poblaciones y la prdida de rendimiento de los

sistemas fisiolgicos hasta un creciente inters en los mecanismos del control

gentico del envejecimiento y su relacin con la longevidad.

El desarrollo de la presente tesis, se sustenta principalmente en la Teora

de envejecimiento por los Radicales Libres, por ello nos centraremos en la

misma.

1.4 TEORA DE LOS RADICALES LIBRES EN EL

ENVEJECIMIENTO

La Teora de los Radicales Libres enunciada por Denham Harman en

1956 (Harman 1956), propone que los radicales libres derivados de oxgeno son

los responsables del dao oxidativo que se produce con la edad a nivel celular y

tisular. Los sistemas antioxidantes no son capaces de hacer frente a todas las

especies reactivas de oxgeno que se generan continuamente a lo largo de la vida

de la clula, lo que acaba provocando un dao oxidativo en ella, y por extensin

sobre los tejidos.

En su interpretacin ms estricta, esta teora predice que una reduccin

del estrs oxidativo, sea mediante la reduccin de la carga prooxidante o el

aumento de las defensas antioxidantes, o alguna combinacin de ambas,

deberan aumentar la vida til (Salmon et al., 2010).

Existen muchas pruebas experimentales a favor de esta teora. Los

animales viejos presentan mayores ndices de oxidacin (se acumulan protenas

oxidadas, formas oxidadas del DNA y de lpidos) que los jvenes (Stadtman

1992; Sohal et al., 1993; Hamilton et al., 2001; Bokov et al., 2004). En principio,

esto podra atribuirse a una tasa mayor de radicales libres generados por los

organismos viejos.

Introduccin -

12 Tesis Doctoral

Tambin, a favor de esta teora son los descubrimientos de numerosos

estudios realizados en diversos organismos, que sugieren que la reduccin del

estrs oxidativo o el aumento de la resistencia al mismo, estn relacionados con

la prolongacin de la vida (Harman 1978; Miquel et al., 1979; Harrington et al.,

1988; Phillips et al., 1989; Orr et al., 1994; Parkes et al., 1998; Finkel et al., 2000;

Melov et al., 2000; Ruan et al., 2002; Ishii et al., 2004; Huang et al., 2006; Zou et

al., 2007; Kim et al., 2008; Quick et al., 2008; Dai et al., 2009; Shibamura et al.,

2009).

A pesar de que la teora de radicales libres est dentro de las ms

estudiadas y aceptadas de todas las hiptesis del mecanismo de envejecimiento,

varios estudios han generado ambigedad y controversia de la misma (Muller et

al., 2007; Perez et al., 2009a; Perez et al., 2009b; Lapointe et al., 2010; Salmon et

al., 2010). Por ejemplo, la gran mayora de los estudios en ratones no muestran

ningn cambio en la vida til despus del incremento o reduccin de enzima

antioxidante (Huang et al., 2000; Perez et al., 2009b). Tampoco ha sido

demostrado que prolongue la vida en ensayos clnicos en humanos, a los que se

les administraba sustancias antioxidantes (Howes 2006; Bjelakovic et al., 2007)

Para entender la Teora de los Radicales Libres en el Envejecimiento

pasamos, a continuacin, a definir algunos conceptos y trminos bsicos.

1.4.1 Radicales libres

1.4.1.1 Concepto y origen de radical libre

Radical libre es aquella especie qumica que contiene uno o ms

electrones desapareados en su capa de valencia (Halliwell et al., 1989), esto hace

que estas especies presenten una gran reactividad. Se caracterizan por su gran

poder oxidante y porque su vida media es normalmente muy corta. La tabla 1.1

muestra ejemplos de la vida media de algunos radicales libres.

Introduccin


Tabla 1.1.- Vida media de radicales libres.

Estas especies qumicas son abundantes en los sistemas vivos. Es ms,

algunos autores, como Denham Harman en su estudio sobre el origen y

evolucin de la vida, proponen a los radicales libres como una de las causas del

origen de la vida en nuestro planeta (Harman 2001).

En la naturaleza los radicales libres son mayoritariamente compuestos

derivados del oxgeno y se denominan especies reactivas del oxgeno (ROS).

Aunque tambin existen otras especies radicales no derivadas del oxgeno que

ests tomando inters en los ltimos aos, como las derivadas del nitrgeno

(RNS).

El oxgeno, por una parte da origen a la vida y por otra, por su capacidad

de formar distintos radicales libres, es capaz de daar estructuras esenciales para

el desarrollo de sta, tales como DNA, protenas, carbohidratos y lpidos (Sies

1983; Gutteridge 1995; Dean et al., 1997; Cadenas et al., 1998). Adems, los

radicales libres intervienen en procesos fisiopatolgicos como la diabetes y

algunos tipos de cncer (Takada et al., 1982; Okamoto 1985; Klaunig et al.,

2004). Tambin intervienen en procesos fisiolgicos como el envejecimiento

(Harman 1956) y el ejercicio fsico agotador (Davies et al., 1982; Sastre et al.,

1992).

El oxgeno diatmico es una forma muy abundante en la naturaleza

debido a que es una molcula estable. Sin embargo, existe un gran nmero de

especies derivadas del oxgeno que, o bien son muy reactivas, o bien son capaces

Radical Sustrato Concentracin Vida media (a 37C)

HO

LHC 1 M 10

-9 seg.

RO LH 100 mM 10

-6 seg.

ROO LH 1 mM 7 seg.

L O2 20 M 10

-8 seg.

Q- - Das

Introduccin -

14 Tesis Doctoral

de dar lugar a especies reactivas (ver Tabla 1.2). Algunas de estas especies son

autnticos radicales libres derivados del oxgeno, como el radical hidroxilo.

Otras como el perxido de hidrgeno, no son en realidad radicales.

Tabla 1.2.- Especies activadas del oxgeno y nitrgeno.

Tal y como veremos a continuacin, las especies clave en la

fisiopatologa del oxgeno y de los radicales libres son el mismo oxgeno, el

radical superxido, el perxido de hidrgeno, los iones de metales de transicin

y el radical hidroxilo, entre otros. ste ltimo es producto de formacin de una

multitud de reacciones en las que participan los cuatro primeros compuestos

mencionados.

1.4.1.2 Clases de radicales libres

Como se ha mencionado antes, existen muchas clases de radicales libres,

tanto especies reactivas derivadas del oxgeno (ROS) como las especies reactivas

del nitrgeno (RNS). Algunos de los radicales libres ms importantes son:

Anin superxido (O2-)

Radical hidroxilo (OH)

Especie Smbolo

Radical superxido O2-

Radical hidroperxido HO2

Perxido de hidrgeno H2O2

Radical hidroxilo HO

Radical alxido RO

Radical peroxilo ROO

xido ntrico NO

Dixido de nitrgeno NO2

Introduccin


Radical peroxilo (ROO)

Oxgeno singlete (1O2)

xido ntrico (NO)

Dixido de nitrgeno (NO2)

Radicales de tomos derivados de carbono (R)

Radicales de tomos derivados de azufre (RS)

Dada su relacin con la presente tesis slo destacar a los dos primeros y

al perxido de hidrgeno que aunque no sea radial libre s es especie reactiva de

oxgeno.

a) Anin superxido (O2-)

Estado de reduccin del oxgeno de un electrn, formado en reacciones

catalizadas enzimticamente, como producto en las reacciones de las

deshidrogenasas flavoprotenicas: xantina oxidasa, aldehdo oxidasa, purina

oxidasa, etc. (Korycka-Dahi et al., 1981), en las oxidasas e hidroxilasas (diamino

oxidasa, galactosa oxidasa, citocromo p450, etc.), tambin en reacciones no

enzimticas del oxgeno con la cistena (Via et al., 1983) o la riboflavina

(Barton et al., 1970). Asimismo en la cadena respiratoria mitocondrial (Boveris

et al., 1972), siendo potencialmente txico, ya que puede iniciar reacciones que

den lugar a otros intermediarios a su vez muy reactivos.

Se ha estimado que una clula del cuerpo humano produce alrededor de

unas 1010 molculas de anin superxido por da (Ames et al., 1993). Sin

embargo, el 99% de las molculas que se producen se dismutan hacia perxido

de hidrgeno (Cheeseman et al., 1993).

2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2

Introduccin -

16 Tesis Doctoral

b) Radical hidroxilo (OH)

Estado de reduccin de tres electrones de la molcula de oxgeno. Es la

especie ms reactiva con una vida media estimada de alrededor de 109 s

(Liochev et al., 1994). Puede generarse in vivo como consecuencia de radiaciones

de alta energa (rayos X, rayos ) que puede provocar rotura homoltica del agua

corporal. La luz UV no tiene suficiente energa como para escindir una molcula

de agua, pero puede dividir el agua oxigenada en 2 molculas de radical

hidroxilo. Otro proceso todava ms importante en la formacin del radical

hidroxilo es la llamada reaccin de Fenton (Fenton 1894).

H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH

Tambin a partir de agua oxigenada y del radical superxido puede

formarse el radical hidroxilo, por la reaccin de Haber-Weiss (Haber et al.,

1934).

H2O2 + O2- O2 + OH

- + OH

Esta reaccin es catalizada por metales como hierro o cobre.

c) Perxido de hidrgeno (H2O2)

El perxido de hidrgeno no es un radical libre como tal, pues no posee

electrones desapareados en su capa de valencia. Es la forma menos activa de las

especies reactivas del oxgeno. Su importancia recae en el hecho de que atraviesa

fcilmente las membranas biolgicas, con lo que puede dar lugar a reacciones de

oxidacin en puntos de la clula ms alejados de su lugar de produccin.

Se puede originar a partir de diversas fuentes:

Introduccin


Por reduccin directa de una molcula de oxgeno por dos

electrones (Sawyer 1988; Fridovich 1997).

2 O2 + 2 e - + 2 H+ H2O2

Por dismutacin del O2- (Cheeseman et al., 1993; Frei 1994).

Como producto de algunas enzimas (glucosa oxidasa,

uricasa, etc.) (Fridovich 1986).

Por reacciones qumicas de autooxidacin (Korycka-Dahi et

al., 1981).

La detoxificacin del perxido de hidrgeno se lleva a cabo por accin

de la catalasa (con formacin de agua), un proceso que determina su vida media.

Por otro lado, parece que el H2O2 est implicado en la regulacin de la

transduccin de la seal de expresin de genes a travs del NFB y AP-1.

Ambos son factores de transcripcin capaces de inducir la transcripcin de

genes tales como el de la manganeso superxido dismutasa (MnSOD) (Yi et al.,

2002), interleukina 2 (IL-2), factor de necrosis tumoral (TNF-), antgenos del

complejo mayor de histocompatibilidad y c-fos (Schreck et al., 1994).

1.4.2 Gnesis de ROS

Las especies reactivas de oxgeno pueden producirse de forma endgena

o exgena (Freeman et al., 1982; Frei 1994).

Algunas de ellas surgen como accidentes qumicos, es decir, reacciones

secundarias no deseadas entre las biomolculas o en la detoxificacin de

xenobiticos, pero otras especies activadas de oxgeno se generan in vivo con un

fin determinado, como en el caso de los fagocitos activados, que producen O2-

y H2O2 (Halliwell 1991).

Introduccin -

18 Tesis Doctoral

La va exgena incluye a los radicales libres procedentes de fuentes

externas tales como la dieta (en la que son ingeridos muchos compuestos de

naturaleza prooxidante), xenobiticos, el ozono, el humo del tabaco, la polucin

ambiental, iones, metales y radiacin. (Ames 1983; Cadenas 1989; Valko et al.,

2006).

Mientras que la va endgena incluye la reaccin de Fenton-Haber-

Weiss, microsomas o peroxisomas, la membrana plasmtica, enzimas solubles y

protenas, los sistemas de transporte electrnico del retculo endoplsmico,

metabolismo del citocromo P450, activacin de clulas inflamatorias y la cadena

de transporte electrnico mitocondrial (Inoue et al., 2003).

La cadena de transporte electrnico mitocondrial es una de las

principales fuentes generadoras de radicales libres en el interior de la clula. Est

compuesta por una serie de protenas con capacidad redox que reducen al

oxgeno molecular hasta la formacin de una molcula de agua. Esta reaccin

est acoplada a la fosforilacin oxidativa, en la cual se produce energa en forma

de ATP.

Este sistema enzimtico se comentar detalladamente en el captulo 1.5

de la introduccin de la presente tesis.

1.4.3 Estrs oxidativo

1.4.3.1 Concepto

El estrs oxidativo se define como una alteracin del equilibrio entre las

especies prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras (Sies 1985).

A pesar del papel fisiolgico que desempean algunas especies activadas

de oxgeno, tambin pueden dar lugar a reacciones de oxidacin indeseadas,

contra las cuales los organismos han tenido que desarrollar defensas

antioxidantes (Halliwell 1996).

Introduccin


La formacin de cierta tasa de radicales libres es un proceso normal e

inevitable, ya que son producto de infinidad de reacciones qumicas

imprescindibles para la vida celular (Slater 1984). Estas especies tan reactivas, no

causan dao oxidativo en condiciones normales debido a que la clula est

provista de gran cantidad de mecanismos antioxidantes.

As pues, el estrs oxidativo puede originarse por un exceso de

sustancias prooxidantes, una deficiencia de agentes antioxidantes, o por ambos

factores a la vez.

Como consecuencia de lo mencionado anteriormente, se sabe que el

estrs oxidativo conlleva consigo daos a las biomolculas, principalmente

lpidos, protenas y DNA (Bokov et al., 2004).

1.4.3.2 Estrs oxidativo y dao a biomolculas

a) Dao oxidativo a lpidos

Los lpidos son el componente principal de las membranas biolgicas y

pueden influir en muchos procesos biolgicos que afectan a la supervivencia

celular.

El dao oxidativo a lpidos puede ocurrir directamente a travs de la

reaccin directa con ROS o indirectamente por la interaccin con aldehdos

reactivos.

Los lpidos, y sobre todo los cidos grasos poliinsaturados, son los ms

susceptibles de ser atacados por radicales libres (Cheeseman et al., 1993), siendo

el radical hidroxilo (HO), el perxido (ROO), el alcoxilo (RO) y el alqulico

(R) los principales generadores de dao oxidativo a lpidos.

El proceso de ataque oxidativo a lpidos, denominado peroxidacin

lipdica, comienza cuando un radical libre ataca a un carbono de la cadena

aliftica de un cido graso, se desprende un tomo de hidrgeno, y se forma un

radical alqulico (Halliwell 1994; Krinsky 1994). Esta reaccin se produce

Introduccin -

20 Tesis Doctoral

preferentemente en los carbonos contiguos a enlaces dobles de los cidos grasos

poliinsaturados, ya que los radicales formados se pueden estabilizar por

resonancia con el enlace doble. Los radicales perxido pueden reaccionar con

cadenas laterales de otros cidos grasos poliinsaturados, con lo que se propaga la

reaccin en cadena radicalaria (Halliwell 1994).

De esta manera, un slo ataque por un radical libre da lugar a la

formacin de un gran nmero de productos de oxidacin, sobre todo aldehdos

como malondialdehdo y 4-hidroxinonenal, e hidrocarburos de cadena corta

como etano y pentano (Freeman et al., 1982; Halliwell 1991; Cheeseman et al.,

1993; Halliwell 1994). Muchos de los aldehdos formados reaccionan

rpidamente con los componentes celulares, con lo que causan mutaciones en el

DNA, y producen daos estructurales y funcionales al reaccionar con protenas

(Krinsky 1994). La peroxidacin lipdica se considera un factor muy importante

en el envejecimiento de clulas aerbicas y en la disminucin de la fluidez de las

membranas celulares (Lippman 1985; Shigenaga et al., 1994; Spiteller 2002).

En una revisin realizada por Hulbert y colaboradores, observan un

incremento de la peroxidacin lipdica con la edad y la susceptibilidad de los

lpidos a la peroxidacin en relacin con la composicin de la membrana en

varias especies de vertebrados (Hulbert et al., 2007).

b) Dao oxidativo a protenas

Las protenas llevan a cabo importantes funciones biolgicas y son las

macromolculas ms abundantes presentes en las clulas. La oxidacin de

protenas por ROS u otras especies reactivas, conduce a la fragmentacin de las

cadenas polipeptdicas, oxidacin de cadenas laterales de aminocidos, y/o

generacin de enlaces cruzados protena-protena (Stadtman 2006).

Se calcula que casi un tercio de las protenas celulares, tanto enzimas

como protenas estructurales, de los animales viejos son disfuncionales como

consecuencia del dao oxidativo (Poon et al., 2004).

Introduccin


Por ello, la estimacin de la oxidacin proteica, ligada a una variedad de

modificaciones en los aminocidos, podra ser un factor importante a la hora de

predecir el proceso de envejecimiento y las enfermedades asociadas a ste. Una

revisin detallada de las modificaciones de los distintos aminocidos alterados,

los mtodos especficos para determinarlos y el impacto que provocan en el

metabolismo celular ha sido realizada por Requena et al (Requena et al., 2003) y

por Stadtman y Levine (Stadtman et al., 2003).

El dao oxidativo suele ser irreversible y puede conducir a la

desnaturalizacin de la protena (Dean et al., 1993).

c) Dao oxidativo al DNA

El DNA tambin es susceptible al dao oxidativo en todos sus

componentes. Se sabe que el oxgeno es capaz de adicionarse a las bases o al

azcar del DNA formndose radical peroxilo. Las posteriores reacciones de

estas especies radicalarias en el DNA dan lugar a un gran nmero de productos.

La alteracin de este tipo que ms se observa es la 8-hidroxi-

2desoxiguanosina (8-oxodG). Su importancia reside en su poder mutagnico ya

que durante la replicacin producir transversiones G-T (Kasai et al., 1984). La

cantidad del nuclesido 8-hidroxi- 2desoxiguanosina se utiliza como ndice del

dao oxidativo al DNA (Barja et al., 2000).

El dao oxidativo asociado a protenas y DNA no debe ser considerado

de manera independiente. La acumulacin de formas inactivas de enzimas

reparadoras puede aumentar la acumulacin de dao oxidativo en el DNA, por

lo que se pueden potenciar uno a otro. Cuando la replicacin del DNA daado

tiene lugar antes de la reparacin o cuando un DNA daado se repara de

manera incorrecta, tiene lugar una mutacin (Halliwell et al., 1991; Breen et al.,

1995). Por ello, las lesiones oxidativas al DNA parecen estar implicadas no slo

en el envejecimiento celular (Fraga et al., 1990), sino tambin en la patognesis

de las enfermedades asociadas a la edad avanzada (Cui et al., 2012). Sin

embargo, otros investigadores no han detectado un incremento en la oxidacin

Introduccin -

22 Tesis Doctoral

del DNA (8-oxodG) con la edad, ni en roedores (Anson et al., 1999) ni en

personas ancianas (Sacheck et al., 2003).

El DNA daado es reparado por enzimas que cortan la parte afectada,

que es entonces excretada por la orina (Viguie et al., 1993). Puesto que las

enzimas reparadoras no llegan a eliminar todas las lesiones, algunas se acumulan,

con lo que el nmero de mutaciones aumenta con la edad (Viguie et al., 1993).

El DNA mitocondrial sufre mucho ms dao oxidativo que el nuclear

(Richter et al., 1988; Linnane et al., 1989), ya que presenta ciertos rasgos que le

hacen especialmente susceptible de ser atacado por agentes oxidantes: carece de

histonas que puedan recibir el ataque en lugar del DNA (Donald et al., 1995); el

sistema de reparacin es menos efectivo (Shen et al., 1995; Suter et al., 1999) y,

por ltimo, se encuentra muy cerca de la cadena de transporte mitocondrial, uno

de los sistemas principales de produccin de especies reactivas del oxgeno

(Giulivi et al., 1993). Otro factor distintivo del DNA mitocondrial es que no

posee intrones, de manera que la modificacin de cualquier base afecta

usualmente a una zona de DNA codificante (Linnane et al., 1989; Ames et al.,

1993) y su repercusin suele ser, por tanto, ms importante (Zastawny et al.,

1998).

1.4.3.3 Indicadores de estrs oxidativo

Como ya hemos podido observar, el estrs oxidativo es de gran

importancia para las clulas y el organismo por el dao que ste puede causar.

Por lo que se han intentado encontrar indicadores que determinen el dao que

este estrs oxidativo puede causar a nivel general (citosol) o en particular a nivel

de lpidos, DNA o protenas. Los principales indicadores son: el cociente

GSSG/GSH para determinar el dao en el citosol, MDA como indicador de

dao a los lpidos, el 8-hidroxi-2-deoxiguanosina como ndice de dao

oxidativo al DNA y los grupos carbonilos como un indicador de dao oxidativo

a protenas (Hageman et al., 1992).

Introduccin


En la presente tesis se detallar con mayor profundidad los dos

siguientes, por ser objetivos de nuestro estudio.

a) Malondialdehdo (MDA)

El malondialdehdo es un indicador de dao oxidativo a lpidos. Se han

descrito varios mtodos de deteccin (Bird et al., 1984; Esterbauer et al., 1991),

pero la mayora son poco especficos ya que detectan todos los aldehdos de la

muestra al utilizar el cido triobarbitrico. Gracias al desarrollo de la

cromatografa lquida de alta resolucin, se consigue la separacin del aducto

malondialdehdo-cido triobarbitrico de otras sustancias que pueden interferir

en la determinacin (Knight et al., 1988).

En la presente tesis se ha medido el MDA ya que numerosos estudios

revelan su incremento con el envejecimiento (Inal et al., 2001; Sverko et al.,

2002; Mutlu-Turkoglu et al., 2003; Gil et al., 2006).

b) Grupos carbonilo

En los procesos de dao oxidativo a protenas, algunos aminocidos

como la lisina, la prolina y la arginina, se oxidan dando lugar a grupos carbonilo,

de modo que el contenido en carbonilos de las protenas se puede emplear

como un indicador de dao oxidativo a las mismas (Stadtman 1992; Dalle-

Donne et al., 2003). Otros aminocidos como la histidina, la cistena y la

metionina, tambin sufren dao oxidativo, pero no forman derivados d

efecto del consumo de soja en la longevidad de

Documents