Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Ingeniería Ambiental y Sanitaria Facultad de Ingeniería

1-1-2004

Efecto de la adición de sales inorgánicas simples como el nitrato Efecto de la adición de sales inorgánicas simples como el nitrato

de amonio y fosfato di básico de potasio en la degradación de de amonio y fosfato di básico de potasio en la degradación de

hidrocarburos en suelos contaminados con petróleo hidrocarburos en suelos contaminados con petróleo

Andrea Casas Ocampo Universidad de La Salle, Bogotá

Maria Fernanda Londoño Rodríguez Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Casas Ocampo, A., & Londoño Rodríguez, M. F. (2004). Efecto de la adición de sales inorgánicas simples como el nitrato de amonio y fosfato di básico de potasio en la degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con petróleo. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_ambiental_sanitaria/1561

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14

EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES INORGÁNICAS SIMPLES COMO EL NITRATO DE AMONIO Y FOSFÁTO DI BÁSICO DE POTASIO EN LA DEGRADACIÓN DE

HIDROCARBUROS EN SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEO

ANDREA CASAS OCAMPO MARIA FERNANDA LONDOÑO RODRÍGUEZ

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA

BOGOTÁ 2004

15

EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES INORGÁNICAS SIMPLES COMO EL NITRATO DE AMONIO Y FOSFÁTO DI BÁSICO DE POTASIO EN LA DEGRADACIÓN DE

HIDROCARBUROS EN SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEO

ANDREA CASAS OCAMPO MARIA FERNANDA LONDOÑO RODRÍGUEZ

PROYECTO DE GRADO

Director JOAQUIN L. BENAVIDES LOPEZ DE MESA

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA

BOGOTÁ 2004

16

NOTA DE ACEPTACIÓN:

_________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________

____________________________________ FIRMA DEL JURADO

____________________________________ FIRMA DEL JURADO

17

AGRADECIMIENTOS

Al Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad de La Salle, por su colaboración incondicional durante la realización de esta investigación. A Joaquín L. Benavides López de Mesa por brindarnos la oportunidad de realizar nuestro proyecto de grado, por su confianza y credibilidad en nosotras. A Cristina Bustos por su aporte e inmensa ayuda durante todo el proceso de investigación. A Clara López de Mesa por su colaboración y disposición para ayudarnos a culminar exitosamente nuestro proyecto de grado.

18

GRACIAS... A Dios, por darme la seguridad para culminar este proyecto exitosamente. A mi mamá y mi tita, por darme la fuerza necesaria para continuar día a día pese a las dificultades, gracias a su amor, paciencia, entrega y apoyo incondicional. A mis tíos y tías, por su ayuda y comprensión, por tener siempre una palabra de aliento en cada uno de los momentos difíciles. A toda mi familia, por ser mi orgullo y sobre todo por creer en mi siempre. A Juan Manuel, por su ternura. A Henry, por su confianza. A Maria Fernanda, por su compañía durante todo este tiempo y por su amistad. A mis amigos Diego y Yemny, por su cariño en cada uno de los momentos en que lo necesite y finalmente, a todas las personas que estuvieron a mi lado animándome y apoyándome permanentemente. Sin ustedes hubiera sido imposible culminar esta etapa de mi vida, este triunfo también es de ustedes.

ANDREA CASAS OCAMPO

19

DEDICO ESTE TRIUNFO A DIOS por encontrar siempre un refugio en él en los momentos de tristeza y alegría. Mi mami por estar junto a mi en cada instante bueno o malo, por su apoyo y consejos incondicionales en los momentos difíciles en los cuales no hubiera podido salir adelante sin ellos. Mi papá gracias por todo. Mis hermanos por brindarme apoyo y estar junto a mi dando siempre una voz de aliento. Mi abuelita por encontrar siempre esa ternura de abuela incondicional. Mi Tía Leito por sufrir y vivir al tiempo con mi mami cada instante de tristeza y alegría. Mi Tía Gladys que aunque hoy ya no está con nosotros este triunfo también es suyo. Carlos Arturo por llegar a mi vida en el momento más difícil e importante al final de mi carrera. Gracias. Andrea por ser además de mi mejor amiga la persona perfecta para trabajar sin problemas. Diego y Yeyis por ser amigos incondicionales. Y gracias también a todos los que de alguna manera me acompañaron a lo largo de este camino y que aunque unos estuvieron más tiempo que otros a todos los llevaré en mi corazón hoy y siempre: Juan Pablo, Joaquín, Luis Augusto, Jenny, Carolina, Julián, Paula.

MARÍA FERNANDA LONDOÑO RODRIGUEZ

1

CONTENIDO

pág.

INTRODUCCIÓN 1 OBJETIVOS 3

1. MARCO TEÓRICO 4

1.1 HIDROCARBUROS 4

1.2 SUELO 8

1.2.1 Composición del suelo 9

1.2.2 Fracción mineral del suelo 9

1.2.3 Fracción orgánica del suelo 10

1.2.4 Humedad del suelo 11

1.2.5 Propiedades físicas del suelo 11

1.2.6 Propiedades químicas del suelo 13

1.2.6.1 pH del suelo 13

1.3 MICROORGANISMOS 19

1.3.1Metabolismo de los microorganismos 21

1.4 PROCESOS DE BIODEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS 32

2

1.4.1 Biorremediación 32

1.4.1.1 Factores medioambientales 33

1.4.1.2 Factores físicos 34

1.4.1.3 Factores químicos 35

2. MARCO REFERENCIAL 41

3. MATERIALES Y MÉTODOS 46

3.1 PROCEDIMIENTO 47

4. RESULTADOS 72

4.1 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS 72

4.1.1 Análisis de nutrientes 72

4.1.2 pH 82

4.1.3 Temperatura 83

4.1.4 Humedad 84

4.2 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 85

4.2.1 Recuento de heterótrofos totales 85

4.2.2 Número más Probable 86

3

4.2.3 Identificación de microorganismos degradadores de petróleo 88

4.3 ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS 89

4.3.1 Hidrocarburos Totales de Petróleo 89

4.3.2 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos 91

5. DISCUSIÓN 100

6. CONCLUSIONES 105

7. RECOMENDACIONES 107

BIBLIOGRAFÍA 108

ANEXOS

4

LISTA DE TABLAS pág. Tabla 1. Calificación del pH en suelo 16 Tabla 2. Clasificación de suelos 16 Tabla 3. Clases y características de los suelos en Colombia 17 Tabla 4. Clasificación de los organismos según su fuente de carbono y energía 23 Tabla 5. Composición típica elemental de las células en base seca 26 Tabla 6. Resultado de los análisis iniciales de nutrientes en el suelo contaminado 69 Tabla 7. Concentración de N-NO3 a lo largo del periodo de estudio 70 Tabla 8. Concentración de N-NH4 a lo largo del periodo de estudio 71 Tabla 9. Concentración de P asimilable a lo largo del periodo de estudio 73 Tabla 10. Concentración de N-mineral a lo largo del periodo de estudio 74 Tabla 11. ANOVA de nutrientes en U.E. 75 Tabla 12. Correlaciones de nutrientes en U.E. 76 Tabla 13. Correlación de nutrientes en C.B. 77 Tabla 14. ANOVA de pH en U.E. y C.B. 79 Tabla 15. ANOVA de temperatura en U.E. y C.B. 80 Tabla 16. ANOVA del porcentaje de humedad en U.E. y C.B. 81 Tabla 17. ANOVA de recuento de heterótrofos totales 82 Tabla 18. ANOVA de NMP en U.E. y C.B. 83 Tabla 19. Correlación de UFC en U.E. y C.B. a través del tiempo de estudio 84 Tabla 20. Prueba de Mann-Whitney para TPH´s en U.E. y C.B. 86

5

Tabla 21. Prueba de estadísticos de contraste de TPH´s en U.E. y C.B. 86 Tabla 22. Concentración de PAH´s en U.E. a través del tiempo de observación 88 Tabla 23. Concentración de PAH´s en C.B. a través del tiempo de Observación 89 Tabla 24. Concentración inicial y final de los compuestos detectados en las U.E. 91 Tabla 25. Concentración inicial y final de los compuestos detectados en los C.B. 92 Tabla 26. Concentración de B(a) antraceno en U.E y C.B a través del tiempo de estudio 93 Tabla 27. Concentración de B(k) fluoranteno en U.E y C.B a través del tiempo de estudio 94 Tabla 28. Concentración de B(b) fluoranteno en U.E y C.B a través del tiempo de estudio 96

6

LISTA DE FIGURAS

pág. Figura 1.Degradación de cicloalcanos 6 Figura 2. Propiedades físicas del suelo 12 Figura 3. El anabolismo y el catabolismo 22 Figura 4. Caja de polietileno utilizada para los montajes en laboratorio 48 Figura 5. Realización del volteo manual 49 Figura 6. Metodología de la investigación 51 Figura 7. Cuadrícula utilizada para la recolección de muestras 54 Figura 8. Cuadrícula utilizada para la recolección de muestras 54 Figura 9. Medición de temperatura 56 Figura 10. Medición de pH 56 Figura 11. Determinación del porcentaje de humedad 57 Figura 12. Determinación del porcentaje de humedad 57 Figura 13. Centrífuga 59 Figura 14. Preparación de la dilución 10–1 60 Figura 15. Crecimiento de UFC 61 Figura 16. Crecimiento de UFC 61 Figura 17. Placa de 96 pozos con INT al 3% 63 Figura 18. Aislamiento de microorganismos degradadores de petróleo 64 Figura 19. Cromatógrafo HPLC (High performance liquid cromatography) 67

Figura 20. Cromatógrafo HPLC (High performance liquid cromatography) 67

7

Figura 21.Valores promedio de las concentraciones de N-NO3 en U.E. y C.B. a través del tiempo. 71 Figura 22. Valores promedio de las concentraciones de N-NH4 en U.E. y C.B. a través del tiempo. 72 Figura 23. Valores promedio de las concentraciones de P asimilable en U.E y C.B. a través del tiempo. 73 Figura 24. Valores promedio de las concentraciones de N-mineral en U.E. y C.B. a través del tiempo. 75 Figura 25. Valores promedio de las concentraciones de nutrientes en U.E. y C.B. a través del tiempo. 77 Figura 26. Valores promedio de las concentraciones de nutrientes en C.B. a través del tiempo. 78 Figura 27. Correlación de pH vs tiempo de estudio en U.E. y C.B. 79 Figura 28. Correlación de la temperatura vs tiempo de estudio en U.E. y C.B. 80 Figura 29. Correlación del porcentaje de humedad vs tiempo de estudio en U.E. y C.B 81 Figura 30. Correlación del número de UFC en U.E. y C.B. a través del tiempo 83 Figura 31. Correlación del NMP en U.E. y C.B. a través del tiempo 85 Figura 32. Valores promedio de la concentración de TPH´s a través del tiempo en U.E y C.B. 87 Figura 33. Porcentaje de degradación de TPH´s en U.E. y C.B. 88 Figura 34. Concentración de PAH´s en U.E. vs tiempo de observación 89 Figura 35. Concentración de PAH´s en C.B. vs tiempo de observación 90 Figura 36. Porcentaje de degradación de PAH´s en U.E. y C.B. 91 Figura 37. Concentración de B(a) antraceno en U.E. y C.B a través del tiempo de estudio 93 Figura 38. Concentración de B(k) fluoranteno en U.E. y C.B a través del tiempo de estudio 95

8

Figura 39. Concentración de B(b) fluoranteno en U.E. y C.B a través del tiempo de estudio 96

9

LISTA DE ANEXOS

pág. Anexo 1. Cálculo de la concentración de TPH´s 112 Anexo 2. Cálculo de la cantidad de NH4NO3 y K2HPO4 a adicionar en cada una de las U.E. 113 Anexo 3. Cantidad de NH4NO3 y K2HPO4 a adicionar en cada una de las U.E. 118 Anexo 4. Determinación de amonio y nitrato en laboratorio 119 Anexo 5. Resultados de nutrientes reportados a lo largo del estudio 122 Anexo 6. Resultados obtenidos a lo largo del periodo de estudio 123 Anexo 7. Resultados estadísticos obtenidos a lo largo del estudio 133 Anexo 8. Reporte de los microorganismos gram positivos y gram negativos 137 Anexo 9. Graficas de PAH´s 138

10

GLOSARIO

Aceptor de electrones: compuesto que acepta electrones en una reacción de oxidación – reducción, siendo además un agente oxidante. Adsorción: proceso químico y físico por el cual una sustancia adsorbida se

adhiere a la superficie de un sólido adsorbente. En los sólidos porosos o

finamente divididos la adsorción es mayor debido al aumento de la superficie

expuesta. Aerobio: organismo capaz de crecer en presencia de oxígeno. Estos organismos pueden ser facultativos o aerobios estrictos. Aerobio estricto: organismo capaz de vivir solamente en presencia de oxígeno. Aerobio Facultativo: organismo capaz de crecer tanto en presencia de oxígeno como en ausencia del mismo. Bioaumentación: adición de un inóculo microbiano de forma que se inicie y/o incremente la tasa de degradación biológica de los contaminantes. Biodegradación: proceso en el cual ocurre la transformación parcial o total de los contaminantes por agentes biológicos como los microorganismos. Biorremediación: empleo de microorganismos, plantas o enzimas para la depuración de contaminantes en distintos ambientes. Biosfera: capa relativamente delgada de aire, tierra y agua capaz de dar sustento

a la vida, que abarca desde unos 10 Km. de altitud en la atmósfera hasta el más

profundo de los fondos oceánicos. En esta zona la vida depende de la energía del

sol y de la circulación del calor y los nutrientes esenciales.

Biotecnología: empleo de organismos vivos para llevar a cabo procesos químicos

definidos para la aplicación industrial.

11

Bioventilación: adición al suelo de estimulantes gaseosos de forma pasiva o forzada con el fin de estimular la actividad microbiana. BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos. Son hidrocarburos aromáticos volátiles de gran importancia en la composición de la gasolina debido a su solubilidad y toxicidad. Catabolismo: procesos Bioquímicos que intervienen en la degradación de los

compuestos orgánicos e inorgánicos; normalmente conducen a la producción de

energía.

Consumidor primario: organismo que se alimenta directamente de los productores primarios. Esto incluye a los herbívoros, alimentadores de desperdicios, depuradores y reductores. Consumidor secundario: organismo que se alimenta de los herbívoros u otros consumidores primarios. Contaminación: presencia o exceso en la cantidad de una sustancia dentro del

aire, agua o suelo trayendo como consecuencia afecciones a la salud del hombre,

la calidad de vida o el funcionamiento natural de los ecosistemas.

Crudo: líquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por diferentes

sustancias orgánicas. También recibe los nombres de petróleo, petróleo crudo o

crudo petrolífero.

Depuración: proceso por el cual un organismo elimina sustancias nocivas o

inútiles en un medio determinado.

Dilución: aumento de la proporción del disolvente frente al soluto. Ecosistema: unidad fundamental ecológica constituida por la interrelación entre los organismos vivos y el medio con el cual intercambian materia y energía.

12

Enzima: sustancia producida por células vivas que actúan como catalizador al promover reacciones dentro del organismo. Enzima oxigenasa: enzima que transfiere oxígeno al metabolismo. Erosión: desmoronamiento producido en la corteza terrestre por la acción de los agentes externos a ella, es decir, el viento, el agua superficial, el agua subterránea, el mar y los organismos litófagos, causando la pérdida selectiva de los materiales del suelo. Gravimetría: método de análisis químico cuantitativo, basado en la transformación de la sustancia que se desea determinar, en una sustancia insoluble que se pueda pesar.

Hidrocarburo: compuesto que contiene Carbono e Hidrógeno y resulta de los

procesos metabólicos de los organismos vivos existentes. Humus: parte orgánica del suelo resultante de la descomposición parcial de materias animales y vegetales. Proporciona al suelo los elementos nitrogenados indispensables para su fertilidad, y actúa como regulador de la nutrición reteniendo y asimilando el fósforo y el potasio, favoreciendo la actividad biológica del suelo. Inóculo: introducción de microorganismos o sustancias que actúan como generadoras de células microbianas dentro d un medio determinado. Lixiviación: proceso de lavado que realiza el agua cuando se infiltra en el suelo, extrayendo materiales disueltos o en suspensión de un modo biológico o químico. Metabolismo: conjunto de los cambios y transformaciones químicas y biológicas que se producen continuamente en los seres vivos y constituyen, en esencia, el acto de la nutrición. Microorganismos: organismos simples, pequeños, unicelulares o multicelulares, formados por protozoos, algas, hongos, virus, bacterias y arckaeas los cuales están presentes en el ambiente y son responsables de muchos de los ciclos del carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros minerales. Nutriente: sustancia necesaria para el crecimiento y el desarrollo normal de cualquier organismo. NMP: número más probable

13

PAH’s : hidrocarburos policíclicos aromáticos. pH: es una medida de acidez en una disolución, es decir, indica la concentración de iones hidrógeno en una disolución. Así mismo, se define como el logaritmo de la concentración de iones hidrógeno H+. Proceso: conjunto de etapas sucesivas que permiten el desarrollo de una determinada actividad. Quimioorganototrofo: Organismo que obtiene su energía de la oxidación de

compuestos orgánicos

Recalcitrante: compuesto no degradado biológicamente por ningún proceso. Sistema: colección de partes o eventos que pueden considerarse como un todo, debido a la interdependencia e interacción consistente de dichas partes o eventos. Solubilidad: máxima cantidad de soluto que se puede disolver en una cantidad dada de solvente. Suelo: conjunto de materiales constituidos por productos minerales de meteorización, aire, agua y restos orgánicos procedentes de la descomposición de material vegetal y animal. Técnica: conjunto de procedimientos utilizados en una ciencia. Tecnología: término general que se aplica al proceso a través del cual se diseñan herramientas y máquinas con el fin de incrementar el control y comprensión del entorno material. TPH’s: hidrocarburos totales de petróleo Toxicidad: daño que puede causar una sustancia determinada a un organismo vivo. UFC : unidades formadoras de colonias. Volatilidad: facilidad de una sustancia para pasar del estado líquido o sólido a vapor mediante evaporación o sublimación respectivamente.

20

INTRODUCCIÓN

En Colombia ocurren con frecuencia y en volúmenes significativos derrames de

petróleo en suelo, los cuales generan el deterioro y la contaminación de los

ecosistemas, debido a diversos procesos como extracción, transporte y

refinamiento, entre otros.

Los derrames de petróleo causan impactos ambientales como la infertilidad del

suelo debido al cambio en las características fisicoquímicas y microbiológicas del

mismo, interrumpiendo el desarrollo normal de la cadena trófica; impactos

económicos como la improductividad generada por los derrames en el suelo e

impactos sociales debido a la alteración de la calidad de vida de la población

afectada; por lo cual, se han desarrollado diferentes técnicas de biorremediación

como la biolabranza, que permiten recuperar ecosistemas afectados por derrames

de hidrocarburos de petróleo.

Debido al problema ambiental que representa en Colombia, el vertido de

hidrocarburos, el Instituto Colombiano del Petróleo (ICP) ha desarrollado desde los

años 80 tecnologías para el tratamiento de residuos aceitosos y aguas residuales

generadas por la industria del petróleo en las ciénagas aceitosas del Complejo

Industrial de Barrancabermeja. Estas tecnologías, incluyen procesos de

biodegradación estimulada e intensiva de lodos, inyección de vapor y

deshidratación, entre otras;1 haciendo posible la depuración de aguas y lodos

contaminados asociados a la actividad petrolera, con el fin de entregar efluentes

que cumplan con las regulaciones ambientales colombianas2.

1 RAMIREZ, N.E., VARGAS, M.C. y SANCHEZ, F.N. Use of the "Sediment-Chromotest" for Monitoring Stimulated Hydrocarbon Biodegradation Processes. Environmental Toxicology and Water Quality An International Journal. 1996. p. 223-230. 2 www.icp.ecopetrolcom.co/technologicaloffer/technlogies.html.

21

Así mismo, el ICP con el fin de aumentar la eficacia en la degradación de los

hidrocarburos de petróleo, también ha desarrollado diferentes técnicas de

biorremediación como la biodegradación estimulada con aireación intensiva de

mezcla de relleno (lodo), obteniendo un porcentaje de remoción de hidrocarburos

del 80% y el biorreactor de lecho fluidizado, el cual obtuvo en la práctica un

porcentaje de remoción de hidrocarburos del 100%3.

En el país, son muy pocos los estudios realizados utilizando la técnica de

biolabranza con microorganismos nativos y adición de nutrientes; razón por la

cual, esta investigación tiene como objetivo evaluar la eficacia de la adición de

sales inorgánicas como el nitrato de amonio (NH4NO3) y el fosfato dibásico de

potasio (K2HPO4) en el proceso de degradación de hidrocarburos en suelos

contaminados con petróleo.

Por otro lado, se evaluará a lo largo del periodo de estudio tanto en las unidades

experimentales como en los controles bióticos, el comportamiento de los

nutrientes (P asimilable, NO3, NH4 y N- mineral) , los hidrocarburos totales de

petróleo (TPH´s), los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH´s) y la dinámica

poblacional de los microorganismos presentes en el suelo contaminado.

Finalmente, en este estudio se identificaran algunos de los microorganismos

capaces de degradar los hidrocarburos de petróleo presentes en el suelo,

obteniendo al final de la investigación una información valiosa para desarrollar

avances tecnológicos que permitan recuperar efectiva y rápidamente los terrenos

contaminados.

3 ECOPETROL. Sistema trifásico para la biodegradación intensiva de lodos aceitosos en sitio. 1995

22

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Evaluar la eficacia de la adición de sales inorgánicas simples como el fosfato di

básico de potasio y nitrato de amonio en el proceso de degradación de

hidrocarburos en suelo contaminado con petróleo. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Evaluar el comportamiento de los nutrientes en las unidades experimentales

frente a los controles bióticos a lo largo del periodo de estudio.

Evaluar el comportamiento de los hidrocarburos totales de petróleo en las

unidades experimentales frente a los controles bióticos a lo largo del periodo de

estudio.

Evaluar el comportamiento de los hidrocarburos policíclicos aromáticos en las

unidades experimentales frente a los controles bióticos a lo largo del periodo de

estudio.

Determinar el comportamiento poblacional de los microorganismos presentes

en el suelo contaminado antes y durante el periodo de estudio.

Identificar los microorganismos capaces de degradar hidrocarburos de petróleo

presentes en el suelo contaminado.

23

1. MARCO TEÓRICO

La transformación biológica de los hidrocarburos de petróleo presentes en

cualquier ecosistema puede llevarse a cabo por medio de diversas técnicas, las

cuales permiten agilizar la biodegradación de los mismos.

Dentro de las diferentes técnicas desarrolladas para el tratamiento de suelos

contaminados con petróleo se encuentra la biolabranza, la cual tiene en cuenta las

características del suelo, la disponibilidad de nutrientes, agua y oxígeno y la

presencia de microorganismos adecuados para llevar a cabo la degradación. A

continuación, se desarrollan cada uno de los componentes involucrados en la

recuperación de los suelos contaminados con petróleo.

1.1 HIDROCARBUROS El petróleo es químicamente una mezcla compleja de hidrocarburos de origen

orgánico, producto de la degradación y metamorfización de material detrítico tanto

vegetal como animal ocurrida hace millones de años, la cual se encuentra

formando grandes mantos en las capas más profundas de la corteza terrestre.

Los hidrocarburos son esencialmente compuestos formados por carbono e

hidrógeno con contenidos menores de otros elementos como azufre, oxígeno,

nitrógeno o trazas de metales, dependiendo del lugar de donde provengan4. La

biodegradabilidad de los hidrocarburos de petróleo depende de su estructura,

composición, variaciones en su longitud, ramificaciones en la cadena y la

presencia de oxígeno, nitrógeno y azufre contenida en los compuestos, así como

por su estado físico y toxicidad. De acuerdo a las características mencionadas 4 RAMIRES A y VIÑA G. Contaminación por hidrocarburos. Limnología colombiana, aportes al conocimiento por estadística de análisis. Panamericana. Bogotá. 1998. Cap.9 p. 229.

24

anteriormente, se contabiliza una amplia variedad de hidrocarburos del petróleo

como alcanos, cicloalcanos, aromáticos, policíclicos aromáticos y asfaltos y

resinas, entre otros 5.

Los alcanos lineales son los hidrocarburos del petróleo mas biodegradables y en

su degradación, la enzima monooxigenasa ataca al grupo terminal metílico para

formar un alcohol6. Sin embargo, aquellos con número de carbono entre C5 y C10 a

altas concentraciones inhiben la degradación de muchos hidrocarburos debido a

su característica de solvente, la cual rompe la membrana lipídica de los

microorganismos. Por otro lado, los alcanos con número de carbono entre C20 a

C40 tales como las ceras, son sólidos hidrófobos; es decir, su baja solubilidad

interfiere con su biodegradación7.

Generalmente, la degradación de los alcanos produce productos oxidados los

cuales son menos volátiles que los compuestos de donde proceden; sin embargo,

estos alcanos iniciales son altamente volátiles y pueden ser removidos

primeramente del suelo a través de arrastre por aire, bajo condiciones aerobias 8.

Los cicloalcanos o hidrocarburos cíclicos son menos degradables que los alcanos,

ya que su biodegradabilidad tiende a decrecer con el incremento del número de

anillos en su estructura. Estos hidrocarburos generalmente son degradados por

ataque de oxidasas dando como producto un alcohol cíclico el cual es

deshidrogenado a una cetona como se muestra en la figura 1 9.

5 Bartha R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation, Microbial Ecology, vol 12. 1986. p. 155 – 172 6 PITTER y Chudoba J. Biodegradability of organic substances in the aquatic environment, CRC Press, Boca Raton, Fl. 1990 7 EWEIS Juana et al, Principios de Biorrecuperación. Mc Graw Hill 1999. p.132 8 Ibid., p. 132 9 Bartha R, Op Cit., p. 155 - 172

25

Figura 1. Degradación de los cicloalcanos

Fuente: EWEIS Juana et al, Principios de Biorrecuperación. Mc Graw Hill 1999. p. 134

Los compuestos aromáticos presentes en el petróleo incluyen compuestos de uno

a cinco anillos como benceno, tolueno, etilbenceno y los tres xilenos, conocidos

como BTEX. Su biodegradación involucra dos etapas: la primera es la activación

del anillo, etapa en la cual se incorpora oxígeno molecular dentro del mismo por

medio de enzimas oxigenasas y la segunda etapa en la cual se presenta la ruptura

del anillo debido a la incorporación del oxígeno. Por otro lado, un incremento en el

peso molecular y en el número de anillos en su estructura disminuye su

solubilidad, volatilidad y biodegradación, incrementando la capacidad de

adsorción10.

Por otro lado, los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH´s) se componen

principalmente por 16 compuestos (naftaleno, aceftileno, acenafteno, fluoreno,

fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, B(a) antraceno, criseno, B(b)

fluoranteno, B(k) fluoranteno, B(a) pireno, DB(a,h) antraceno, B(g,h,i) perileno e

indeno), los cuales se degradan, un anillo cada vez, por mecanismos similares a

los utilizados para degradar los compuestos aromáticos; sin embargo, para los

PAH´s un incremento en el peso molecular, en el número de anillos y de

10 EWEIS Juana et al., Op cit., p. 134

26

sustituyentes alquilos en su estructura disminuye su solubilidad, volatilidad y

biodegradación, incrementando su capacidad de adsorción11.

Finalmente, los asfaltos y resinas son compuestos de alto peso molecular que

contienen nitrógeno, azufre y oxígeno; los asfaltos y muchas resinas, tienen una

estructura compleja compuesta de cadenas de hidrocarburos, nitrógeno, azufre y

átomos de oxígeno, ligado a ramificaciones de policíclicos aromáticos los cuales

incluyen níquel y vanadio. Los compuestos de estos dos grupos son recalcitrantes

debido a su insolubilidad y a la presencia de grupos funcionales que los protegen

de ataques microbianos por las extensivas estructuras de anillos aromáticos12.

Cantidades relativas y a veces absolutas de asfaltos tienden a incrementarse

durante la biodegradación de hidrocarburos de petróleo debido a su resistencia a

la degradación por reacciones de condensación13.

Además de lo mencionado anteriormente, otro parámetro a tener en cuenta en la

recuperación de suelos contaminados con petróleo es la toxicidad de los

hidrocarburos de petróleo, ya que se asocia en forma directa a la complejidad

química de los mismos; es decir, las diferentes clases de hidrocarburos además

de producir efectos tóxicos sobre los organismos, deteriora el biotopo o lugar

físico, produciendo cambios en la estructura y el funcionamiento del suelo en los

ecosistemas14.

11 Ibid., p. 134 12 ATLAS, R. M. Microbial Hydrocarbon degradation – bioremediation of oil spills. Journal of chemical technical biotechnol, vol 52. 1991. p. 149 – 156 13 Ibid., p. 149 - 156 14 RAMIREZ A y VIÑA G. Op cit. Cap. 9. p., 236

27

1.2 SUELO

Los suelos son medios porosos formados en la superficie terrestre mediante las

siguientes etapas: la fragmentación de la roca, la disolución química, la formación

de la capa orgánica y finalmente la organización del suelo.

En la primera etapa la roca se quiebra a causa de cambios bruscos en la

temperatura, la humedad y la gravedad que se presentan en el ambiente; una vez

fragmentada la roca, los fragmentos se ven expuestos a procesos de disolución

química causados por el agua y las bacterias producto de la descomposición de

hongos, líquenes e insectos 15. Posteriormente, se presenta la formación de la

capa orgánica en la cual a medida que la descomposición avanza y la capa de

materia orgánica es más gruesa, la vegetación se instala y genera un aporte

orgánico constante que alimenta el suelo16.

Finalmente, el suelo se organiza en capas que corresponden a los diferentes

periodos de su formación, estas capas forman "perfiles de suelo", que sirven para

evaluar cuán desarrollado está. Por lo cual, los suelos se consideran sistemas

biogeoquímicos, multicomponentes y abiertos que contienen sólidos, líquidos y

gases, sometidos a flujos de masa y energía con la atmósfera, la biosfera y la

hidrosfera17.

Los suelos proporcionan soporte físico y nutrientes para el crecimiento de las

plantas y los microorganismos; los suelos fértiles, se caracterizan tanto por la

presencia de nutrientes como por una estructura física adaptable a los organismos

y microorganismos como bacterias, actinomicetos, hongos, algas, protozoos y

15 www.lablaa.org 16 Ibid 17 Ibid

28

archeobacterias, que casi siempre están presentes aunque las densidades de

población varíen ampliamente debido a las condiciones del suelo18.

1.2.1 Composición del suelo La matriz de un suelo está compuesta generalmente por cinco componentes

principales: minerales, aire, agua, materia orgánica y organismos. Los materiales

minerales constituyen los principales componentes estructurales de los suelos y

supone mas del 50% del volumen total; el aire y el agua conjuntamente,

constituyen el volumen de poros, que por lo general, ocupa entre el 25 y el 50%

del volumen total; la proporción aire - agua varía considerablemente con la

humedad del suelo y la materia orgánica oscila entre el 3 y el 6% del volumen

como valor medio, mientras que los organismos ocupan menos del 1%19.

1.2.2 Fracción mineral del suelo La parte sólida del suelo, se encuentra formada por fragmentos minerales en

distintos grados de desintegración y descomposición dentro de los cuales se

encuentra material mineral formado principalmente por cinco clases de partículas:

piedras con un diámetro de más de 5 mm., gravas con un diámetro de 2 a 5 mm.,

arenas con un diámetro de 2 a 0.05 mm, limos con un diámetro de 0.005 a 0.002

mm. y arcillas con un diámetro menor de 0.002 mm. Los principales componentes

del suelo se encuentran en estado de subdivisión y en mezcla intima.20

Así mismo, generalmente el material predominante en un suelo es el dióxido de

silicio. También se encuentran en abundancia el aluminio y el hierro, mientras que

18 Alexander, M. Interruption to soil microbiology, Wiley, New York y Londres. 1991 19 EWEIS Juana et al., Op cit ., p. 28 20 BAUTISTA, Conferencias edafología. Universidad Gran Colombia, 1972 p. 2

29

el calcio, magnesio, potasio, manganeso, sodio, nitrógeno, fósforo y azufre están

presentes en menor cuantía21. La fracción mineral aporta la mayor parte de

nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos en el suelo,

variando la composición química en gran medida de un suelo a otro, y en un

mismo suelo, a diferentes profundidades.22

Los nutrientes que necesitan los microorganismos comprenden nitrógeno, fósforo,

potasio, magnesio, azufre y calcio, entre otros. Sin embargo, los microorganismos

pueden disponer con facilidad únicamente de una pequeña parte de estos

minerales. En general, el nitrógeno, el fósforo y los oligoelementos de un suelo

representan más una provisión de lento empleo que una fuente de rápido uso.

1.2.3 Fracción orgánica del suelo

La fracción orgánica del suelo está constituida por residuos de plantas y animales

en varios estados de descomposición; un nivel adecuado de materia orgánica

beneficia al suelo ya que mejora sus condiciones físicas, incrementa la infiltración

de agua, facilita la labranza del suelo, reduce las pérdidas por erosión y

proporciona nutrientes a las plantas. La mayoría de estos beneficios se derivan

de la acumulación en el suelo de los productos resultantes de la descomposición

de los residuos orgánicos23.

La mayor parte de los tejidos a descomponer son la materia vegetal y algunos

residuos de microorganismos; así mismo, al tiempo que se verifica la síntesis de

humus, se desprende CO2 y posteriormente nitratos, sulfatos y otros productos

asimilables liberándose la energía contenida en forma de calor, la cual es utilizada

21 Ibid. 22 Ibid. 23 AGROPECSTAR. Conceptos de fertilidad y productividad del suelo.

30

libremente por los organismos del suelo24. Aunque la materia orgánica contiene

alrededor del 5% de N total, este se encuentra formando parte de compuestos

orgánicos y no está inmediatamente disponible para el uso de las plantas, debido

a que la descomposición ocurre lentamente. Aún, cuando el suelo contenga

abundante materia orgánica, es necesario el uso de fertilizantes nitrogenados para

asegurar en el suelo una fuente adecuada de N disponible.

1.2.4 Humedad del suelo

La humedad de un suelo influye en gran medida en la actividad biológica. El agua

es el componente principal del protoplasma bacteriano y un suministro adecuado

de agua es esencial para el establecimiento y la estabilidad microbiana.

Un suelo con una humedad demasiado baja, da lugar a zonas secas y a una

disminución en la actividad microbiana. Sin embargo, demasiada humedad inhibe

el intercambio de gases y el movimiento de oxígeno a través del suelo, dando

como resultado la aparición de zonas anaerobias.25

1.2.5 Propiedades físicas En un volumen dado de un suelo mineral, hay una proporción aproximadamente

igual de sólidos, compuestos de 45% de minerales y 5% de materia orgánica y

espacios de poro, constituidos por agua y aire como se observa en la figura 2. El

movimiento del aire y del agua a través del perfil del suelo es un factor importante

24 BAUTISTA. Op cit., p. 4 25 EWEIS Juana et al., Op cit ., p., 28

31

en la descomposición de la materia orgánica y se ve afectado por determinantes

como la textura y la estructura del suelo26.

La textura, se refiere a los distintos tamaños que comprenden la parte sólida del

suelo y se encuentra relacionada tanto con la conductividad hidráulica como con la

retención del agua.

La estructura por su parte, se refiere a la forma en que se disponen y se

mantienen juntas las partículas primarias individuales como unidades identificables

más o menos diferentes27.

Figura 2. Propiedades físicas del suelo

Fuente: KIELY Gerard. Ing. Ambiental. Fundamentos, entornos, tecnologías y sistemas de gestión. Mc Graw

Hill 1999. p. 576.

26 KIELY Gerard. Ing. Ambiental. Fundamentos, entornos, tecnologías y sistemas de gestión. Mc Graw Hill 1999. p. 576 27 Ibid., p. 576

Fracción sólida 50 %

Regolito

Lecho rocoso

Suelo

Materia Orgánica 5 %

Agua 20-30%

Minerales 45 %

Agua 20-30%

32

Finalmente, otra propiedad importante, es la capacidad de infiltración de los

suelos, la cual es controlada por los dos factores mencionados anteriormente

(textura y estructura), así como por la presencia y el tipo de vegetación, grado de

pendiente y el estado de la humedad del suelo28.

1.2.6 Propiedades químicas del suelo Además de proporcionar las características al suelo, las fracciones mineral y

orgánica, también determinan las propiedades químicas del mismo, ya que

contienen la mayor parte de los nutrientes en formas que no están disponibles

para las plantas. Las partículas inorgánicas del tamaño de la arcilla y el humus son

los responsables de la mayor parte de las propiedades químicas del suelo29.

La capacidad amortiguadora y la acidez del suelo, son propiedades químicas

inherentes que afectan la absorción de los nutrientes y la movilidad de algunos

contaminantes potenciales.

1.2.6.1 pH del suelo El pH del suelo determina la actividad de los iones H+; es decir, la condición básica

o ácida del mismo expresada en términos logarítmicos. El pH del suelo, tiene

influencia en varios factores entre los que se incluyen el material de origen y

profundidad del suelo, precipitación, inundación, vegetación natural, cultivos

sembrados y fertilización nitrogenada30.

28 Ibid., p. 577 29 Ibid., p. 577 30 AGROPECSTAR. Op cit., cap. 2

33

Material de origen: Los suelos que se desarrollaron de un material parental

proveniente de rocas básicas generalmente tienen un pH más alto que aquellos

formados de rocas ácidas como el granito31.

Profundidad del suelo: Excepto en áreas de baja precipitación, la acidez del

suelo, generalmente aumenta con la profundidad. Sin embargo, existen áreas

donde el pH del subsuelo es más alto que el pH de la capa superior32.

Precipitación: A medida que el agua de las lluvias se percola en el suelo, se

produce la salida (lixiviación) de nutrientes básicos como calcio y magnesio, los

cuales, son reemplazados por elementos ácidos como aluminio, hidrogeno y

manganeso. Por lo tanto, los suelos formados bajo condiciones de alta

precipitación son más ácidos que aquellos formados bajo condiciones áridas33.

Inundación: La inundación del suelo incrementa el pH en suelos ácidos y lo

reduce en suelos básicos. Sin tener en cuenta el valor original del pH, la

mayoría de los suelos llegan a valores de pH entre 6.5 y 7.2 alrededor de un

mes después de haber sido inundados y se mantienen a ese nivel hasta que se

secan34.

Vegetación natural: Los suelos que se forman bajo bosque tienden a ser más

ácidos que aquellos que se desarrollan bajo praderas35.

Descomposición de materia orgánica: Los materiales orgánicos del suelo

son descompuestos continuamente por los microorganismos convirtiéndolos en

31 Ibid., cap. 2 32 Ibid., cap. 2 33 Ibid., cap. 2 34 Ibid., cap. 2 35 Ibid., cap. 2

34

ácidos orgánicos, dióxido de carbono y agua, formando finalmente ácido

carbónico. El ácido carbónico reacciona a su vez con los carbonatos Ca y Mg

en el suelo para formar bicarbonatos solubles que se lixivian, haciendo el suelo

más ácido36.

Siembra de cultivos: Los suelos a menudo se vuelven más ácidos con la

cosecha de los cultivos debido a que éstos remueven bases. El tipo de cultivo

determina las cantidades relativas removidas37. Fertilización nitrogenada: El N ya sea proveniente de los fertilizantes, materia

orgánica, estiércol o fijación biológica produce acidez. La fertilización con N

acelera el desarrollo de la acidez. A dosis bajas de N, la acidificación es lenta,

pero se acelera a medida que las dosis de N se incrementan38.

El pH del suelo debe estar en un rango óptimo entre 6 y 9 para el desarrollo de los

microorganismos; cuando el pH sea mayor a 9 se debe disminuir mediante adición

de azufre al suelo; por el contrario, si es menor de 6 se puede incrementar

mediante la incorporación de carbonato de calcio o hidróxido de calcio. Si en el

terreno se encuentran metales pesados en concentraciones muy altas, se debe

trabajar a un pH que mantenga el metal inmovilizado o en forma no soluble39. A

continuación, se presenta la calificación del pH en los suelos de Colombia según

el Instituto Geográfico Agustín Codazzi.

36 Ibid., cap. 2 37 Ibid., cap. 2 38 Ibid., cap. 2 39 ECOLI et al. Análisis de parámetros críticos y evaluación en la biodegradación de hidrocarburos en suelo. 2001

35

Tabla 1. Calificación del pH en los suelos.

pH CALIFICACIÓN

Menor de 5,5 Muy ácido: posible toxicidad del aluminio, hidrogeno y manganeso. Se presenta deficiencia de fósforo, calcio, magnesio, molibdeno y nitrógeno.

5,5 - 5,9 Moderadamente ácido: baja solubilidad de fósforo y regular disponibilidad de calcio y magnesio.

5,9 - 6,5 Ligeramente ácido: condición adecuada para la mayoría de los cultivos

6,6 - 7,3 Casi neutro: hay buena disponibilidad de calcio y magnesio. Moderada disponibilidad del fósforo y baja disponibilidad de micronutrientes a excepción del molibdeno.

7,4 – 8 Alcalino: posible exceso de calcio, magnesio y carbonatos. Baja solubilidad del fósforo y micronutrientes a excepción del molibdeno.

Mayor a 8 Muy alcalino: posible exceso de sodio intercambiable. Se inhibe el crecimiento de la mayoría de los cultivos.

Fuente: Instituto Geográfico Agustín Codazzi

De acuerdo a la composición y a las propiedades físicas y químicas del suelo

relacionadas anteriormente, los suelos se han clasificado de la siguiente manera:

suelos orgánicos, suelos de clima estepario, suelos de clima templado húmedo,

suelos de clima tropical y subtropical y suelos de clima frío y húmedo, entre otros,

como se observa en la siguiente tabla.

Tabla 2. Clasificación de los suelos.

CLASIFICACIÓN TIPO CARACTERÍSTICAS

Suelos Orgánicos Histosoles Suelos con una carga orgánica superior al 20% de su composición, aptos para cultivar.

Chernozems Suelos ricos en materia orgánica, altamente humidificados, muy bien estructurados. Suelos de clima

estepario Phaeozems Suelos saturados en bases, con pH elevado por lo cual

son bastante fértiles.

Suelos de clima templado húmedo Cambrosol Suelos blandos, saturados de bases, los cuales se

desmoronan fácilmente.

Lixisoles Suelos saturados en bases y de muy baja actividad. Suelos de clima tropical y subtropical

Acrisoles Suelos desaturados en bases y de muy baja actividad.

36

Ferrosoles Suelos ricos en material férrico, propios o exclusivos de

los climas tropicales.

Suelos de clima frío y húmedo Podzoles Suelos con gran cantidad de materia orgánica ricos en

hierro y aluminio, se caracterizan por ser ácidos.

Fuente: Instituto Geográfico Agustín Codazzi

Debido a la variedad de climas, geología, relieve y vegetación, en Colombia se

presenta una gran diversidad de suelos; sin embargo, los suelos dominantes en el

territorio presentan limitaciones por su excesiva humedad, baja fertilidad y su

localización en relieves escarpados de altas pendientes.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, los suelos en el país se encuentran

distribuidos de la siguiente manera: El 50% corresponde a suelos que deberían

destinarse para bosques o reservas naturales, el 30% esta conformado por suelos

de tierras planas o quebradas, pero con limitaciones para la agricultura y el 20%

restante, son los suelos altamente eficientes para usos agrícolas. Los mejores

suelos de Colombia se localizan en los altiplanos y en los conos y valles de

algunos ríos40. A continuación, se presentan las clases y características de

algunos suelos en Colombia según el Instituto Geográfico Agustín Codazzi

I.G.A.C.:

Tabla 3. Características de los suelos en Colombia.

SUELO CARACTERÍSTICAS

Suelos de playas, barras marinas, y otras formas litorales, generalmente mal drenados y muy poco evolucionados con presencia de sales y/o material orgánico

Suelos de formas litorales

Suelos de clima seco en aplanamiento derivados de calizas coralíferas y depósitos espesos de arena. Poco evolucionados y baja fertilidad. Son las áreas de recreación y embellecimiento del paisaje

40 www.lablaa.org.

37

Suelos desarrollados en áreas aluviales mal drenadas e inundables, son suelos poco evolucionados con materiales orgánicos.

Suelos mal drenados, poco evolucionados, ácidos y de poca fertilidad; utilizables solo en ganadería extensiva. Suelos aluviales y/o

lacustres Suelos predominantemente bien drenados, poco a moderadamente evolucionados. localizados en climas secos y húmedos. Su fertilidad es de baja a buena siendo aptos para la agricultura comercial y ganadería extensiva.

Suelos de clima predominantemente seco, con vegetación de la sabana; presentan avanzada evolución y baja fertilidad. Suelos de la

altillanura Suelos de clima húmedo y muy húmedo, muy evolucionados y de baja fertilidad.

Suelos de colinas Suelos de clima cálido muy seco poco evolucionados. La vegetación espinosa y caducifolia, hacen a estos terrenos inapropiados para cualquier uso.

Suelos de clima templado húmedo, en relieve fuertemente ondulado a quebrado, derivados o no de cenizas volcánicas, moderadamente evolucionados y de baja fertilidad. Son suelos aptos cultivos y ganadería extensiva

Suelos de clima cálido seco y ocasionalmente templado, en relieve quebrado, moderadamente evolucionados, fertilidad moderada y bien drenados. Son suelos aptos para cultivos y pastos. La ganadería extensiva debe ser dirigida y establecidas en las áreas de menor pendiente.

Suelos de clima frío y páramos, húmedo y muy húmedo, en relieve en relieve fuertemente ondulado a quebrado, derivados o no de cenizas volcánicas, moderadamente a poco evolucionados y de baja fertilidad. Las áreas de menor pendiente son aptas para cultivos y ganadería extensiva, en el resto de la unidad se debe conservar el bosque y reforestar.

Suelos de cordillera

Suelos de clima húmedo, muy húmedo y pluvial. Son suelos de muy poco evolucionados y de muy baja fertilidad.

Fuente: I.G.A.C., Atlas básico de Colombia, 1989. p . 69-70.

38

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, el suelo de Nemocón utilizado para la

ejecución del estudio, está catalogado como un suelo de clima frío y húmedo el

cual presenta texturas finas a moderadamente finas, cuya profundidad efectiva

está limitada por fluctuaciones del nivel freático; su pH varía de 4.5 a 541, lo cual

químicamente lo clasifica como un suelo muy ácido, con alta saturación de bases,

alto contenido de carbono orgánico y alta saturación de aluminio42.

El perfil de este suelo, presenta las siguientes características: el primer horizonte

es de textura arcillosa de color gris a pardo grisáceo, con presencia de

macroorganismos, raicillas abundantes y un pH moderadamente ácido. El

segundo horizonte es arenoso, de color pardo grisáceo oscuro con abundantes

manchas amarillas las cuales se han originado por el mal drenaje, no hay

presencia de macroorganismos y el pH es moderadamente ácido. El tercer

horizonte es de color negro, con gran cantidad de material vegetal parcialmente

descompuesto casi en contacto con el nivel freático43.

1.3 MICROORGANISMOS

Los microorganismos son organismos microscópicos tales como bacterias,

hongos, protozoos, algas y archeobacterias, los cuales juegan un papel muy

importante en los procesos de biorrecuperación.

Las bacterias casi siempre son los degradadores primarios iniciando la

degradación de la materia orgánica en el suelo44, estas se desarrollan

generalmente en las capas superficiales del suelo debido a las condiciones que 41 CORREAL URREGO Gonzalo. Investigaciones arqueológicas en abrigos rocosos de Nemocón y Sueva. 1979.p. 25. 42 SUBDIRECCIÓN AGROLÓGICA. Estudio general de suelos de los municipios de Ubate y norte de la sabana de Bogotá. 1982. p. 106, 108. 43 CORREAL URREGO GONZALO, Op cit. P. 25, 26. 44 EWEIS Juana et al. Op cit., p. 77

39

exigen de aireación, temperatura, humedad y buen contenido de sustancias

nutritivas. Todas las bacterias necesitan en mayor o menor grado del oxígeno; las

que exigen en abundancia son aeróbicas mientras que las otras se denominan

anaeróbicas; sin embargo, algunas son facultativas; es decir, se desarrollan es

presencia o ausencia de oxígeno.45

Los hongos son potencialmente utilizados en el tratamiento de compuestos

peligrosos46; tienen una función muy importante en la transformación de los suelos

y son facultativos en cuanto a pH se refiere; es decir, se desarrollan bien en suelos

ácidos, neutros o alcalinos; sin embargo, en los suelos ácidos tienen la

supremacía por no ser el campo propicio para el desarrollo de las bacterias; sin

ellos no sería posible la formación del humus en tales tipos de suelos. Se

desarrollan mejor en la superficie y se estimulan con la adición de estiércol o

fertilizantes 47.

Los protozoos consumen materiales particulados incluyendo a otros

microorganismos48 y por último, las algas se emplean para eliminar nutrientes

inorgánicos y para proveer oxígeno a sistemas microbianos49, degradando los

contaminantes por medio de los procesos metabólicos que realizan; estas se

desarrollan generalmente en la superficie del suelo y por encontrarse en grandes

cantidades se pueden considerar como contribuyentes de material orgánico; así

mismo, son almacenadoras de energía; es decir, tienen poder de resistencia

cuando hay condiciones desfavorables, volviendo a desarrollarse cuando tales

condiciones cesan50.

45 BAUTISTA. Op cit., p. 29 46 EWEIS Juana et al. Op cit., p. 77 47 Conferencias edafología Op cit., p. 28 48 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 77 49 Ibid., p. 77 50 Conferencias edafología Op cit., p. 28

40

Por otro lado, el crecimiento de los microorganismos se realiza de manera

exponencial, lo cual permite determinar el número de organismos presentes en el

suelo por unidad de tiempo. El crecimiento poblacional bacteriano se divide en

cuatro fases: fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria, fase de

muerte51.

La fase de latencia, es el periodo de tiempo que toman las bacterias para

aclimatarse al medio ambiente antes de comenzar su crecimiento. Durante esta

fase de aclimatación la velocidad de crecimiento es cercana a 0. Así mismo, indica

el tiempo que necesitan las bacterias para sintetizar las enzimas que necesita para

metabolizar el nuevo nutriente52.

La fase exponencial generalmente sigue a la aclimatación de los nutrientes que

son usados para construir o sintetizar nuevo material celular. Inicialmente, el

número de células empieza a incrementarse mensurablemente53.

La fase estacionaria, inicia cuando la tasa de crecimiento específico tiende

aproximadamente a 0 después del crecimiento exponencial. En esta fase no hay

incremento ni decremento neto en el número de células; sin embargo, aunque en

esta fase no tiene lugar el crecimiento, todavía ocurren muchas funciones

celulares incluyendo el metabolismo energético y algunos procesos biosintéticos54.

La fase de muerte puede simplemente significar la inactivación de la actividad

metabólica o esta puede ser descomposición real de la célula55.

51 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 89 52 Ibid., p. 90 53 Ibid., p. 90 54 Ibid., p. 92 55 Ibid., p. 92

41

1.3.1 Metabolismo de los microorganismos

El metabolismo es uno de los procesos mas importantes dentro de los

microorganismos, ya que es el conjunto de cambios y transformaciones químicas y

biológicas que se producen continuamente en los organismos y cuyo objetivo final

es la producción de nuevas células. Como se observa en la figura 2, el

metabolismo se divide en dos procesos generales: el catabolismo que es el

proceso por el cual se obtiene energía y elementos estructurales básicos a partir

de nutrientes y el anabolismo que utiliza la energía obtenida en el catabolismo

para sintetizar nuevos componentes celulares; estos procesos son

interdependientes y se llevan a cabo simultáneamente56. FIGURA 3. El anabolismo y el catabolismo,

Fuente: DREYFUS Cortés Georges. El mundo de los microbios. 1996. cap. 2.

56 DREYFUS Cortés Georges. El mundo de los microbios. 1996. cap. 2.

42

Para desarrollar el proceso metabólico y crecer, los microorganismos requieren de

una fuente de carbono y una fuente de energía, la cual obtienen de la luz y la

materia orgánica e inorgánica 57 como se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 4. Clasificación de los organismos según fuente de carbono y energía.

ORGANISMO FUENTE DE ENERGÍA FUENTE DE CARBONO

Fotótrofos Luz

Quimiótrofos Química

Autótrofos CO2

Heterótrofos Compuestos orgánicos

Foto autótrofos (Vegetales, algas, bacterias fotosintéticas, cianobacterias)

Luz CO2

Foto heterótrofos (Bacterias) Luz Compuestos orgánicos

Quimioautótrofos (Bacterias) Química CO2

Quimioheterótrofos (Animales, protozoos, bacterias)

Química Compuestos orgánicos

Fuente: www.edición-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema09.html

En la utilización de la materia orgánica e inorgánica se requiere de un aceptor final

de electrones como el oxígeno para completar la reacción de oxido-reducción,

pero se pueden utilizar otros aceptores de electrones como NO3, NO2, SO4, CO2 y

Fe3; sin embargo, hay que tener en cuenta que los microorganismos tienen una

capacidad limitada para usar los aceptores de electrones, por lo cual sólo una

parte de los organismos capaces de usar O2 pueden también usar NO3-. Por otro

57 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 120

43

lado, cuando se utiliza como fuente de energía la luz, esta debe ser convertida en

energía química antes de ser utilizada58.

En el metabolismo de la materia orgánica existen dos vías: la primera es la

fermentación en la cual la materia orgánica sufre reacciones de oxidación-

reducción en ausencia de un aceptor final externo como el oxígeno y la segunda

es la respiración (aerobia y anaerobia) en la cual la materia orgánica actúa como

dador de electrones y el aceptor de electrones es un compuesto exógeno59.

En el metabolismo de la materia inorgánica o litotrofía, los organismos litótrofos

obtienen la energía de la oxidación de los compuestos inorgánicos, usando como

fuente de carbono casi siempre el dióxido de carbono60. En el metabolismo

fototrófico, los microorganismos por medio de la fotosíntesis convierten la energía

lumínica en energía química, utilizando como única fuente de energía el dióxido

de carbono.61

Finalmente, un caso especial de metabolismo es el cometabolismo, en el cual los

microorganismos son capaces de transformar un compuesto orgánico sin poder

emplear ese mismo compuesto como sustrato para su crecimiento o como fuente

de energía, necesitando así de otros compuestos que le suplan estas

necesidades.62

Por otro lado, para el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos del

petróleo, se requiere una concentración mínima de microorganismos

degradadores específicos de 103 a 104 UFC/g. de suelo y de microorganismos

58 Ibid., p. 120 59 Ibid., p. 120 60 Ibid., p. 125 61 Ibid., p. 127 62 Ibid., p. 128

44

heterótrofos totales de 105 a 106 UFC/g. de suelo, con el fin de asegurar las

reacciones metabólicas necesarias para garantizar la degradación del

contaminante. Si las Unidades Formadoras de Colonias no son suficientes, se

pueden incorporar microorganismos al suelo mediante inoculación o a través del

proceso conocido como bioaumentación; sin embargo, también se puede lograr un

incremento importante estimulando la población microbiana existente por

incorporación de nutrientes63, proceso conocido como bioestimulación.

La inoculación de microorganismos autóctonos, es un proceso en el cual se

incorporan microorganismos al suelo para realizar una función específica, como es

la degradación de contaminantes. La inoculación se usa cuando los

microorganismos del suelo no pueden degradar el contaminante presente o

cuando se produce inhibición por presencia de sales o metales pesados. Sin

embargo, tiene como desventaja que los microorganismos inoculados pueden

desplazar a los existentes en el suelo por competición y lograr poco efecto

degradativo o bien no adaptarse a las condiciones ambientales del lugar; así

mismo, puede ocurrir que no puedan competir con los microorganismos locales y

el efecto sea nulo64.

La bioaumentación es un proceso que implica incrementar drásticamente la masa

microbiana del suelo mediante la adición de microorganismos provenientes del

suelo contaminado, los cuales fueron obtenidos mediante cultivo en reactores

biológicos; en algunos casos, dependiendo del tipo de contaminante presente,

puede ser necesario inocular varias veces65.

63 ECOLI et al, Op cit. 64 Ibid 65 Ibid

45

Por otro lado, la concentración y composición de la comunidad microbiana y la

tasa de transformación de contaminantes está influenciada por condiciones

ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes, pH, presencia de metales y

sales, biodisponibilidad, temperatura y humedad.

Disponibilidad de nutrientes Los nutrientes son sustancias químicas necesarias para el desarrollo de los

microorganismos y se clasifican en macronutrientes y micronutrientes. Los

macronutrientes son compuestos requeridos en grandes cantidades y forman

parte de las macromoléculas de las células como carbohidratos, lípidos y ácidos

nucleicos; entre los macronutrientes se tiene el carbono, nitrógeno, fósforo y

azufre. Por su parte, los micronutrientes aunque no son requeridos en grandes

cantidades y casi no aportan energía son esenciales para que el metabolismo

funcione; algunos de los micronutrientes son el calcio, fósforo y algunos

oligoelementos como hierro, cobre, zinc, azufre, cobalto, manganeso, magnesio,

calcio y otros compuestos que dependen del tipo de microorganismos y del

proceso que se realiza. El porcentaje de la composición celular y los nutrientes se

agrupa en la siguiente tabla66.

Tabla 5. Composición típica elemental de células en base seca.

ELEMENTO % PESO SECO

FUNCIÓN FISIOLÓGICA GENERAL

Carbono 50 Materia orgánica celular

Oxígeno 20 Materia orgánica y agua en células

66 RODRÍGUEZ Refugio. Curso de biorremediación. Pontificia universidad Javeriana. Bogotá.2003

46

Nitrógeno 14 Proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas

Hidrógeno 8 Materia orgánica y agua en células

Fósforo 3 Fosfolípidos, ácidos nucleicos y coenzimas

Azufre 1 Proteínas, coenzimas

Potasio 1 Procesos celulares

Sodio 1 Procesos celulares

Calcio 0.5 Procesos celulares y cofactor coenzimas

Magnesio 0.5 Procesos celulares y cofactor en reacciones con

ATP

Cloro o.5 Procesos celulares

Hierro 0.2 Citocromo, proteínas, enzimas

Elementos traza 0.3 Constituyentes inorgánicos en ciertas enzimas

Fuente: RODRÍGUEZ Refugio. Curso de biorremediación. Pontificia universidad Javeriana.

Bogotá.2003.

De acuerdo a lo anterior, la limitación de algunos nutrientes como nitrógeno y

fósforo pueden reducir la actividad microbiana, afectando la degradación de

compuestos xenobióticos 67.

El nitrógeno es un componente esencial de proteínas para las bacterias; en

proporciones bajas la población microbiana no tiene un desarrollo óptimo y en

contraste, demasiado nitrógeno permite el crecimiento microbiano rápido y acelera

la descomposición. Es importante tener en cuenta que el nitrógeno puede

perderse rápidamente en el suelo debido a la desnitrificación del mismo y a la

lixiviación del amonio y el nitrato. Los suelos contaminados con hidrocarburos

tienen una relación C:N muy alta, por lo tanto una deficiencia de N puede ser uno

67 Ibid

47

de los factores limitantes para la degradación por acción de la microbiota

autóctona68.

El N que a través de transformaciones complejas y de carácter bioquímico se

libera en formas simples por medio de la descomposición de la materia orgánica,

generando en sus primeras etapas desprendimiento de CO2; el nitrógeno primero

aparece como amonio y posteriormente si las condiciones son favorables para

oxidación, se oxida a nitritos y nitratos; dándose el proceso de nitrificación69.

NItratoNitritoAmonioorgánicoNitrógeno →→→

iónamonificac

ycióndescomposi iónnitrificac

Por otro lado, el fósforo forma parte de importantes compuestos que están

directamente relacionados con los procesos energéticos de las plantas y en

general de los organismos, siendo necesario para formar los ácidos nucleicos, las

membranas celulares y el ATP. Las principales acciones de los microorganismos

sobre el fósforo son la transferencia de fosfato inorgánico a orgánico o bien de

formas insolubles e inmóviles a solubles y móviles70.

Cuando éste se encuentra en combinación orgánica, la descomposición de esta

facilita su simplificación; sin embargo, el fósforo mineral contiene fosfatos

insolubles y aún cuando se encuentra en gran cantidad el disolvente (agua

cargada con CO2), la solución es lenta71.

68 RODRÍGUEZ Refugio. Op cit. 69 BAUTISTA. Op cit., p. 12 70 RODRÍGUEZ Refugio. Op cit. 71 BAUTISTA. Op cit., p. 12

48

CaHCOCaHPOCOOHCaPO )(2)(44)( 322422324 +→++

leinso

Fosfatolub

leso

Fosfatolub

En conclusión, la fuente de nitrógeno proporciona el elemento necesario para la

producción de aminoácidos y enzimas y la fuente de fósforo interviene en la

formación de compuestos energéticos dentro de la célula, los cuales se utilizan en

los procesos de reproducción de los microorganismos y la degradación de

contaminantes.

Por otro lado, la fuente de carbono utilizada en el proceso de degradación es el

contaminante, el cual proporciona el carbono necesario para producir compuestos

celulares y productos metabólicos como CO2, agua y enzimas72. Dado que la

utilización del nitrógeno, fósforo y carbono en el suelo es muy rápida y este no

alcanza a cubrir todas las necesidades del proceso, estos compuestos pueden ser

incorporados bajo la forma de sales inorgánicas simples como nitrato de amonio y

fosfato dibásico de potasio73. La dosificación de nitrógeno y fósforo en forma de

sales se realiza en función de la concentración del contaminante de acuerdo a una

relación que vincula C:N:P y cuyas proporciones son entre 100:10:1 y 300:10:174.

72 ECOLI et al, Op cit. 73 Dibble J. T. and Bartha R. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil sludge. 1979 Mishra Sanjeet et al. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily – sludge – contaminated soil. 2001. p.1676 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 196 SARANITRO Joseph et al. Crude oil hydrocarbon bioremediation and soil ecotoxicity assessment. 1997. 74 MAROTO Arroyo, Maria Ester y ROGEL Q. Juan Manuel. Aplicación de sistemas de biorremediación de suelos y aguas contaminadas por hidrocarburos. Geocisa Div. Protección ambiental de suelos. p. 298

49

pH El pH del suelo es importante para el desarrollo de los microorganismos

degradadores en un rango optimo entre 6 y 9. Cuando el pH excede 9 se debe

disminuir adicionando azufre al suelo; sin embargo, si es menor de 6 se puede

incrementar mediante la incorporación de carbonato de calcio o hidróxido de

calcio. Cuando se encuentran metales pesados en el terreno a muy altas

concentraciones se debe trabajar a un pH que mantenga el metal inmovilizado o

en forma no soluble75.

Presencia de metales y sales La presencia de metales y sales a altas concentraciones en el suelo intoxican a los

microorganismos o actúan como biocidas; entre estos se incluyen metales

pesados y sodio en alta concentración. En general, la presencia de sales y

metales disminuye la velocidad de degradación en forma importante a menos que

se disponga de microorganismos tolerantes en el lugar de tratamiento o se haya

producido una bioaumentación76.

Los microorganismos no degradan contaminantes inorgánicos, sólo pueden alterar

su forma química inmovilizándolos o eliminándolos del lugar mediante lixiviación

de los compuestos solubles por el agua de lluvia o volatilización.

Biodisponibilidad

La degradación de un contaminante en suelo depende de una serie de factores,

entre los que se encuentran la actividad de los microorganismos y la transferencia 75 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 94 76 ECOLI et al, Op.cit.

50

de masa desde el suelo hasta el microorganismo. El incremento de la capacidad

de los microorganismos, no siempre conduce a un aumento en la velocidad de

degradación, siendo este hecho aun más evidente en derrames.

La reducción de la biodisponibilidad en el tiempo se debe a un proceso de

envejecimiento causado por reacciones de oxidación química que incorporan el

contaminante dentro de la materia orgánica, difusión lenta dentro de los poros muy

pequeños del suelo y adsorción en las paredes de los mismos77.

Temperatura

La temperatura afecta la actividad microbiana y las tasas de biodegradación ya

que los microorganismos tienen rangos de temperaturas óptimas en el intervalo

de 5 a 40 ºC. En general a temperaturas superiores a 40 ºC decrece la

biodegradación debido a la desnaturalización de enzimas y proteínas y a

temperaturas aproximadas a 0 ºC se detiene esencialmente la biodegradación78.

Por regla general, las bacterias son mas tolerantes a bajas extremas de

temperatura, porque pueden capsularse y recuperar algunas condiciones

ambientales impropias. A muy altas temperaturas, sin embargo, la mayoría de las

poblaciones microbianas mueren 79.

Humedad

Los microorganismos requieren un porcentaje de humedad entre el 30 y 90% de la

capacidad de campo para su crecimiento; poca humedad en el suelo da como

resultado zonas secas y por lo tanto poca actividad de los microorganismos; sin 77 Ibid 78 SIMS et al. Approach to bioremediation of contaminated soil. Hazardous waste and hazardous materials. 1990. vol. 7 p. 117 - 149 79 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 94 - 95

51

embargo, demasiada humedad inhibe el intercambio de gases y da como

resultado el desarrollo de zonas anaerobias y el aumento de bacterias anaerobias

o anaerobias facultativas. La humedad tiene gran influencia en la actividad

microbiana ya que el agua es el mayor componente del protoplasma bacteriano y

su suministro es esencial para el crecimiento y mantenimiento de los

microorganismos80.

1.4 PROCESOS DE BIODEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS Los procesos de biodegradación de hidrocarburos del petróleo, permiten la

transformación parcial del contaminante por agentes biológicos como los

microorganismos, utilizando técnicas como biorremediación, bioventilación,

atenuación natural y biolabranza o landfarming, entre otros. 1.4.1 Biorremediación La biorremediación es la utilización de tecnologías mediante las cuales se estimula

la biodegradación del contaminante o la capacidad de recuperación del

ecosistema mediante procesos dinámicos, con el fin de minimizar las

consecuencias de un derrame. Estos procesos de biodegradación pueden ser

llevados a cabo por la microbiota autóctona de la zona contaminada o por

microorganismos adicionados al efecto, en ambos casos, lo que se consigue es

una biotransformación de sustancias peligrosas a sustancias menos toxicas o

inocuas81.

80 Ibid., p. 196 81 Grupos de Investigaciones de tecnologías del medio ambiente. Guías de referencia y selección de tecnologías de biorremediación en ambientes marinos. Universidad de Cádiz, España. 2002. p.5.

52

Para que la biorremediación tenga lugar, los microorganismos han de presentar

una actividad adecuada. Las tecnologías de biorremediación, favorecen el

crecimiento de los microorganismos provocando un aumento de la población

microbiana mediante la generación de condiciones ambientales óptimas, puesto

que una máxima velocidad de crecimiento microbiano implica una máxima

velocidad de degradación y por lo tanto detoxificación del medio82.

La selección de una determinada tecnología de biorremediación está condicionada

por múltiples factores como el tipo de microorganismos presentes en el medio, las

condiciones del terreno contaminado, la concentración y la toxicidad de los

contaminantes.

La biorremediación ofrece diversas ventajas con respecto a los tratamientos

físicos y químicos empleados en el tratamiento de terrenos y aguas contaminadas

como los costos de depuración, los cuales son mas económicos que las

tecnologías convencionales y eliminación de contaminantes tóxicos. Los factores

que afectan el rendimiento de la biorremediación pueden clasificarse en tres

grandes grupos: medioambientales, físicos y químicos.

1.4.1.1 Factores medioambientales Estos factores proporcionan las condiciones óptimas de temperatura, pH,

disponibilidad de nutrientes, oxígeno y humedad para el crecimiento de los

microorganismos que llevan a cabo la biorremediación.

Los microorganismos tienen regiones de temperaturas óptimas en el intervalo de

5 a 40 ºC y temperaturas por encima de las cuales la actividad microbiana se

82 Ibid., p.5

53

detiene; la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor dentro del rango

de pH de 6 a 9; los nutrientes son aquellos compuestos químicos necesarios para

el crecimiento microbiano, precisándose con mayor frecuencia el nitrógeno y

fósforo; el oxígeno, es el aceptor final de electrones generalmente usado en

procesos biológicos y la humedad constituye un factor importante en la

biorremediación debido a que proporciona las condiciones para que los

microorganismos obtengan todos los nutrientes necesarios para su crecimiento83.

1.4.1.2 Factores físicos

Los factores físicos de mayor importancia en la biorremediación son la

disponibilidad del contaminante para los microorganismos, la provisión de agua y

la presencia de un aceptor de electrones adecuado, como el oxígeno. Muchos de

los contaminantes mas habituales poseen una baja solubilidad en agua y son

absorbidos con gran intensidad por partículas sólidas. Los hidrocarburos derivados

del petróleo, son en general apolares, tendiendo a distribuirse en la fase sólida

principalmente84.

La presencia de agua es necesaria, ya que los microorganismos toman el carbono

orgánico, los nutrientes inorgánicos y los aceptores de electrones necesarios para

el crecimiento microbiano, de la fase líquida; por lo tanto, el agua debe estar en

contacto con los contaminantes y estar presente en cantidades que permita el

desarrollo de las comunidades microbianas. Sin embargo, el agua puede llegar a

inhibir el flujo de aire y reducir el suministro del oxígeno necesario para la

respiración microbiana, por lo cual, existen valores de humedad óptima para la

biorremediación de terrenos no saturados, que habitualmente están entre 150 y

250 gramos de agua por Kg. de terreno en seco. 83 EWEIS Juana, et al Op cit. p. 20 84 Ibid., p. 20 - 21

54

Finalmente, el oxígeno supone ser el aceptor ultimo de electrones más empleado

en la respiración microbiana; sin embargo, existen otros aceptores de electrones

que resultan más fáciles de suministrar como NO3, NO2, SO4, Fe3, CO2. En

comparación con aquellas situaciones en las que se emplea el oxígeno, la

variedad de microorganismos capaces de usar cada alternativa es reducida, el

resultado de las reacciones catalizadoras es más limitado y la oxidación de los

productos finales es a menudo menor 85.

1.4.1.3 Factores químicos

El factor químico mas importante en biorremediación es la estructura molecular del

contaminante y su capacidad para ser biodegradado. Esta capacidad esta

relacionada con factores tales como la solubilidad, el grado de ramificación y el

grado de saturación.

La solubilidad constituye una propiedad fundamental, ya que los microorganismos

toman los nutrientes de una solución acuosa; una elevada solubilidad se traduce

en una gran disponibilidad, en potencia de un determinado compuesto.

Finalmente, la biorremediación se basa en un fundamento bioquímico en el cual la

cadena respiratoria o transportadora de electrones de las células, produce una

serie de reacciones de óxido-reducción cuyo fin es la obtención de energía. La

cadena la inicia un sustrato orgánico que es externo a la célula y que actúa como

dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba

degradando y consumiendo dicha sustancia86.

85 Ibid., p. 22 86 MAROTO Arroyo, Maria Ester y ROGEL Q. Juan Manuel. Op cit. p. 298

55

Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el

oxígeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el

oxígeno es utilizado como aceptor de electrones la respiración microbiana se

produce en condiciones aerobias y los procesos de biodegradación serán de tipo

aerobio, generando como productos CO2 y H2O de la siguiente manera87:

Degradación aerobia: Sustrato + O2 biomasa + CO2 y H2O

Sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dióxido de carbono como aceptores finales

de electrones, la respiración microbiana se produce en condiciones reductoras o

anaerobias y los procesos de biodegradación serán de tipo anaerobio, de la

siguiente manera88:

Degradación anaerobia:

Sustrato + (NO3, SO42-, Fe3+, Mn4+, CO2) Biomasa + CO2 +(N2, Mn2+, S2+,

Fe2+, CH4)

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, dentro de las diferentes técnicas de

biorremediación se encuentran la bioventilación, atenuación natural y biolabranza

entre otros.

Bioventilación

La bioventilación es una técnica de tratamiento in situ, la cual consiste en la

ventilación forzada del suelo mediante la inyección a presión de oxígeno a través 87 Ibid., p. 298 88 Ibid, p. 298

56

de pozos de inyección. Debido a la aireación del suelo, se favorece la degradación

de hidrocarburos por dos razones: primero, la volatilización facilita la migración de

la fase volátil de los contaminantes y segundo al incrementar la oxigenación del

suelo se estimula la actividad bacteriana89. La bioventilación es aplicable para

compuestos de alta volatilidad, funcionando en periodos de tiempo relativamente

cortos y es una alternativa a la excavación y tratamiento ex situ del suelo, la cual

tiene como objetivo minimizar la migración del contaminante90.

Las limitaciones comunes para una aplicación de bioventilación incluyen la

perdida de nutrientes en el subsuelo, el bajo contenido de humedad en el suelo y

la dificultad en lograr el caudal de aire a través de la zona contaminada.

Atenuación natural

La atenuación natural, aunque no está considerada como una técnica de

descontaminación propiamente dicha, está englobada dentro de las técnicas de

remediación in situ de muy bajo costo. Su característica principal es la utilización

de los procesos fisicoquímicos de interacción contaminante - suelo y los procesos

de biodegradación que tienen lugar de forma natural en el medio. Estos procesos

se conocen como procesos de biotransformación natural91.

Los procesos de biotransformación natural son aquellos que van a reducir la

concentración de los contaminantes y entre los que se encuentran la dilución,

dispersión, volatilización, adsorción, biodegradación y aquellas reacciones

químicas que se producen en el suelo o en el agua y que contribuyen de alguna

forma a la disminución de la contaminación.

89 MAROTO Arroyo, Maria Ester y ROGEL Q. Juan Manuel. Op cit. p. 299 90 EWEIS Juana, et al. p., 169 91 MAROTO Arroyo, Maria Ester y ROGEL Q. Juan Manuel. Op cit. p. 301

57

Esta técnica se aplica en aquellos casos en los que exista contaminación tanto en

suelos como en aguas subterráneas producida por hidrocarburos de tipo

halogenado o no halogenado.

Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de la atenuación natural

se destacan las necesidades de reducción de la masa contaminante en un

intervalo razonable de tiempo, tanto en la superficie del suelo como en la zona

más subsuperficial del mismo, la confirmación de la existencia de los tipos y

número de poblaciones de microorganismos que puedan biodegradar los

contaminantes y la producción y conservación en el medio de subproductos de

carácter persistente o más tóxicos que los iniciales, durante y después de la

atenuación natural.

Biolabranza o Landfarming

Landfarming, también conocido como biolabranza, es una tecnología para la

remediación de suelos, la cual reduce concentraciones de componentes de

petróleo por medio de la biodegradación.

Esta tecnología implica generalmente la separación del suelo contaminado y la

estimulación de la actividad microbiana aerobia dentro de este a través de la

aireación y adición de minerales y nutrientes, manteniendo condiciones óptimas

de temperatura, pH y humedad requeridas en el proceso de biodegradación. Antes

de realizar un proceso de biolabranza in situ, generalmente se realizan ensayos de

laboratorio para determinar las condiciones óptimas para la biodegradación. En

general, se realizan pruebas para determinar la capacidad de campo del suelo y la

humedad óptima para la actividad microbiana; se hacen pruebas para determinar

la relación C:N:P con el fin de establecer si se necesitan aportes de nutrientes y se

58

mide el pH para determinar si es necesario ajustarlo para mantener la actividad

microbiológica92.

En el tratamiento de suelos contaminados por medio de la biolabranza, el medio

contaminado se esparce en capas finas y se voltea, con el fin de conseguir tanto la

aireación como la mezcla del suelo, lo cual mejora el transporte de masa y la

bioaccesibilidad. Para mejorar la actividad microbiológica dentro del proceso, se

realiza un seguimiento regular ajustando, cuando sea necesario el contenido de

humedad y el pH. Así mismo, otros factores importantes en el proceso de

biolabranza son la profundidad de la capa de suelo contaminado, el laboreo y la

adición de nutrientes93.

La profundidad a la cual se distribuye el suelo contaminado depende de las

propiedades del suelo, equipo de volteo y cantidad de suelo a tratar, siendo clave

para facilitar la difusión de oxígeno y así mantener las condiciones aerobias; como

regla general se aconseja que la profundidad sea menor de 30 cm, si se desea

conseguir un buen tratamiento94.

El volteo es necesario para airear el suelo e incrementar el contacto entre

microorganismos, nutrientes y contaminantes, mejorando así la biodegradabilidad

y la homogeneidad en los niveles de contaminación. El suelo que no se voltea

regularmente tendrá una limitación de oxígeno ya que la difusión de éste a través

de la superficie es relativamente baja; sin embargo, esto no significa que la

biodegradación no se produzca en suelos a los cuales no se les realiza volteo,

92 EWEIS Juana, et al. p., 188 93 Ibid., p. 193 94 Ibid., p.188

59

sino que las tasas de biodegradación serán probablemente mas bajas y el tiempo

para completar la biorrecuperación será mayor95.

La adición de nutrientes inorgánicos a menudo es necesaria para compensar la

ausencia de nitrógeno o fósforo en el suelo natural. La adición de altas

concentraciones de nutrientes puede originar dos problemas: el primero el

aumento en el costo y el segundo el efecto resultante de la salinidad y presión

osmótica. Si se necesitan altas concentraciones, entonces se pueden añadir los

nutrientes de manera gradual, en lugar de todo a la vez, al comienzo del

tratamiento96.

Por otro lado, la volatilidad de los contaminantes en el proceso de landfarming es

importante, ya que los componentes volátiles tienden a evaporarse del suelo

particularmente durante la labranza, antes de ser biodegradados por las bacterias.

Finalmente, algunas de las ventajas de la biolabranza son los bajos costos de

inversión y explotación en el tratamiento de residuos, la eficiencia en la

degradación de constituyentes orgánicos con tasas de biodegradación bajas y el

funcionamiento en periodos de tiempo relativamente cortos; sin embargo, la

biolabranza presenta como desventajas las grandes necesidades de espacio, la

inhibición del crecimiento microbiano debido a la presencia de metales pesados y

las altas tasas de volatilización en las cuales es muy probable que se emitan

COV´s biológicamente recalcitrantes debido a que el laboreo facilita el contacto

con la atmósfera97.

95 Ibid., p.193 96 Ibid., p.195 97 Ibid., p 199

60

2. MARCO REFERENCIAL

Alrededor de 1950, la biolabranza se convirtió en un método popular para el

tratamiento de los residuos peligrosos e industriales aplicados en forma líquida,

sólida o de fango98 y a principio de los años 70, se inicio la supervisión científica

de la biolabranza en la aplicación de terrenos contaminados con lodos, utilizando

el suelo como inóculo y medio de soporte para el crecimiento microbiano99; más

adelante se fueron optimizando los procesos en los experimentos de campo y de

laboratorio de manera sistemática100.

Desde 1960, en todo el mundo se han incluido nuevos métodos de recuperación

de terrenos y procesos para la biodegradación de determinados tipos de

compuestos bajo la categoría de procesos de tratamiento biológico. Durante los

últimos 30 años, la mayor parte de los estudios publicados sobre biorrecuperación

se han referido al tratamiento de aquellos terrenos contaminados con compuestos

derivados del petróleo; esto en parte debido a que la mayoría de los hidrocarburos

del petróleo son relativamente fáciles de degradar y como tales son susceptibles a

ser tratados mediante biorrecuperación.101 Así mismo, a nivel internacional se han

venido desarrollando desde hace algunos años estudios con relación a la adición

de microorganismos nativos para estimular el proceso de biorremediación de

hidrocarburos en suelos.

En Colombia el Instituto Colombiano del Petróleo (ICP) ha desarrollado desde los

años 80 tecnologías para el tratamiento de residuos aceitosos y aguas residuales 98 EWEIS Juana et al., Op cit ., p 198 99 ATLAS R. M. Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons: an Environmental Perspective. Microbiological Reviews, 1981. p. 180-209 100 DIBBLE, J. T. y BARTHA, R. Effect of Environmental Parameters on the Biodegradation of Oil Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 1979. p. 729-739 BROWN, K.W. y DONNELLI K.S. Influence and soil environment on biodegradation of a refinery and petrochemical sludge. Environmental Pollution.1983. ser 6. p. 119-132 101 EWEIS Juana et al., Op cit ., p 12

61

generadas por la industria del petróleo en las ciénagas aceitosas del Complejo

Industrial de Barrancabermeja. Estas tecnologías incluyen procesos de

biodegradación estimulada e intensiva de lodos, inyección de vapor y

deshidratación, entre otras;102 haciendo posible la depuración de aguas y lodos

contaminados asociados a la actividad petrolera, reduciendo las concentraciones

iniciales de fenoles en periodos de tiempo que no superan las 24 horas y

entregando efluentes que cumplen con las regulaciones ambientales

colombianas103.

Así mismo, el ICP con el fin de aumentar la eficacia en la degradación de los

hidrocarburos de petróleo, también ha desarrollado diferentes técnicas de

biorremediación como la biodegradación estimulada con aireación intensiva de

mezcla de relleno (lodo), presentando en su aplicación el 80% de remoción de

hidrocarburos; la biodegradación estimulada con aireación forzada en las eras, la

cual al ser aplicada obtuvo un porcentaje de remoción del 85% y el biorreactor de

lecho fluidizado, el cual obtuvo en la práctica un porcentaje de remoción de

hidrocarburos del 100%104.

En 1979, se realizó un estudio en New Jersey con suelos y lodos provenientes de

la refinería central, evaluando en el proceso de biodegradación de hidrocarburos

por medio de la técnica de biolabranza, los efectos de humedad, pH, niveles de

fertilizantes inorgánicos, micronutrientes y suplementos orgánicos, carga de lodos,

frecuencia en la aplicación de los tratamientos y la temperatura. En este estudio,

se logró degradar 91.000 L. de hidrocarburos por hectárea por estación105.

102 RAMIREZ, N.E., VARGAS, M.C. y SANCHEZ, F.N. Use of the "Sediment-Chromotest" for Monitoring Stimulated Hydrocarbon Biodegradation Processes. Environmental Toxicology and Water Quality An International Journal. 1996. p. 223-230. 103 www.icp.ecopetrolcom.co/technologicaloffer/technlogies.html. 104 ECOPETROL. Sistema trifásico para la biodegradación intensiva de lodos aceitosos en sitio. 1995 105 DIBBLE J and BARTHA R. Effect of enviromental parameters on the biodegradation of oil sludge.1979

62

En 1997, se realizó un estudio utilizando microorganismos nativos en dos suelos

de tipo agrícola, aplicando la técnica de biolabranza. El primer suelo contenía

0.3% de materia orgánica y un pH de 8.2, obteniendo una degradación del 50%.

El segundo suelo contenía 20.3% de materia orgánica y un pH de 4, en el cual se

obtuvo una degradación del 75%106.

En el año de 1998, se realizó un estudio utilizando la técnica de biolabranza con

adición de microorganismos y nutrientes en suelos contaminados con creosota. En

este estudio, se obtuvo una reducción de 6200 ppm a 800 ppm y de 3000 ppm a

100 ppm, en 30 días107.

En 1999, se realizó un estudio en campos petroleros en Argentina de las presas

de desecho sin membrana, con lodos de perforación de emulsión inversa y

recortes contaminados, en el cual se mezcló el lodo y suelo y se adicionó

fertilizante. Así mismo, se realizó un estudio paralelo adicionando fertilizante más

bacterias autóctonas, obteniendo reducción de hidrocarburos de casi 1000 ppm.

en tres semanas108.

En ese mismo año, se realizó un estudio en suelos impactados por petróleo en el

sureste mexicano, realizando el proceso de biodegradación por medio de

bacterias nativas e introducidas para saneamiento de agua y vegetación

impregnada por hidrocarburos. Se obtuvo una reducción de TPH´s de 3400 ppm a

70 ppm, en 30 días109.

106 SARANITRO Joseph et al. Crude oil hidrocarbon bioremediation and soil ecotoxicities assesment. 1997 107 BOGAT J. D. and LEAGUE J. R. Biological remediation of underground storages facilities. 1998 108 ADAMS et al. Potencial de la Biorremediación de suelo y agua impactados por petróleo en el trópico mexicano. 1999 109 Ibid.

63

En el 2001, se realizó un estudio en suelos y aguas subterráneas de Corea, por

medio de la atenuación natural en zonas, teniendo en cuenta el cambio de

estaciones en el lugar de estudio, obteniendo una biodegradación del 50%.

Simultáneamente, se realizó una mezcla de vegetación impregnada de aceite con

lodos, disponiendo la mezcla en landfarming aplicando bacterias y nutrientes,

logrando un saneamiento satisfactorio en un año110.

En ese mismo año, se realizó un estudio en la refinería de Mathura a 150 Km. al

sur de Delhi. Realizando el proceso de la biorremediación por medio de la adición

de inóculos como microorganismos y nutrientes en un suelo contaminado con

lodos aceitosos. El estudio se realizó en dos parcelas problema y una parcela

control, logrando una reducción de TPH´s entre el 92% y 89.7% en un año,

comparada con el control, el cual tuvo una reducción del 14%111.

Por otro lado, dentro de las múltiples técnicas desarrolladas para el tratamiento de

terrenos contaminados con petróleo, la biolabranza ha sido usada de manera

exitosa por años para el control y disposición de lodos aceitosos y otros residuos

provenientes de la refinación del petróleo, ya que permite reducir altas

concentraciones de hidrocarburos hasta niveles aceptables en un lapso de tiempo

razonable y a muy bajo costo .

En el 2002 se realizó un estudio alrededor de las plataformas en el oriente

ecuatoriano, teniendo unas concentraciones iniciales de TPH´s entre 50.000 ppm.

y 12.000 ppm. Se inoculó el material contaminado por petróleo con varias cepas

de microorganismos combinados con aminoácidos, enzimas, vitaminas, minerales

110 CHEO Hyo Lee et al Attenuation of petroleum hidrocarbons in smear zones: a case study. 2001 111 MISHRA et al. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily - sludge -contaminated soil. 2001

64

y nutrientes, realizando aireación periódica mediante labranza. Se lograron

concentraciones inferiores a 5000 ppm y 3000 ppm. en 90 días de tratamiento112.

Finalmente, los investigadores de la Universidad de los Andes del Centro de

Investigaciones Microbiológicas (CIMIC), han realizado investigaciones a partir de

1991, en las cuales se han evaluado diferentes cepas degradadoras de

hidrocarburos de petróleo in vitro, a partir de pooles microbianos de cepas nativas

obtenidas de suelos de la región de Caño Limón.

112 WINI Schmidt. Suelos contaminados con hidrocarburos: la biorremediación como una solución ecológicamente compatible. 2002

65

3. MATERIALES Y MÉTODOS Se realizó un estudio de tipo experimental y prospectivo en suelo procedente de la

finca San Javier propiedad de la Universidad Pontificia Javeriana (PUJ) localizada

en Nemocón Cundinamarca a 2585 msnm y una temperatura promedio de 14 ºC,

el cual fue contaminado con petróleo tipo crudo de castilla suministrado por

ECOPETROL. El estudio se desarrolló durante el periodo de noviembre de 2003 a

febrero de 2004.

El suelo de Nemocón esta catalogado como un suelo de clima frío y húmedo el

cual presenta texturas finas a moderadamente finas, cuya profundidad efectiva

está limitada por fluctuaciones del nivel freático; su pH varía de 4.5 a 5,113 lo cual

químicamente lo clasifica como un suelo muy ácido, con alta saturación de bases,

alto contenido de carbono orgánico y alta saturación de aluminio.114

El perfil de este suelo, presenta las siguientes características: el primer horizonte

es de textura arcillosa de color gris a pardo grisáceo, con presencia de

macroorganismos, raicillas abundantes y un pH moderadamente ácido. El

segundo horizonte es arenoso, de color pardo grisáceo oscuro con abundantes

manchas amarillas las cuales se han originado por el mal drenaje; no hay

presencia de macroorganismos y el pH es moderadamente ácido. El tercer

horizonte es franco orgánico, de color negro, con gran cantidad de material vegetal

parcialmente descompuesto casi en contacto con el nivel freático.115 En Nemocón,

se desarrollan actividades económicas como la ganadería y transitoriamente la

agricultura, sobresaliendo los cultivos de arveja, trigo, cebada y maíz.

113 CORREAL URREGO Gonzalo. Investigaciones arqueológicas en abrigos rocosos de Nemocón y Sueva. 1979.p. 25. 114 SUBDIRECCIÓN AGROLÓGICA. Estudio general de suelos de los municipios de Ubate y norte de la sabana de Bogotá. 1982. p. 106, 108. 115 CORREAL URREGO GONZALO, Op cit. P. 25, 26.

66

3.1 PROCEDIMIENTO

La muestra de suelo a contaminar se recolectó escogiendo tres puntos

aleatoriamente dentro del terreno seleccionado en la finca San Javier.

Posteriormente, se procedió mediante palas a retirar tanto la cobertura vegetal

como el suelo presente en el terreno a una profundidad aproximada de 20 cm116;

a partir de esta profundidad se recolectaron 250 Kg. de suelo. Posteriormente, el

suelo recolectado se trasladó a las instalaciones de la PUJ con el fin de

contaminarlo con el petróleo.

En las instalaciones de la PUJ , con el fin de obtener una concentración de

hidrocarburos totales de petróleo mayor a 10.000 mg./Kg. (Véase Anexo 1), se

mezclaron los 250 Kg. de suelo con 6 litros de petróleo, homogenizándolos por

volteo manual seis horas diarias durante un periodo de cuatro días. Al cabo de

este periodo, el suelo contaminado con el petróleo fue tamizado empleando

costales con el fin de obtener una textura uniforme que permitiera homogenizar el

tamaño de partícula de suelo en el momento de la toma de muestras.

Para la realización de los montajes de las unidades experimentales y controles

bióticos en el laboratorio, el suelo contaminado en la PUJ fue trasladado al

laboratorio de microbiología del departamento de Ciencias Básicas de la

Universidad de La Salle en seis cajas de polietileno como se observa en la figura

4.

116 Environmental Protection Agency. Preparation of Soil Sampling Protocols: Sampling Techniques and strategies. Capítulo 7. 1992

67

FIGURA 4. Caja de polietileno utilizada para los montajes en laboratorio.

De las seis cajas, tres fueron consideradas como unidades experimentales (UE)

agregándoles fosfato di básico de potasio (K2HPO4) y nitrato de amonio (NH4NO3),

con el objeto de evaluar el efecto de la adición de las sales inorgánicas simples; a

las tres cajas restantes no se les agregaron sales y fueron consideradas como

controles bióticos (CB).

Posteriormente, en el laboratorio de suelos del Instituto Geográfico Agustín

Codazzi I.G.A.C., se realizó la caracterización inicial del suelo contaminado de

cada una de las unidades experimentales y controles bióticos, evaluando los

parámetros de densidad aparente, humedad y cuantificación de nutrientes

(nitratos, amonio y fósforo asimilable) con el fin de determinar la cantidad de

K2HPO4 y NH4NO3 necesarias para cumplir la relación C:N:P de 100:10:1117, como

se determina en el Anexo 2. De la misma manera, en el laboratorio PRODYCON

LTDA. se realizó el análisis correspondiente a la cantidad inicial de TPH´s

presentes en el suelo.

117 RAMÍREZ, A and VIÑA, G. Limnología Colombiana, Aportes a su Conocimiento y estadística de análisis. Editorial Panamericana, Bogotá. 1998.

68

A cada una de las unidades experimentales y controles bióticos se les llevo a cabo

semanalmente un volteo manual como se observa en la figura 5 y un riego con

agua potable por medio de una regadera con capacidad de 2 L., agregando

aproximadamente 1.5 L., con el fin de asegurar tanto el suministro de oxígeno en

la actividad celular de los microorganismos como la humedad necesaria requerida

por los mismos. Así mismo, a cada uno de ellos se les realizó un control periódico

de temperatura, pH y porcentaje de humedad.

FIGURA 5. Realización de volteo manual

Por otro lado, con el fin de evaluar por duplicado el efecto de la adición de las

sales inorgánicas simples así como el proceso de degradación; se tomaron

mensualmente dos muestras compuestas en cada una de las unidades

experimentales y controles bióticos, para realizar análisis de nutrientes como

nitratos, amonio y fósforo asimilable, análisis microbiológicos como conteo de

heterótrofos totales y número más probable (NMP) y los análisis correspondientes

a hidrocarburos totales de petróleo (TPH´s) y determinación de hidrocarburos

policíclicos aromáticos (PAH’s).

69

De la misma manera, los análisis de nutrientes a través del tiempo de estudio,

fueron realizados en el laboratorio de suelos del Centro de Investigaciones y

Asesorías Agroindustriales de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano,

mientras que los análisis microbiológicos, los análisis de TPH’s y los análisis

correspondientes a PAH’s, se realizaron en la Universidad de La Salle.

Finalmente, al cabo de los cuatro meses de tratamiento, se realizó el aislamiento e

identificación de los microorganismos degradadores de petróleo presentes en

cada una de las unidades experimentales y controles bióticos.

A continuación, se explica de manera específica cada uno de los procedimientos

mencionados anteriormente, los cuales se llevaron a cabo a lo largo del periodo

de investigación como se observa en la figura 6.

70

Figura 6. Metodología de la investigación

Fuente: Autores,2004

Recolección del suelo a contaminar

Traslado del suelo a la PUJ

Mezcla del suelo y el petróleo Volteo durante un periodo de cuatro días Tamizado del suelo contaminado con petróleo

Distribución del suelo en UE y CB

Traslado del suelo contaminado a la ULS

Caracterización inicial del suelo (nutrientes yTPH´s)

Adición de las sales inorgánicas a las unidades eRealización de análisis de nutrientes, control de T°, pH y %H, análisis microbiológicos, TPAislamiento e identificación de microorganismos

degradadores de petróleo

METODOLOGÍAA

Resultados

71

Mezcla del suelo y el petróleo

En las instalaciones de la PUJ se mezclaron los 250 Kg. de suelo recolectados en

la finca San Javier, con los 6 L. de petróleo tipo castilla buscando obtener una

concentración final de TPH´s mayor a 10.000 mg. / Kg. en peso seco118.

El suelo y el petróleo se homogenizaron por volteo manual durante seis horas

diarias y un periodo de cuatro días; al cabo de este tiempo, el suelo contaminado

con el petróleo, fue tamizado empleando costales con el fin de obtener una textura

uniforme de las partículas.

Montaje del ensayo en el laboratorio

Para la realización de los montajes del ensayo en el laboratorio, el suelo

contaminado en la PUJ fue trasladado al laboratorio de microbiología del

departamento de Ciencias Básicas de la Universidad de La Salle en seis cajas de

polietileno; estas cajas se ubicaron en estantes dentro del laboratorio.

Las dimensiones de las cajas de polietileno que se utilizaron para realizar el

montaje de las unidades experimentales y controles bióticos fueron de 40 cm de

ancho, 60 cm de largo y 25 cm de profundidad, disponiendo en cada una de ellas

33.7 Kg. de suelo contaminado hasta una altura de 13 cm. aproximadamente.

De las seis cajas, tres fueron consideradas como unidades experimentales (UE)

y las tres cajas restantes fueron consideradas como controles bióticos (CB).

118 CLEVES, I & SANDOVAL, M. Evaluación de la Biodegradación de Hidrocarburos presentes en suelos contaminados con Lodos Aceitosos de la Industria Petrolera ( HUILA- COLOMBIA ). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad Ciencia Básicas. 2001.

72

En las unidades experimentales, se agregó fosfato di básico de potasio (K2HPO4) y

nitrato de amonio (NH4NO3), con el objeto de evaluar el efecto de la adición de las

sales inorgánicas simples; el NH4NO3 y el K2HPO4 fueron adicionados a las tres

unidades experimentales de la siguiente manera: el 50% se agregó al inicio del

proceso, el 25% se agregó en el segundo mes y el 25% restante en el tercer mes,

como se determina en el Anexo 3, con el fin de obtener un mayor aporte de

nitrógeno y fósforo en el proceso de biodegradación119.

Recolección de las muestras

Para la toma de suelo de las unidades experimentales y de los controles bióticos,

con el fin de realizar los análisis de nutrientes, pH, humedad, análisis

microbiológicos, TPH´s y PAH´s, se realizó un muestreo compuesto en el cual

cada muestra se recolectó tomando cuatro puntos dentro de cada una de las cajas

por medio de números aleatorios y una cuadrícula de 60 cm. de largo por 40 cm.

de ancho dividida en cuadros de 5 cm120 como se observa en las figuras 7 y 8.

119 DIBBLE, J.T. and BARTHA, R. Effect of Environmental Parameters on the Biodegradation of Oil Sludge. Applied and Environmental Microbiology, p. 729 - 739. 1979. REYNOLDS, C.H., BHUNIA, P. and KOENEN, B.A. Soil remediation demonstration project: Biodegradation of heavy fuel oils. US Army Corps of Engineers. 1997, BELLOSO, C. and CARRARIO, J. Bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos contaminados. p. 1 -4, Asociación Interamericana de Ingeniería Sanitaria. 1998. 120 Environmental Protection Agency. Op Cit.

73

FIGURA 7. Cuadricula utilizada para la FIGURA 8. Cuadricula utilizada para la

recolección de muestras recolección de muestras

Las muestras se depositaron en bolsas plásticas resellables con capacidad

aproximada de 1 lb. y cada una de ellas fue rotulada de acuerdo a los parámetros

de muestreo tales como: fecha, unidad experimental o control biótico y número de

muestra.

Para realizar los análisis de nitrato, amonio y fósforo asimilable se tomaron

muestras compuestas de 500 g. de suelo contaminado de cada una de las

unidades experimentales y controles bióticos.

Así mismo, para los análisis microbiológicos se tomaron muestras compuestas de

200 g. de suelo contaminado de cada una de las unidades experimentales y

controles bióticos y se realizó el análisis de recuento de heterótrofos totales y

número más probable.

Finalmente, se tomaron muestras compuestas de cada una de las unidades

experimentales y controles bióticos para los análisis de TPH´s, pH y humedad, de

1 g. , 50 g. y 10 g. respectivamente.

74

Evaluación de los parámetros fisicoquímicos

Para la evaluación de los parámetros fisicoquímicos del suelo se tuvieron en

cuenta nutrientes, temperatura, pH y humedad; estos parámetros se midieron de

la siguiente manera:

Los análisis de nutrientes se realizaron en el Centro de Investigaciones y

Asesorías Agroindustriales de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.

La determinación del NO3, NH4 y fósforo asimilable, tiene como objetivo establecer

el comportamiento de los nutrientes a lo largo del periodo de estudio en cada una

de las unidades experimentales y controles bióticos. La determinación del NO3 y

NH4, se llevó a cabo utilizando el método KCl 1N y el fósforo asimilable se

determinó por medio del método Bray II, debido a que este método se encuentra

estandarizado en el país para suelos de pH ácidos como se observa en el anexo

4.

- Medición de temperatura

Las mediciones de temperatura se llevaron a cabo semanalmente en cada una de

las unidades experimentales y controles bióticos por medio de un termómetro de

máximos y mínimos marca Mengte como se observa en la figura 9.

75

FIGURA 9. Medición de temperatura.

- Medición de pH

Las mediciones de pH se realizaron semanalmente utilizando un peachimetro

marca Fisher Accumet; para llevar a cabo lo anterior, se utilizaron 12 erlenmeyer

de 250 ml. En cada uno de los erlenmeyer se pesaron 50 g. de suelo

contaminado de cada una de las muestras y se agregaron 125 ml. de agua

destilada; posteriormente, los erlenmeyer se agitaron en shaker marca Lab line a

120 rpm durante 15 minutos y se dejó decantar 1 hora realizando la lectura en

cada una de las muestras como se observa en la figura 10.

FIGURA 10. Medición de pH.

76

- Determinación del porcentaje de humedad

El porcentaje de humedad se realizó cada 2 semanas. Para determinar el

porcentaje de humedad se pesaron 10 g. de suelo contaminado de cada una de

las 12 muestras recolectadas dejándose en la estufa marca MLW a una

temperatura de 107 ºC durante 24 horas como se observa en las figuras 11 y 12.

FIGURA 11. Determinación de %H. FIGURA 12. Determinación de %H.

Al cabo de este tiempo las muestras se pesaron de nuevo en una balanza

analítica marca Mettler Toledo determinando el porcentaje de humedad de cada

una de las unidades experimentales y controles bióticos. El cálculo del porcentaje

de humedad se determinó de la siguiente manera:

100sec

% ×−

=humedosueloPeso

osueloPesohumedosueloPesoHumedad

Evaluación microbiológica

Para realizar la evaluación microbiológica del proceso de degradación en el

tiempo de estudio, se llevó a cabo el recuento de heterótrofos totales, número

77

más probable (NMP) y aislamiento e identificación de los microorganismos

presentes en el suelo contaminado.

- Técnica de recuento de heterótrofos totales

El método de recuento en placa en superficie se emplea para la recuperación y

conteo de microorganismos totales presentes en el suelo. El recuento se realiza a

partir de los microorganismos capaces de crecer en medios enriquecidos como el

agar infusión suelo, el cual suple las necesidades nutricionales que se encuentran

presentes en su hábitat natural.

Este método se empleo con el fin de determinar la cantidad de UFC presentes en

cada una de las muestras. El recuento en placa de heterótrofos totales, se llevó a

cabo con diluciones de 10-2 hasta 10-6 para un total de 5 diluciones para cada una

de las muestras.

El agar infusión suelo se preparó utilizando 20 g./L de agar nutritivo, 200 ml./L. de

infusión suelo y 800 ml./L de agua destilada. La infusión suelo se preparó

mezclando 500 g. de suelo orgánico con 1000 ml. de agua destilada los cuales se

agitaron en shaker durante 15 minutos a 120 rpm; se dejó precipitar el suelo y

posteriormente se centrífugo hasta obtener los 200 ml. necesarios para preparar el

agar, en una centrífuga marca Hermle como se observa en la figura 13.

78

FIGURA 13. Centrífuga

Finalmente, el medio se esterilizó en autoclave a 121ºC y 16 atm. de presión

durante 30 minutos, al cabo de este tiempo y en condiciones asépticas se

dispensó el agar en las cajas de petri. De acuerdo a lo anterior, se prepararon

3050 ml. de agar infusión suelo.

Con el fin de inocular las cajas de petri se prepararon las diluciones de cada una

de las muestras en agua buferada. Los reactivos empleados para la preparación

de un litro de agua buferada fueron 0.085 g. de fosfato monobásico de potasio

(KH2PO4) y 0.405 g. de cloruro de magnesio exha hidratado (MgCl2.6H2O). Para

preparar cada litro se disolvió el KH2PO4 y el MgCl2..6H2O en 1.25 ml. y 5 ml. de

agua destilada respectivamente; luego se llevó a un volumen de 1000 ml y se

esterilizó en la autoclave a 121ºC y 16 atm. de presión durante 30 minutos. De lo

anterior, se prepararon dos litros. Posteriormente se realizaron diluciones utilizando 12 erlenmeyer de 250 ml., 60

tubos tapa rosca con capacidad de 10 ml. y 72 pipetas de 1 ml. Cada uno de los

erlenmeyer y tubos de ensayo se marcaron según la unidad experimental y control

biótico, muestra, dilución y réplica.

79

A cada uno de los erlenmeyer se les agregó 10 g. de suelo de la muestra

correspondiente y 90 ml. de agua buferada obteniendo la dilución 10-1;

posteriormente se colocaron en el shaker durante 25 minutos como se muestra en

la figura 14 y una vez cumplido el tiempo se dejaron decantar; a partir de esta

dilución se prepararon las demás diluciones.

FIGURA 14. Preparación de la dilución 10-1

Una vez preparadas las diluciones se procedió a inocular las cajas de petri con 0.1

ml de la dilución correspondiente, incubándolas por 7 días a temperatura

ambiente, tiempo en el cual se realizaron los conteos de las UFC que crecieron

en cada una de las cajas, como se observa en las figuras 15 y 16.

80

FIGURA 15. Crecimiento de UFC. FIGURA 16. Crecimiento de UFC.

Con el fin de obtener los resultados en gramos de peso seco, los reportes del

recuento de heterótrofos totales de cada una de las muestras se realizó de la

siguiente manera:

humedosueloPesoosueloPeso

opesoenFracciónsec

sec =

opesodefracciónpositivapotencialaaelevadoreplicapromedio

totalesosheterotrofsec

=

- Técnica de número más probable Mediante la técnica de número más probable se determina la concentración de

bacterias que presentan la capacidad metabólica para degradar hidrocarburos de

petróleo. Para su crecimiento se emplea un medio líquido mineral como el caldo

Bushnell - Haas (BH) enriquecido con un sustrato hidrocarbonado el cual

suministra la fuente de carbono y energía para el crecimiento de la población

81

microbiana.121 Para confirmar la presencia o ausencia de microorganismos se

puede utilizar como indicador el Iodonitrotetrazolium (INT). Este compuesto

compite con el oxígeno por los electrones de la cadena respiratoria, reduciéndose

a un compuesto insoluble de color rojo en el caso de haber metabolismo; sin

embargo, hay que tener en cuenta que es necesario tener una concentración

aproximada de una a nueve células para que el pozo pueda dar positivo122

Para cada una de las 12 muestras recolectadas se utilizaron placas de 96 pozos

de fondo en U sin tapa marca Falcon, caldo BH, kerosene como fuente de carbono

e INT al 3% marca Sigma.

Se prepararon 250 ml. de caldo BH de la siguiente manera: 0.05 g. de

MgSO4.7H2O, 0.005 g. de CaCl2, 0.25 g. de K2HPO4, 0.25 g. de NH4NO3, 5 g. de

NaCl y 0.0125 g. de FeCl3.6H2O, llevando a un volumen de 250 ml. con agua

destilada y esterilizado en autoclave a 121ºCy 16 atm. de presión durante 30

minutos.

En cada placa se realizaron seis diluciones (10-1 a 10-6) cada una con cinco

replicas. En cada uno de los 5 pozos se dispuso 180 µl. de BH, 5 µl. de kerosene y

20 µl. de la dilución correspondiente. Por otro lado, en la misma placa se

realizaron tres controles cada uno con seis replicas de la siguiente manera: a los

pozos del primer control se les agregó 205 µl. de BH; a los pozos del segundo

control se les agregó 200 µl. de BH y 5 µl. de kerosene y a los pozos del tercer

control se les agregó 185 µl. de BH y 20 µl. de la mayor dilución de la muestra,

incubando a temperatura ambiente durante 15 días.

121 BRADDOCK, J.F. and BROWN, E.J. Microbial Populations and Hydrocarbon Biodegradation Potentials in Fertilized Shoreline Sediments Affected by the T/V. 1991. 122 HAINES et al., Bioremediation of an experimental spill on the shoreline of Delaware Bay. Environmental Science and Technology 30, 1996.

82

Al cabo de este tiempo, a cada uno de los pozos tanto de las diluciones como de

los controles, se les agregó 50 µl. de INT al 3% y nuevamente se incubó por 16

horas a temperatura ambiente; los resultados obtenidos se analizaron en el

programa Most Probable Number Calculator, versión 4.04 de 1996 cuya finalidad

es determinar la densidad de microorganismos presentes en una muestra

determinada, como se observa en la figura 17.

FIGURA 17. Placa de 96 pozos con reactivo INT al 3%.

Finalmente, para obtener el reporte en gramos de peso seco de cada una de las

muestras se realizó dividiendo el resultado de NMP arrojado por el programa en

ml. en la fracción de peso seco de cada una de las muestras .

- Aislamiento e identificación de microorganismos degradadores de petróleo

El aislamiento e identificación de los microorganismos tiene como objetivo

determinar el tipo de microorganismos presentes en el suelo contaminado capaces

de degradar hidrocarburos de petróleo.

83

Para llevar a cabo el aislamiento de los microorganismos se utilizó BH como

medio líquido distribuido en 12 erlenmeyer de 100 ml. y agar BH al 1.5%

distribuido en 12 cajas de petri respectivamente.

A cada uno de los erlenmeyer se les agregó 0.1 g. de suelo de cada una de las

muestras de las unidades experimentales y controles bióticos, 50 ml. de BH líquido

y 1 ml. de kerosene como fuente de carbono; posteriormente, se agitó en shaker a

120 rpm durante 3 días como se observa en la figura 18.

FIGURA 18. Aislamiento de microorganismos degradadores de petróleo

Al cabo de este tiempo, se preparó el agar BH y se dispenso en cada una de las

cajas de petri. Posteriormente, en cada una de las cajas, se realizó un estriado de

cuatro zonas con petróleo crudo, con el fin de asegurar la fuente de carbono

utilizada por los microorganismos.

Finalmente, las cajas de petri fueron inoculadas con 0.1ml. de los medios líquidos

contenidos en los erlenmeyer y fueron incubadas a 37 ºC durante 48 horas, tiempo

en el cual se realizó la identificación de los microorganismos por medio de BBL

Cristal.

84

Determinación de hidrocarburos totales de petróleo (TPH’s) La determinación de TPH’s tiene como objetivo extraer todos los hidrocarburos

totales de petróleo presentes en un suelo contaminado 123; sin embargo, para

llevar a cabo esta técnica es necesario realizar extracciones en fase sólida.

Con el fin de determinar los TPH’s presentes en cada una de las muestras

recolectadas, se utilizaron 26 erlenmeyer de 250 ml. y 13 tubos de ensayo de 10

ml., los cuales se pesaron antes y después de realizada la extracción en fase

sólida.

Para realizar la extracción en fase sólida se agregó 1 g. de suelo de la muestra y

10 ml. de diclorometano en un erlenmeyer de 250 ml.; después se agitó en shaker

a una velocidad de 120 rpm durante 30 minutos. Al cabo de este tiempo, el

contenido del erlenmeyer se filtró al vacío a través de papel filtro marca Whatman

el cual tenía en su superficie silica gel activada (capa aproximada de 2 mm.),

recogiéndose el extracto filtrado en otro erlenmeyer. Este proceso desde la adición

del diclorometano se repitió dos veces más y finalizada la última filtración, se lavó

el suelo con 10 ml. de diclorometano, el cual se agregó al erlenmeyer que

contenía todo el extracto, obteniéndose un volumen final de 40 ml. Para la

extracción en fase sólida del blanco, al erlenmeyer no se le agregó suelo

contaminado y el procedimiento se realizó de la misma manera.

El extracto obtenido al final del proceso se trasvasó a un balón y se evaporó al

vacío en un rotavapor marca Heidolph a una temperatura de 60 ºC hasta obtener 5

ml.; posteriormente, los 5 ml. fueron trasvasados a un tubo de ensayo previamente

123 Schwab A.P , Su J .Extraction of petroleum hydrocarbons from soil by mechanical shaking. 1999

85

pesado. Después se lavó el balón con 5 ml. de diclorometano y se agregaron al

mismo tubo de ensayo.

El extracto recogido en el tubo de ensayo se evaporó a sequedad en baño maría

marca Memmert a una temperatura de 60 ºC bajo una campana extractora, luego

el tubo se colocó en la estufa a una temperatura de 107 ºC durante

aproximadamente 5 minutos.

Una vez frío el tubo de ensayo, se pesó y se determinó por gravimetría la cantidad

de hidrocarburos totales de petróleo presentes en la muestra de suelo

contaminado teniendo en cuenta la ganancia en peso de los tubos de ensayo. Los

cálculos de los TPH´s se realizaron de la siguiente manera:

)(

)(

extraccióninicioblancopesoextraccionfinalblancopeso

extraccióniniciotubopesoextracciónfinaltubopesopesoenGanancia

−−

−=

humedosueloPesoosueloPeso

opesoenFracciónsec

sec =

opesoenFraccióngmuestraladePesosueloKgsuelog

TPHgTPHmg

gpesoenGananciaKgmgsTPH

sec.)(.1.1000

.1.1000

.)(.)/.('

×

××

=

Determinación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH’s)

Esta determinación se realiza con el objetivo de identificar los PAH´s presentes en

una muestra de suelo contaminado y en que concentraciones se encuentra cada

uno de ellos. Para determinar los PAH´s se empleó la cromatografía líquida, la

86

cual consiste en la separación de sustancias químicas por medio de solventes,

que permiten que los componentes que se separan se distribuyan en dos fases:

una constituida por un soporte estacionario de gran superficie y otra por un líquido

que se filtra por la fase estacionaria. La identificación de estos compuestos se

llevo a cabo en el cromatógrafo HPLC (High Performance Liquid

Chromatography), el cual se observa en las figuras 10 y 20.

FIGURAS 19 y 20. Cromatógrafo HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Para determinar estos hidrocarburos, se estableció un método de identificación,

utilizando una ampolleta comercial la cual contenía los 16 compuestos a una

concentración de 2000 ppm, con la cual se realizaron curvas de calibración a

concentraciones de 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 90 ppm, 100 ppm y 500 ppm

diluyendo el contenido de la misma en acetonitrilo. Como solventes se utilizaron

agua milli Q y acetonitrilo.

87

Por medio de las curvas de calibración, se estableció el tiempo al cual el HPLC

detectaba cada uno de los 16 compuestos, lo cual permitió establecer las

condiciones de identificación de los PAH´s en el método anteriormente

establecido.

Con el fin de obtener el extracto a inyectar en el HPLC, a cada uno de los tubos de

ensayo utilizados en las extracciones en fase sólida y después de calculados los

TPH´s, se les agregó 0.1 ml de diclorometano y 0.9 ml. de acetonitrilo con el fin de

disolver la muestra y poder inyectarla en el cromatógrafo.

Finalmente, cada una de las gráficas realizadas por el cromatógrafo fueron

analizadas con el fin de especificar los PAH´s encontrados en cada una de las

muestras de suelo contaminado y las concentraciones de cada uno de ellos.

Determinación de métodos estadísticos

Los resultados obtenidos a lo largo del estudio, se procesaron mediante el

programa estadístico SPSS y se aplicaron pruebas estadísticas como Anova de un

factor y la prueba de Duncan con el fin de hallar diferencias entre las unidades

experimentales y controles bióticos durante el tiempo de observación. Así mismo,

se calcularon coeficientes de relación para las variables de temperatura, humedad

y pH y estas a su vez con nutrientes y TPH´s, considerando una diferencia

estadísticamente significativa P < 0.005.

88

4. RESULTADOS

A continuación, se presentan los resultados de los análisis fisicoquímicos

(nutrientes, pH, temperatura y humedad), los análisis microbiológicos (recuento de

heterótrofos y NMP) y los análisis de hidrocarburos (TPH´s y PAH´s), obtenidos a

lo largo del estudio.

4.1 Análisis fisicoquímicos 4.1.1 Análisis de nutrientes

Los nutrientes NO3, NH4, P asimilable y N mineral analizados inicialmente en el

suelo contaminado, en el laboratorio de suelos del I.G.A.C., arrojaron los

siguientes resultados:

Tabla 6. Resultados de análisis iniciales de nutrientes en el suelo contaminado.

ANÁLISIS RESULTADOS

Nitratos 94,9 ppm.

Amonio 2,3 ppm.

N-mineral 97.2 ppm.

Fósforo asimilable 120 ppm.

Fuente: Instituto Geográfico Agustín Codazzi, 2003.

A los resultados de nutrientes obtenidos a lo largo del periodo de estudio (Véase

Anexo 5), se les realizaron los análisis estadísticos, los cuales determinaron lo

siguiente:

89

N – NO3

En los dos grupos de estudio, se presentó un incremento estadísticamente

significativo (P < 0.001) en las concentraciones de este nutriente. En las unidades

experimentales, se alcanzaron valores promedios de 1068.87 ppm; sin embargo,

en los controles bióticos la concentración del NO3, alcanzó valores promedios de

171.175 ppm. como se observa en la tabla 7 y figura 21.

Tabla 7. Concentración de N-NO3 a lo largo del periodo de estudio.

N-NO3 GRUPO Noviembre Diciembre Enero Febrero

CB1 M1 120,2 163,9 185,9 205,9 CB1 M2 139,4 180,8 167,6 216,5 CB2 M1 138,8 155,8 167,6 207,3 CB2 M2 127 153,4 148,3 178,6 CB3 M1 111,1 157,2 170,6 248,1 CB3 M2 132,4 155,2 166,1 310,5

x = 171.175 ppm. UE1 M1 716,9 841,9 1257,4 1215,4 UE1 M2 499,2 1239,5 642,4 893,4 UE2 M1 770,1 820,6 1225,1 2161,4 UE2 M2 591,8 1010,9 1225,8 2192,1 UE3 M1 781,1 917,5 1037 1848,1 UE3 M2 726,9 909,3 1129,4 999,9

x = 1068.879 ppm.

Fuente. Autores, 2004.

90

Figura 21. Valores promedios de concentraciones de N-NO3 en U.E. y C.B. a través del tiempo

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

N-N

O3

(ppm

)

3000

2000

1000

0

-1000

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

Fuente: Autores, 2004.

N-NH4

En las concentraciones de este nutriente, se presentó un incremento

estadísticamente significativo con P < 0.001, en los dos grupos de estudio. En las

unidades experimentales, se alcanzaron valores promedios de 804.679 ppm; sin

embargo, en los controles bióticos la concentración del NH4, alcanzó valores

promedios de 54.212 ppm. como se observa en la tabla 8 y figura 22.

Tabla 8. Concentración de N-NH4 a lo largo del periodo de estudio.

N-NH4 GRUPO Noviembre Diciembre Enero Febrero

CB1 M1 50 55,2 61 56,3 CB1 M2 41,9 41,9 44,5 83 CB2 M1 36,3 63,7 149 54,4 CB2 M2 26,7 35 52 45,7 CB3 M1 26,6 30,1 50 59,1 CB3 M2 85 38 66,9 48,8

x = 54.212 ppm UE1 M1 484,4 595,1 924,6 919,3 UE1 M2 418,5 145,2 901 1397

P < 0.001

91

UE2 M1 541,7 558,8 889,3 1526 UE2 M2 577,2 696,4 878,7 1563,7 UE3 M1 583,6 556,3 912 1294,1 UE3 M2 505,6 554,6 756,1 1133,1

x = 804.679 ppm

Fuente: Autores, 2004. Figura 22. Valores promedios de concentraciones de N-NH4 en U.E . y C.B. a través del tiempo

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

N-N

H4

(ppm

)

2000

1000

0

-1000

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

Fuente: Autores, 2004.

P asimilable

En los dos grupos de estudio, se presentó un incremento estadísticamente

significativo con P < 0.001 en las concentraciones de este nutriente. En las

unidades experimentales, se alcanzaron valores promedios de 213.029 ppm; sin

embargo, en los controles bióticos la concentración del P asimilable, alcanzó

valores promedios de 146.741 ppm. como se observa en la tabla 9 y figura 23.

P < 0.001

92

Tabla 9. Concentración de P asimilable a lo largo del periodo de estudio.

P asimilable GRUPO Noviembre Diciembre Enero Febrero

CB1 M1 98 101 165,1 221

CB1 M2 88 97 174,6 205

CB2 M1 101 115 152,1 242

CB2 M2 93 107 160,8 223

CB3 M1 84 114 166,5 235

CB3 M2 108 111 132,7 227

x = 146.741 ppm

UE1 M1 122 144 227,2 368

UE1 M2 137 151 232,8 317

UE2 M1 97 146 213,5 313

UE2 M2 129 151 229,9 334

UE3 M1 113 153 270,9 421

UE3 M2 118 147 243,4 334

x = 213.029 ppm

Fuente: Autores, 2004.

Figura 23. Valores promedios de concentraciones de P asimilable en U.E y. C.B. a través del tiempo.

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

Fósfor

o (p

pm)

500

400

300

200

100

0

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

Fuente: Autores, 2004.

P < 0.001

93

N-mineral

Las concentraciones de N-mineral fueron directamente proporcionales a las

concentraciones de NO3 y NH4 de cada uno de los grupos de estudio. Por lo tanto,

las concentraciones de N-mineral fueron mayores en las unidades experimentales

que en los controles bióticos. En las unidades experimentales, se alcanzaron

promedios de 1873.558 ppm de N-mineral y en los controles bióticos de 225.383

ppm de N-mineral como se observa en la tabla 10 y figura 24.

Tabla 10. Concentración de N-mineral a lo largo del periodo de estudio.

N-mineral GRUPO Noviembre Diciembre Enero Febrero

CB1 M1 170,2 219,1 246,9 262,2

CB1 M2 181,2 222,7 212,1 299,5

CB2 M1 175,1 219,5 316,6 261,7

CB2 M2 153,7 188,4 200,3 224,3

CB3 M1 137,7 187,3 220,6 307,2

CB3 M2 217,4 193,2 233 359,3

x = 225.383 ppm

UE1 M1 1201,3 1437 2182 2134,7

UE1 M2 917,7 1384,7 1543,4 2290,4

UE2 M1 1311,8 1379,4 2114,4 3687,4

UE2 M2 1169 1707,3 2104,5 3755,8

UE3 M1 1364,7 1473,8 1949 3142,2

UE3 M2 1232,5 1463,9 1885,5 2133

x = 1873.56 ppm

Fuente: Autores, 2004.

94

Figura 24. Valores promedios de concentraciones de N-Mineral en U.E. y C.B. a través del tiempo

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

N-M

iner

al (p

pm)

5000

4000

3000

2000

1000

0

-1000

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

Fuente: Autores, 2004.

Por otro lado, como se observa en la tabla 11, en las unidades experimentales

existió una diferencia estadísticamente significativa (P < 0.001) entre los nutrientes

NO3, NH4, P asimilable y N mineral a través del tiempo. (Véase Anexo 7). Tabla 11. ANOVA de nutrientes en U.E.

Suma de

cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

P asimilable Inter-grupos 119574,888 2 59787,444 87,310 ,000 Intra-grupos 10271,595 15 684,773 Total 129846,483 17

N-NH4 Inter-grupos 1866698,254 2 933349,127 27,849 ,000 Intra-grupos 502721,102 15 33514,740 Total 2369419,356 17

Inter-grupos 1175305,631 2 587652,816 4,181 ,036

Intra-grupos 2108374,245 15 140558,283 N-NO3

Total 3283679,876 17

N-Mineral Inter-grupos 5901532,341 2 2950766,171 13,447 ,000 Intra-grupos 3291667,483 15 219444,499 Total 9193199,824 17

Fuente: Autores, 2004.

P < 0.001

95

Las correlaciones de los nutrientes en las unidades experimentales, representan el

grado de asociación entre cada uno de ellos a través del tiempo. En la tabla 12,

se determina que el P asimilable presenta una correlación mayor con el NH4, el

NH4 a su vez, presenta una mayor correlación con el N-mineral y NO3, mientras

que el N-mineral presenta una correlación mayor con el NH4 y NO3 que con el P

asimilable.

Tabla 12. Correlaciones de nutrientes en U.E.

P asimilable N-NH4 N-NO3 N-Mineral

P asimilable Correlación de Pearson 1 ,813(**) ,570(*) ,754(**)

Sig. (bilateral) . ,000 ,013 ,000

N 18 18 18 18

N-NH4 Correlación de Pearson ,813(**) 1 ,635(**) ,887(**)

Sig. (bilateral) ,000 . ,005 ,000

N 18 18 18 18

N-NO3 Correlación de Pearson ,570(*) ,635(**) 1 ,920(**)

Sig. (bilateral) ,013 ,005 . ,000

N 18 18 18 18

N-Mineral Correlación de Pearson ,754(**) ,887(**) ,920(**) 1

Sig. (bilateral) ,000 ,000 ,000 . N 18 18 18 18

Fuente: Autores, 2004.

Así mismo, como se observa en la figura 25, el NO3 presentó las concentraciones

más elevadas, seguido por el NH4, mientras el P asimilable se encontró en

concentraciones más bajas.

96

Figura 25: Valores promedios de concentraciones de nutrientes a través del tiempo en las U.E.

Tiempo de observación

Mes 4

Mes 3

Mes 2

Mes 1

Suelo contaminado

Suelo sin contaminar

Con

cent

racion

es (p

pm)

5000

4000

3000

2000

1000

0

-1000

Fósforo

N-NH4

N-NO3

N-Mineral

Fuente: Autores, 2004.

En los controles bióticos se presentó una diferencia estadísticamente significativa

(P < 0.001) entre todos los nutrientes (NO3, NH4, P asimilable y N mineral) a través

del tiempo (Véase Anexo 6). Como se observa en la tabla 13, el P asimilable

presenta una correlación mayor con el NO3 que con el NH4; sin embargo, el NO3

tiene una correlación mayor con el P asimilable que con el NH4.

Tabla 13. Correlaciones de nutrientes en el C.B.

P asimilable N-NH4 N-NO3 N-Mineral Meses P asimilable Correlación de Pearson 1 ,118 ,701(**) ,645(**) ,421

Sig. (bilateral) . ,642 ,001 ,004 ,082

N 18 18 18 18 18

N-NH4 Correlación de Pearson ,118 1 ,031 ,557(*) ,429

Sig. (bilateral) ,642 . ,904 ,016 ,076

N 18 18 18 18 18

N-NO3 Correlación de Pearson ,701(**) ,031 1 ,847(**) ,068

Sig. (bilateral) ,001 ,904 . ,000 ,787

P < 0.001

97

N 18 18 18 18 18

N-Mineral Correlación de Pearson ,645(**) ,557(*) ,847(**) 1 ,285

Sig. (bilateral) ,004 ,016 ,000 . ,252

N 18 18 18 18 18

Meses Correlación de Pearson ,421 ,429 ,068 ,285 1 Sig. (bilateral) ,082 ,076 ,787 ,252 . N 18 18 18 18 18

Fuente: Autores, 2004.

Como se observa en la figura 26, las concentraciones de los nutrientes

aumentaron a través del tiempo, siendo el NO3 el nutriente que se encontró en una

concentración mayor a la concentración del fósforo y el amonio, siendo este último

el nutriente con concentraciones mas bajas.

Figura 26. Valores promedios de concentraciones de nutrientes a través del tiempo en C.B.

Tiempo de observación

Mes 4

Mes 3

Mes 2

Mes 1

Suelo contaminado

Suelo sin contaminar

Con

cent

racion

es (p

pm)

400

300

200

100

0

-100

Fósforo

N-NH4

N-NO3

N-Mineral

Fuente: Autores, 2004.

P < 0.001

98

Finalmente, existió una diferencia estadísticamente significativa entre las unidades

experimentales y controles bióticos (P < 0.001), lo cual representa una variación

significativa entre los dos grupos de estudio.

4.1.2 pH Como se observa en la tabla 14 y en la figura 27, el análisis estadístico de los

resultados obtenidos para pH a lo largo del periodo de observación determinó que

no hay una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de

estudio, presentando una correlación r = 0.87 y un valor promedio de 6. Tabla 14. ANOVA de pH en U.E y C.B.

Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos ,038 1 ,038 ,130 ,719

Intra-grupos 55,562 190 ,292

Total 55,600 191

Fuente: Autores, 2004.

Figura 27. Correlación del pH vs tiempo de estudio en las U.E. y C.B.

CORRELACIÓN DEL pH vs TIEMPO DE ESTUDIO

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

SEMANAS

pH

Sales Cont rol Biót ico Polinómica (Cont rol Biót ico) Polinómica (Sales)

Fuente: Autores, 2004

r = 0.87

99

Así mismo, se observa una diferencia significativa entre los meses de estudio,

presentando un descenso elevado de pH en el primer mes tanto en las unidades

experimentales como en los controles bióticos. (Véase anexo 5).

4.1.3 Temperatura Como se observa en la tabla 15, la temperatura no presentó variaciones

significativas en las unidades experimentales y controles bióticos, ya que osciló

entre 13 ºC y 15 ºC (Véase Anexo 5); por lo cual, no existe una variación

estadísticamente significativa, siendo P = ns. (ns = no significativa), como se

observa la figura 28. (Véase anexo 6) Tabla 15. ANOVA de la temperatura en U. E. y C.B.

Suma de

cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Inter-grupos ,010 1 ,010 ,039 ,843 Intra-grupos 24,979 94 ,266 Temperatura Total 24,990 95

Fuente: Autores, 2004

Figura 28. Correlación de la temperatura vs tiempo de estudio en las U.E. y C.B.

CORRE LACI ÓN DE LA T E M P E RAT URA E N U. E . y C. B. vs T I E M P O DE OBSE RV ACI ÓN

12,5

13

13,5

14

14,5

15

15,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

T I E M P O DE OBSE RV ACI ÓN

UE CB Pol inómica (CB ) Pol inómica (UE )

Fuente: Autores, 2004

100

4.1.4 Humedad El comportamiento de la humedad, es similar al de la temperatura, ya que no

existe una diferencia estadísticamente significativa a través del tiempo (P = ns),

como se observa en la tabla 16 y en la figura 29. ( Véase anexo 6)

Tabla 16. ANOVA del porcentaje de humedad en U.E y C.B.

Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos ,261 1 ,261 ,223 ,638 Intra-grupos 110,072 94 1,171 Humedad Total 110,333 95

Fuente: Autores, 2004

Figura 29. Correlación del porcentaje de humedad vs tiempo de estudio en las U. E. y C. B.

CORRELACIÓN DEL % DE HUMEDAD EN U.E. y C.B. vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

27

28

29

30

31

32

33

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

% D

E H

UM

EDA

D

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Fuente: Autores, 2004

Como se observa en la grafica anterior, el porcentaje de humedad se mantuvo en

un rango entre 29 y 31% a lo largo del periodo de estudio. (Véase Anexo 6)

101

4.2 Análisis microbiológicos 4.2.1 Recuento de heterótrofos En la tabla 17, se determina que no existió una diferencia estadísticamente

significativa (P < 0.001) entre las unidades experimentales y controles bióticos

(Véase Anexo 6); sin embargo, el número de UFC aumentó a lo largo del periodo

de estudio.

Tabla 17. ANOVA de recuento de heterótrofos en U.E y C.B.

Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos

2530985394737660,000 4 63274634868

4415,000 1,437 ,306

Intra-grupos

3523254265905661,000 8 44040678323

8207,700 UFC EN U.E.

Total 6054239660643320,000 12

UFC EN C.B.

Inter-grupos

46366751079302,800 4 11591687769

825,710 16,450 ,001

Intra-grupos

5637225554640,440 8 70465319433

0,056

Total 52003976633943,200 12

Fuente: Autores, 2004

De la misma manera, como se observa en la tabla 18 y figura 30, el número de

Unidades Formadoras de Colonias en las unidades experimentales aumentó a

través del tiempo de estudio, siendo en el mes de noviembre de 1 x 105 y en el

mes de febrero de 3 x 107 . Por otro lado, las Unidades Formadoras de Colonias

en los controles bióticos aumentó a través del tiempo de observación de 1 x 105 en

el mes de noviembre a 5 x 106 en el mes de febrero. (Véase Anexo 6).

102

Figura 30. Correlación del número de UFC en U.E y C.B a través del tiempo

NÚMERO DE UFC EN U.E. y C.B. vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

-5,00E+06

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

3,00E+07

3,50E+07

0 1 2 3 4 5

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

LOG

DE

UFC

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Fuente: Autores, 2004.

Finalmente, en la figura anterior, se observa el incremento de las UFC en los

controles bióticos y unidades experimentales a través del tiempo de observación,

siendo mayor el aumento en las unidades experimentales que en los controles

bióticos.

4.2.2 NMP

En la tabla 18, se establece una diferencia estadísticamente significativa entre las

unidades experimentales y controles bióticos, debido a la diferencia presentada en

las medias de cada uno de los grupos de estudio. (Véase Anexo 6).

Tabla 18. ANOVA de NMP en U.E. y C.B.

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Inter-grupos 602302309,668 3 200767436,556 ,759 ,548

Intra-grupos 2115341334,480 8 264417666,810 NMP CB

Total 2717643644,148 11

103

Inter-grupos 626834880121,155 3 208944960040,385 2,517 ,132

Intra-grupos 664082754556,464 8 83010344319,558 NMP UE

Total 1290917634677,620 11

Fuente: Autores, 2004.

Por otro lado, como se observa en la tabla 19, las UFC de los microorganismos

degradadores de petróleo en los dos grupos de estudio, aumentaron los tres

primeros meses de tratamiento, sin embargo, en el último mes, el número de UFC

comenzó a disminuir. (Véase Anexo 6).

Tabla 19. Correlación en Log. de UFC en U.E.. y C.B. a través del tiempo de estudio.

NOVIEMBRE DICIEMBRE ENERO FEBRERO UE 1 2,4625372 5,01866651 6,04245916 5,24303846 UE 2 2,63570581 5,01723627 5,73540138 5,39395085 UE 3 5,71831703 4,21181481 5,38490303 4,64809794 CB1 4,18549666 4,54815897 4,60238081 4,64638544 CB 2 3,69503476 4,10833005 4,58471337 3,80905735 CB 3 3,76545463 2,91121518 4,11388711 3,77806567

Fuente: Autores, 2004.

En la figura 31, las Unidades Formadoras de Colonias de los microorganismos

capaces de degradar hidrocarburos de petróleo, se incrementó en las unidades

experimentales a través del tiempo de estudio, presentando un valor logarítmico

en el mes de noviembre de 3.6055 y en el mes de febrero de 5.0950. En los

controles bióticos, igualmente se observa un incremento en las UFC a través del

tiempo de observación; en este grupo de estudio, las UFC presentaron un valor

logarítmico en el mes de noviembre de 3.8819 y en el mes de febrero de 4.0778.

104

Figura 31. Correlación del NMP en U.E. y C.B a través del tiempo de observación

NÚMERO DE UFC EN U.E y C.B vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

LOG

DE

UFC

UE CB Logarítmica (CB) Logarítmica (UE)

Fuente: Autores, 2004.

Finalmente, como se observa en la figura anterior, las UFC se incrementaron a

través del tiempo de observación en los dos grupos de estudio; sin embargo, en

las unidades experimentales el incremento fue mayor que en los controles

bióticos. 4.2.3 Identificación de microorganismos degradadores de petróleo El número de aislamientos positivos realizados en la UE1 M2, UE2 M1, CB1 M2,

CB2 M1 y CB2 M2, determinaron la presencia de microorganismos gram positivos

y gram negativos; siendo los gram positivos las cepas de la UE1 M2 y el CB2 M2 y

los gram negativos las cepas de la UE2 M1, CB1 M2 y CB2 M1.(Véase Anexo 8)

De ese número de cepas aisladas de microorganismos gram positivos, el

programa BBL Cristal, identificó en la UE1 M2 el Staphylococcus Saprofitricus con

un porcentaje de confiabilidad de 99.99% y en el CB2 M2 se identificó el

Streptococcus Uberis con un porcentaje de 98.78%.

105

En el caso de las cepas de microorganismos gram negativos, el programa BBL

cristal no determinó el nombre especifico de cada una de ellas, debido a que estas

no se encontraban en la base de datos del programa.

4.3 Análisis de hidrocarburos 4.3.1 TPH´s El análisis estadístico de los resultados obtenidos para TPH´s a lo largo del

periodo de estudio como se observa en la tabla 20 y 21, determinó por medio de la

prueba de Mann Whitney una diferencia estadísticamente significativa entre las

unidades experimentales y controles bióticos. (Véase Anexo 6)

Tabla 20. Prueba de Mann-Whitney para TPH´s en U.E . y C.B.

Grupo N Rango promedio

Suma de rangos

TPH`s Control Biótico 19 23,34 443,50

Unidades Experimentales 19 15,66 297,50

Total 38

Fuente: Autores, 2004. Tabla 21. Prueba de estadísticos de contraste de TPH´s en U.E y C.B.

TPH`s

U de Mann-Whitney 107,500

W de Wilcoxon 297,500

Sig. asintót. (bilateral) ,033

Sig. exacta [2*(Sig. unilateral)] ,032(a)

Fuente: Autores, 2004.

106

En la figura 32, se observa que la concentración final de TPH´s en las unidades

experimentales fue menor a la concentración en los controles bióticos (r = - 0.8);

siendo los TPH´s inversamente proporcionales al tiempo de observación, ya que a

mayor tiempo de estudio menor concentración. (Véase Anexo 6) Figura 32. Valores promedios de concentraciones de TPH’s a través del tiempo en U.E. vs C.B.

6661 6661N =

Tiempo de observación

10,006,002,00,00

TPH̀

s

30000

20000

10000

0

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

10

Fuente: Autores, 2004.

Por otro lado, aunque no existe una diferencia estadísticamente significativa entre

los dos grupos de estudio, los porcentajes de degradación varían entre 60.82% y

70.62% para las unidades experimentales y 30.59% y 62.47% para los controles

bióticos como se observa en la figura 33.

107

Figura 33. Porcentaje de degradación de TPH´s en U. E. y C. B.

PORCENTAJE DE DEGRADACIÓN DE TPH´s EN U. E. y C. B.

70,62% 70,39%

60,82% 58,99%

30,59%

62,47%

UE1 UE2 UE3 CB1 CB2 CB3

Fuente: Autores, 2004.

4.3.2 PAH´s

Los resultados obtenidos a lo largo del periodo de estudio, determinaron la

concentración total de PAH´s y la concentración de algunos de los 16 compuestos

presentes en el suelo contaminado. (Véase Anexo 9).

Como se observa en la tabla 22 y posteriormente en la figura 34, la concentración

total de PAH´s disminuyó en las unidades experimentales a través del tiempo,

presentándose una disminución mayor en la UE2 que en la UE1 y UE3. Sin

embargo, la degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos se llevó a cabo

en cada una de ellas.

Tabla 22. Concentración de PAH´s en U.E. a través del tiempo de observación

MES 2 MES 3 MES 4 UE1 0,5101335 0,35776 0,1837415

UE2 0,7070275 0,275515 0

UE3 0,3868395 0,2844995 0,145353 Fuente: Autores, 2004

108

Figura 34. Concentración de PAH´s en U.E. vs tiempo de observación

CONCENTRACIÓN DE PAH´s EN U.E vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 1 2 3 4

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

UE1

UE2

UE3

Fuente: Autores, 2004

De acuerdo a la figura anterior, la concentración de PAH´s en la UE1 disminuyó de

0.5101 mg./Kg. de suelo a 0.1837 mg./Kg. de suelo; en la UE2 la concentración

de PAH´s disminuyó de 0.7070 mg./Kg. de suelo a 0 mg./Kg. de suelo y en la UE3

la disminución en la concentración de PAH´s fue de 0.3868 mg./Kg. de suelo a

0.1453 mg./Kg. de suelo.

Por otro lado, en la tabla 23 y en la figura 35, se observa una disminución en la

concentración de PAH´s a través del tiempo, presentándose una disminución

mayor en el CB3 que en el CB1 y CB2.

Tabla 23. Concentración de PAH´s en C.B. a través del tiempo de observación

MES 2 MES 3 MES 4 CB1 0,954277 0,446323 0,2871015 CB2 0,5342285 0,3376305 0,21119 CB3 2,42858 0,712458 0,2639464

Fuente: Autores, 2004

109

Figura 35. Concentración de PAH´s en C.B. vs tiempo de observación

CONCENTRACIÓN DE PAH´s EN C.B. vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

CB1CB2CB3

Fuente: Autores, 2004

En el CB1 la concentración de PAH´s disminuyó de 0.9542 mg./Kg. de suelo a

0.2871 mg./Kg. de suelo; en el CB2 la concentración de PAH´s disminuyó de

0.5342 mg./Kg. de suelo a 0.2111 mg./Kg. de suelo y en el CB3 la concentración

de PAH´s disminuyó de 2.4285 mg./Kg. de suelo a 0.2639 mg./Kg. de suelo.

Finalmente, de acuerdo a la disminución en la concentración total de PAH´s en

cada una de las unidades experimentales y controles bióticos, se obtuvieron

porcentajes de degradación en las UE1, UE2 y UE3 de 63.98%, 100% y 62.43% y

en los CB1, CB2 y CB3 los porcentajes de degradación fueron de 69.91%, 60.47%

y 89.13% respectivamente como se observa en la figura 36.

110

Figura 36. Porcentaje de degradación de PAH´s en U.E. y C.B

PORCENTAJES DE DEGRADACIÓN DE PAH´s EN U.E. y C.B.

89,13%

60,47%62,43%

100,00%

63,98%

69,91%

UE1 UE2 UE3 CB1 CB2 CB3

Fuente: Autores, 2004

Por otro lado, de los 16 compuestos principales que conforman los PAH´s, en

todas las unidades experimentales se detectaron B(a) antraceno, B(k) fluoranteno,

B(b) fluoranteno y criseno y en todos los controles bióticos se detectaron B(a)

antraceno, B(b) fluoranteno, B(k) fluoranteno, B(a) pireno y DB(a,h) antraceno;

siendo el B(a) antraceno, B(k) fluoranteno y B(b) fluoranteno común en los dos

grupos de estudio. En las unidades experimentales las concentraciones de cada uno de los

compuestos detectados disminuyó a través del tiempo de observación, como se

observa en la tabla 24.

Tabla 24. Concentración inicial y final de los compuestos detectados en las U.E.

UNIDAD COMPUESTO CONCENTRACIÓN INICIAL (mg./Kg. suelo)

CONCENTRACIÓN FINAL (mg./Kg. suelo)

B(a) antraceno 0,213176 0,033803 B(k) fluoranteno 0,1133815 0,09372446 B(b) fluoranteno 0,0348622 0,03221505

UE1

Criseno 0,169175 0 UE2 B(a) antraceno 0,62329105 0,02179

111

B(k) fluoranteno 0,1127865 0 B(b) fluoranteno 0,065797 0

Criseno 0,0526495 0 B(a) antraceno 0,160507 0,0131537 B(k) fluoranteno 0,120258 0,1034476 B(b) fluoranteno 0,0583615 0,063494045

UE3

Criseno 0,1656115 0,0532965 Fuente. Autores, 2004

En los controles bióticos, algunas de las concentraciones de los compuestos

detectados disminuyeron a través del tiempo de observación, o bien se

mantuvieron más o menos constantes, como se observa en la tabla 25. Tabla 25. Concentración inicial y final de los compuestos detectados en los C.B.

CONTROL COMPUESTO CONCENTRACIÓN INICIAL

CONCENTRACIÓN FINAL

B(a) antraceno 0,632725 0,07274615 B(k) fluoranteno 0,1947385 0 B(b) fluoranteno 0,09047245 0,1000405 B(a) pireno 1,420645563 0,2884245

CB1

DB (a,h) antraceno 0,0541456 B(a) antraceno 0,458625 0,05778275 B(k) fluoranteno 0,0239539 0 B(b) fluoranteno 0,12167765 0,10942425 B(a) pireno 0,0364369 0,0414225

CB2

DB (a,h) antraceno 0,0177303 0,0365637 B(a) antraceno 2,42858 0,1826435 B(k) fluoranteno 0,0287684 0,0228037 B(b) fluoranteno 0,09399135 0,05505055 B(a) pireno 0,022817 0,01235285

CB3

DB (a,h) antraceno 0,0469221 Fuente. Autores, 2004

Los compuestos comunes B(a) antraceno, B(K) fluoranteno y B(b) fluoranteno que

se detectaron en los dos grupos de estudio se comportaron a través del tiempo de

estudio de la siguiente manera:

112

- B(a) antraceno Como se observa en la tabla 26 y posteriormente en la figura 37, en general, la

concentración inicial de B(a) antraceno fue mayor en el CB3 que en las unidades

experimentales; sin embargo, la concentración final fue menor en las unidades

experimentales.

Tabla 26. Concentración de B(a) antraceno en U.E. y C.B. a través del tiempo de estudio

B(a) antraceno Concentración inicial

Concentración final

UE1 0,213176 0,033803 UE2 0,62329105 0,02179 UE3 0,160507 0,0131537 CB1 0,632725 0,07274615 CB2 0,458625 0,05778275 CB3 2,42858 0,1826435

Fuente. Autores, 2004

Figura 37. Concentración de B(a) antraceno en U.E. y C.B. a través del tiempo de estudio

CONCENTRACIÓN DE B(a) antraceno EN U.E. y C.B. vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Fuente. Autores, 2004

113

Según la grafica anterior, la concentración de B(a) antraceno disminuyó en la UE1

de 0.2131 ppm. a 0.033 ppm; en la UE2 de 0.6233 ppm. a 0.0218 ppm y en la UE3

de 0.1605 ppm. a 0.0131 ppm. Por otro lado la concentración de B(a) antraceno

disminuyó en el CB1 de 0.6327 ppm. a 0.072 ppm; en el CB2 de 0.4586 ppm. a

0.0577 ppm y en el CB3 de 2.4285 ppm. a 0.1826 ppm. - B(k) fluoranteno

Como se observa en la tabla 27 y en la figura 38, la concentración inicial de B(k)

fluoranteno fue similar tanto en las unidades experimentales como en los controles

bióticos, sin embargo, en las unidades experimentales la concentración final fue

menor.

Tabla 27. Concentración de B(k) fluoranteno en U.E. y C.B a través del tiempo de estudio.

B(k) fluoranteno Concentración inicial

Concentración final

UE1 0,1133815 0,09372446 UE2 0,1127865 0 UE3 0,120258 0,1034476 CB1 0,09047245 0,1000405 CB2 0,12167765 0,10942425 CB3 0,09399135 0,05505055

Fuente. Autores, 2004

114

Figura 38. Concentración de B(k) fluoranteno en U.E. y C.B

CONCENTRACIÓN DE B(k) fluoranteno EN U.E. y C.B. vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Fuente. Autores, 2004

La concentración de B(k) fluoranteno, disminuyó en la UE1 de 0.1133 ppm. a

0.0937 ppm; en la UE2 de 0.1127 ppm. a 0 ppm y en la UE3 de 0.1202 ppm. a

0.1034 ppm. Por otro lado la concentración de B(k) fluoranteno disminuyó en el

CB1 de 0.0904 ppm. a 0.1000 ppm; en el CB2 de 0.1216 ppm. a 0.1094 ppm y en

el CB3 de 0.0939 ppm. a 0.0550 ppm.

- B(b) fluoranteno

Como se observa en la tabla 28 y posteriormente en la figura 39, la concentración

inicial de B(b) fluoranteno fue mayor en el CB1; sin embargo, en el CB2 y CB3 la

concentración inicial fue menor a la concentración inicial en las unidades

experimentales. Así mismo, la concentración final fue menor en los controles

bióticos.

115

Tabla 28. Concentración de B(b) fluoranteno en U.E. y C.B a través del tiempo de estudio.

B(b) fluoranteno Concentración inicial

Concentración final

UE1 0,0348622 0,0321505UE2 0,065797 0UE3 0,0583615 0,063494045CB1 0,1947385 0CB2 0,0239539 0CB3 0,0287684 0,0228037

Fuente. Autores, 2004

Figura 39. Concentración de B(b) fluoranteno en U.E. y C.B

CONCENTRACIÓN DE B(b) fluoranteno EN U.E. y C.B vs TIEMPO DE OBSERVACIÓN

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

AC

IÓN

UE CB Logarítmica (CB) Polinómica (UE)

Fuente. Autores, 2004

Finalmente, la concentración de B(b) fluoranteno, disminuyó en la UE1 de

0.0348ppm. a 0.0562 ppm; en la UE2 de 0.0657 ppm. a 0 ppm y en la UE3 de

0.0583 ppm. a 0.0634 ppm. Por otro lado la concentración de B(b) fluoranteno

disminuyó en el CB1 de 0.1947 ppm. a 0 ppm; en el CB2 de 0.2395 ppm. a 0 ppm

y en el CB3 de 0.0287 ppm. a 0.0228 ppm.

116

5. DISCUSIÓN A continuación, se presenta la discusión de los resultados obtenidos en cada uno

de los parámetros evaluados (nutrientes, pH, temperatura, humedad, recuento de

heterótrofos totales, NMP, TPH´s y PAH´s) a lo largo del periodo de estudio, con el

fin de analizar el comportamiento de cada uno de ellos en el proceso de

biodegradación de hidrocarburos de petróleo en el suelo.

La concentración de los nutrientes (NO3, NH4, P asimilable y N-mineral) en el

suelo, presentó un incremento en los dos grupos de estudio durante el tiempo de

observación, debido a que el proceso de biodegradación se trabajó en un sistema

cerrado, en el cual, no se llevaron a cabo procesos de lixiviación o escorrentía y

no había presencia de vegetación que pudiera generar la pérdida de nutrientes en

el suelo.

Por el contrario, cuando los procesos de biodegradación se realizan en campo, es

decir, en un sistema abierto, la presencia de vegetación y los procesos de

escorrentía o lixiviación que se llevan a cabo en el suelo124, generan una

disminución en la concentración de los nutrientes a través del tiempo, ya que la

vegetación los absorbe y asimila como fuente de alimento y la escorrentía o

lixiviación bajan su concentración en el suelo.

Los resultados obtenidos en esta investigación mostraron un aumento progresivo

en las concentraciones de los nutrientes, no pudiendo homologarse con estudios

anteriores125, ya que estos fueron aplicados en sistemas abiertos, a diferencia de

este, el cual fue realizado en un sistema cerrado.

124 BAUTISTA Op cit, p . 99 125 DIBBLE J.T. y Bartha R. Op cit., p. 729-739. SARANITRO Joseph et al. Op cit,1997

117

El comportamiento de los nutrientes a lo largo del periodo de observación, fue

similar en los dos grupos de estudio; sin embargo, el aumento en la concentración

del NO3, NH4, P asimilable y N-mineral, fue mayor en las unidades experimentales,

debido a la adición gradual que se realizó de las sales inorgánicas simples

(NH4NO3 y K2HPO4), en los meses de noviembre, diciembre y enero, lo cual

generó un suministro constante de nutrientes durante los tres primeros meses de

tratamiento, a diferencia de los controles bióticos, a los cuales no se les

proporcionó ninguna fuente de nutrientes durante el periodo de estudio.

En el caso del NO3, las elevadas concentraciones que se presentaron en las

unidades experimentales, se debieron a la adición gradual del NH4NO3 y al

proceso de mineralización del suelo, en el cual, por medio de la nitrificación se

produjo NO3 como producto de las reacciones metabólicas de los

microorganismos126. En los controles bióticos, también se presentó el proceso de

mineralización, lo cual generó un aumento en la concentración del nutriente; sin

embargo, debido a que no se adicionó NH4NO3, la concentración de NO3 fue más

baja.

Las concentraciones de NH4 fueron más altas en las unidades experimentales que

en los controles bióticos, debido a la adición gradual del NH4NO3; sin embargo,

este nutriente se encuentra en menor proporción que el NO3, ya que es fácilmente

asimilable por los microorganismos y cuando ya no es requerido por ellos, se

transforma en NO2 y posteriormente en NO3, debido al proceso de mineralización.

Así mismo, el NH4 es estable en el suelo, por lo cual, no es común que se pierda BOGAT y League. Op cit. 1998 ADAMS Randy et al, Op cit., p. 159-172, CHEO-Hyo Lee et al, Op cit., p . 639-647 MISHRA Sanjeet et al, Op cit. SMICHDT Wini, Suelos contaminados con hidrocarburos: la biorremediación como una solución ecológicamente compatible, Cooperación técnica alemana, p. 1-7,2002 126 BAUTISTA, Op cit,1972 BROCK, Op cit., p. 497

118

por lixiviación. Por otro lado, aunque en los controles bióticos, también se

presentó el proceso de mineralización, no existió un aporte de NH4, que

incrementará de manera considerable la concentración del mismo.

En el caso del P asimilable, la concentración aumentó en los dos grupos de

estudio, debido tanto a la fijación de este nutriente en las partículas del suelo,

como en la insolubilidad que presenta en suelos de pH ácido; sin embargo, otra

causa que generó el aumento en la concentración de este nutriente, fue la

ausencia de escorrentía debido a que el proceso de biodegradación se llevó a

cabo en un sistema cerrado. Además de lo mencionado anteriormente, en las

unidades experimentales el incremento del P asimilable fue mayor que en los

controles bióticos debido a la adición del K2HPO4.

Por otro lado, de acuerdo a los resultados obtenidos a lo largo del periodo de

estudio, se determinó que el pH presentó una disminución similar a través del

tiempo, tanto en las unidades experimentales como en los controles bióticos,

debido al proceso de mineralización, en el cual, la descomposición de la materia

orgánica produjo acidez al suelo127.

Otro de los factores que aceleró la acidificación del suelo, además del proceso de

mineralización, fue la fertilización nitrogenada que se realizó adicionando NH4NO3

al suelo, debido a que los microorganismos tomaron como fuente de alimento los

nutrientes provenientes de esta sal, liberando iones H+; es decir, que a mayor

fertilización nitrogenada, mayor acidez en el suelo128. Sin embargo, debido a que

el comportamiento del pH en los dos grupos de estudio a través del tiempo fue

muy similar, se determinó que el comportamiento de esta variable, no dependió de

la intervención realizada en el proceso; es decir, el pH, es un factor que no se ve 127 AGROPECSTAR. Op cit, p.11 128 AGROPECSTAR. Op cit, p.13

119

afectado de manera considerable por la adición de sales inorgánicas simples en el

proceso de biodegradación de hidrocarburos de petróleo.

Finalmente, las variaciones que presentaron la humedad y la temperatura durante

todo el periodo de estudio, se encontraron dentro de los valores óptimos para el

proceso de degradación de los hidrocarburos de petróleo. La humedad se

mantuvo en un rango de 29% y 31%, es decir, entre el 30% y 90% de la capacidad

de campo129. Por otro lado, debido a que el montaje del proyecto se realizó en

condiciones de laboratorio, la temperatura del suelo tuvo ligeras variaciones

durante el periodo de estudio, manteniéndose en un rango entre 13 ºC y 15 ºC, es

decir, dentro del rango óptimo de 5 ºC y 40 ºC para llevar a cabo el proceso de

biodegradación.

El recuento de heterótrofos totales, determinó un incremento en el número de UFC

a través del tiempo de observación en los dos grupos de estudio; sin embargo, en

las unidades experimentales, el numero de UFC fue mayor que en los controles

bióticos. En las unidades experimentales se presentó una cantidad mayor de UFC,

debido a que los microorganismos contaron con una mayor cantidad de nutrientes

como N y P, los cuales son primordiales en el desarrollo de las actividades

metabólicas, permitiendo incrementar el crecimiento poblacional.

Así mismo, los resultados obtenidos en los conteos bacterianos obtenidos por

método de NMP, determinaron que el número de UFC de los microorganismos

degradadores de petróleo, se incrementó en los dos grupos de estudio a lo largo

del tiempo de observación, debido a que los microorganismos utilizaron el petróleo

presente en el suelo contaminado como fuente de carbono y energía. Sin

embargo, el número de UFC en las unidades experimentales fue mayor a los

129 EWEIS JUANA, et al. Op cit., p. 196

120

controles bióticos, debido a la mayor disponibilidad de nutrientes que tenían los

microorganismos; es decir, al N y P presente en el suelo contaminando y a la

concentración a la cual se encontraban cada uno de ellos.

Finalmente, de las cinco cepas escogidas para la identificación bioquímica de los

microorganismos capaces de degradar hidrocarburos de petróleo por medio del

programa BBL Cristal, solo en dos se pudo realizar la identificación bioquímica,

encontrando Staphylococcus Saprophyticus y Streptococcus Uberius, mientras

que los microorganismos de las tres cepas restantes no se encontraron en la

base de datos del programa, por lo cual, los resultados arrojados por el mismo, no

presentaron un porcentaje de confiabilidad significativo.

En estudios realizados anteriormente, se han reportado diferentes cepas de

microorganismos degradadores de petróleo130, sin embargo, en ninguno de ellos

se encontraron reportado los microorganismos encontrados en este estudio.

Por otro lado, la concentración final de TPH´s en las unidades experimentales fue

menor que en los controles bióticos a lo largo del periodo de estudio; por lo cual, la

degradación de los TPH´s fue mayor en las unidades experimentales, debido a

que estas presentaron una mayor concentración de nutrientes 131 y UFC; es decir,

que la degradación de TPH´s dependió de la presencia y la cantidad de

microorganismos capaces de degradar los hidrocarburos de petróleo presentes en

el suelo y la cantidad de nutrientes como el N y P necesarios para que los

microorganismos pudieran llevar a cabo todas sus reacciones metabólicas.

130 ADAMS Randy et al. Potencial de la biorremediación de suelo y agua impactados por petróleo en el trópico mexicano. 1999., p. 169 DOMÍNGUEZ Refugio. Biorremediación de terrenos contaminados con compuestos orgánicos. 2003 131 DIBBLE J.T. y Bartha R., Op cit. p. 737-738

121

En los controles bióticos, la degradación de TPH´s fue menor debido a que el

número de UFC de microorganismos capaces de degradar hidrocarburos de

petróleo y la concentración de nutrientes, se encontraban en menor cantidad que

en las unidades experimentales.

La concentración total de PAH´s, disminuyó en los dos grupos de estudio, sin

embargo, la concentración final fue menor en las unidades experimentales, debido

a que existió una mayor cantidad de nutrientes disponibles en el suelo

contaminado, los cuales permitieron a los microorganismos llevar a cabo el

proceso de biodegradación de estos compuestos de una manera más eficiente.

Finalmente, de los 16 compuestos (naftaleno, aceftileno, acenafteno, fluoreno,

fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, B(a) antraceno, criseno, B(b)

fluoranteno, B(k) fluoranteno, B(a) pireno, DB(a,h) antraceno, B(g,h,i) perileno e

indeno) posibles a identificar según el estándar establecido en el método, no se

determinaron en los grupos de estudio el naftaleno, aceftileno, acenafteno,

fluoreno, fenantreno y antraceno, debido a que éstos son compuestos altamente

volátiles, los cuales pudieron eliminarse del suelo contaminado en el momento en

el que se realizó el volteo a cada una de las unidades experimentales y controles

bióticos.

Así mismo, los compuestos comunes en los dos grupos de estudio B(a) antraceno,

B(b) fluoranteno y B(k) fluoranteno, se degradaron totalmente en algunos casos y

en otros, disminuyeron notablemente su concentración en el suelo contaminado.

La biodegradación de estos tres compuestos, se llevó a cabo de maneras

diferentes, debido a la cantidad de anillos que tenían en su estructura molecular es

decir, que a menor cantidad de anillos estructurales, existío mayor degradación,

debido a que los compuestos de PAH´s se degradan un anillo cada vez.

122

De acuerdo a lo anterior, a continuación se relacionan entre si los factores

evaluados en este estudio, con el fin de analizar la interrelación entre cada uno de

ellos y su importancia dentro del proceso de biodegradación de hidrocarburos de

petróleo.

Inicialmente, la fertilización realizada por medio de la adición de las sales

inorgánicas simples NH4NO3 y K2HPO4, en las unidades experimentales, permitió

mantener una relación de C:N:P 100.10:1 a lo largo del periodo de estudio, la cual

suministró a los microorganismos la fuente de energía y disponibilidad de

nutrientes necesarios, para llevar a cabo los procesos metabólicos, esto reflejado

en que en las unidades experimentales, se obtuvieron porcentajes mayores de

degradación de TPH´s y PAH´s que en los controles bióticos. Sin embargo, los

porcentajes de degradación obtenidos en las unidades experimentales, no solo

dependieron de la concentración de los nutrientes, sino de las reacciones

metabólicas llevadas a cabo por los microorganismos en el suelo contaminado.

De acuerdo a lo anterior, el porcentaje de degradación de TPH´s y PAH´s, fue

directamente proporcional a la cantidad de microorganismos y a la disponibilidad

de los nutrientes presentes en el suelo; es decir, que a mayor consumo de

carbono y nutrientes como N y P por parte de los microorganismos, las tasas de

degradación fueron mayores. Por otro lado, el comportamiento de la concentración

de los TPH´s y PAH´s respecto a los nutrientes es inversamente proporcional; es

decir, en este estudio, a medida que la concentración de TPH´s y PAH´s

disminuía, los nutrientes aumentaban a lo largo del periodo de estudio; sin

embargo, la disminución en la concentración de TPH´s y PAH´s no se presentó

solamente por al aumento en la concentración de los nutrientes, sino

primordialmente por el aumento en el número de UFC de microorganismos

degradadores de petróleo.

123

Aunque la disponibilidad de nutrientes y el número de UFC de microorganismos

degradadores de petróleo, fueron primordiales en el proceso, parámetros como el

pH, la temperatura, la humedad y el volteo fueron fundamentales ya que

proporcionaron las condiciones óptimas para llevar a cabo eficientemente la

degradación. Así mismo, se determinó que cada una de estas variables no

dependió de la intervención realizada en las unidades experimentales, debido a

que el comportamiento de estos factores fue similar en los dos grupos de estudio;

es decir, que la adición de las sales inorgánicas simples no afectó el

comportamiento del pH, la temperatura y la humedad, sino que fueron parámetros

controlados a lo largo del periodo de observación. Igualmente, el volteo,

incrementó el contacto entre microorganismos, nutrientes e hidrocarburos de

petróleo, lo cual mejoró la biodegradabilidad y suministró el oxígeno necesario

tanto para la respiración celular como para que el proceso se desarrollaran de

manera aerobia durante todo el estudio.

Finalmente, al realizar una comparación entre los dos grupos de estudio, se

determinó que aunque en los controles bióticos se presentó una disminución en la

concentración final de TPH´s y PAH´s respecto a la concentración inicial de cada

uno de estos compuestos, las unidades experimentales, presentaron unas tasas

de degradación mayores, lo que significa que la intervención realizada en este

grupo; es decir, la adición de NH4NO3 y K2HPO4 dio los resultados esperados, ya

que se logró la biodegradación de los hidrocarburos de petróleo presentes en el

suelo contaminado.

124

6. CONCLUSIONES

A lo largo del periodo de estudio, se comprobó que la adición de las sales

inorgánicas simples NH4NO3 y K2HPO4, optimizó el proceso de biodegradación

de los hidrocarburos totales de petróleo, ya que las unidades experimentales,

presentaron un porcentaje de degradación promedio de 67.11%, mientras que

los controles bióticos presentaron un porcentaje de degradación promedio de

50.68%.

La temperatura y humedad, fueron variables independientes en el proceso de

biodegradación, debido a que el comportamiento en los dos grupos de estudio

fue similar.

La concentración de cada uno de los nutrientes en las unidades

experimentales y controles bióticos a través del tiempo aumentó, debido a que

el estudio se llevó a cabo en un sistema cerrado, en el cual no existieron

perdidas de nutrientes.

La disminución en la concentración de TPH´s fue mayor en las unidades

experimentales que en los controles bióticos, debido a la alta disponibilidad de

nutrientes presentes en el suelo, la cual, permitió a los microorganismos

desarrollar sus procesos metabólicos, utilizando una mayor proporción de

TPH´s como fuente de carbono. La concentración total de PAH´s disminuyó en los dos grupos de estudio,

debido tanto a la volatilidad como a la estructura de algunos de los compuestos

mas representativos; sin embargo, el proceso de biodegradación fue mayor en

125

las unidades experimentales con un porcentaje de degradación promedio de

75.47%, debido a la adición de las sales inorgánicas simples, mientras que en

los controles bióticos se presentó un porcentaje de degradación promedio de

73.17%. El aumento en el número de UFC de microorganismos capaces de degradar

hidrocarburos de petróleo, fue mayor en las unidades experimentales que en

los controles bióticos, debido a la mayor disponibilidad de N y P y a las

condiciones óptimas de humedad, temperatura y pH, las cuales, permitieron

que los microorganismos llevaran a cabo sus procesos metabólicos,

incrementando el crecimiento poblacional. Los microorganismos degradadores identificados bioquímicamente en el suelo

contaminado de las unidades experimentales y controles bióticos fueron el

Staphylococcus saprophyticus y el Streptoccocus uberis. Debido a que el

programa BBL Cristal es un kit diseñado para determinación clínica y no

ambiental, en su base de datos se encuentran algunas limitaciones que

impidieron identificar otros microorganismos.

Los impactos ambientales producidos por derrames de petróleo causan la

infertilidad del suelo debido al cambio en las características fisicoquímicas y

microbiológicas del mismo, generando un daño ambiental elevado. Sin

embargo, aunque la recuperación total del terreno no sea económicamente

rentable, así se empleen las técnicas más económicas de tratamiento para la

recuperación de suelos contaminados con petróleo como la técnica de

biorremediación, ambientalmente si se presentan beneficios, ya que el terreno

se recupera en periodos de tiempo relativamente cortos.

126

7. RECOMENDACIONES

Se debe realizar el análisis de los nutrientes de NH4, NO3 y P asimilable no

solo en forma inorgánica o asimilable sino en forma total, con el fin de evaluar

las perdidas de nutrientes generadas en el proceso de biodegradación de

hidrocarburos de petróleo. Realizar un montaje de suelo sin contaminar con el fin de estudiar el

comportamiento de los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos a través del

tiempo comparándolos con el comportamiento de los mismos en el suelo

contaminado.

Para determinar los microorganismos degradadores de petróleo en el suelo

contaminado, además de los análisis bioquímicos realizados por el BBL cristal,

deben realizarse otras pruebas de confirmación, con el fin de obtener una

identificación más completa. Llevar a cabo la investigación en campo con el fin de determinar la variación de

los parámetros fisicoquímicos , microbiológicos y los hidrocarburos totales de

petróleo e hidrocarburos policíclicos aromáticos respecto a los resultados

obtenidos en la investigación ex situ.

127

BIBLIOGRAFÍA AGROPECSTAR. Conceptos de fertilidad y productividad del suelo. cap. 2

ASHOK B, SAXENA S and MUSARRAT J. Isolation and characterization of four polyciclic

aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery. Applied

Microbiology 21, 1995, 246- 248 p.

ALEXANDER M. Biodegradation and Bioremediation. San Diego: Academic Press Inc.

CA, 1994.

ASTM. Partition-Gravimetric Method, Method 5520B. Washington, DC: American Public

Health Association, 1985.

ATLAS R.M. Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons: an Environmental

Perspective Microbiological Reviews, 1981. 180-209 p.

ATLAS R. M. Microorganisms and Petroleum Pollutants. BioScience, 1978. 387 p.

ATLAS R.M.Oil Spills: Regulation and Biotechnology. Current Opinion Biotechnology,

1992. 220-223. p.

ATLAS R.M. and BARTHA R. Abundance Distribution and Oil Biodegradation Potential of

Microorganisms in Raritan Bay. Environmental Pollution, 1973. 291-300 p.

BARTHA R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation. Microbiology Ecology,

1986. 152-172 p.

BAUTISTA. Conferencias edafología. Universidad Gran Colombia, 1972.

128

BELLOSO C. y CARRARIO J. Bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de

suelos contaminados. Asociación Interamericana de Ingeniería Sanitaria, 1998. 1-4 p.

BELLOSO C, CARRARIO J. y VIDUZZI D. Biodegradación de hidrocarburos en suelos

contenidos en terrarios: Asociación Interamericana de Ingeniería Sanitaria, 1998a 1-8 p.

BRADDOCK J.F., LINDSTROM J.E. and BROWN E.J. Distribution of Hydrocarbon-

Degrading Microorganisms in Sediments From Prince William Sound, Alaska following the

Exxon Valdez Oil Spill. Marine Pollution Bulletin, 1995. 125-132 p.

BROCK T. D. and MADIGAN M.T. Biology of Microorganisms. Englewood Cliffs, NJ

Prentice Hall, 1997.

BROWN K.W. and DONNELLI K.S. Influence and soil environment on biodegradation of a

refinery and petrochemical sludge. Environmental Pollution Ser, 1983. 119-132 p.

CHEO Hyo Lee et al. Attenuation of petroleum hidrocarbons in smear zones: a case study,

2001.

CLEVES I & SANDOVAL M. Evaluación de la Biodegradación de Hidrocarburos presentes

en suelos contaminados con Lodos Aceitosos de la Industria Petrolera. Huila - Colombia:

Pontificia Universidad Javeriana. Facultad Ciencia Básicas, 2001.

CORREAL URREGO Gonzalo. Investigaciones arqueológicas en abrigos rocosos de

Nemocón y Sueva, 1979.

DREYFUS Cortés Georges. El mundo de los microbios, 1996.

ECOLI et al. Análisis de parámetros críticos y evaluación en la biodegradación de

hidrocarburos en suelo, 2001

129

ECOPETROL. Sistema trifásico para la biodegradación intensiva de lodos aceitosos en

sitio, 1995

EWIS Juana et al. Principios de biorrecuperación. McGraw Hill, 2000.

I.G.A.C Métodos de análisis de laboratorio de suelo. p. 121 - 123

LINDSTROM J.E., PRINCE R.C., CLARK J.C., GROSSMAN M.T., YEAGER T.R.,

BRADDOCK J.F. and BROWN E.J. Microbial Populations and Hydrocarbon

Biodegradation Potentials in Fertilized Shoreline Sediments Affected by the T/V Exxon

Valdez Oil Spill. Applied and Environmental Microbiology, 1991. 2514-2522. p.

MAROTO Arroyo, Maria Ester y ROGEL Q. Juan Manuel. Aplicación de sistemas de

biorremediación de suelos y aguas contaminadas por hidrocarburos. Geocisa Div.

Protección ambiental de suelos. 298 p.

MISHRA H., JYOT J., KUHAD R.C. and LAL B. Evaluation of Inoculum addition to

stimulate in situ bioremediation of oily-sludges-contaminated soil. Applied and

Environmental Microbiology, 2001. 1675-1681 p.

QUIJANO, A & QUIZA C. Evaluación de la Degradación Microbiológica por la técnica de

Landfarming. Bogotá: Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias, 2000.

RAMIREZ N.E., VARGAS M.C. and SANCHEZ F.N. Use of the "Sediment-Chromotest" for

Monitoring Stimulated Hydrocarbon Biodegradation Processes. Environmental Toxicology

and Water Quality: An International Journal, 1996. 223-230 p.

RAMÍREZ A & VIÑA G. Limnología Colombiana, Aportes a su Conocimiento y estadística

de análisis. Bogotá: Editorial Panamericana, 1998.

130

RITTER W.F. and SCARBOROUGH R.W. A Review of Bioremediation of Contaminated

Soils and Groundwater. Journal of Environmental Science and Health, 1995 333-357 p.

SARANITRO Joseph et al. Crude oil hydrocarbon bioremediation and soil ecotoxicity

assessment, 1997.

SUBDIRECCIÓN AGROLÓGICA. Estudio general de suelos de los municipios de Ubate y

norte de la sabana de Bogotá, 1982.

WINI Schmidt. Suelos contaminados con hidrocarburos: la biorremediación como una

solución ecológicamente compatible, 2002.

158

ANEXOS

131

ANEXO 1 Cálculo de la concentración inicial de TPH´s

Para lograr una concentración inicial de TPH´s de 10.000 mg. / Kg. en peso seco,

se realizaron los siguientes cálculos:

[ ]

LagregarapetroleoCantidad

Kgxcm

mx

mL

xmg

gx

cmgKgmg

agregarapetróleoCantidad

arcontaasuelodecantidadxsuelodelDensidad

sTPHdedeseadaagregarapetróleoCantdad

31.2

.250100

11

1000.1000

.1

.08.1

10000

min´

33

3

3

3

=

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

=

Sin embargo, a los 250 Kg. de suelo se les agregaron 6 L. de petróleo, obteniendo

una concentración inicial de:

[ ]

[ ]

[ ] suelodeKgmgsTPHdeinicial

m

cmx

L

mx

g

mgx

cm

gxKg

LsTPHdeinicial

suelodeldensidadxarcontaaesuelodCantidad

agregarapetróleodeCantidadsTPHdeinicial

./21600´

31

33)100(1000

31

1

10003

08.1.250

6´

min´

=

=

=

Este valor obtenido, se encontró dentro del rango de 19.083 a 23.280 mg./Kg. de

suelo, determinado por el laboratorio PRODYCON LTDA.

132

ANEXO 2 Cálculo de la cantidad de NH4NO3 y K2HPO4 a adicionar en cada una de las

unidades experimentales.

Los análisis iniciales realizados al suelo contaminado, en el laboratorio de suelos

del I.G.A.C., arrojaron los siguientes resultados:

Tabla 21. Resultados de los análisis iniciales

ANÁLISIS RESULTADOS

Nitratos 94,9 ppm.

Amonio 2,3 ppm.

Fósforo asimilable 120 ppm.

Densidad aparente 1,08 g / cc

Fuente: Instituto Geográfico Agustín Codazzi, 2003.

De acuerdo a los datos obtenidos anteriormente, se realizaron los cálculos

correspondientes a la cantidad de nitrato de amonio y fosfato dibásico de potasio a

adicionar en cada una de las unidades experimentales:

Determinación de porcentaje de humedad y fracción de peso seco Peso de suelo seco = 6.6175 g.

Peso de suelo húmedo = 10.032 g.

- 100sec

% ∗−

=humedosuelodePeso

osuelodePesohumedosuelodePesoHumedad

133

04.34% =Humedad

- húmedosuelodePeso

osuelodePesoosoFracciónpe

secsec =

6596.0sec =osoFracciónpe

Determinación de cantidad de nutrientes en el suelo contaminado.

El análisis de TPH en el laboratorio PRODICOM, dio como resultado 21481.5

mg. / Kg. de TPH en peso seco. Teniendo en cuenta la relación C:N:P 100:10:1, la

cantidad de nutrientes en el suelo esta dada de la siguiente manera:

C: 21481.50 mg. / Kg.

N: 2148.15 mg. / Kg.

P: 214.815 mg. / Kg.

Determinación de la cantidad de nutrientes en cada una de las tres unidades experimentales

húmedopesoenAmonioyNitratoCantidadAmonioCantidadNitratoCantidad =+

húmedo.pesoKgmg97.2p.p.m.2.3p.p.m.94.9 =+

- opesoNutrientesCantidadopesoFracciónhúmedopesoNutrientes secsec =×

134

opesoKgmghúmedopeso

Kgmg sec1131.646596.02.97 =×

Determinación de la cantidad de suelo contaminado en cada una de las unidades experimentales y controles bióticos

suelodeldprofundidaUEladeáreaaparentedensidadw ××=

cmcmcmgw 13240008.1 2

3 ××=

.696,3333696 Kggw ==

Determinación del peso seco en cada una de las unidades experimentales

y controles bióticos

OHKgsueloKgsueloKg

OHKg2

2 4701,11.696,33100

04.34=×

opesoKg sec.225,224701,11696,33 =−

Determinación de la cantidad de NH4NO3 a adicionar en cada una de las tres unidades experimentales

UEenfaltaqueNCantidadhayqueNCantidadhaberdebequeNCantidad =−

opesoKgmgopeso

Kgmgopeso

Kgmg sec0368,2084sec1131,64sec15,2148 =−

135

agregaraNCantidadUEdeopesofaltaqueNCantidad =× sec

.319,46sec225,220368,2084 NdegUEenopesoKgNdeKgmg

=×

3434 3415,132

.2880

319,46 NONHdegNdeg

NONHgNdeg =×

Determinación de la cantidad de fosfato dibásico de potasio a adicionar en cada una de las unidades experimentales

- opesoNutrientesCantidadopesoFracciónhúmedopesoNutrientes secsec =×

opesoKgmghúmedopeso

Kgmg sec152,796596.0120 =×

UEenfaltaquePCantidadhayquePCantidadhaberdebequePCantidad =−

opesoKgmgopeso

Kgmgopeso

Kgmg sec663,135sec152,79sec815,214 =−

agregaraPCantidadUEdeopesofaltaquePCantidad =× sec

.0152,3sec225,22663,135 PdegUEenopesoKgPdeKgmg

=×

136

4242 9405,16

.3118,174

0152,3 HPOKdegPdeg

HPOKgPdeg =×

137

ANEXO 3 Cantidad de NH4NO3 y K2HPO4 adicionada en cada una de las unidades

experimentales.

Los 132,3415 g de NH4NO3, se agregaron de la siguiente manera:

- Inicio del tratamiento 50% = 66,17 g.

- Segundo mes de tratamiento 25% = 33,085 g.

- Tercer mes de tratamiento 25% = 33,085 g. Los 16,9405 g de K2HPO4, se agregaron de la siguiente manera:

- Inicio del tratamiento 50% = 8,47 g.

- Segundo mes de tratamiento 25% = 4,235 g. - Tercer mes de tratamiento 25% = 4,235 g.

138

ANEXO 4 Determinación de amonio y nitrato en laboratorio.

a. Determinación de amonio Para realizar el análisis de amonio es necesario preparar las siguientes

soluciones:

Indicador mixto, el cual se prepara disolviendo 0.330 g. de bromocresol verde y

0.165 g. de metil rojo en 500 ml. de etanol de 95º.

Hidróxido de sodio 0.05N, el cual se prepara pesando 2 g. de NaOH en 1 L. de

agua destilada.

Solución indicadora de ácido bórico (H3BO3), la cual se prepara disolviendo 20 g.

de H3BO3 puro, en 700 ml. de agua destilada caliente; luego se enfría y se

transfiere la solución a un balón de 1 L. que contenga 200 ml. de etanol y 20 ml.

de solución indicadora mixta. Mezclar el contenido del balón y agregar

aproximadamente NaOH, 0.05N hasta que el cambio de color de rosado a verde

pálido se advierta, cuando 1 ml. de la solución se trata con 1 ml. de agua

destilada. Posteriormente se diluye la solución y se lleva a volumen de 1 L.

cuidadosamente. Como extractante de suelo se usa una solución de KCl 1N en relación 1:10

suelo:extractante. Se agita durante 1 hora y se filtra.

Para determinar el N-amoniacal, en erlenmeyer de 50 ml marcados a volumen de

30 ml, se colocan 5 ml. de solución indicadora de ácido bórico, luego los

139

erlenmeyer se ubican bajo el condensador del aparato de destilación de vapor, de

manera que el terminal del condensador quede 4 cm. por encima de la superficie

del H3BO3. Posteriormente, se pipetea en los matraces de destilación una alícuota

de 10 a 20 ml. del extracto de suelo. Se agregan 0.2 g. de MgO y se conecta al

aparato de destilación, destilando por arrastre de vapor; luego se conecta el

destilado hasta la marca de 30 ml; después, se suspende el suministro de vapor y

se lava la punta del condensador. Finalmente, el N-amoniacal se determina en el

destilado por titulación con H2SO4 0.005N. En el punto final, el color cambia de

verde a rosado tenue. Se debe llevar un blanco de reactivos, el cual se le resta a

la determinación132.

b. Determinación de fósforo asimilable

Para realizar el análisis de fósforo asimilable es necesario preparar las siguientes

soluciones:

Solución extractante (HCl 0.1N – NH4F 0.03N), la cual se prepara pesando 16.65

g. de NH4F y se disuelve en 125 ml. de HCl concentrado, llevando a un volumen

de 15 L. con agua destilada.

Solución de molibdato de amonio ((NH4)6Mo7O24 . 4H2O), la cual se prepara

pesando 22.5 g. de molbidato de amonio disolviéndolos en 450 ml. de agua

destilada a 50 ºC; luego se filtra. Posteriormente, se agregan lentamente 437.5 ml.

de HCl concentrado en frío y se guarda la solución en un frasco ámbar.

Solución de cloruro estannoso, se prepara pesando 10 g. de SnCl2 . 2H2O y

disolviéndolos en 25 ml. de HCl concentrado. La solución de cloruro estannoso

132 I.G.A.C Métodos de análisis de laboratorio de suelo. p. 121 - 123

140

diluido se prepara agregándole 333 ml. de agua destilada a 1 ml. de solución

concentrada de cloruro estannoso, luego se agita. Esta solución se debe preparar

minutos antes de la determinación.

Para la determinación del fósforo asimilable, se mide con una cuchara con

capacidad de 3 ml el suelo, el cual se transfiere a frascos de extracción de 100 ml.

Los frascos se colocan en un agitador mecánico y a cada uno de ellos se les

agrega simultáneamente 20 ml. de la solución extractante; se tapa rápidamente y

se agita por 40 segundos exactamente. Una vez terminada la agitación se filtra el

extracto utilizando un filtro marca Whatman No. 5 de 11 cm. de diámetro y se

recoge el extracto filtrado en tubos de ensayo de 25 ml. Todas las muestras deben

ser filtradas al tiempo.

Luego, se mide con un gotero aforado 1 ml. de los extractos filtrados; el gotero

debe ser lavado con agua destilada cada dos mediciones. Posteriormente, con

una bureta se agregan 2 ml. de molibdato de amonio y 6 ml. de agua destilada a

cada uno de los tubos de ensayo. A continuación, se agita y se agrega 1 ml. de la

dilución diluida de cloruro estannoso y se agita nuevamente. Posteriormente se lee

el porcentaje de transmisión en un fotocolorímetro a 660 nm. a un intervalo entre

10 y 15 minutos de desarrollado el color y se ajusta el 100% de transmisión con un

blanco de reactivos133.

133 I.G.A.C Métodos de análisis de laboratorio de suelo. p. 136 - 138

141

ANEXO 5 Resultados de nutrientes reportados a lo largo del estudio.

A continuación, se relacionan los resultados mensuales de P asimilable, N-NO3,

N-NH4 y N-mineral, reportados por el Centro de Investigaciones y Asesorías

Agroindustriales de la universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.

142

ANEXO 6 Resultados obtenidos a lo largo del periodo de estudio

Datos de pH

Semana Muestra UE 1 UE 2 UE 3 CB 1 CB 2 CB 3

1 1 5.2 5.4 5.1 5.5 5.5 5.6

2 5.2 5.3 5.1 5.4 5.4 5.5

2 1 5.4 5.5 5.3 5.6 5.8 5.7

2 5.4 5.6 5.4 5.6 5.7 5.6

3 1 5.6 6.5 6.5 5.9 5.6 5.9

2 5.5 6.5 6.4 5.8 5.6 5.8

4 1 5.4 5.5 5.3 5.5 5.4 5.3

2 5.4 5.5 5.4 5.5 5.4 5.3

5 1 5.6 5.4 5.5 5.6 5.5 5.4

2 5.5 5.4 5.4 5.6 5.6 5.4

6 1 5.4 5.5 5.7 5.9 5.6 5.9

2 5.4 5.3 5.7 5.8 5.7 5.8

7 1 5.5 5.5 5.5 5.4 5.5 5.6

2 5.5 5.4 5.5 5.3 5.6 5.8

8 1 5.6 5.2 5.5 5.9 5.3 5.7

2 5.6 5.0 5.4 5.8 5.4 5.7

9 1 5.3 5.1 5.6 5.6 5.4 5.5

2 5.4 5.3 5.8 5.6 5.5 5.4

10 1 5.7 5.5 5.6 5.4 5.3 5.4

2 5.5 5.6 5.4 5.6 5.3 5.4

11 1 5.6 5.4 6.0 5.7 5.6 5.5

2 5.7 5.6 5.8 5.6 5.5 5.6

12 1 5.4 6.0 5.6 5.4 5.4 5.3

2 5.5 5.9 5.4 5.3 5.4 5.4

13 1 5.7 5.7 5.4 5.6 5.5 5.7

2 5.6 5.6 5.4 5.6 5.6 5.6

14 1 5.4 5.5 5.6 5.5 5.6 5.5

2 5.4 5.3 5.3 5.4 5.6 5.6

15 1 5.6 5.5 5.4 5.6 5.7 5.8

143

2 5.7 5.5 5.5 5.6 5.6 5.8

16 1 5.8 5.6 5.8 5.7 5.9 5.7

2 5.8 5.7 5.8 5.7 5.8 5.7

Datos de temperatura

Semana UE 1 UE 2 UE 3 CB 1 CB 2 CB 3

1 13° C 13° C 13° C 14° C 13° C 13° C

2 15° C 14° C 14° C 13° C 14° C 14° C

3 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

4 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

5 14° C 14° C 13° C 14° C 14° C 13° C

6 13° C 14° C 14° C 14° C 13° C 14° C

7 14° C 13° C 14° C 14° C 14° C 14° C

8 14° C 14° C 13° C 14° C 14° C 15° C

9 14° C 14° C 14° C 15° C 14° C 14° C

10 15° C 14° C 15° C 14° C 14° C 14° C

11 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

12 14° C 15° C 14° C 14° C 14° C 14° C

13 13° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

14 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

15 15° C 15° C 15° C 15° C 15° C 15° C

16 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C 14° C

Datos de porcentaje de humedad Semana Muestra UE 1(%) UE 2(%) UE 3(%) CB 1(%) CB 2(%) CB 3(%)

1 1 27.85 29.25 28.33 29.63 28.06 31.23

2 28.27 29.69 29.03 29.06 27.10 28.53

4 1 29.32 30.26 28.79 29.50 28.54 30.56

2 30.46 31.01 28.52 30.12 29.32 29.62

6 1 30.39 29.98 30.59 29.62 30.45 31.22

2 29.98 29.92 29.56 30.75 30.42 32.62

144

8 1 30.22 29.87 30.20 31.25 31.57 30.73

2 30.56 30.42 29.47 29.39 30.30 30.52

10 1 29.47 30.09 28.86 27.76 31.38 31.10

2 29.56 32.54 28.41 30.78 31.52 30.03

12 1 31.56 32.87 30.12 31.30 31.08 29.84

2 29.74 31.45 30.94 30.28 29.78 30.67

14 1 30.53 32.30 31.36 31.15 30.06 31.28

2 30.28 31.75 31.43 31.03 30.26 31.32

16 1 30.15 30.38 30.49 29.86 29.67 30.28

2 29.95 30.27 29.98 30.02 30.13 31.15

Datos de TPH’s

(mg./Kg. suelo)

Semana Muestra UE 1 UE 2 UE 3 CB 1 CB 2 CB 3

2 1 13639.916 7422.12 11178.50 12239.30 14626.32 11346.27

2 12876.906 7548.49 11767.86 9802.31 17241.70 10576.50

6 1 7806.20 6839.12 10268.92 9320.39 12846.20 8888.41

2 6530.13 7100.91 9803.97 9112.01 10289.69 8781.87

10 1 6970.21 6117.49 8815.97 8934.09 7723.41 8222.46

2 5651.42 6403.49 8017.27 8680.84 8953.9 7908.09

Datos de recuento de heterótrofos totales

- Resultados de Noviembre.

UNIDAD EXPERIMENTAL 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) 10.-3 38 34 6,79 x 104 56 68 1,20 x 105 10.-4 18 15 2,3 x 105 19 22 2,91 x 105 10.-5 3 7 6,9 x 105 6 11 1,2 x 106 10.-6 0 2 2,7 x 106 2 4 4,1 x 106

10.-7 0 0 0 0

145

UNIDAD EXPERIMENTAL 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) 10.-3 39 75 1,10 x 105 35 51 8,45 x 104 10.-4 7 35 2,9 x 105 30 38 4,79 x 105 10.-5 5 5 6,9 x 105 8 8 1,12 x 106 10.-6 5 1 4,18 x 106 2 1 2,81 x 106 10.-7 1 0 1,39 x 107 1 0 1,4 x 107

UNIDAD EXPERIMENTAL 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) 10.-3 39 75 1,10 x 105 35 51 8,45 x 104 10.-4 7 35 2,9 x 105 30 38 4,79 x 105 10.-5 5 5 6,9 x 105 8 8 1,12 x 106 10.-6 5 1 4,18 x 106 2 1 2,81 x 106 10.-7 1 0 1,39 x 107 1 0 1,4 x 107

CONTROL BIÓTICO 1 MUESTRA 1 MUESTRA 2

DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

peso seco) 10.-3 46 42 8,88 x 104 43 60 1,03 x 105 10.-4 7 16 1,7 x 105 14 25 2,82 x 105 10.-5 5 9 9,94 x 105 4 1 4,22 x 105 10.-6 1 3 2,8 x 106 2 1 2,81 x 106

10.-7 1 0 1,42 x 107 0 0

CONTROL BIÓTICO 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2

DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 105 60 1,60 x 105 82 101 1,73 x 105

10.-4 36 34 4,86 x 105 23 34 3,9 x 105

10.-5 2 4 4,17 x 105 8 5 9,6 x 105

10.-6 1 2 2,78 x 106 3 5 5,48 x 106 10.-7 1 1 1,39 x 106 1 0 1,37 x 106

146

CONTROL BIÓTICO 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 92 112 2,15 x 105 110 148 2,52 x 105 10.-4 29 34 4,65 x 105 37 40 5,45 x 105 10.-5 10 13 1,74 x 106 6 5 8,39 x 105 10.-6 3 1 2,9 x 106 2 2 2,79 x 106

10.-7 1 0 1,45 x 107 0 0

- Resultados de Diciembre

UNIDAD EXPERIMENTAL 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 38 34 7,65 x 104 56 68 1,26 x 104 10.-4 18 15 2,44 x 105 19 22 2,99 x 105 10.-5 3 7 7,18 x 105 6 11 1,28 x 106 10.-6 1 2 2,87 x 106 2 4 4,28 x 106

10.-7 0 0 0 1 1,42 x 107

UNIDAD EXPERIMENTAL 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 60 76 1,39 x 105 81 79 1,63 x 105 10.-4 20 40 4,28 x 105 12 15 1,99 x 105 10.-5 5 9 9,99 x 105 9 7 1,14 x 106 10.-6 2 0 1,42 x 106 2 0 1,42 x 106

10.-7 0 0 1 1 1,42 x 107

UNIDAD EXPERIMENTAL 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 39 75 1,18 x 105 35 51 8,66 x 104 10.-4 5 35 2,88 x 105 30 38 4,82 x 105 10.-5 5 5 7,2 x 105 8 8 1,13 x 106 10.-6 7 0 5,76 x 106 2 1 2,83 x 106 10.-7 1 1 1,44 x 107 1 0 1,41 x 107

147

CONTROL BIÓTICO 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 46 42 8,88 x 104 43 60 1,08 x 105 10.-4 5 16 1,5 x 105 6 25 2,31 x 105 10.-5 7 9 1,13 x 106 4 1 4,33 x 105 10.-6 1 3 2,84 x 106 2 0 1,44 x 106

10.-7 1 0 1,42 x 107 0 0

CONTROL BIÓTICO 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 105 60 1,63 x 105 82 101 1,96 x 105 10.-4 36 34 4,91 x 105 23 34 4,24 x 105 10.-5 2 1 2,81 x 105 8 5 1,02 x 106 10.-6 1 1 1,40 x 106 3 5 5,86 x 106 10.-7 1 0 1,40 x 107 1 0 1,46 x 107

CONTROL BIÓTICO 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 92 112 2,15 x 105 99 180 2,06 x 105 10.-4 29 34 4,65 x 105 37 40 5,79 x 105 10.-5 10 13 1,74 x 106 6 5 8,91 x 105

10.-6 0 0 2 2 2,97 x 106

10.-7 0 0 0 1 1,48 x 107

- Resultados de Enero

UNIDAD EXPERIMENTAL 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC/g.) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 25 31 5,63 x 106 21 32 4,73 x 106

148

10.-6 13 20 2,41 x 106 12 9 1,45 x 107

10.-7 4 5 7,18 x 107 8 5 9,26 x 107

UNIDAD EXPERIMENTAL 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 40 52 9,41 x 106 45 41 9,74 x 106 10.-6 36 41 5,57 x 107 28 29 4,29x 107 10.-7 4 1 4,29 x 107 7 16 1,77 x 107

UNIDAD EXPERIMENTAL 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 53 18 7,11 x 106 49 13 6,13 x 106 10.-6 40 29 4,92x 107 43 35 5,53 x 107 10.-7 13 6 1,40 x 108 5 3 5,67 x 107

CONTROL BIÓTICO 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 13 11 2,35 x 106 10 8 1,86 x 106 10.-6 4 3 5,6 x 106 4 2 4,33 x 106 10.-7 4 2 4,15x 107 2 0 1,44 x 107

CONTROL BIÓTICO 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2

DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable

149

10.-5 8 3 1,27 x 106 10 17 2,98 x 106

10.-6 0 2 1,43 x 106 2 2 2,92 x 106

10.-7 0 0 0 0

CONTROL BIÓTICO 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 14 17 3,37 x 106 18 8 2,64 x 106 10.-6 1 2 2,9 x 106 1 1 1,43 x 106

10.-7 0 0 0 0

- Resultados de Febrero

UNIDAD EXPERIMENTAL 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 50 75 8,86 x 106 42 60 9,89 x 106

10.-6 30 25 3,99 x 107 30 23 3,95 x 107

10.-7 17 22 2,85 x 108 21 11 2,34 x 108

UNIDAD EXPERIMENTAL 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 Incontable Incontable 61 40 7,32 x 106 10.-6 61 40 1,05 x 108 32 25 6,17 x 107 10.-7 12 7 1,43 x 108 15 9 1,72 x 108

150

UNIDAD EXPERIMENTAL 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 42 47 9,11 x 106 69 73 1,44E x 107

10.-6 23 38 4,47 x 107 21 20 3,04 x 107 10.-7 20 16 2,59 x 108 19 14 2,46x 108

CONTROL BIÓTICO 1

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 28 25 5,34 x 106 22 19 4,39 x 106 10.-6 21 13 2,43 x 107 17 16 2,46 x 106 10.-7 19 9 2,00x 108 7 5 8,71 x 107

CONTROL BIÓTICO 2

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) 10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 13 11 2,58 x 106 20 18 3,99 x 106 10.-6 8 9 1,33 x 107 11 9 1,44 x 107 10.-7 5 6 8,89 x 107 5 3 5,76 x 107

CONTROL BIÓTICO 3

MUESTRA 1 MUESTRA 2 DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo) CAJA 1 CAJA 2

REPORTE (UFC / g.

suelo)

10.-3 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-4 Incontable Incontable Incontable Incontable 10.-5 33 41 7,53 x 106 19 32 5,42 x 106 10.-6 11 13 1,68 x 107 15 27 3,06 x 107 10.-7 7 8 1,12 x 108 10 7 1,31 x 108

151

Datos de NMP

GRUPOS NOVIEMBRE DICIEMBRE ENERO FEBRERO UE 1 2,4625372 5,01866651 6,04245916 5,24303846UE 2 2,63570581 5,01723627 5,73540138 5,39395085UE 3 5,71831703 4,21181481 5,38490303 4,64809794CB 1 4,18549666 4,54815897 4,60238081 4,64638544CB 2 3,69503476 4,10833005 4,58471337 3,80905735CB 3 3,76545463 2,91121518 4,11388711 3,77806567

152

ANEXO 7 Resultados estadísticos obtenidos a lo largo del periodo de estudio

Análisis descriptivos de nutrientes en las U.E.

Media

Desviación típica

Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo

Límite inferior Límite superior

P asimilable Diciembre 148,6667 3,50238 144,9911 152,3422 144,00 153,00

Enero 347,8333 40,75987 305,0585 390,6082 313,00 421,00 Febrero 236,2833 19,51117 215,8076 256,7590 213,50 270,90 Total 244,2611 87,39581 200,8002 287,7220 144,00 421,00 N-NH4 Diciembre 517,7333 190,37934 317,9425 717,5242 145,20 696,40 Enero 1305,5333 246,03329 1047,3372 1563,7294 919,30 1563,70 Febrero 876,9500 61,38035 812,5353 941,3647 756,10 924,60 Total 900,0722 373,33311 714,4180 1085,7264 145,20 1563,70 N-NO3 Diciembre 956,6167 153,88248 795,1269 1118,1064 820,60 1239,50 Enero 1551,7167 586,62408 936,0925 2167,3409 893,40 2192,10 Febrero 1086,1833 232,09314 842,6165 1329,7501 642,40 1257,40 Total 1198,1722 439,49703 979,6155 1416,7290 642,40 2192,10 N-Mineral Diciembre 1474,3500 120,68376 1347,7002 1600,9998 1379,40 1707,30 Enero 2857,2500 767,55106 2051,7546 3662,7454 2133,00 3755,80 Febrero 1963,1333 233,73982 1717,8384 2208,4282 1543,40 2182,00 Total 2098,2444 735,37505 1732,5510 2463,9379 1379,40 3755,80

ANOVA de los nutrientes en las U.E.

Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos 119574,888 2 59787,444 87,310 ,000 Intra-grupos 10271,595 15 684,773 P asimilable

Total 129846,483 17 Inter-grupos 1866698,254 2 933349,127 27,849 ,000 Intra-grupos 502721,102 15 33514,740 N-NH4

Total 2369419,356 17 N-NO3 Inter-grupos 1175305,631 2 587652,816 4,181 ,036

153

Intra-grupos 2108374,245 15 140558,283 Total 3283679,876 17

N-Mineral Inter-grupos 5901532,341 2 2950766,171 13,447 ,000

Intra-grupos 3291667,483 15 219444,499 Total 9193199,824 17

Análisis descriptivos del recuento de heterótrofos totales durante el tiempo de

observación

Media Desviación

típica Intervalo de confianza para la

media al 95% Mínimo Máximo

Límite inferior

Límite superior

UFC UE 0 900000,00 . . . 900000 900000

1 112727,36 29621,290 39143,99 186310,72 93917 146872

2 118196,32 28148,796 48270,84 188121,81 101439 150694

3 7125947,64 2242406,081 1555502,14 12696393,15 5177478 9576998

4 34750513,95 41911777,320 -69364112,66

138865140,56 9375113 83126642

Total 9786319,68 22461522,026 -3787042,24 23359681,59 93917 83126642

UFC CB 0 900000,00 . . . 900000 900000

1 165340,28 68745,886 -5433,97 336114,52 96085 233565

2 163038,65 57904,905 19194,90 306882,41 98640 210813

3 2413802,47 512960,311 1139538,42 3688066,53 2108743 3006028

4 4875757,67 1596059,373 910926,40 8840588,95 3283473 6475565

Total 1827216,71 2081745,594 569230,44 3085202,98 96085 6475565

ANOVA del recuento de heterótrofos totales durante el tiempo de observación

Suma de

cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Inter-grupos

2530985394737660,000 4 6327463486

84415,000 1,437 ,306 UFC UE

Intra-grupos

3523254265905661,000 8 4404067832

38207,700

154

Total 6054239660

643320,000 12

Inter-grupos

46366751079302,800 4 1159168776

9825,710 16,450 ,001

Intra-grupos

5637225554640,440 8 7046531943

30,056 UFC CB

Total 52003976633943,200 12

Análisis descriptivos del NMP durante el tiempo de observación

Media Desviación

típica Intervalo de confianza para la

media al 95% Mínimo Máximo

Límite inferior Límite superior

NMP CB

1,00 12670,8528 10301,47647 -12919,4334 38261,1390 5025,02 24385,31

2,00 18386,2907 17320,98980 -24641,4332 61414,0147 815,54 35446,22 3,00 32012,2488 12988,24459 -252,3394 64276,8370 17030,8

6 40105,39

4,00 18927,6598 21973,59926 -35657,7868 73513,1064 6038,06 44299,50 Tota

l 20499,2630 15718,09509 10512,4619 30486,0642 815,54 44299,50

NMP UE

1,00 275442,2257 360848,26452 -620954,5564 1171839,0078 15643,0

2 687458,4

2,00 105365,3503 69714,97876 -67816,2575 278546,9581 24866,80 146021,8

3,00 688586,4734 431374,68287 -383007,6442 1760180,5910 242328,

2 1103351

4,00 159743,0086 104334,13627 -99437,3539 418923,3711 44473,36 247714,2

Total 307284,2645 342572,83694 89623,8682 524944,6608 15643,0

2 1103351

ANOVA de NMP durante el tiempo de observación

Suma de

cuadrados gl Media

cuadrática F Sig. Inter-grupos 4934738224

46,915 1 493473822446,915 8,392 ,008

Intra-grupos 1293635278321,768 22 5880160356

0,080

Total 1787109100768,683 23

155

Análisis descriptivos de los TPH´s durante el tiempo de observación

Media Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo

Límite inferior

Límite superior

TPH CB ,00 21481,5000 . . 21481,50 21481,50

2,00 10738,9653 7945,8607 13532,0700 7422,12 13639,92 6,00 8058,2083 6383,3105 9733,1062 6530,13 10268,92 10,00 6995,9750 5729,0935 8262,8565 5651,42 8815,97 Total 9275,8101 7453,3585 11098,2617 5651,42 21481,50

TPH UE ,00 21481,5000 . . 21481,50 21481,50

2,00 12638,7333 9697,8441 15579,6226 9802,31 17241,70 6,00 9873,0950 8243,3911 11502,7989 8781,87 12846,20 10,00 8403,7983 7848,0705 8959,5261 7723,41 8953,90 Total 10893,4347 9183,5180 12603,3514 7723,41 21481,50

ANOVA de los TPH´s durante el tiempo de observación

Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

TPH CB Inter-grupos 201905018,228 3 67301672,743 18,209 ,000

Intra-grupos 55441465,398 15 3696097,693

Total 257346483,626 18

TPH UE Inter-grupos 173819824,764 3 57939941,588 16,483 ,000

Intra-grupos 52726041,281 15 3515069,419

Total 226545866,045 18

156

ANEXO 8 Reporte de microorganismos gram positivos y gram negativos

157

ANEXO 9 Gráficas de concentración total de PAH´s a lo largo del periodo de estudio

A continuación, se presentan las gráficas realizadas por el HPLC, las cuales

contienen la concentración total de PAH´s en cada una de las muestras de suelo

contaminado y la concentración de los compuestos presentes en cada una de

ellas.

EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES INORGÁNICAS SIMPLES COMO EL NHINORGÁNICAS SIMPLES COMO EL NH44NONO33 y y KK22HPOHPO44 EN EL PROCESO DE DEGRADACIÓN EN EL PROCESO DE DEGRADACIÓN

DE HIDROCARBUROS EN SUELOS DE HIDROCARBUROS EN SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEOCONTAMINADOS CON PETRÓLEO

ANDREA CASAS OCAMPOANDREA CASAS OCAMPO

MARIA FERNANDA LONDOÑOMARIA FERNANDA LONDOÑO R.R.

Junio 8 de 2004Junio 8 de 2004

UNIVERSIDAD DE LA SALLEUNIVERSIDAD DE LA SALLE

JUSTIFICACIÓNJUSTIFICACIÓN

Extracción, transporte y refinamientoExtracción, transporte y refinamiento

Técnicas de Técnicas de biorremediaciónbiorremediaciónImpactos ambientales,Impactos ambientales,económicos y socialeseconómicos y sociales

Contaminación de los ecosistemasContaminación de los ecosistemas

OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL

Evaluar la eficacia de la Evaluar la eficacia de la adiciadicióón de sales n de sales inorginorgáánicas simples comonicas simples comoel fosfato di bel fosfato di báásico de sico de potasio y nitratopotasio y nitratode amonio en el proceso de de amonio en el proceso de biodegradacibiodegradacióón de n de hidrocarburos en suelo hidrocarburos en suelo contaminado con petrcontaminado con petróóleo.leo.

OBJETIVOS OBJETIVOS ESPECÍFICOSESPECÍFICOS

•• Evaluar el comportamiento de los nutrientes en las U.E. frente Evaluar el comportamiento de los nutrientes en las U.E. frente

a los C.B. a los C.B.

•• Evaluar el comportamiento de los TPH´s en las U.E. frente a Evaluar el comportamiento de los TPH´s en las U.E. frente a

los C.B. los C.B.

•• Evaluar el comportamiento de los PAH´s en las U.E. frente a Evaluar el comportamiento de los PAH´s en las U.E. frente a

los C.B.los C.B.

•• Determinar el comportamiento poblacional de los Determinar el comportamiento poblacional de los

microorganismos presentes en el suelo contaminado antes y microorganismos presentes en el suelo contaminado antes y

durante el periodo de estudio.durante el periodo de estudio.

•• Identificar los microorganismos capaces de degradar los Identificar los microorganismos capaces de degradar los

hidrocarburos de petróleo presentes en el suelo contaminado.hidrocarburos de petróleo presentes en el suelo contaminado.

METODOLOGÍAMETODOLOGÍA

Aireación durante Aireación durante cuatro días y tamizado delcuatro días y tamizado del

suelo contaminadosuelo contaminado

Recolección del Recolección del suelosuelo

Traslado del suelo Traslado del suelo a la P.U.J.a la P.U.J.

Mezcla del suelo y el Mezcla del suelo y el petróleopetróleo

Distribución del suelo en las Distribución del suelo en las U.E y C.B. y traslado a la U.L.S.U.E y C.B. y traslado a la U.L.S.

Continuación metodología

Caracterización Caracterización inicialinicial

Adición del NHAdición del NH44NONO33

y Ky K22HPOHPO44 en U.E.en U.E.

Distribución del suelo en las Distribución del suelo en las U.E y C.B. y traslado a la ULSU.E y C.B. y traslado a la ULS

Análisis de laboratorioAnálisis de laboratorio

AireaciónAireacióny Tamizadoy Tamizado

Recolección del sueloRecolección del suelo

Traslado del suelo Traslado del suelo a la P.U.J.a la P.U.J.

Caracterización inicialCaracterización inicial

Adición del NHAdición del NH44NONO33 y Ky K22HPOHPO44 en U.E.en U.E.

FisicoquímicosFisicoquímicos

Distribución del suelo y traslado a la ULSDistribución del suelo y traslado a la ULS

MicrobiológicosMicrobiológicos HidrocarburosHidrocarburos

Análisis de laboratorioAnálisis de laboratorio

Continuación metodología

FisicoquímicosFisicoquímicos

ResultadosResultados

Análisis de laboratorioAnálisis de laboratorio

Continuación metodología

NutrientesNutrientes

HumedadHumedad

TTemperaturaemperatura

pHpH

ResultadosResultados

MicrobiológicosMicrobiológicos

Continuación metodología

Recuento de Recuento de heterótrofos totalesheterótrofos totales

NMPNMP

Identificación de Identificación de microorganismosmicroorganismos

Análisis de laboratorioAnálisis de laboratorio

ResultadosResultados

HidrocarburosHidrocarburos

Continuación metodología

TPH’sTPH’s

PAH’sPAH’s

Análisis de laboratorioAnálisis de laboratorio

Continuación metodología

ResultadosResultados

DiscusiónDiscusión

ConclusionesConclusiones

RecomendacionesRecomendaciones

Estudio económicoEstudio económico

RECOLECCIÓN DEL SUELO Y RECOLECCIÓN DEL SUELO Y TRASLADO A LA TRASLADO A LA P.U.JP.U.J..

Se recolectaron 250 Kg. de suelo retirando la cobertura vegetal

El suelo se traslado a las instalaciones de la P.U.J.

MEZCLA, AIREACIÓN y TAMIZADOMEZCLA, AIREACIÓN y TAMIZADODEL SUELODEL SUELO

Se mezcló hasta obtener una concentracion final de TPH´smayor a 10.000 mg. /Kg. de sueloSe realizó volteo con el fin

de volatilizar los COV’s

Se tamizó con el fin de obtener un tamaño de partícula homogéneo

DISTRIBUCIÓN DEL SUELO EN LAS DISTRIBUCIÓN DEL SUELO EN LAS U.EU.E. . y y C.BC.B. y TRASLADO A LA . y TRASLADO A LA U.L.SU.L.S..

En cada una de las

U.E. y C.B. se

agregaron 33.7 kg. de

suelo contaminado

hasta una altura

aproximada de 13 c m. Posteriormente se

trasladaron las

cajas con el suelo

contaminado

a las instalaciones

del laboratorio de

microbiología de la

U.L.S.

CARACTERIZACIÓN INICIAL DEL SUELO CARACTERIZACIÓN INICIAL DEL SUELO CONTAMINADO y ADICIÓN DEL NHCONTAMINADO y ADICIÓN DEL NH44NONO33 y Ky K22HPOHPO44

EN LAS EN LAS U.EU.E..

Se adicionaron en cada una de las U.E:

- 132.3415 g. de NH4NO3

- 16.9405 g. de K2HPO4

Instituto Agustin CodazziI. G. A. C.

NO3

NH4

P asimilable

Densidad aparente

Humedad

PRODYCON L.T.D.A. TPH´s

COMPORTAMIENTO DEL NCOMPORTAMIENTO DEL N--NONO3 3

EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Valor máximo de concentración U.E. = 2192,1 ppm.

Valor máximo de concentración C.B. = 248.1 ppm.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5

TIEM PO

UE CB Polinómica (UE) Polinómica (CB)

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

N-N

O3

(ppm

)

3000

2000

1000

0

-1000

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

NutrientesNutrientes

COMPORTAMIENTO DEL NCOMPORTAMIENTO DEL N--NHNH4 4

EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Valor máximo de concentración en

U.E. = 1563,7 ppm.

Valor máximo de concentración enC.B. = 59,1 ppm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 1 2 3 4 5

TIEM PO

UE CB Polinómica (UE) Polinómica (CB)

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

N-N

H4

(ppm

)

2000

1000

0

-1000

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

NutrientesNutrientes

Tiempo de observación

Mes 4Mes 3

Mes 2Mes 1

SCSSC

Fósf

oro

(ppm

)

500

400

300

200

100

0

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

COMPORTAMIENTO DEL P asimilableCOMPORTAMIENTO DEL P asimilableEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Valor máximo de concentración en

U.E. = 421 ppm.

Valor máximo de concentración en

C.B. = 242 ppm.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 1 2 3 4 5

TIEM PO

UE CB Polinómica (UE) Polinómica (CB)

NutrientesNutrientes

COMPORTAMIENTO DEL pHCOMPORTAMIENTO DEL pHEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

SEMANAS

Sales Cont rol Biót ico Polinómica (Cont rol Biót ico) Polinómica (Sales)

El pH en las U.E. estuvo entre 5 y 6.5

El pH en los C.B. estuvo entre 5.3 y 6

FisicoquímicosFisicoquímicos

COMPORTAMIENTO DE LA TCOMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURAEMPERATURAEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

12,5

13

13,5

14

14,5

15

15,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

T IEM PO DE OBSERVACIÓNUE CB Polinómica (CB ) Polinómica (UE)

La temperatura se mantuvo entre 13 ºC y 15 ºC.

FisicoquímicosFisicoquímicos

COMPORTAMIENTO DE LA HUMEDAD EN COMPORTAMIENTO DE LA HUMEDAD EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOU.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

El porcentaje de humedad se mantuvo entre 27,5 % y 32,3 %

27

28

29

30

31

32

33

0 5 10 15 20

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

FisicoquímicosFisicoquímicos

NÚMERO DE UFC EN U.E. y C.B. NÚMERO DE UFC EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOA TRAVÉS DEL TIEMPO

Recuento de heterótrofos totalesRecuento de heterótrofos totales

-5.00E+06

0.00E+00

5.00E+06

1.00E+07

1.50E+07

2.00E+07

2.50E+07

3.00E+07

3.50E+07

0 1 2 3 4 5

TIEM PO DE OBSERVACIÓN

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Valor máximo de UFC/g. suelo

en U.E. = 3 x 107

Valor máximo de UFC/g. suelo

en C.B. = 5 x 106

NÚMERO DE UFC DE MICROORGANISMOS NÚMERO DE UFC DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO DEGRADADORES DE PETRÓLEO

EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOEN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Número más probableNúmero más probable

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

TIEM PO

UE CB Logarí t mica (CB) Logarí t mica (UE)

Valor máximo de UFC/g. suelo

en U.E. = 159743

Valor máximo de UFC/g. suelo

en C.B. = 18928

•• Se identificSe identificóó en las en las U.EU.E. el. elStaphylococcusStaphylococcus saprofitricussaprofitricuscon un 99.99%con un 99.99% de confiabilidad de confiabilidad

IDENTIFICACIÓN DE LOS IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

PETRÓLEOPETRÓLEO

•• Se identificSe identificóó en los en los C.BC.B. el. el

StreptococcusStreptococcus uberisuberis con uncon un

98.78% de confiabilidad98.78% de confiabilidad

COMPORTAMIENTO DE LOS TPH´s EN COMPORTAMIENTO DE LOS TPH´s EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOU.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

21000

0 2 4 6 8 10 12

TIEM PO

UE CB Polinómica (UE) Polinómica (CB)

6661 6661N =

Tiempo de observación

10,006,002,00,00

TPH

`s

30000

20000

10000

0

Grupo

Control Biótico

Sales Inorgánicas

10

Valor inicial de concentración de

TPH´s en C.B. = 12638,73 mg./Kg.

Valor final de concentración deTPH´s en C.B. = 8403,798 mg./Kg.

Valor inicial de concentración de

TPH´s en U.E. = 10738,96 mg./Kg.

Valor final de concentración deTPH´s en U.E. = 6995,97 mg./Kg.

Porcentajes de biodegradación de TPH´sPorcentajes de biodegradación de TPH´s

58,99%60,82%

70,39%70,62%

30,59%

62,47%

UE1 UE2 UE3 CB1 CB2 CB3

COMPORTAMIENTO DE LOS TPH´s EN COMPORTAMIENTO DE LOS TPH´s EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOU.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Porcentajes de biodegradación Porcentajes de biodegradación

en U.E. fue de 67.11 %en U.E. fue de 67.11 %

Porcentajes de biodegradación Porcentajes de biodegradación

en C.B. fue de 50.68 %en C.B. fue de 50.68 %

COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN U.E. COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN U.E. A TRAVÉS DEL TIEMPOA TRAVÉS DEL TIEMPO

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 1 2 3 4

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

ACIÓ

N

UE1UE2UE3

Valor inicial de concentración total de

PAH´s:

U.E.3 = 0,3868 mg./Kg. de suelo

Valor final de concentración total de

PAH´s :

U.E.3 = 0,1453 mg./Kg. de suelo

COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN C.B. COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOA TRAVÉS DEL TIEMPO

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

ACIÓ

N

CB1CB2CB3

Valor inicial de concentración total de

PAH´s:

C.B.3 = 2,4285 mg./Kg. de suelo

Valor final de concentración total de

PAH´s :

C.B.3 = 0,2639 mg./Kg. de suelo

COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS COMUNES DE PAH´s EN LOS DOS GRUPOS DE COMUNES DE PAH´s EN LOS DOS GRUPOS DE

ESTUDIOESTUDIO

B(a) antracenoB(a) antraceno

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

ACIÓ

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

B(k) fluorantenoB(k) fluoranteno

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEM PO DE OBSERVACIÓN

UE CB Polinómica (CB) Polinómica (UE)

Continuación del comportamiento de los compuestos comunesContinuación del comportamiento de los compuestos comunesde PAH´s en los dos grupos de estudiode PAH´s en los dos grupos de estudio

B(b) fluorantenoB(b) fluoranteno

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO DE OBSERVACIÓN

CO

NC

ENTR

ACIÓ

UE CB Logarítmica (CB) Polinómica (UE)

COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN COMPORTAMIENTO DE LOS PAH´s EN U.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPOU.E. y C.B. A TRAVÉS DEL TIEMPO

Porcentajes de biodegradación de PAH´sPorcentajes de biodegradación de PAH´s

89,13%

60,47%62,43%

100,00%

63,98%

69,91%

UE1 UE2 UE3 CB1 CB2 CB3

Porcentajes de biodegradación Porcentajes de biodegradación

en U.E. fue de 75.47 %en U.E. fue de 75.47 %

Porcentajes de biodegradación Porcentajes de biodegradación

en C.B. fue de 73.17 %en C.B. fue de 73.17 %

DISCUSIÓNDISCUSIÓN

NUTRIENTESNUTRIENTES

NONO33

Adición gradual de NHAdición gradual de NH44NONO33

Proceso de nitrificaciónProceso de nitrificación

NHNH44

Adición gradual de NHAdición gradual de NH44NONO33

Proceso de mineralizaciónProceso de mineralización

P P asimilasimil..

Adición gradual de KAdición gradual de K22HPOHPO44

Baja solubilidad en suelos Baja solubilidad en suelos con con pHpH ácidosácidos

Mayor en Mayor en U.EU.E..

pHpH

No se afectó por la adición de No se afectó por la adición de NHNH44NONO33 y Ky K22HPOHPO44

Disminuyó debido al procesoDisminuyó debido al procesode mineralizaciónde mineralización

TEMPERATURA y TEMPERATURA y

HUMEDADHUMEDAD

Se mantuvieron dentro de los Se mantuvieron dentro de los

rangos óptimos para llevar a rangos óptimos para llevar a

cabo el proceso de cabo el proceso de

biodegradaciónbiodegradación

Continuación de discusiónContinuación de discusión

MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS

Disponibilidad de N y P Disponibilidad de N y P presente en el suelo contaminado presente en el suelo contaminado Mayor cantidad de Mayor cantidad de

UFC de UFC de

microorganismos microorganismos

degradadores de degradadores de

petróleo en petróleo en U.EU.E..

Concentración de N y P Concentración de N y P

presente en el suelo contaminado presente en el suelo contaminado

Uso del petróleo como fuente Uso del petróleo como fuente

de carbono y energía.de carbono y energía.

Continuación de discusiónContinuación de discusión

Continuación de discusiónContinuación de discusión

TPH´sTPH´s

y y

PAH´sPAH´s

Disponibilidad y concentración Disponibilidad y concentración del N y P presente en el suelo del N y P presente en el suelo contaminado contaminado Mayor % de Mayor % de

biodegradación en biodegradación en

las las U.EU.E..Cantidad de UFC de Cantidad de UFC de microorganismos degradadoresmicroorganismos degradadoresde petróleode petróleo

El % de degradación es directamente proporcional a la El % de degradación es directamente proporcional a la

cantidad de UFC de microorganismos y a la cantidad de UFC de microorganismos y a la disponbilidaddisponbilidad

de nutrientesde nutrientes

La concentración de los La concentración de los TPH´sTPH´s y y PAH´sPAH´s es inversamente es inversamente

proporcional a la concentración de los nutrientesproporcional a la concentración de los nutrientes

PAH´sPAH´s

No se identificaron el No se identificaron el naftaleno, naftaleno,

aceftileno, acenafteno, fluoreno, aceftileno, acenafteno, fluoreno,

fenantreno y antraceno, debido a fenantreno y antraceno, debido a

su elevada volatilidad.su elevada volatilidad.

Continuación de discusiónContinuación de discusión

El costo total para llevar a cabo el proyecto en un terreno de El costo total para llevar a cabo el proyecto en un terreno de 70 m70 m33, , durante 8 meses es $ 31.969.500, es decir, el costo de tratamiedurante 8 meses es $ 31.969.500, es decir, el costo de tratamiento por mnto por m33

es de US 172,34.es de US 172,34.

ESTUDIO ECONÓMICOESTUDIO ECONÓMICO

Fuente: IV Congreso internacional de biotecnología ambiental. Rodríguez Vázquez Refugio.

Relación Beneficio Relación Beneficio –– CostoCosto

B B = = $ 19.097.222,04 $ 19.097.222,04

C $ 29.693.199C $ 29.693.199

B B = = 0.64310.6431

CC

Desorción térmica

Biorremediación

Lavado de suelo

Incineración

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600COSTO US POR m3

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

•• Las U.E. presentaron un porcentaje de biodegradación de Las U.E. presentaron un porcentaje de biodegradación de

TPH´s mayor que los C.B.TPH´s mayor que los C.B.

•• El pH, la temperatura y la humedad fueron variables El pH, la temperatura y la humedad fueron variables

independientes en el proceso de biodegradación.independientes en el proceso de biodegradación.

•• La concentración de los nutrientes a través del tiempo aumentó La concentración de los nutrientes a través del tiempo aumentó

en las U.E. y C.B. debido a que el estudio se llevó a cabo en unen las U.E. y C.B. debido a que el estudio se llevó a cabo en un

sistema cerrado.sistema cerrado.

•• La disminución en la concentración de TPH´s fue mayor en La disminución en la concentración de TPH´s fue mayor en

U.E. que en C.B., debido a la disponibilidad de nutrientes en elU.E. que en C.B., debido a la disponibilidad de nutrientes en el

suelo.suelo.

Continuación de conclusionesContinuación de conclusiones

•• El proceso de biodegradación de PAH´s fue mayor en las U.E. El proceso de biodegradación de PAH´s fue mayor en las U.E.

que en los que en los C.BC.B..

•• El aumento en el número de UFC de microorganismos capaces El aumento en el número de UFC de microorganismos capaces

de degradar hidrocarburos de petróleo, fue mayor en las U.E. de degradar hidrocarburos de petróleo, fue mayor en las U.E.

debido a la disponibilidad de nutrientes.debido a la disponibilidad de nutrientes.

•• Los microorganismos degradadores de petróleo Los microorganismos degradadores de petróleo identificados identificados

bioqubioquíímicamente en el suelo contaminado fueron el micamente en el suelo contaminado fueron el

SStaphylococcus taphylococcus saprophyticussaprophyticus y el Streptoccocus y el Streptoccocus uberisuberis..

•• La recuperaciLa recuperacióón del terreno no es econn del terreno no es econóómicamente rentable, sin micamente rentable, sin

embargo, los beneficios ambientales son incalculables.embargo, los beneficios ambientales son incalculables.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

•• Se debe realizar el análisisSe debe realizar el análisis de los nutrientes NHde los nutrientes NH44, NO, NO33 y P y P

asimilable no solo en forma inorgasimilable no solo en forma inorgáánica o asimilable sino en nica o asimilable sino en

forma total.forma total.

•• Para determinar los microorganismos degradadores de petrPara determinar los microorganismos degradadores de petróóleo leo

en el suelo contaminado, ademen el suelo contaminado, ademáás de los ans de los anáálisis bioqulisis bioquíímicos micos

realizados por el BBL cristal, deben realizarse pruebas de realizados por el BBL cristal, deben realizarse pruebas de

confirmaciconfirmacióón.n.