efecto de andrografolido sobre las vias de seÑalizacion
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Profesor Patrocinante Dr. Rafael Burgos A. Instituto de Farmacología y Morfofisiología Facultad de Ciencias Veterinarias
Profesor Co-Patrocinante Dra. M. Angélica Hidalgo G. Instituto de Farmacología y Morfofisiología Facultad de Ciencias Veterinarias
EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LAS VIAS DE
SEÑALIZACION CELULAR MAPK Y PI3K, Y SOBRE MARCADORES OSTEOGENICOS EN CELULAS
OSTEOBLASTICAS DE RATON
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
KARIN DENISE ALEGRIA FLANDEZ
VALDIVIA – CHILE
2010
A mi familia, en especial a mi hijo, por ser el motor y la luz de mis días.
“Nunca consideres el estudio como una obligación, sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber.”Albert Einstein.
Agradecimientos.
Al Dr. Rafael Burgos por ser una excelente persona tanto en lo personal como en lo
profesional, por ser generoso con toda su enseñanza, por su dedicación, paciencia y
apoyo durante todo el periodo que estuve en el laboratorio. A la Dra. Angélica Hidalgo,
por sus palabras críticas y objetivas a la hora de dar un consejo y por ser un apoyo
constante durante mi formación. A mis amigos y compañeros de laboratorio, Loretto,
Daniella (Danny), Pablo, Jano, Iván, Evelyn (Eve), Kathy y Luis, por llenar de risa los
espacios vacíos y por todos los momentos agradables tanto dentro como fuera del
laboratorio. A mis amigas, más que amigas hermanas, Pía, Faby y Sara, por ser
incondicionales, por su apoyo y sus consejos en los momentos difíciles, por sus
sonrisas y alegrías en todos los momentos que vivimos y por estar ahí, aun cuando las
palabras no eran necesarias.
A mi familia, abuelitos, tíos y primos, por ser comprensivos ante las dificultades vividas,
por el apoyo brindado durante todas las etapas de mi formación profesional, por la
exigencia en mis horas de flaqueza y en especial a mi mamá por ser incondicional en
todo momento. A mi hijo, que sin sus sonrisas, abrazos, besos y todas sus muestras de
cariño todo hubiera sido más difícil.
Esta tesis fue realizada gracias al apoyo del proyecto FONDEF DO4I1240.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS.
Página
1. RESUMEN. 1
SUMMARY. 2
2. INTRODUCCIÓN. 3
3. MATERIALES Y MÉTODOS. 26
3.1 Materiales. 26
3.1.1 Material Biológico. 26
3.1.2 Reactivos Químicos. 26
3.2 Métodos. 30
3.2.1 Cultivo de la línea celular osteoblástica de ratón MC3T3-E1. 30
3.2.2 Viabilidad de la línea celular osteoblástica MC3T3-E1 mediante
citometría de flujo.
31
3.2.3 Determinación del efecto de andrografólido sobre las vías de
señalización MAPK en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
31
3.2.4 Determinación del rol de la vía MAPK en el aumento de la
proteína COX-2 en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
32
3.2.5 Determinación del efecto de andrografólido sobre la expresión
del RNAm de COX-2 en presencia de inhibidores.
32
ii
3.2.6 Determinación de la producción de fosfatasa alcalina en la
línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
33
3.2.7 Determinación de la mineralización en la línea celular
osteoblástica MC3T3-E1 mediante la tinción rojo alizarina.
33
3.2.8 Análisis del efecto de andrografólido sobre los factores de
transcripción NF-ĸB y AP-1 en la línea celular osteoblástica MC3T3-
E1.
34
3.2.9 Extracción de proteínas totales 34
3.2.10 Separación electroforética de proteínas 35
3.2.11 Electrotransferencia. 35
3.2.12 Análisis de Western blot. 36
3.2.13 Inmunofluorescencia. 37
3.2.14 Transcripción reversa - reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real (RT-PCR).
38
3.2.15 Análisis estadísticos. 39
4. RESULTADOS. 40
4.1 Viabilidad Celular de la línea osteoblástica MC3T3-E1 en
presencia de andrografólido.
40
4.2 Determinación del efecto de andrografólido sobre las vías de
señalización MAPK en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
43
4.3 Determinación del rol de las vías MAPK en el aumento de COX-2.
47
iii
4.4 Efecto de andrografólido en marcadores osteogénicos. 54
4.5 Efecto de andrografólido en los factores de trascripción AP-1 y NF-
κB.
62
4.5.1 Análisis de inmunodetección de IκBα y del factor NF-κB. 62
4.5.2 Análisis de inmunodetección para la proteína c-Fos,
componente de la proteína AP-1.
65
5. DISCUSIÓN. 68
6. BIBLIOGRAFÍA. 81
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Grupo de osteoclastos reabsorbiendo hueso. 6
Figura 2 Osteocito en el interior de una laguna. 8
Figura 3 Vía de señalización de Smad al núcleo. 14
Figura 4 Vías de activación de las MAPKs. 17
Figura 5 Síntesis de prostaglandinas a partir de la liberación de ácido
araquidónico desde los fosfolípidos de la membrana.
20
Figura 6 Vías de señalización que median la inducción de COX-2. 22
Figura 7 Viabilidad celular de la línea osteoblástica MC3T3-E1. 41
Figura 8 Análisis de Western blot para la fosforilación de Akt en
presencia de andrografólido.
44
Figura 9 Análisis de Western blot para la fosforilación de p38 en
presencia de andrografólido.
45
Figura 10 Análisis de Western blot para la fosforilación de ERK 1/2 en
presencia de andrografólido.
46
Figura 11 Efecto de andrografólido en la vía de señalización MAPK
ERK 1/2, en presencia de los inhibidores UO126, SB203580
y LY294002.
48
v
Figura 12 Efecto de andrografólido en la expresión de COX-2, en
presencia de los inhibidores UO126, SB203580 y
LY294002.
51
Figura 13 Análisis de RT-PCR en tiempo real para COX-2 53
Figura 14 Viabilidad celular de la línea osteoblástica MC3T3-E1 a las
24 hrs.
55
Figura 15 Viabilidad celular de la línea osteoblástica MC3T3-E1 a los
2 días.
57
Figura 16 Viabilidad celular de la línea osteoblástica MC3T3-E1 a los
10 días.
58
Figura 17 Actividad de fosfatasa alcalina. 60
Figura 18 Efecto de andrografólido en la mineralización de las células
MC3T3-E1.
61
Figura 19 Efecto de andrografólido sobre la proteína IκBα en las
células osteoblásticas MC3T3-E1.
63
Figura 20 Efecto de andrografólido sobre la localización subcelular de
p65/NF-κB en células MC3T3-E1.
64
Figura 21 Efecto de andrografólido sobre la proteína IκBα en las
células osteoblásticas MC3T3-E1.
67
Figura 22 Esquema propuesto para el aumento de COX-2 en las
células MC3T3-E1 por andrografólido.
79
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ALP : Actividad de fosfatasa alcalina
AMP : 2-amino-2-metil-1 propanol
AP : Andrografólido
AP-1 : Proteína Activadora 1
ATF : Factor activante de transcripción
BMP : Proteína morfogenética de hueso
BSA : Albúmina sérica de bovino
CFU-F : Unidad formadora de colonias de fibroblastos.
CFU-MG : Unidad formadora de colonias granulocito-macrófago
COX-1 : Ciclooxigenasa-1
COX-2 : Ciclooxigenasa-2
EGF : Factor de crecimiento epidermal
ERK1/2 : Quinasas reguladas por señales extracelulares
fMLP : N-formilmetionina-leucil-fenilalanina
GAPDH : Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
GDFs : Factores de crecimiento y diferenciación
IGF-1 : Factor de crecimiento de insulina 1
IL-1 : Interleuquina-1
IL-6 : Interleuquina-6
IL-11 : Interleuquina-11
iNOS : Oxido nitrico sintasa inducible
vii
JNK : Quinasas N-terminales de c-Jun
LPS : Lipopolisacáridos
M-CSF : Factor estimulante colonia macrófago
MAPK : Proteínas quinasas activadas por mitógeno
MEK : Quinasa extracelular mitógena (MAPK/ERK quinasa)
NFAT : Factor nuclear de células T activadas
NF-IL6 : Factor nuclear para interleuquina 6
NF-κB : Factor Nuclear kappa B
OC : Osteocalcina
OPN : Osteopontina
PAF : Factor activador de plaquetas
PBS : Tampón fosfato salino
PCR : Reacción en cadena de la polimerasa
PEA3 : Factor de transcripción de la familia Ets
PG : Prostaglandina
PGA2 : Prostaglandina A2
PGD2 : Prostaglandina D2
PGE2 : Prostaglandina E2
PGF2α : Prostaglandina F2α
PI3K : Fosfatidil inositol 3 quinasa
PMSF : Fenilmetilsulfonil fluoruro
pNPP : p-nitrofenilfosfato
R-SMAD : recetor activador de SMAD
viii
SBE : Elementos de unión SMAD
SDS-PAGE : Electroforesis en gel poliacrilamida en condiciones denaturantes
TEMED : N, N, N´, N´- tetrametilendiamina
TGF-β : Factor de crecimiento transformante β
TNF : Factor de necrosis tumoral
Tris : Tris-(hidroximetil)-aminometano
VEGF : Factor de crecimiento vascular endotelial
1
1. Resumen.
Andrografólido ha sido usado para aliviar enfermedades inflamatorias, lo cual ha
incentivado su estudio para lograr entender su mecanismo de acción. Datos del
laboratorio sugieren que el uso de este compuesto, en la línea celular osteoblástica
MC3T3-E1 aumenta la expresión de COX-2 inducida por TNF-α y TGF-β. Ante esto, nos
planteamos la hipótesis que andrografólido vía MAPK aumenta la expresión de COX-2
favoreciendo la mineralización en la línea celular MC3T3-E1. Utilizando técnicas de
Western blot, se demostró que andrografólido aumenta la fosforilación de la vía ERK1/2,
no así de las vías p38 y Akt. Mediante Western blot y PCR en tiempo real, se analizó el
efecto de los inhibidores UO126, SB203580 y LY294002 sobre la expresión de COX-2
mostrando en el Western blot una inhibición estadísticamente significativa sólo para el
inhibidor SB203580 comparado con andrografólido, no así en el análisis de PCR en
tiempo real, en donde los tres inhibidores presentaron diferencias significativas. Se
analizó además la presencia de la proteína IkBα mediante Western blot mostrando una
disminución a los 30 minutos y se analizó también el factor de transcripción NF-κB
mediante inmunocitoquímica mostrando su presencia en el núcleo a las 2 horas de
estimulación. Andrografólido produjo una disminución dosis dependiente de la actividad
de fosfatasa alcalina y del grado de mineralización. Concluimos de esta manera que
andrografólido mediante la vía ERK1/2 aumentó la expresión de COX-2, dejando entre
ver la posible participación de otras vías como p38 y Akt. Además, se observó una
disminución dosis dependiente de marcadores osteogénicos como ALP, posiblemente
atribuible a un efecto pro-apoptótico.
2
1.1 Summary
Andrographolide has been used to relieve inflammatory diseases, which has
encouraged their study in order to understand its mechanism of action. It has been
suggested that the use of this compound, in the osteoblastic cell line MC3T3-E1,
increases the expression of COX-2 induced TNF-α and TGF-β. For this reason, we
proposed that andrographolide via MAPK pathway, increases expression of COX-2
favoring mineralization in MC3T3-E1 cell line. Using Western blot techniques, show that
andrographolides increased the ERK1 / 2 phosphorylation, but not affected p38 and Akt
pathways. Using Western blot and real time PCR, we examined the effect of the
inhibitors UO126, SB203580 and LY294002 on the expression of COX-2 induced by
andrographolide. A statistically significant inhibition of COX-2 expression using
SB203580 it compared with andrographolide, was observed. UO126, SB203580 and
LY294002 significantly reduced the COX-2 mRNA. We demonstrated by using
inmunoblot that IkBα was reduced at 30 minutes of incubation with andrographolide. The
transcription factor NF-κB was observed by immunocytochemistry in the nucleus after 2
hours of stimulation with andrographolide. The alkaline phosphatase (ALP) activity and
mineralization showed a dose dependant inhibition. Thus, we conclude that
andrographolide via ERK1/2 MAPK increases the expression of COX-2, however we did
not discard a role of p38 MAPK and Akt. Andrographolide, caused a decrease on
osteogenic markers such as ALP, possibly induced by a pro-apoptotic effect.
3
2. Introducción
El hueso es un órgano firme, duro y resistente. Es el principal tejido esquelético
de los vertebrados, proporciona soporte mecánico a las articulaciones, tendones y
ligamentos, protege órganos vitales y actúa como reservorio de iones en especial calcio
y fosfatos para la mantención normal de la homeostasis mineral (Stuart H, 2005).
Es un tejido vivo y en crecimiento. Posee una estructura mineralizada porosa,
hecha de células, vasos, cristales de compuestos cálcicos (hidroxiapatita), cuya
proporción varia de acuerdo al tipo de hueso y región (Serrano, 1998).
Los huesos del esqueleto presentan formas y tamaños diferentes pero poseen
una estructura común: una corteza de hueso compacto (80% del volumen total del
hueso) que por su superficie interna se halla en continuidad con un hueso de aspecto
esponjoso o trabecular (20% del volumen total del hueso) (Gurley y Roth, 1992).
Más del 99% en volumen de la matriz ósea se halla mineralizado (hueso cortical:
99.9%; hueso esponjoso 99.2%) por lo que posee un componente orgánico y otro
inorgánico. El componente orgánico se halla integrado por colágeno tipo 1 (85-90%) y
una pequeña porción de otras proteínas (10-15%), como proteoglicanos (biglicano,
decorita), proteínas implicadas en la adhesión celular (trombospondina, osteonectina,
sialoproteína ósea), osteocalcina y factores de crecimiento. El componente inorgánico
de la matriz ósea está constituido en su mayor parte por fosfato cálcico en forma de
cristales de hidroxiapatita (Serrano, 1998; Gartner et al., 2007; Jadlowiec et al., 2004).
4
El tejido óseo está compuesto por células metabólicamente activas, las cuales
permiten, dentro de otras cosas, la remodelación ósea de forma continua. Estas células
son: las células precursoras osteogénicas, osteoclastos, osteocitos y osteoblastos
(Filvaroff et al., 1999).
Las células precursoras osteogénicas están presentes en todas las superficies no
resortivas del hueso, y ellas forman la capa profunda del periostio, que a su vez
conforma la capa externa del hueso, y el endostio el cual se encuentra en la superficie
medular interna (Kalfas, 2001).
Los osteoclastos son células especializadas cuya actividad biológica es, en
conjunto con los osteoblastos, la homeostasis del tejido óseo (Mikán y Oliveros, 2007).
Los osteoclastos son células multinucleadas, de citoplasma acidófilo y ricas en
anhidrasa carbónica y fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) (Serrano, 1998;
Raggatt y Partridge, 2010). Esta característica bioquímica está dada por la capacidad
que tienen de crear medios ácidos sobre la superficie a la cual se adhieren, en donde
liberan enzimas hidrolíticas capaces de degradar tejido calcificado (Mikán y Oliveros,
2007).
Los osteoclastos derivan de la célula madre hematopoyética a través de células
formadoras de granulocitos y macrófagos (CFU-GM). La proliferación de estas células
es activada por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) (Takahashi et
al., 1999). El reclutamiento de los preosteoclastos a partir de las CFU-GM parece ser
promovido por la IL-1, IL6 e IL11. Los preosteoclastos son células dotadas de un solo
5
núcleo que se adhieren a las superficies óseas y al fusionarse entre sí dan lugar a los
osteoclastos (Figura 1 ) (Serrano, 1998). En conjunto con los osteoblastos, los
osteoclastos se encargan de mantener la homeostasis de iones fosfato y calcio, al
precipitar (osteoblastos) o liberar (osteoclastos) al medio extracelular los componentes
de la matriz ósea (Mikán y Oliveros, 2007).
6
Figura 1. Grupo de osteoclastos reabsorbiendo hueso. Obsérvese, la
multinucleación de estas células y el aspecto ondulado que, por acción de los
osteoclastos, adquiere la superficie ósea adyacente (Tricrómico de Goldner x 500).1
1 Imagen obtenida en el sitio web http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteocl.htm
7
Los osteocitos (Figura 2 ), el tercer tipo de célula ósea, son el estado terminal
diferenciado de los osteoblastos que están embebidos en la matriz mineralizada,
residiendo individualmente en cuevas llamadas lagunas osteocitarias (Aarden et al.,
1994; Tatsumi et al., 2007).
Los osteocitos se hallan en contacto entre sí y con las células de la superficie
(células de revestimiento, osteoblastos) mediante finas prolongaciones tubulares de su
citoplasma que recorren la matriz ósea en diversas direcciones (Boyce et al., 2009;
Bonewald, 2007). La laguna osteocitaria se prolonga como una red a través de los
diminutos canalículos que albergan sus prolongaciones citoplásmicas que reciben el
nombre de conductos calcóforos (Serrano, 1998; Burger y Klein-Nulend, 1999).
El estudio ultraestructural de los osteocitos revela que presentan un aparato de
Golgi y un retículo endoplásmico rugoso menos desarrollado que los osteoblastos.
Estas organelas se concentran en el cuerpo celular donde se disponen alrededor del
núcleo. En los puntos de contacto entre las prolongaciones citoplásmicas se observan
uniones tipo "gap" (gap junctions) (Palumbo et al., 2001). En estas uniones existen
pequeños canales intercelulares con un diámetro interno de 1.5 nm. Estos canales
permiten el paso directo de una a otra célula de iones inorgánicos y pequeñas
moléculas hidrosolubles (aminoácidos, azúcares, nucleótidos y vitaminas) por lo que
posibilitan una comunicación química y eléctrica (Serrano, 1998).
8
Figura 2. Osteocito en el interior de una laguna. La matriz ósea mineralizada es de
color negro y en el margen superior izquierdo de la imagen, se observa cómo una
prolongación osteocitaria penetra en el interior de un conducto calcóforo. El citoplasma
del osteocito contiene retículo endoplásmico rugoso que es especialmente visible en el
segmento superior derecho de la imagen (Microscopía electrónica x 5700).2
2 Imagen obtenida en el sitio web http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteobl.htm
9
Los osteocitos son células con una escasa actividad metabólica pero su
preservación parece necesaria para que el tejido óseo mantenga sus propiedades
biomecánicas. La situación de los osteocitos es teóricamente ideal para detectar el
estrés mecánico y las microlesiones de la matriz. Estas células podrían transmitir
señales a las células de revestimiento que utilizarían la información recibida para
modular localmente el remodelado. Durante años se ha discutido acerca de si los
osteocitos son o no capaces de inducir la osteólisis de la matriz que los rodea al ser
estimulados por la hormona paratiroidea, PTH (osteólisis osteocitaria) (Serrano, 1998).
Los preosteoblastos son células de aspecto fibroblástico cercanos a las
superficies óseas pero separados de éstos por otros tipos celulares (células del
endostio, osteoblastos). Los preosteoblastos son difíciles de identificar en condiciones
normales, pero pueden observarse con facilidad si sufren una hiperplasia como por
ejemplo en el hiperparatiroidismo. Los preosteoblastos derivan de una célula madre del
estroma medular (CFU-F: Unidad Formadora de Colonias de Fibroblastos) y en
condiciones normales constituyen el compartimiento proliferativo del linaje osteoblástico
(Serrano, 1998).
Los osteoblastos son las células que se encuentran en la superficie del hueso
que son responsables de la formación ósea (Mackie, 2003). Los osteoblastos maduran
desde sus osteoprogenitores que residen en la medula ósea (Hu et al., 2003). Son
células de forma cúbica, con núcleo redondo, usualmente encontrado en una capa
simple adherida a la superficie del periostio o del endostio en el hueso (Marks y Odgren,
2002). La principal función de los osteoblastos es la secreción de un complejo mixto de
10
proteínas a la matriz del hueso (conocida como osteoide), los osteoblastos tienen un
predominante complejo de Golgi y abundante retículo endoplásmico rugoso (Mackie,
2003).
Los osteoblastos juegan un rol central en la creación y mantención de la
arquitectura esqueletal y lo hace de dos maneras: primero, es la responsable del
depósito en la matriz ósea y segundo, regula la diferenciación y actividad de los
osteoclastos en la reabsorción del hueso. Como consecuencia a su habilidad de regular
la actividad osteoclástica, el osteoblasto indirectamente juega un importante rol en la
homeostasis de calcio (Mackie, 2003). Los osteoblastos expresan varios tipos de
marcadores como el aumento en la actividad de la fosfatasa alcalina, también procesa
el pro colágeno a colágeno depositándolo en la matriz junto a proteínas adicionales (por
ejemplo osteopontina, sialoproteína ósea y osteocalcina) en el sustrato, el cual es
subsecuentemente mineralizado (Suh et al., 2007; Peterson, 1987; Yamaguchi et al.,
2000). Tanto in vivo como in vitro los osteoblastos pasan sucesivamente por tres
estadios funcionales: a) proliferación celular y síntesis de los componente orgánicos de
la matriz ósea, b) maduración de la matriz ósea (cambios en la composición y
organización de la matriz que la hacen competente para ser mineralizada) y c) depósito
de mineral. In vitro se ha comprobado que estos estadios coinciden con la activación
sucesiva de una serie de genes: c-fos, c-jun, histona H4, colágeno tipo I, fibronectina y
factor TGF-β (proliferación y síntesis de los componente orgánicos de la matriz ósea);
fosfatasa alcalina (maduración de la matriz); sialoproteína ósea, osteopontina y
osteocalcina (depósito de mineral) (Serrano, 1998).
11
La formación del hueso in vivo ocurre por dos grandes procesos, osificación
intramembranosa y endocondral (Gori et al., 2001; Mackie, 2003).
La formación de hueso intramembranosa, se originan en el arco-branquial y da
lugar a los huesos del cráneo y de la cara (Rodan y Harada, 1997). Las células
mesenquimatosas se condensan y directamente se diferencian en células formadoras
de hueso, los osteoblastos (Kobayashi y Kronenberg, 2005). En cambio, el resto del
esqueleto se basa en la osificación endocondral, donde las células mesenquimatosas
se condensan y se convierten en condrocitos. Este molde de cartílago es reemplazado
en un largo proceso, donde la invasión vascular es seguida por el depósito de hueso
mineralizado formando hueso maduro (Kobayashi y Kronenberg, 2005; Rodan y
Harada, 1997). Por otra parte las lesiones óseas, como fracturas, muestran en su
caracterización histológica, la participación de ambos procesos de osificación en su
recuperación, la intramembranosa y la endocondral con la subsiguiente formación de un
callo (Einhorn, 1998; Dimitriou et al, 2005). Aunque la formación de hueso endocondral
in vivo e in vitro ha sido foco de varios estudios, las señales moleculares que controlan
estos procesos aún no se definen.
La familia del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) juega un rol central
en la regulación de un amplio espectro de respuestas celulares incluyendo crecimiento
celular y diferenciación (Attisano y Lee-Hoeflich, 2001). Miembros de esta familia
incluye TGF-βs, activinas, proteínas morfogenéticas del hueso (BPMs) y otros factores
relacionados. Las BPMs fueron originalmente identificadas como moléculas que
inducen la formación de hueso y cartílago cuando se implantan en sitios ectópicos en
12
ratas. Según estos efectos in vivo, las BMPs regulan el crecimiento y diferenciación de
condroblastos y células de la línea celular osteoblástica in vitro y es la responsable de
inducir a las células mesenquimales en fenotipos osteoblástico/condrocito. La acción de
TGF-β en la formación de hueso tiene partes confusas porque efectos divergentes han
sido reportados en ambos in vivo e in vitro dependiendo de las condiciones
experimentales, las células empleadas y su estado de maduración. TGF-β1 ha sido
demostrada tanto para estimular como para inhibir la formación de hueso, y afectar
diferencialmente distintos marcadores osteoblásticos in vitro (Spinella-Jaegle et al.,
2001).
La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) agrupa a
más de 30 miembros relacionados estructuralmente, e incluye dos subfamilias
principales: 1) la familia de los TGF-βs y las activinas; y 2) la familia de las proteínas
morfogenéticas de hueso (BMPs) y los factores de crecimiento y diferenciación (GDFs)
(Janssens et al., 2005; de Caestecker, 2004).
El TGF-β es una familia de citoquinas multifuncionales que regulan el
crecimiento, diferenciación, apoptosis y acumulación de matriz de variadas células
(Miyazono et al 2004). Este factor es más abundante en la matriz ósea comparada con
otros tejidos, y es activado en el microambiente del hueso (Miyazono et al, 2004;
Ghayor et al., 2005; Selvamurugan et al., 2004).
13
La señalización intracelular mediada por TGF-β se inicia con la formación de
heterocomplejos del ligando con dos tipos principales de receptores, ambos con
actividad de quinasa en residuos de serinas y treoninas, que al ser fosforilados activan
a la familia de factores transcripcionales, las proteínas Smads (Ghayor et al., 2005).
Los Smad activado por receptor (R-Smads), al ser fosforilados activan la vía de
señalización canónica Smad, resultando en la translocación nuclear del complejo R-
Smad/Smad4. Este regula respuestas transcripcionales a través de interacción directa
con ambos tipos de elementos activadores cis y trans, asociados con una variedad de
genes blancos (Sowa et al., 2002).
Los dos principales grupos de R-Smads son activados por un set de receptores
TGF- β tipo I y activan distintas respuestas río abajo de la cascada de señalización; el
receptor BMP activa las proteínas Smad1, Smad5 y Smad8, y el receptor TGF-
β/Activina activa Smad2 y Smad3 (Figura 3 ) (Janssens et al., 2005; de Caestecker,
2004; Ogasawara et al., 2004).
14
Figura 3. Vía de señalización de Smad al núcleo.
Las proteínas Smads pueden ser fosforiladas por receptores de TGF-β/Activina o BMP.
Una vez fosforiladas, el receptor específico de Smads (R-Smads) se junta con Smad-4
formando un complejo hetero-trimerico y se transloca al núcleo. Una vez en el núcleo,
Smads forman diversas asociaciones con cofactores y elementos de unión sitio
específico Smad (SBE). Smad-2 y -3 (Smad-2/3) es activado con señales desde el
ligando TGF-β/Activin, mientras que Smad-1, -5, y -8 (Smad-1/5/8) son activados desde
el ligando BMP. Para cada grupo R-Smad, se haya un inhibidor Smad (I-Smad): Smad-
6 preferentemente inhibe a Smad-1/5/8 y Smad-7 preferentemente inhibe Smad-2/3.3
3 Owens P. et al, 2008
15
No obstante, hay estudios que demuestran la activación de vías alternativas a
Smad. Estas señales podrían mediar y/o posiblemente aumentar su efecto haciendo
sinergia o podrían también activar distintas respuestas dependiendo del tipo celular.
Las vías alternativas activadas por TGF-β corresponden a la vía de señalización
de las proteínas quinasa activada por mitógenos (MAPK) (de Caestecker, 2004; Mulder,
2000), la fosforilación de miembros Jun, Fos y la familia de factores de trascripción ATF,
las cuales homo y heterodimerizan para formar la proteína activada 1 (AP-1)
(de Caestecker, 2004), en una amplia variedad de células como por ejemplo células
epiteliales intestinales, de pulmón, de carcinoma humano de colon, osteoblásticas, etc.
En células de mamíferos, la familia de las proteínas activadas por mitógenos
(MAPK) proporciona un link entre los receptores unidos a la membrana y los cambios
en el patrón de expresión génica. Las MAPK son activadas río abajo de diferentes tipos
de receptores incluyendo receptores tirosina quinasa, receptores de citoquinas y
receptores acoplados a proteína G (Symone et al., 2005).
La familia MAPK está compuesta por las proteínas ERK1/2, p38 MAPK y JNK.
Las proteínas ERK1/2 son activadas “upstream” o “río arriba” por las proteínas MEK1/2
(Roux y Blenis, 2004), y se expresan ampliamente en todos los tejidos. ERK1/2 son
activadas por variados estímulos, como por ejemplo factores de crecimiento, ésteres de
forbol, ligandos de receptores acoplados a proteína G, estrés, etc. (Roux y Blenis 2004).
16
La fosforilación de ERK 1/2 regula la expresión y fosforilación de factores de
transcripción de las familias fos y jun, los cuales conforman la proteína activante 1 (AP-
1) que controlan la transcripción río abajo de genes con promotores que contienen sitios
de unión AP-1, así como la fosforilación de Runx2/Cbfa1 (Xiao et al., 2002; Xiao et al.,
2000). p38 MAPK, es activada por fosforilación dual en residuos Tyr y Thr en el motivo
Thr-Gly-Tyr por las proteínas MAP quinasa quinasa 3/6 (MKK3/6) (Garrington y
Johnson, 1999). p38 MAPK es activada principalmente en respuesta a condiciones de
estrés y participa en diversos tipos de células en arresto del ciclo celular e inducción de
apoptosis, mientras que en otras induce diferenciación y proliferación (Roux y Blenis,
2004). Las proteínas JNK están implicadas en respuestas de estrés celular y participan
en expresión génica, supervivencia, proliferación y apoptosis en respuesta a citoquinas
y factores de crecimiento (Figura 4 ).
La señal extracelular regulada por quinasa (ERK), un miembro de la cascada de
las MAPK, transmite información sobre el medio extracelular al núcleo y desempeña un
papel crítico en la diferenciación de los osteoblastos y el desarrollo del esqueleto
(Khatiwala et al., 2009; Lai et al., 2001).
17
Figura 4. Vías de activación de las MAPKs. 4
4 Adaptado de: Cooper G 2000. The cell. Amolecular Approach. Second Edition. Ed Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA
MAP Kinasa
Respuesta
Factores de crecimiento
Ras
Raf
MEK
ERK
Proliferación Diferenciación
Supervivencia celular
Citoquinas Estrés Celular
MEKKs
MKKs
JNK/p38
Inflamación Muerte celular
Kinasas río arriba
Estímulos
18
In vivo, se ha demostrado, que TGF-β está mayormente en la matriz ósea,
almacenado en forma inactiva liberándose desde la matriz y activándose con el
microambiente óseo, (Ghayor et al., 2005; Centrella et al., 1994; Jennings y Mohan,
1990; Sowa et al., 2002) producto de esto, y de la seguidilla de eventos ya
mencionados, se produce la activación de factores de trascripción como Runx2/Cbfa1
y/o osterix, llevando a un aumento en la expresión de genes específicos de
osteoblastos como son la fosfatasa alcalina (ALP), osteocalcina (OC), sialoproteína
ósea y osteopontina (OPN) (Chung-Fang y Cheng, 2002; Murray, 1994; Logothetis y
Lin, 2005; Tsiridis y Giannoudis, 2006).
También se sabe que Ras es un efector río arriba de fos y MAPK, y que
elementos de respuesta a AP-1 están presentes en el promotor de la mayoría de las
proteínas óseas como colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina y fibronectina (Lai y
Cheng, 2002).
Por otra parte, también hay datos que sugieren que las prostaglandinas, juegan
un rol importante en la reparación por lesión en el hueso, siendo fundamental para la
síntesis de éste, la enzima ciclo-oxigenasa 2 más conocida como COX-2 (Einhorn,
2002).
19
Ciclo-oxigenasa 2 (COX-2)
Ciclo-oxigenasa (COX) también conocida como prostaglandina sintasa, es la
enzima clave en la síntesis de prostaglandinas (Wadleigh y Herschman, 1999). La
síntesis de prostaglandinas (PG) es iniciada con la liberación de ácido araquidónico
desde la membrana de los fosfolípidos. La subsiguiente conversión de ácido
araquidónico a prostaglandina H2 es catalizada en dos pasos por la ciclo-oxigenasa.
Enzimas sintasa entonces convierten PGH2 a prostaglandinas especificas como son
PGD2, PGE2, PGF2α, prostaciclina y tromboxano (Figura 5 ) (Einhorn T., 2002; Smith y
Song, 2002).
Dos distintas ciclo-oxigenasas han sido identificadas, las cuales son codificadas
por genes separados. COX-1 es expresada constitutivamente en muchos tejidos. Por el
contrario, más recientemente se ha identificado que el mensajero de COX-2 es
expresado en niveles basales muy bajos en muchos tejidos, pero es rápidamente y
transientemente inducida por una amplia variedad de mitógenos, hormonas y otros
ligandos, estando también involucrada en la producción de PG en la inflamación y en
otras respuestas agudas (Wadleigh y Herschman, 1999; Herschman et al., 1995; Xu et
al., 2007).
COX-2 es inducida por una diversidad de estímulos, incluyendo inflamación,
lesión y estrés mecánico (Einhorn, 2002; Topper et al., 1996; Muscara et al., 2000).
20
Figura 5. Síntesis de prostaglandinas a partir de la liberaci ón de ácido
araquidónico desde los fosfolípidos de la membrana. La fosfolipasa A2 libera desde
la membrana celular al ácido araquidónico, el cual por medio de las enzimas COX-1 y
COX-2 es transformado a prostaglandinas, tromboxano A2 y prostaciclina (PGI2).
21
La región promotora del gen de COX-2 de ratón, rata, y humano han sido
clonados y secuenciados. A pesar de las especies animales estas regiones promotoras
contienen una caja TATA canónica y varios elementos regulatorios transcripcionales
putativos, como CRE, NF-IL6 (C/EBPß), AP2, SP1, NF-ĸB y caja GATA (Figura 6 )
(Yamamoto et al., 1995; Chun y Surth, 2004; Hinz y Brune, 2002).
NF-κB es el nombre colectivo de factores de transcripción diméricos de la familia
de proteínas Rel que incluye RelA (p65), c-Rel, RelB, NF-κB1 (p50), and NF-κB2 (p52).
La forma más abundante encontrada en células estimuladas es el heterodímero
RelA/NF-κB1 (p65/p50), más a menudo referido como el “clásico” NF-κB (Brown et al.,
2008; Jimi et al., 1998). En células no estimuladas, NF-κB reside en el citoplasma en
forma latente, y debe translocarse al núcleo para su función. La retención citoplasmática
de NF-κB es mantenida por interacción con proteínas inhibitorias conocidas como IκB.
La estimulación lleva a la fosforilación y posterior degradación proteosomal de IκB,
permitiendo a la forma “activa” NF-κB entrar al núcleo e iniciar la transcripción
(Makarov, 2001; Siebenlist et al., 1994; Baldwin, 1996).
El rol de COX-2 en la reparación de hueso, ha tomado auge, porque se ha visto
que drogas que inhiben la producción de prostaglandinas también inhiben la
recuperación de las fracturas. Los antiinflamatorios no esteroidales serían uno de los
medicamentos involucrados, no así los no antiinflamatorios no esteroidales (Einhorn,
2002; Simon et al., 2002; Simon y O'Connor, 2007).
22
Figura 6. Vías de señalización que median la inducción de COX -2. Distintos set de
quinasas, incluyendo MAPKs pueden activar distintos factores de trascripción (NF-kB,
AP-1, C/EBP, etc.), que a su vez llevan a la inducción positiva de COX-2. 5
5 Tomado de “Signal transduction pathways regulating cyclooxygenase-2 expression: potential molecular targets for chemoprevention” K.-S. Chun, Y.-J. Surh / Biochemical Pharmacology 68 (2004) 1089–1100
23
Andrografólido
El uso de hierbas medicinales para el tratamiento de diversas enfermedades es
uno de los focos actuales de la medicina moderna por las distintas propiedades que
presentan y por la disminución de los efectos secundarios con respecto a los
medicamentos usados en la medicina tradicional.
Las plantas herbales han sido ampliamente usadas como remedios caseros, por
ejemplo, en Asia, se han utilizado por más de dos milenios. Hasta el día de hoy,
algunos de ellos aún no pierden popularidad como por ejemplo, la planta Andrographis
(Andrographis paniculata) que ha sido usada largamente como remedio casero para
aliviar los desordenes inflamatorios en China, India, Corea y Japón. Es prescrita para
tratamientos de laringitis, diarrea, artritis reumatoide, cólicos, fiebre, resfríos, hepatitis
virales y dolor de colon entre otras. (Xia et al., 2004; Tsai et al., 2004; Puri et al., 1993;
Batkhuu et al., 2002)
El extracto de Andrographis paniculata es conocido por contener dipertenoides,
flavonoides y esteroides (Siripong et al., 1992). Los principales componentes de
Andrographis paniculata son las lactonas diterpénicas de las cuales el andrografólido
es el mayor componente y constituye el 70% de la fracción de los extractos de la planta
(Siripong et al., 1992). Andrografólido (AP) es aislado desde las partes aéreas de la
planta (hojas y tallos) y el extracto etílico, como los purificados, estimulan la respuesta
inmune específica y la no específica en ratones (Kumar et al., 2004).
24
Estudios revelan que andrografólido es capaz de disminuir la glucosa en ratas
diabéticas inducidas con estreptozotocina (Yu et al., 2003); es capaz de disminuir la
producción de óxido nítrico estimulado con LPS en macrófagos (Batkhuu et al., 2002) y
la supresión de óxido nítrico sintasa inducido (iNOS) en células RAW 264.7 (Chiou et
al., 2000); inhibiría la agregación plaquetaria inhibiendo la fosforilación de la MAPK ERK
1/2 (Thisoda et al., 2006), también inhibiría la producción de TNF-α por la inhibición de
la vía ERK 1/2 no así las vías JNK, p38 (Qin et al., 2006). Asimismo, hay estudios que
indican que andrografólido reduce la activación de NF-κB y la expresión de COX-2
inducido por PAF y fMLP en HL-60/neutrófilos (Hidalgo et al., 2005).
Sin embargo, estudios preliminares de nuestro laboratorio indican que en la línea
celular osteoblástica MC3T3-E1, andrografólido aumenta la expresión de COX-2
inducida por TNF-α y TGF-β.
Datos bibliográficos expresados anteriormente, muestran que la vía MAPK está
involucrada en la síntesis de COX-2 y en una amplia variedad de respuestas celulares,
sugiriendo además para COX-2 una participación relevante en el proceso de
regeneración ósea causada por algún traumatismo.
Ante esto se ha planteado la siguiente hipótesis de trabajo “Andrografólido, vía
la activación de MAPK, provoca un aumento de la exp resión de COX-2
favoreciendo la diferenciación osteoblástica de la línea celular MC3T3-E1.”
Por lo tanto los objetivos específicos de la presente tesis son:
25
• Determinar si la estimulación de las células MC3T3-E1 con andrografólido
induce una estimulación de las vías MAPK.
• Determinar el rol de la vía MAPK en el aumento de COX-2
• Determinar si hay un aumento en la producción de fosfatasa alcalina (ALP) y
en la mineralización de las células osteoblásticas.
• Determinar si andrografólido estimula factores de trascripción como NF-kB y
AP-1.
26
3. Materiales y Métodos
3.1 Materiales
3.1.1 Material Biológico:
Línea celular osteoblástica de ratón MC3T3-E1 subclon 4 de la ATCC®, número de
catálogo CRL-2593TM
3.1.2 Reactivos Químicos:
De AMRESCO® Life Science Research Products & Biochemic als (Solon, Oho,
USA) se obtuvo albumina de suero bovino (BSA).
De BD Biosciences Pharmingen TM (San Diego, california, USA) se obtuvo el kit
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I.
De Calbiochem (La Jolla, California, USA) se obtuvo lo siguiente: p-Nitrofenilfosfato y
ortovanadato de sodio (Na3VO4).
De Cayman Chemical (Michigan, USA) se obtuvo el anticuerpo anti COX-2 murino.
De Cell Signaling (Boston, MA, USA) se obtuvieron los siguientes anticuerpos:
anticuerpos anti-p-ERK1/2, anti-p-p38, anti-p38, anti-pAKT, anti-AKT.
De Gibco Laboratories Life Technologies, Inc. (Rockvil le, MD, USA) se obtuvo el
medio minimo esencial alfa (α-MEM).
27
De Invitrogen (Grand Island, NY, USA) se adquirieron los siguientes reactivos:
TEMED, anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a Alexa fluor 488 (verde), ioduro de
propidio, soluciones dCTP, dATP, dTTO, dGTP.
De MBI Fermentas (Hanover, Maryland (MD), USA) , se obtuvo el estándar de peso
molecular preteñido para geles de poliacrilamida-SDS.
De Merck & Co, Inc. (Darmstadt, Germany) , fueron adquiridos los siguientes
reactivos: Persulfato de sodio, Fluoruro de sodio, PMSF, azul de bromofenol, Etanol
grado biología molecular, cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), hidróxido de
sodio (NaOH), glicerol, cloruro de magnesio (MgCl2), fosfato hidrógeno de disodio
(Na2HPO4), fosfato dihidrogeno de sodio (NaH2PO4), fosfato dihidrógeno de potasio
(KH2PO4).
De Perkin Elmer Life and analitical Science (Massachusetts, USA) se obtuvo el kit
de quimioluminiscencia para Western blot, Western Lightning®–ECL, Enhanced
Chemiluminescence.
De PlusOne Pharmacia Biotech (USA) se obtuvo el Triton X-100.
De Promega (Madison, WI, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Tampón de
lisis pasivo, acrilamida, UO126, LY294002, SB203580, oligo-dT 15 primer, tampón M-
MLV RT 5X, transcriptasa reversa M-MLV.
De QIAGEN USA (Hilden, Germany) se obtuvo el kit QIAGEN RNAeasy plus.
De Roche Diagnostic (Indianápolis, IN, USA) se obtuvo lo siguiente: leupeptin,
aprotinin y pepstatin.
28
De Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, U SA) se obtuvieron los
anticuerpos anti-ERK1/2 (sc-94), anti-IkBα, Anti NF-ĸB p65, anti-IgG rabbit unido a
peroxidasa y anti-IgG mouse unido a peroxidasa.
De Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos:
Nonidet P-40 (IGEPAL), piruvato de sodio, Tween-20, ß-mercaptoetanol,
dimetilsulfóxido (DMSO), ß-glicerofosfato, Alizarin Red S, Hexadecylpyridinium Chloride
monohydrate, 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), Histochoice, anticuerpo anti ß-actina,
partidores para COX- 2 y GAPDH.
De Stratagene (La Jolla, CA, USA) se obtuvo el kit para PCR en tiempo real QPCR
Master Mix Brilliant® II SYBR Green.
De TCL Ltda. (Santiago, Chile) . Se obtuvo el etanol y metanol.
De Thermo Scientific Hyclone (Madrid, España) , fueron obtenidos los siguientes
reactivos: suero fetal bovino, glutamina, tripsina 0.25% (1X) y penicilina/estreptomicina.
De US Biological (Massachussets, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: Tris-
Base, EDTA, glicina y SDS.
De Vector Laboraties (California, USA) se obtuvo el medio de montaje para
fluorescencia (VECTASHIELD® Mounting Medium).
De Winkler (Santiago, Chile) se obtuvo el reactivo de Bradford 5X.
29
Los equipos utilizados para el desarrollo de la parte experimental fueron los siguientes:
Centrífuga Eppendorf 5702, centrífuga Mikro 22RE, baño termorregulado Memmert,
Balanza analítica Scientech, Espectrofotometro UV-1700 Pharma Spec (Shimadzu),
Lector de microplacas Tecan Sunrise, sistema de electroforesis Mini Protean III y
sistema de transferencia Mini Trans Blot de Bio Rad, microscopio Olympus BX51,
Incubador de CO2 (Sanyo), Gabinete de Flujo laminar (ESCO Global), cámara de
Neubauer, Microscopio Olympus CKX41, Shaker Lab Companion SI-600, Orbital Shaker
SO3 Stuart Scientific, Citómetro de flujo BS FACSCANTOTM II, pHmetro HANNA, Vortex
MAXI-MIX II Barnstead thernoline, MICROSONTM ultrasonic cell disruptor misonix,
fuente de poder Bio-Rad Power PAC 200, Equipo para PCR en tiempo real MX 3000p
(Stratagene), equipo para PCR convencional Gene Amp PCR System 2400 (Perkin
Elmer), NanoDrop 2000.
30
3.2 Métodos:
3.2.1 Cultivo de la línea celular osteoblástica de ratón MC3T3-E1
Las células osteoblásticas fueron mantenidas con medio esencial mínimo alfa (α– MEM)
con ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos (GIBCO No. Catálogo 11900-024), 2mM de
L- glutamina, piruvato de sodio 1mM, suero fetal bovino al 10% y
penicilina/estreptomicina al 1%, a una temperatura de 37º C y con un porcentaje de
dióxido de carbono del 5%. Para el subcultivo celular, el medio fue removido y las
células fueron lavadas con PBS 0.1M (1X) estéril, se adicionó tripsina al 0.25%, una vez
sueltas las células, la tripsina fue neutralizada con medio completo (α– MEM). Las
células eran centrifugadas a 2000 g por 6 minutos descartando el sobrenadante y
resuspendiendo el pellet en medio completo para su conteo bajo un microscopio
invertido. En una placa de 60 mm se dejaba una cantidad de 100.000 células hasta que
alcanzaran aproximadamente un 70% de confluencia. Una vez logrado esto, el medio
fue cambiado por medio completo con suero fetal bovino al 2%, a una temperatura de
37º C y 5% de CO2, 16 a 18 horas antes de realizar el experimento.
31
3.2.2 Viabilidad de la línea celular osteoblástica MC3T3-E1 mediante citometría de
flujo.
Las células fueron crecidas a confluencia, se les cambio el medio 16-18 horas antes del
experimento y se estimularon con andrografólido 10, 50 y 100 µM respectivamente por
1, 2 y 10 días. Las células fueron tripzinizadas, contadas y resuspendidas en tampón de
unión a una concentración de 2 mill/mL, siguiendo posteriormente el protocolo de
marcaje (con ioduro de propidio y Anexina V) del kit.
3.2.3 Determinación del efecto de andrografólido so bre las vías de señalización
MAPK en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
2.5 x 105 células fueron incubadas con andrografólido 50 µM a distintos tiempos (0, 15,
30, 60, 120 y 180 minutos) o con vehículo (0.2% DMSO). Posteriormente, las células
fueron lavadas con PBS 1X, lisadas con tampón de lisis y los extractos proteicos fueron
sometidos a Western blot, utilizando los anticuerpos fosfo ERK 42/44, fosfo p38 y fosfo
Akt (Ser473). Como control de carga se utilizaron los respectivos anticuerpos anti ERK1
total, p38 total, y β-actina post stripping.
32
3.2.4 Determinación del rol de la vía MAPK en el au mento de la proteína COX-2 en
la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
2.5 x 105 células fueron preincubadas con los inhibidores U0126 (inhibidor de la vía
MEK1 y MEK2), (inhibidor de la vía p38 MAP quinasa) y LY294002 (inhibidor de la vía
PI3K) por 30 minutos y posteriormente con andrografólido 50 µM o con vehículo (0.2%
DMSO) por 9 horas para determinar si hay aumento en la expresión de COX-2.
Posteriormente, las células fueron lavadas con PBS 1X, lisadas con tampón de lisis y
los extractos proteicos fueron sometidos a Western blot, utilizando el anticuerpo
policlonal COX-2 (murino). Como control de carga se utilizó el anticuerpo β-actina post
stripping.
3.2.5. Determinación del efecto de andrografólido s obre la expresión del RNAm de
COX-2 en presencia de inhibidores.
2.5 x 105 de osteoblastos fueron preincubados por 30 minutos con vehículo (0.2%
DMSO) o con los inhibidores UO126, SB203580 o LY294002 y posteriormente
estimulados con andrografólido 50 µM durante 6 horas. Posteriormente, se aisló el
mRNA de las células, con el kit Quiagen, para el análisis de la expresión de COX-2
mediante PCR en tiempo real (RT-PCR). Como control se utilizó gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenada (GAPDH).
33
3.2.6 Determinación de la producción de fosfatasa a lcalina en la línea celular
osteoblástica MC3T3-E1.
Las células fueron crecidas a confluencia y estimuladas con andrografólido 10 y 50 µM
o con vehículo (0.2% DMSO) durante 14 días. Una vez pasado este tiempo, las células
fueron lavadas con PBS 1X frío y lisadas usando tampón de lisis pasivo Promega ®
durante 5 minutos en hielo. El lisado fue homogeneizado y sonicado por 20 segundos a
4ºC. En una placa de 96 posillos se colocó 100 µL de la muestra, 50 µL de la solución
tampón 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) 0.5M a pH 10.3 con MgCl2 2mM y 50 µL de
la solución sustrato p-nitrofenil-fosfato 10 mM. Se incubó a 37ºC por 30 minutos, se
detuvo la reacción con 100 µL de NaOH 3M y se leyó la absorbancia en el lector de
placas a 405 nm.
3.2.7 Determinación de la mineralización en la líne a celular osteoblástica MC3T3-
E1 mediante la tinción rojo alizarina.
Las células fueron crecidas en placas de 6 posillos. Una vez alcanzada la confluencia,
se les suplementó el medio de cultivo con β-glicerofosfato 10 mM y posteriormente
fueron estimuladas con andrografólido 10 µM, 50 µM o con vehículo (0.2% DMSO)
respectivamente durante 14 días. Después de este tiempo, las células fueron fijadas
con etanol frío al 70% por 1 hora, teñidas con rojo alizarina 40 mM a pH 4.2 por 10
minutos y lavadas con PBS 1X para eliminar el exceso. Para liberar el rojo alizarina se
34
incubó con cloruro de cetilpiridinio al 10% en fosfato de sodio 10 mM a pH 7.0 por 15
minutos. La absorbancia fue leída a 562 nM.
3.2.8 Análisis del efecto de andrografólido sobre l os factores de transcripción NF-
ĸB y AP-1 en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1 .
2.5 x 105 células fueron preincubadas con andrografólido 50 µM a distintos tiempos (0,
15, 30, 60 y 120 minutos) o con vehículo (0.2% DMSO). Posteriormente, las células
fueron lavadas, lisadas con tampón de lisis y los extractos proteicos fueron sometidos a
Western blot, utilizando los anticuerpos anti IĸB-α y anti c-fos. Como control de carga se
utilizó el anticuerpo anti ERK1 total, post stripping.
3.2.9 Extracción de proteínas totales
Las células fueron lavadas con PBS 1X y se le agregó 80 µL de tampón de lisis (tris
HCl 50 mM a pH 7.4, EDTA 1 mM, NaF 10 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, Nonidet
P-40 al 0.5%, KCl 100 mM, y 10 ug/ml de inhibidores de proteasas: leupeptin, aprotinin,
pepstatin), siendo mantenidas en hielo durante 5 minutos. La placa fue raspada con un
rastrillo estéril, y el contenido fue colocado en un tubo Eppendorf por 15 minutos en
hielo. Para su homogeneización final, el tubo fue vortexeado y sometido a
centrifugación a 9.000 x g por 20 minutos a 4º C. El sobrenadante fue rescatado y
cuantificado por el método de Bradford.
35
3.2.10 Separación electroforética de proteínas
La separación electroforética de proteínas se realizó en geles de poliacrilamida en
condiciones denaturantes (SDS-PAGE), en el sistema de electroforesis Mini Protean®
III (BIO RAD ™). El gel separador y espaciador de 1,5 mm de grosor, se prepararon a
partir de una solución de acrilamida-bisacrilamida 30%-0,8%. Los geles se prepararon
de acuerdo al tamaño de proteína a detectar, utilizando geles a una concentración final
de poliacrilamida del 12%. El gel separador contenía, Tris-HCl 375 mM (pH 8.8), SDS
0.1 %, persulfato de amonio 0.03% y TEMED 0,03%. El gel espaciador se preparó a
una concentración del 4 % de acrilamida incluyendo Tris 125 mM (pH 6.8), SDS 0.1%,
persulfato de amonio 1% y TEMED 0.04%. A las muestras de proteínas totales se les
agregó SDS 20%, β-mercaptoetanol y tampón muestra 5X (SDS 5%, glicerol 50%, azul
de bromofenol 0.05% y Tris-HCl 0.125 M pH 6.8). Luego éstas fueron cargadas en el
gel, realizándose la electroforesis en tampón de corrida (Tris base 25 mM, glicina 190
mM y SDS 0.1%) a un voltaje constante de 80 V por aproximadamente 2 horas.
3.2.11 Electrotransferencia
Una vez terminada la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana
de nitrocelulosa. Para esto, sobre una esponja embebida en tampón de transferencia
(Tris base 25 mM, glicina 200 mM y metanol 20%) se depositaron secuencialmente: un
trozo de papel filtro, la membrana de nitrocelulosa, el gel a transferir y luego otro papel
filtro, todo lo cual se cubrió con otra esponja embebida en la misma solución. Esto se
36
colocó en una cámara de electrotransferencia conteniendo el tampón mencionado y se
aplicó una intensidad de corriente de 200 mA por 2 horas. Transcurrido este tiempo, la
membrana se utilizó para análisis de Western blot.
3.2.12 Análisis de Western blot
La membrana fue incubada con 7 mL de solución de bloqueo (TBS 1x, 0.1% Tween-20
con 5% p/v de leche descremada) por una hora con agitación constante, luego fue
incubada con los anticuerpos primarios correspondientes y a la dilución adecuada por
toda la noche a 4 ºC con agitación constante. Al día siguiente la membrana fue lavada 3
veces con TBS-T (TBS 1X, 0.1% Tween-20) durante 5 minutos a temperatura ambiente
con agitación y por último se incubó con el anticuerpo secundario conjugado a
peroxidasa, IgG anti-conejo o IgG anti-ratón según corresponda por una hora y media.
Concluida la incubación con el anticuerpo secundario la membrana fue lavada 3 veces
con TBS-T durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El revelado se efectuó por quimioluminiscencia (ECL), el cual se basa en la emisión de
luz no radiactiva. Este método detecta antígenos inmovilizados unidos directa o
indirectamente con anticuerpos conjugados con peroxidasa. El resultado se obtiene al
mezclar partes iguales de dos reactivos, obteniéndose una solución de peróxido de
hidrógeno y luminol que se vierte sobre las membranas, dejándose actuar por 1 minuto
y secando el exceso con papel filtro. Luego se expone en un film el resultado de la
excitación del luminol. Finalmente, se detiene la reacción al retirar la película de la
membrana, procediendo a su revelado con reactivo D72 y su fijación con reactivo U3.
37
Para estandarizar los resultados que se obtuvieron de este procedimiento, las mismas
membranas se utilizaron para detectar las proteínas totales (ERK, Akt y p38) o β-actina.
Para ello previamente se incubaron con solución stripping (2-mercaptoetanol 100 mM,
SDS 2%, tris-HCl 62.5 mM a pH 6.7) durante 1 hora a 50ºC con agitación constante.
Después se lavó la membrana con TBS-T cada 10 minutos por 1 hora hasta eliminar el
β-mercaptoetanol. Luego, se siguió el procedimiento utilizado para el primer anticuerpo.
Las señales obtenidas en el film, son escaneadas y analizadas densitométricamente.
3.2.13 Inmunofluorescencia
Las células previas al tratamiento fueron colocadas sobre “covers” de vidrio de 18
mm de diámetro. Posterior al tratamiento, estas fueron fijadas con Histochoice® (diluido
4:1 con etanol 100%) sobre portaobjetos de vidrio durante 10 minutos, lavadas 3 veces
en PBS 1X, y permeabilizadas durante 15 minutos con Tritón X-100 al 0,3% en PBS 1X,
de manera de facilitar el acceso a antígenos intracelulares. Luego de 3 lavados en PBS
1X los preparados celulares fueron incubados durante 1 hora a temperatura ambiente
con solución de bloqueo (BSA 1% y leche descremada 5% en PBS 1X). En esta misma
solución fueron incubadas las muestras con el anticuerpo primario de NF-κB/p65 a una
dilución 1:200 durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente los covers fueron lavados 3
veces en PBS 1X e incubados durante dos horas con un anticuerpo secundario anti-
ratón conjugado a Alexa Fluor 488 a una dilución 1:500 en solución de bloqueo a
temperatura ambiente en oscuridad. Los núcleos fueron teñidos con ioduro de propidio
38
0.33 µg/ml durante 2 minutos. Las muestras fueron montadas con medio de montaje
para fluorescencia y visualizadas utilizando un Microscopio Olympus BX51.
3.2.14 Transcripción reversa - reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
(RT-PCR)
Se analizó la expresión de los mRNAs de COX- 2 y GAPDH para lo cual se aisló RNA
total de osteoblastos preincubados con los inhibidores UO126, SB203580 y LY294002 y
tratados con andrografólido (50 µM). El RNA fue aislado utilizando el kit RNeasy plus
Mini Kit de QIAGEN, según el procedimiento recomendado por el fabricante.
Posteriormente se cuantificó el RNA a 260 nm, y la pureza fue analizada determinando
la razón 260/280 nm, con el instrumento NanoDrop 2000. La síntesis de cDNA se
realizó a partir de 1 µg de RNA total, 0.5 µg de oligo-dT, siendo esto preincubado por 5
minutos a 70°C, se sacó la muestra, se dejó enfriar en hielo, se adicionó 4 µl tampón
5X, dNTPs 1 mM, 200 unidades de transcriptasa reversa y se completó con agua
nanopura a un volumen final de 20 µl. La reacción de amplificación fue 10 segundos a
25°C, 50 minutos a 42°C y 15 minutos a 70°C.
Posteriormente, la reacción de PCR se realizó con 2 µl de cDNA, 5 µM (2µl) de cada
partidor, 6 µl de agua y 10 µl de Master Mix 2X (Stratagene). Los partidores COX-2
utilizados fueron: COX-2 sense 5’ – TGGAAAAGGTTCTTCTACGGA – 3’ y antisense
5’ – TGAACCCAGGTCCTCGCT – 3’.
39
La conducción del PCR en tiempo real fue 95°C por 10 minutos por 1 ciclo, 95°C por 15
segundos y 57°C por 15 segundos, y 72°C por 20 segu ndos por 40 ciclos, y 95° C por
10 segundos, 70°C por 1 segundo y 95°C por 1 segund o por 1 ciclo. Como control
interno se utilizó la amplificación de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
de ratón con los partidores: GAPDH sense 5’-GACAACTTTGGCATTGTGG -3’, y
GADPH antisense 5’- ATGCAGGGATGATGTTCTG -3’.
3.2.15 Análisis estadísticos
Los resultados fueron expresados en gráficos de barras como promedio ± error
estándar. El análisis de los datos porcentuales, se efectuaron utilizando la
transformación arcoseno, análisis de varianza (ANDEVA) y un test de comparaciones
múltiples de Dunnet. En el caso de los datos expresados como razón estos fueron
analizados por ANDEVA y un test de comparaciones de Dunnet. En ambos casos se
utilizó un nivel de significancia del 5 %. Todos los análisis fueron realizados con el
software GraphPad Prism versión 3.00 para Windows, GraphPad Software TM (San
Diego California, USA).
40
4. Resultados.
4.1 Viabilidad Celular de la línea osteoblástica MC 3T3-E1 en presencia de
andrografólido.
Para analizar el efecto citotóxico de andrografólido se realizó un marcaje con Anexina
V-FITC y ioduro de propidio, el cual hace posible diferenciar las células apoptóticas
(V+/IP-) de las necróticas (V+/IP+ doble positivo) y esto se analizó por citometría de
flujo. Las células fueron incubadas con andrografólido 10, 50 y 100 µM durante 6 horas
usando como control positivo ácido butírico 10 mM. Los resultados mostraron que en
las células control (Figura 7 A ) hay un 93.7% de células vivas, un 1.6% de células
apoptóticas y un 4.9% de células necróticas; las células tratadas con ácido butírico
(Figura 7 B ) mostraron que hay 94.6% de células vivas, un 1.9% de células apoptóticas
y un 3.6% de células necróticas, mientras que en los tratamientos con andrografólido se
observó lo siguiente: con andrografólido 10 µM (Figura 7 C ) presentó un 92% de
células vivas, un 0.9% de células apoptóticas y un 7.3 % de células necróticas, con
andrografólido 50 µM (Figura 7 D ) presentó un 94.1% de células vivas, un 0.9 % de
células apoptóticas y un 7.8% de células necróticas, con andrografólido 100 µM (Figura
7 E) presentó un 94.9% de células vivas, un 1.2% de células apoptóticas y un 4% de
células necróticas. Estos resultados dan cuenta que la viabilidad celular no se ve
afectada en presencia de andrografólido 10, 50 y 100 µM por un tiempo de 6 horas.
41
A. B.
C. D.
4.9%
93.7%
1.6%
3.6%
94.6%
1.9%
7.3%
92%
0.9%
7.8%
91.4%
0.9%
42
E.
Figura 7. Viabilidad celular de la línea osteoblást ica MC3T3-E1.
La viabilidad se midió mediante citometría de flujo, en el cual por un tiempo de 6 horas,
las células fueron incubadas en presencia de andrografólido. A) Control tratado con
DMSO al 0.2%. B) Control positivo con ácido butírico 10 mM. C) Andrografólido 10 uM.
D) Andrografólido 50 uM. E) Andrografólido 100 uM. (Rojo: células vivas; verde: células
apoptóticas: azul: células necróticas).
4%
94.9%
1.2%
43
4.2 Determinación del efecto de andrografólido sobr e las vías de señalización
MAPK en la línea celular osteoblástica MC3T3-E1.
Para determinar si andrografólido producía algún efecto en la vía de Akt (proteína
quinasa B) y las vías MAPK, específicamente ERK 1/2 y p38, se realizó una cinética de
fosforilación en donde las células fueron incubadas con andrografólido 50 µM a distintos
tiempos (0, 15, 30, 60, 120, 180 y 360 minutos). Posteriormente se extrajeron proteínas
para realizar la electroforesis y análisis de Western blot respectivamente, tal como se
describió en materiales y métodos.
Como se aprecia en la Figura 8 , la cinética de fosforilación de Akt, en la cual se usó
como control de carga Akt total, no presenta cambios estadísticamente significativos a
los distintos tiempos analizados. En la cinética de fosforilación de p38 (Figura 9 ), en la
cual se utilizó como control de carga β-actina, tampoco se aprecian cambios
estadísticamente significativos con respecto al control (tiempo 0), mientras que en la
Figura 10 , en donde se analizó la fosforilación de ERK 1/2, usando como control de
carga ERK total, se puede apreciar que andrografólido, a los 15 minutos de estímulo,
presenta un incremento estadísticamente significativo (p<0.05) con respecto al control.
44
A.)
B.)
________________________________________________
0 5 15 30 60 120 180 360 Minutos
Figura 8. Análisis de Western blot para la fosforil ación de Akt en presencia de
andrografólido. Las células MC3T3-E1 fueron incubadas con vehículo DMSO (0.2%) o
con andrografólido 50 µM a distintos tiempos (0, 5, 15, 30, 60, 120, 180, 360 minutos,
respectivamente). A.) Gráfico de la cinética de fosforilación de Akt en presencia de
andrografólido 50 µM a distintos tiempos utilizando como control de carga Akt total.
Promedio ± e.e, n= 2 B.) Western blot representativo de lo graficado anteriormente.
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
0 5 1 5 3 0 6 0 1 2 0 1 8 0 3 6 0 M in u t o s
p-Akt
Akt
45
A.)
0
1
2
3
4
0 5 15 30 60 120 180 360 Minutos
p38/
ββ ββ-a
ctin
a
B.)
___________________________________________
0 5 15 30 60 120 180 360 Minut os
Figura 9. Análisis de Western blot para la fosforil ación de p38 en presencia de
andrografólido. Las células MC3T3-E1 fueron incubadas con vehículo DMSO (0.2%) o
con andrografólido 50 µM a distintos tiempos (0, 5, 15, 30, 60, 120, 180, 360 minutos,
respectivamente). A.) Gráfico de la cinética de fosforilación de p38 en presencia de
andrografólido 50 µM a distintos tiempos utilizando como control de carga β-actina.
Promedio ± e.e, n= 2. B.) Western blot representativo de lo graficado anteriormente.
p-p38
β-actina
46
A.)
B.)
____________________________________________
0 5 15 30 60 120 180 Minutos
Figura 10. Análisis de Western blot para la fosfori lación de ERK 1/2 en presencia
de andrografólido. Las células MC3T3-E1 fueron incubadas con vehículo DMSO
(0.2%) o con andrografólido 50 µM a distintos tiempos (0, 5, 15, 30, 60, 120, 180
minutos, respectivamente). A.) Gráfico de la cinética de fosforilación de ERK 1/2 en
presencia de andrografólido 50 µM a distintos tiempos utilizando como control de carga
ERK total. Promedio ± e.e, n= 3, * p< 0.05. B.) Western blot representativo de lo
graficado anteriormente.
T O´
T 5
´T 1
5´T 3
0´ T 1 T2 T30.0
0.5
1.0
1.5
2.0p-
Erk
/ E
rk 1
/2 *
ERK 1/2
ERK Total
47
4.3 Determinación del rol de las vías MAPK en el au mento de COX-2
Para ver el efecto de las vías MAPK en el aumento de COX-2, primero se realizó un
Western blot, tal como se describió en materiales y métodos. Se analizó la fosforilación
de la vía ERK 1/2 en presencia de andrografólido 50 µM y de los inhibidores UO126,
SB203580 y LY294002. Los inhibidores fueron preincubados durante 30 minutos y
estimulados durante un tiempo de 15 minutos, el cual fue escogido por ser el tiempo en
el cual se vió mayor fosforilación en la cinética realizada anteriormente (Figura 10 ).
Se puede apreciar en la Figura 11 que andrografólido provoca el aumento esperado
con respecto al control y que el inhibidor SB203580 presenta por sí solo un aumento en
la estimulación de las células osteoblásticas el cual es estadísticamente significativo
(p<0.01). En paralelo también se puede apreciar que andrografólido, en presencia del
inhibidor UO126 y del inhibidor LY294002 presenta una disminución estadísticamente
significativa (p<0.01). El inhibidor SB203580, sin embargo no presenta tal disminución,
la cual se puede deber al aumento que presenta por sí solo, provocando un
enmascaramiento de su real efecto.
De estos resultados se puede abstraer principalmente que la vía ERK 1/2 tiene una
participación relevante en el aumento de COX-2 y sugiere que la vía de señalización Akt
podría estar participando de una manera no conocida.
48
A.
B.
AP 50 µM UO126 10 µM SB203580 10 µM LY294002 10 µM
- - - + - - + -
- - + - - + - -
- - - - + - - +
- + - - - + + +
0
1
2
**
** **p-E
RK
/ER
K t
otal
A P 5 0 µM U O 1 2 6 1 0 µM S B 2 0 3 5 8 0 1 0 µM L Y 2 9 4 0 0 2 1 0 µM
- - - + - - + -
- - + - - + - -
- - - - + - - +
- + - - - + + +
49
Figura 11. Efecto de andrografólido en la vía de se ñalización MAPK ERK 1/2, en
presencia de los inhibidores UO126, SB203580 y LY29 4002. Las células MC3T3-E1
fueron preincubadas con los inhibidores durante 30 minutos y posteriormente incubadas
con andrografólido 50 µM durante 15 minutos, tal como se describió en materiales y
métodos. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE e inmunodetectadas
utilizando un anticuerpo específico para p-ERK 1/2. Como control de carga se utilizó
ERK total. (A) El gráfico muestra el análisis densitométrico de las bandas
correspondientes a p-ERK y ERK total expresado como razón más el promedio ± e.e,
n= 4, ** p < 0.01. (B) Análisis de Western blot de la fosforilación de p-ERK 1/2 en
presencia de los inhibidores UO126, SB203580 y LY294002.
50
Por otra parte se analizó, mediante Western blot, la expresión de COX-2 en presencia
de los inhibidores antes mencionados (Figura 12 ) y se puede apreciar que con el
inhibidor UO126 y LY294002 hay una disminución, pero se observó que con el inhibidor
SB203580 hay una disminución estadísticamente significativa (p<0.01) con respecto a
AP. Ante esto se procedió a realizar un PCR en tiempo real, tal como se describió en
materiales y métodos. Como se puede apreciar en la Figura 13 , las células
osteoblásticas al ser incubadas con los inhibidores UO126, SB203580 y LY294002 en
presencia de andrografólido, presentan una disminución estadísticamente significativa
(p<0.05, p<0.01 y p<0.01, respectivamente) con respecto a andrografólido 50 µM.
51
A.
B.
AP 50 µM UO126 10 µM SB203580 10 µM LY294002 10 µM
- - - + - - + -
- - + - - + - -
- - - - + - - +
- + - - - + + +
0.0
0.5
1.0
1.5
Cox
-2/ββ ββ
-act
ina
AP 50 µM UO126 10 µM SB203580 10 µM LY294002 10 µM
- - - + - - + -
- - + - - + - -
- - - - + - - +
- + - - - + + +
52
Figura 12. Efecto de andrografólido en la expresión de COX-2, en presencia de los
inhibidores UO126, SB203580 y LY294002. Las células MC3T3-E1 fueron
preincubadas con los inhibidores durante 30 minutos y posteriormente incubadas con
andrografólido 50 µM durante 9 horas, tal como se describió en materiales y métodos.
Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE e inmunodetectadas utilizando un
anticuerpo específico para COX-2. Como control de carga se utilizo β-actina. (A)
Análisis de Western blot de la expresión de COX-2 en presencia de los inhibidores
UO126, SB203580 y LY294002. Promedio ± e.e, n= 3, ** p<0.01. (B) El gráfico muestra
el análisis densitométrico de las bandas correspondientes a COX-2 y β-actina
expresado como razón.
53
0
5
10
15
**
**
*
cant
idad
rel
ativ
a
Figura 13. Análisis de RT-PCR en tiempo real para C OX-2. Las células MC3T3-E1
fueron preincubadas con los inhibidores UO126, SB203580 y LY294002 durante 30
minutos y posteriormente incubadas con andrografólido 50 µM o vehículo por 6 horas.
La expresión de COX-2 fue analizada por medio de RT-PCR en tiempo real usando
Brilliant II® Sybr® Green (Stratagene). El gen GAPDH fue usado como control. El gráfico
muestra la cuantificación relativa de 3 experimentos independientes. Promedio ± e.e.
*p< 0,05, **p< 0,01 comparado con AP 50 µM.
AP 50 µM UO126 10 µM SB203580 10 µM LY294002 10 µM
- - - - - - + +
- - + + - - - -
- - - - + + - -
- + - + - + - +
54
4.4 Efecto de andrografólido en marcadores osteogén icos.
Las células osteoblásticas mientras alcanzan su nivel de maduración, van expresando
marcadores moleculares también conocidos como marcadores osteogénicos. Los
marcadores osteogénicos van a depender del estado en el que se encuentra la célula.
En estados tempranos se encuentran factores de trascripción como RUNX2 y osterix,
mientras que en estados tardíos se encuentran proteínas como sialoproteína ósea,
osteopontina, osteonectina, fostasa alcalina entre otras. También se empieza a
depositar el calcio en forma de fosfato una vez que la matriz empieza su proceso de
mineralización. Por todos estos datos se procedió a determinar la actividad de fosfatasa
alcalina y a determinar si el fitofármaco produce o no mineralización en el cultivo celular.
Primero, se realizó un análisis de viabilidad celular por un periodo de 10 días. Las
células fueron incubadas con andrografólido 50 µM, contadas en cámara de Neubauer,
resuspendidas a una concentración de 200.000 cel/mL y posteriormente examinadas en
el citómetro tal como se describe en materiales y métodos. Las células fueron
analizadas a los días 1, 2 y 10, respectivamente. Los resultados muestran en el día 1
(Figura 14 ) que en el control (Figura 14 A ) hay un 87.1% de células vivas, un 1.2% de
células apoptóticas y un 11.8% de células necróticas, mientras que en los tratamientos
con andrografólido se observó lo siguiente: con andrografólido 10 µM (Figura 14 B )
presentó un 91.6% de células vivas, un 2.8% de células apoptóticas y un 5.6 % de
células necróticas, con andrografólido 50 µM (Figura 14 C ) presentó un 92.7% de
células vivas, un 2.2% de células apoptóticas y un 5.2% de células necróticas, con
andrografólido 100 µM (Figura 14 D ) presentó un 93.6% de células vivas, un 1.6% de
55
A) B)
C) D)
Figura 14. Viabilidad celular de la línea osteoblás tica MC3T3-E1 a las 24 hrs. Las
células fueron incubadas con andrografólido a distintas concentraciones durante 1 día y
analizadas posteriormente mediante citometria de flujo. A) Control con vehículo DMSO.
B) Andrografólido 10 uM. C) Andrografólido 50 uM. D) Andrografólido 100 uM.
(Rojo: células vivas; verde: células apoptóticas: azul: células necróticas)
11.8%
87.1%
1.2%
5.6%
91.6%
2.8%
5.2%
92.7%
2.2%
4.9%
93.6%
1.6%
56
células apoptóticas y un 4.9% de células necróticas. Los resultados del día 2 (Figura
15) muestran que en el control (Figura 15 A ) hay un 90.8% de células vivas, un 0.5%
de células apoptóticas y un 8.8% de células necróticas, mientras que en los
tratamientos con andrografólido se observó lo siguiente: con andrografólido 10 µM
(Figura 15 B ) presentó un 90.7% de células vivas, un 1% de células apoptóticas y un
8.3% de células necróticas, con andrografólido 50 µM (Figura 15 C ) presentó un 91.9%
de células vivas, un 2.5% de células apoptóticas y un 5.8% de células necróticas, con
andrografólido 100 µM (Figura 15 D ) presentó un 90.2% de células vivas, un 1.5% de
células apoptóticas y un 8.4% de células necróticas. Los resultados del día 10 (Figura
16) muestran que en el control (Figura 16 A ) hay un 90.9% de células vivas, un 1% de
células apoptóticas y un 8.2% de células necróticas, mientras que en los tratamientos
con andrografólido se observó lo siguiente: con andrografólido 10 µM (Figura 16 B )
presentó un 75% de células vivas, un 0.3% de células apoptóticas y un 24.8% de
células necróticas, con andrografólido 50 µM (Figura 16 C ) presentó un 85.9% de
células vivas, un 1.2% de células apoptóticas y un 13.1% de células necróticas, con
andrografólido 100 µM (Figura 16 D ) presentó un 88% de células vivas, un 5.1% de
células apoptóticas y un 7.2% de células necróticas.
Con todos estos datos podemos concluir que al día 10 las células que fueron tratadas
con andrografólido 10 µM, 50 µM y 100 µM presentan una cantidad más elevada de
células necróticas comparadas con el día 1, pero aun así, la diferencia no es
significativa.
57
A) B)
C) D)
Figura 15. Viabilidad celular de la línea osteoblás tica MC3T3-E1 a los 2 días. Las
células fueron incubadas con andrografólido a distintas concentraciones durante 2 días
y analizadas posteriormente mediante citometria de flujo. A) Control con vehículo
DMSO. B) Andrografólido 10 uM. C) Andrografólido 50 uM. D) Andrografólido 100 uM.
(Rojo: células vivas; verde: células apoptóticas: azul: células necróticas)
90.8%
0.5%
8.8%
90.7%
1%
8.3%
5.8%
91.9%
2.5%
8.4%
90.2%
1.5%
58
A) B)
C) D)
Figura 16. Viabilidad celular de la línea osteoblás tica MC3T3-E1 a los 10 días. Las
células fueron incubadas con andrografólido a distintas concentraciones durante 10 días
y analizadas posteriormente mediante citometria de flujo. A) Control con vehículo
DMSO. B) Andrografólido 10 uM. C) Andrografólido 50 uM. D) Andrografólido 100 uM.
(Rojo: células vivas; verde: células apoptóticas: azul: células necróticas)
8.2%
90.9%
1%
75%
24.8%
0.3%
13.1%
85.9%
1.2%
7.2%
88%
5.1%
59
Una vez realizado el ensayo de viabilidad se procedió a analizar la actividad de la
fosfatasa alcalina en la línea celular osteoblástica en presencia de andrografólido
durante 10 días, tal como se describió en materiales y métodos. En la Figura 17 se
puede observar que a medida que se aumenta la concentración de andrografólido, la
actividad de la fostasa alcalina va disminuyendo proporcionalmente. En paralelo a este
experimento se realizó el estudio de mineralización (Figura 18 ), tal cual como se
describe en materiales y métodos, y se pudo corroborar que a medida que aumenta la
concentración de andrografólido, la mineralización disminuye proporcionalmente.
60
0
50
100
150
µµµµM AP- 10 50
% r
espe
cto
al c
ontr
ol
***
***
Figura 17. Actividad de fosfatasa alcalina. Las células MC3T3-E1 fueron incubadas
durante 10 días con vehículo (DMSO 0.2%) o andrografólido 10 y 50 µM. La actividad
fue analizada en el lisado celular y fue medida la hidrólisis de p-nitrofenil fosfato a
p-nitrofenol, tal como se describe en materiales y métodos, midiendo la absorbancia a
405 nm. Promedio ± e.e, n=6. *** p<0.01 comparado con el control.
61
0 .0
0 .5
1 .0
***
***
__ 10 µM 50µM AP
Vec
es d
el c
ontr
ol
Figura 18. Efecto de andrografólido en la mineraliz ación de las células MC3T3-E1.
Las células MC3T3-E1 fueron crecidas a confluencia e incubadas durante 10 días con
vehículo (DMSO 0.2%) o andrografólido 10 y 50 µM, fijadas con etanol frío al 70% y
teñidas con rojo alizarina. La tinción adherida a las células fue removida y se midió la
absorbancia a 562 nm, tal como se describe en materiales y métodos. Promedio ± e.e,
n=4. *** p<0.01 comparado con el control.
62
4.5 Efecto de andrografólido en los factores de tra scripción AP-1 y NF- κB.
4.5.1 Análisis de inmunodetección de I κBα y del factor NF- κB
NF-κB es un homo o heterodímero, el cual cuando se encuentra activo transloca al
núcleo para unirse a sitios específicos del DNA y así activar genes involucrados en
distintos tipos de respuesta según sea el caso (estrés, supervivencia, etc). En células
no estimuladas los dímeros de NF-κB son secuestrados en el citoplasma por una familia
de inhibidores llamada IκBs (Inhibitor of κB), siendo la más estudiada la proteína IκBα.
Cuando NF-κB es activado se inicia el proceso de degradación de las proteínas IκB, las
cuales son fosforiladas y degradadas vía ubiquitina-proteosoma (Zhang et al., 2005).
Para evaluar el efecto de andrografólido sobre el factor de transcripción NF-κB, se
analizó la proteína IκBα, realizándose una cinética a los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120
minutos mediante Western blot. Se observa en la Figura 19 que la proteína IκBα entre
los tiempos 0, 15, 30 y 60 minutos no presenta grandes cambios, mientras que a las
dos horas su presencia no es tan notoria lo cual sugiere que esta ha sido degradada.
Para verificar que el factor NF-κB esta siendo activado se estudió la proteína p65 la cual
fue detectada mediante inmunofluorescencia. Las células fueron incubadas con
andrografólido 50 µM durante los siguientes tiempos: 0, 1 y 2 horas. Se utilizó un
anticuerpo primario anti-p65/NF-κB y como anticuerpo secundario se utilizó anti-IgG de
conejo conjugado a Alexa 488. En la Figura 20 se muestra la inmunodetección positiva
63
A.
B.
Figura 19. Efecto de andrografólido sobre la proteí na IκBα en las células
osteoblásticas MC3T3-E1. Las células fueron estimuladas con andrografólido 50 µM y
analizadas a distintos intervalos de tiempo (0, 15, 30, 60 y 120 minutos,
respectivamente) y analizadas mediante Western blot como se describe en materiales y
métodos. A) Análisis densitométrico de IκBα usando como control de carga ERK total.
n=3 B) Análisis de Western blot en extractos totales.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 15 30 60 120 Minutos
Iκκ κκB
αα αα /E
rk T
otal
0 15 30 60 120 Minutos
IκBα
Erk total
64
______________________________________________________________________
Figura 20. Efecto de andrografólido sobre la localización subcelular de p65/NF- κB
en células MC3T3-E1. Las células MC3T3-E1 fueron incubadas con andrografólido por
0, 1 y 2 horas. La proteína p65/NF-κB fue detectada por inmunocitoquímica y análisis
por microscopia de epifluorescencia utilizando un anticuerpo anti-p65/NF-κB y como
segundo anticuerpo Alexa 488 (verde). Los núcleos fueron teñidos con ioduro de
propidio (rojo). Aumento utilizado 40X.
P65/NF-κB Ioduro de Propidio Superposición
T 0
T 1
T 2
65
(verde) para p65/NF-κB, mostrando que estas proteínas se encuentran localizadas en el
área citoplasmática cuando se encuentran en un estado de reposo (control). En las
células tratadas con andrografólido se observó que hasta los 60 minutos p65/ NF-κB se
distribuyó en el citoplasma, sin embargo, a los 120 minutos este factor se localizó
mayoritariamente dentro del núcleo. Como control negativo se agregó solución de
bloqueo sin primer anticuerpo, no observándose inmunoreacción positiva en las células.
Este resultado se correlaciona con la Figura 19 , en la cual la proteína IκBα se
encuentra disminuida a las 2 horas.
4.5.2 Análisis de inmunodetección para la proteína c-Fos, componente de la
proteína AP-1.
La proteína activadora 1 (AP-1) es un factor de transcripción heterodimérico que juega
un importante rol en el desarrollo y mantención esqueletal. AP-1 consiste en dímeros
formados por miembros proteícos de las familias Fos, Jun y ATF. Las proteínas Fos
(c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2) son sólo capaces de heterodimerizarse con miembros de la
familia Jun, mientras las proteínas Jun (c-Jun, JunB, JunD) pueden homo y/o
heterodimerizarse con proteínas Fos para formar complejos transcripcionales activos.
(Wagner, 2002; Naito et al., 2004). Varios complejos son expresados diferencialmente
durante la maduración de osteoblastos in vitro siendo altamente expresadas todas las
proteínas Fos y Jun en sus comienzos. Subsecuentemente, durante el periodo de
producción de matriz extracelular y mineralización, sus niveles van decayendo y Fra-2 y
66
JunD se convierten en los principales componentes del complejo AP-1 en los
osteoblastos totalmente diferenciados. (Wagner, 2002)
Para estudiar el efecto de andrografólido sobre la expresión de este dímero se realizó
un análisis de inmunodetección, tal como se describe en materiales y métodos. Como
se puede apreciar en la Figura 21 , se realizó una cinética para evaluar la expresión de
la proteína c-fos, en presencia de andrografólido 50 µM mostrando un aumento
estadísticamente significativo (p<0.01) a los 30 minutos comparado con el control a
tiempo cero.
67
A.
B.
Figura 21. Efecto de andrografólido sobre la proteí na c-Fos en las células
osteoblásticas MC3T3-E1. Las células fueron estimuladas con andrografólido 50 µM y
analizadas a distintos intervalos de tiempo (0, 15, 30, 60 y 120 minutos
respectivamente) y analizadas mediante Western blot como se describe en materiales y
métodos. A) Análisis densitométrico de c-Fos usando como control de carga ERK total.
Promedio ± e.e, n=4 (***p<0.01 comparado con el control) B) Análisis de Western blot
en extractos totales.
0
1
2
3
4 ***
0 15 30 60 120 Minutos
c-Fo
s/E
RK
Tot
al
0 15 30 60 120 Minutos
c-Fos
ERK total
68
5. Discusión
El esqueleto, formado por los huesos, es el principal sustento de los organismos
vertebrados, jugando un rol primordial para el soporte del cuerpo y para la protección de
órganos vitales. Los huesos, al ser el pilar fundamental del organismo, son un foco
destacado de investigación para poder conocer su anatomía, función y procesos
biológicos en los cuales se encuentran comprometidos, como su mantención a través
de la vida y/o mecanismos de reparación a la hora de sufrir algún trauma u enfermedad.
El hueso está constituido por el tejido óseo, el cual esta compuesto principalmente por
osteoblastos, osteoclastos y osteocitos, los cuales se encargan de mantener la
homeostasis del hueso entre formación y resorción (Hadjidakis y Androulakis, 2006). La
formación es un foco recurrente de investigaciones, ya que traumas como fracturas y/o
enfermedades como osteoporosis, necesitan de este mecanismo para volver a su
equilibrio y es fundamental el descubrimiento de fármacos o fitofármacos que
contribuyan a esto.
Andrografólido, es un labdano diterpénico, y es el componente principal de la planta
Andrographis paniculata, la cual ha mostrado tener cualidades farmacológicas
anticancerígenas, inmunoestimulantes y antiinflamatorias (Liang et al., 2008; Kumar et
al., 2004; Rajapogal et al., 2003; Shen et al., 2002). Las propiedades farmacológicas
hasta el momento aún no han sido exploradas en líneas celulares osteoblásticas.
Estudios previos realizados en este laboratorio han mostrado que andrografólido por sí
solo es capaz de aumentar la expresión de COX-2 en células MC3T3-E1 y debido a que
69
COX-2 participa en el proceso de mineralización ósea, se propuso en el presente
trabajo de tesis el objetivo de conocer si andrografólido es capaz de estimular la
formación ósea (mineralización) en la línea celular osteoblástica de ratón MC3T3-E1,
como así también evaluar las vías de señalización MAPK y PI3K, que podrían estar
contribuyendo en la modulación de esta respuesta.
Los primeros datos obtenidos sobre viabilidad celular muestra que andrografólido no es
citotóxico a las 6 horas ya que el porcentaje de muerte celular fue de cercano al 4% con
la concentración de andrografólido 100 µM (Figura 7 ), lo cual nos permitió realizar los
experimentos siguientes descartando un potencial efecto citotóxico agudo.
Del análisis de Western blot realizado para evaluar las cinéticas de fosforilación de las
vías MAPK (Figura 9 y 10 ), se observó que andrografólido 50 µM es capaz de
aumentar significativamente la vía ERK 1/2, no pudiendo evidenciarse de la misma
manera en las otras vías. Estudios realizados en modelos animales muestran que ERK1
y ERK2 son esenciales para la diferenciación osteoblástica y la formación de hueso.
Mediante técnicas de hibridación in situ, fluorescencia basada en la tinción de TRAP
(fosfatasa acida resistente a tartrato) y PCR en tiempo real, se mostró que la expresión
de osteocalcina en osteoblastos maduros no se desarrollaría en ausencia de ERK1 y
ERK2, indicando que ERK1 y ERK2 son esenciales para la diferenciación a
osteoblastos maduros (Matsuchita et al., 2009). Otros estudios realizados muestran que
la producción autocrina de PGE2, inducida por TGF-β, juega un importante rol en la
estimulación de las vías MAPK, en particular en la vía ERK, y la activación de ésta
70
MAPK media la proliferación celular inducida por TGF-β en estas células (Ghayor et al.,
2005). Por otra parte, estudios de otros compuestos naturales que estimulan la
diferenciación osteoblástica, como por ejemplo Balicaina, ha mostrado también un
aumento en la fosforilación de las vías de señalización MAPK, como ERK 1/2 (Kim et
al., 2008).
Para evaluar que este aumento inducido por andrografólido sea producto de la
activación de la vía ERK 1/2 o participe de manera indirecta a través de cross talk las
vías p38 MAPK o PI3K, se analizó mediante western blot la fosforilación de ERK 1/2 en
presencia de los inhibidores UO126 (inhibidor de la vía MEK1 y MEK2), SB203580
(inhibidor de la vía p38 MAP quinasa) y LY294002 (inhibidor de la vía PI3K) (Figura 11 ).
UO126 inhibe significativamente esta fosforilación indicando que andrografólido
mediante la activación de MEK1/2 fosforila a ERK 1/2. Sin embargo también se aprecia
una disminución estadísticamente significativa con el inhibidor LY294002, dejando entre
ver que la vía Akt podría estar participando río arriba de ERK1/2. El inhibidor SB203580
presenta una tendencia a la disminución la cual no es estadísticamente significativa.
Otros estudios realizados con cultivos de médula ósea han mostrado que la vía de
señalización de PI3-K es requerida por BMP para la inducción de la expresión de genes
osteoblásticos tempranos (Osyczka y Leboy, 2005). Asimismo, en células MC3T3-E1
estimuladas con epinefrina, se ha visto distintos roles para las vías MAP quinasa ERK y
p38, en donde ERK estaría involucrada en el control de la proliferación celular mientras
71
que la vía de p38 regularía la actividad de fosfatasa alcalina en respuesta a la
activación de receptores acoplados a proteína G (Suzuki et al, 1999).
Para confirmar si estas vías provocaban algún efecto sobre COX-2 se analizó la
expresión de la proteína mediante Western blot (Figura 12 ) y el RNAm mediante RT-
PCR en tiempo real (Figura 13 ). Ambos análisis se efectuaron en presencia o ausencia
de los inhibidores para p38 MAPK, ERK1/2 y PI3K. En los análisis de Westerm blot se
observó una disminución para el inhibidor UO126 y para el inhibidor LY294002, los
cuales no fueron estadísticamente significativos, en cambio, con el inhibidor SB203580,
si hubo una inhibición estadísticamente significativa (p<0.01), indicando un rol más
destacado para la vía p38 MAPK sobre la expresión de COX-2 en osteoblastos inducida
por andrografólido. Mediante RT-PCR en tiempo real, se pudo evidenciar que en
presencia de los tres inhibidores hay una disminución estadísticamente significativa
(p<0.05 y p<0.01), dejando entre ver que en estas células osteoblásticas, las vías ERK,
p38 y Akt posiblemente estarían participando en la regulación de los niveles de RNAm
de COX-2.
Una posible diferencia entre los resultados obtenidos en el Western blot y RT-PCR en
tiempo real, se puede deber a que los niveles de RNA mensajero a las 6 horas aún no
haya alcanzado su máximo umbral de transcripción provocando de esta manera que la
inhibición con UO126 y LY294002 fuera significativa. De otra manera, la sensibilidad de
ambos métodos puede ser un factor que esté influenciando dicho comportamiento
estadístico.
72
Algunos estudios demuestran que la vía ERK/MAPK activa y fosforila al factor de
trascripción RUNX2 el cual es el mayor regulador de la expresión de genes específicos
de osteoblastos (Ge et al., 2007; Franceschi y Xiao, 2003). Se ha visto también que la
activación de las vías MAPK, (ERK1/2, p38 y JNK/SAPK) aumentan la expresión de
COX-2 (Pratt et al., 2003).
Estudios en células óseas muestran que la estimulación mecánica lleva a la regulación
positiva de factores de crecimiento como es el factor de crecimiento de insulina (IGF) I y
II, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento transformante
β1 (TGF-β1), y proteínas morfogéneticas de hueso 2 y 4, los cuales actúan vía
mecanismos autocrinos y paracrinos, a través de sus receptores tirosina y
serina/treonina quinasa. Estos factores de crecimiento activan fosfoinositol 3 quinasa
(PI3K)-Akt, MAPK, y la vía de transducción de señales SMAD (Liedert et al., 2006).
Para evaluar el efecto de andrografólido a más largo plazo sobre los marcadores
osteogénicos, se realizó un análisis de viabilidad mediante citometría de flujo para
descartar un efecto citotóxico (Figura 14, 15, 16 ). Estos datos sugieren que períodos de
incubación de 10 días con andrografólido 100 µM, eleva de una manera esperable la
cantidad de células apoptóticas y necróticas (total de células apoptóticas y necróticas
10 a 15% aproximadamente). Por esto se prefirió utilizar una dosis menor para los
experimentos de ALP y mineralización para descartar la posible interferencia por
disminución de la viabilidad celular, ya que estudios en otras líneas celulares como por
ejemplo en células de hepatoma humano HepG2 han concluido que andrografólido
73
ejerce un efecto citotóxico, el cual es atribuido a la inducción del arresto de ciclo celular
por la alteración del estado redox en la célula (Li et al., 2007). En células de cáncer
humano colorectal LOVO también se ha visto que andrografólido produce una inhibición
del crecimiento celular por un arresto en la fase G1-S del ciclo (Shi et al., 2008). En
células de cáncer humanas, miembros de la familia pro apoptosis Bcl-2 (Bind y Bax)
serían las piezas claves en la transmisión de la señalización de muerte celular inducida
por andrografólido desde caspasa 8 hasta la mitocondria, llevando así a una eventual
muerte celular por apoptosis (Zhou et al., 2006).
El experimento realizado para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina en presencia
de andrografólido 10 y 50 µM (Figura 17 ) mostró que hay una disminución dosis
dependiente estadísticamente significativa (p<0.01). De esto se puede concluir que bajo
las condiciones experimentales utilizadas en este trabajo, andrografólido no estaría
aumentando los marcadores osteogénicos, por ende no estaría fomentando la
mineralización en cultivos osteoblásticos in vitro. Para corroborar ésto se realizó el
análisis de mineralización el cual mostró correlación con los datos obtenidos
anteriormente, observándose una disminución de manera dosis dependiente, la cual es
estadísticamente significativa p<0.01 (Figura 18 ).
Estos resultados podrían sustentarse con otros reportes que sugieren un posible cross-
talk entre las vías Smad y MAPK, modulando la regulación transcripcional de genes
blanco. En este sentido, Sowa et al. (2002) concluye en su estudio que TGF-β activa las
cascadas ERK 1/2 y JNK, y regulan negativamente la actividad transcripcional así como
74
la actividad de fosfatasa alcalina y mineralización, inducido por Smad3 en células
osteoblásticas de ratón. Nakayama et al. (2003) sugiere que la vía RTK-Ras-ERK
suprime la señal de BMP por interferir con la transactividad con Smad1. Kretzschmar et
al. (1997) y Higuchi et al. (2002) también sugieren que MAPK inhibe la señalización de
BMP evitando así la fosforilación de la proteína Smad1 y que la continua inhibición de la
vía de señalización MAPK promovería la diferenciación osteoblástica temprana y la
mineralización de la matriz extracelular. Por otra parte, Kono et al. (2007) sugieren que
la vía ERK regula negativamente la mineralización de la matriz tanto in vivo como in
vitro.
Diversos estudios sugieren que COX-2 es un poderoso modulador de la función celular
en el hueso y que su expresión es crítica en traumatismos (Leis y Windischhofer, 2008;
Xie et al., 2008; Gerstenfeld et al., 2003). La fosforilación de señales extracelulares
reguladas por quinasa (ERK) regula la expresión y fosforilación de factores de
transcripción de la familia fos y jun que controla la transcripción río abajo de genes
blancos con promotores que contienen sitios de unión a AP-1, así como también la
fosforilación de RUNX2 (Jansen et al., 2004). El gen promotor de COX-2 contiene cajas
canónicas TATA box y sitios de unión para varios factores de transcripción incluyendo
NF-kB, NF-IL6/C/EBP, PEA3, NFAT, CRE, AP-2 y SP-1 (Chun y Surth, 2004; Kosaka et
al., 1994).
Ante estos datos obtenidos de literatura, se evaluó el potencial efecto de andrografólido
sobre los factores de transcripción NF-κB y AP-1 en la línea celular osteoblástica
75
MC3T3-E1. Primero se realizó un análisis de western blot para la proteína IκBα, la cual
se encarga de secuestrar a NF- κB cuando está inactivo. El resultado obtenido en el
análisis de inmunodetección (Figura 19 ) mostró que a las 2 horas, la proteína IκBα
presenta una disminución notoria con respecto al control, sugiriendo que esta proteína
estaría siendo degradada para activar al factor de transcripción NF-κB que se estaría
translocando al núcleo. Para confirmar esto se realizó una inmunocitoquímica, en la
cual se marcó la proteína p65, la cual forma parte del factor de transcripción NF-κB.
Como se aprecia en la Figura 20, la localización del factor de transcripción está en el
citoplasma, y a medida que pasa el tiempo, se va translocando al núcleo viéndose más
claramente a las 2 horas. Estos datos apoyan a los experimentos realizados
anteriormente en el cual la proteína IκBα iba disminuyendo su presencia.
Este resultado muestra relación a su vez con el aumento de la expresión de la proteína
COX-2, ya que como se mencionó anteriormente, el gen contiene sitios de unión para
este factor de transcripción (Figura 6 ), sugiriéndonos que NF-κB al ser estimulado con
andrografólido tiene una participación en la expresión de la proteína COX-2. El rol de
COX-2 en la reparación de hueso ha recibido reciente atención, ya que fármacos que
inhiben la producción de prostaglandinas, han mostrado inhibir experimentalmente la
reparación de fracturas (Einhorn, 2002; Goodman et al., 2002), además la formación de
hueso en respuesta a la carga mecánica exógena, es dependiente de la síntesis de
prostaglandinas vía COX-2 (Chen et al., 2003).
76
El otro factor de transcripción analizado fue el heterodimero AP-1. La proteína AP-1, la
cual esta formada por las proteínas Fos y Jun, han sido implicadas en una amplia
variedad de procesos biológicos incluyendo diferenciación celular, proliferación,
apoptosis y transformación oncogénica (Suetsugu et al., 2007; Naito et al., 2004). En
osteoblastos la actividad de AP-1 puede ser inducida por TGF-β, por la hormona
paratiroidea y por 1,25-dihidroxi vitamina D, las cuales son potentes reguladores de la
diferenciación y proliferación osteoblástica (Wagner, 2002). Se sabe además que
señales extracelulares activan a esta proteína, siendo la familia de las MAPK una de
ellas. Las MAPKs son activadas por fosforilación en el citoplasma y translocan hacia el
núcleo, donde ellas inducen la fosforilación de factores de transcripción, co-activadores
y proteínas nucleosomales. Las vías de señalización MAPKs regula la actividad de AP-1
mediante el aumento de la transcripción y por la fosforilación de la proteína AP-1. La
proteína c-fos es expresada en niveles bajos o en niveles casi indetectables en la
mayoría de los tipos celulares, pero es rápida y transientemente inducida en respuesta
a varios estímulos como factores de crecimiento, y estrés ambiental y físico (Eriksson,
2005).
La cinética de expresión realizada a la proteína c-Fos (un componente del factor de
transcripción AP-1), mostró un aumento estadísticamente significativo (p<0.01) a los 30
minutos de estimulación (Figura 21 ), correlacionándose con el aumento visto en la
cinética de fosforilación de ERK, en donde su pico estaba alrededor de los 15 minutos
(Figura 10 ), además como el gen de COX-2 tiene sitios de unión para la familia de
factores de transcripción de la proteína AP-1 (Chen et al., 2003; Wadleigh y Herschman,
77
1999; Chun y Surh, 2004) (Figura 6 ), se sugiere que estas vías estarían estimulándose
de una manera secuencial al ser estimuladas con andrografólido.
Por otra parte estudios en otras líneas celulares revelan que andrografólido suprime la
migración quimiotáctica a través de la inhibición de la fosforilación de ERK 1/2 y Akt en
macrófagos pudiendo contribuir a la actividad anti-inflamatoria de andrografólido (Tsai et
al., 2004). Hay estudios que indican que andrografólido suprime la apoptosis celular
endotelial mediante la activación de la vía PI3-K/ Akt (Chen et al., 2007), y también de
que andrografólido interfiere con la activación de células T y reduce la encéfalo mielitis
autoinmune experimental en el ratón (Iruretagoyena et al., 2004).
Estudios de este laboratorio han mostrado que andrografólido inhibe la producción de
IL-2, aumentando la fosforilación de JNK y disminuyendo la fosforilación del factor de
transcripción NF-κB y la de la vía de señalización ERK1 y ERK5, sugiriendo además
que andrografólido a concentraciones 100 µM aumentaría la apoptosis temprana en
células Jurkat (Carretta et al., 2009).
Los resultados obtenidos de este trabajo, demuestran por primera vez que
andrografólido es capaz de estimular por sí solo la fosforilación de la vía MAPK ERK
1/2, siendo esta dependiente de la activación de MEK1/2. Además, esta vía tendría una
estrecha relación con la activación de los factores de transcripción NF-κB y AP-1 que
regulan la expresión de COX-2, sin embargo la participación de las vías p38 y Akt no
pueden ser excluídas de este fenómeno.
78
Bajo las condiciones de cultivo realizadas, andrografólido no fue capaz de estimular
marcadores osteogénicos como ALP ni provocar la mineralización de cultivos in vitro
siendo afectada posiblemente por un cross-talk con las vías de señalización de Smad o
por un posible efecto citotóxico causado por la cantidad de días a las que fueron
expuestas las células frente al fármaco. En la Figura 22 , se propone un posible
mecanismo por el cual andrografólido ejercería su efecto sobre la línea celular
osteoblástica MC3T3-E1. Como se aprecia en el esquema, andrografólido activaría la
vía Ras, fosforilando a MEK1/2 y este fosforila a ERK1/2 el cual transloca al núcleo
activando la transcripción de genes blancos como c-fos y c-jun, provocando el aumento
en la expresión de la proteína COX-2. También ERK1/2 podría estar actuando en la
translocación al núcleo del factor de transcripción NF-κB, o bien esto lo podría estar
ejerciendo alguna otra MAP quinasa, como por ejemplo p38. Por otra parte, estudios de
este laboratorio muestran que andrografólido no presenta cambios en la fosforilación de
Smad2/3, desconociéndose si afecta a otras proteínas de esta familia (Pérez, 2008).
Investigaciones de Nakayama et al. (2003) muestra que la vía RTK-Ras-ERK suprime la
señal de BMP por interferir con la transactividad de Smad1, señalando que la
fosforilación directa de Smad1 por ERK no es requerida para la inhibición de la
diferenciación osteoblástica y que otros factores, que son fosforilados por ERK,
posiblemente estarían envueltos en la regulación de la diferenciación. Suzawa et al.
(2002) sugiere que Ras, pero no PI3-K potencia la actividad transcripcional de Smad1 a
través de la activación de ERK, sin embargo la vía Ras támbien es activada por EGF, el
cual inhibiría la transactivación de Smad1 provocando así el efecto inhibitorio de la
diferenciación osteoblástica.
79
IkBα
Smad1
Apoptosis
c-junc-fos
ERK1/2
MEK1/2
Rasp38 y
otras kinasas
COX-2
p53 p65
p53 p65
ALP yfactores osteogénicos
Andrografólido
?
? ?
Núcleo
Célula osteoblástica
Figura 22. Esquema propuesto para el aumento de COX -2 en las células
MC3T3-E1 por andrografólido. Andrografólido actuaría vía Ras fosforilando a MEK1/2,
provocando así la subsiguiente fosforilación de ERK1/2, translocando éste al núcleo
activando la expresión del gen de COX-2.
80
Esto hace pensar en una posible interacción de andrografólido con Smad1 el cual
podría estar afectando la expresión de marcadores osteogénicos bajo las condiciones
experimentales realizadas. Otro factor que puede estar influenciando los marcadores
osteogénicos es el efecto pro-apoptótico que puede ejercer andrografólido debido a la
cantidad de días de exposición del fármaco frente a las células, el cual puede causar su
inhibición. De esta manera se deja una ventana abierta para investigaciones futuras, las
cuales pueden realizarse bajo condiciones experimentales distintas, considerando el
tiempo de exposición de las células frente al fármaco y las posibles interferencias que
pueden surgir frente a otras vías de señalización.
81
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