Dra. Mildred Jiménez

Mapeo Genético y Genoma Humano

2

Interrogantes

• Cantidad de genes• Localización de éstos en los 24 crms• Sus posiciones relativas• La distancia entre ellos

diagnóstico de enfconsejo genéticoinformación sobre enf

3

Mapeos Físicos y Genéticos

Mapeo Físico

• Asigna los genes a localizaciones particulares a lo largo de los crm

• Usa medidas que son el reflejo de la distancia física entre genes

• Baja resolución: Ubica los genes según las bandas citogenéticas

• Alta resolución: los ubica en distancias físicas: pb

4

Mapeo Genético

• Análisis de ligamiento (Linkage), para determinar la distancia entre genes

• Se basa en medir la frecuencia con la cual 2 genes permanecen juntos (ligados) durante las meiosis

5

Mapeo Físico de Genes Humanos

6

Genética en Células Somáticas

• Estudio de la organización, expresión y regulación del gen en células cultivadas de tejidos somáticos

• Ventaja de poder hacer crecer diferentes células indefinidamente

• Permite generar clones genéticamente idénticos a una línea determinada: LINEAS CELULARES

• Fibroblastos (biopsias de piel)

7

Mapeo por transferencia de Cromosomas

• Método que permite transferir segmentos o cromosomas de un donador a una célula receptora cultivada.

• “Correlacionando qué genes están presentes en una célula receptora cuando se han transferido cromosomas específicos o segmentos particulares de crm, se puede determinar la localización cromosomal de los genes transferidos.”

8

Hibridización de células somáticas

• Forma más común de transferencia cromosómica

• Híbridos de células somáticas: fusión de céls somáticas de ≠ especies

• Hombre y ratón

9

10

11

Paneles de mapeo de híbridos de células somáticas

• Variedad de híbridos Ho/ratón (por perdida de crms del Ho) ==> panel

• Se prueban los diferentes clones buscando presencia o ausencia de un gen humano y se relaciona con ausencia o presencia de un crm

• Ej: Tay-Sachs, gen para la hexosaminidasa A y crom 15

12

PCR +

13

Mapeo del gen para una región específica del cromosoma

• Realizar híbridos con cromosomas portadores de translocaciones o deleciones

==> gen en esa porción de cromosoma

14

DMD, Enf Granulomatosa crónica, Retinitis pigmentosa, Def de glicerol quinasa, hipoplasia adrenal congénita

15

Mapeo por irradiación de híbridos

• Habilidad de los rayos X de crear cortes en la doble hélice de ADN

• “Entre más cercanos estén dos genes entre ellos, menor es la probabilidad de que se separen por un corte por rayos X”

• Análisis estadístico

• Variaciones en dosis de rayos X

16

Mapeo por dosificación genética usando céls del px

• Dosis en productos de los genes que se encuentran en dosis variables:– Crms 21, X…– Monosomías– Trisomías parciales

17

Mapeo por FISH

• Permite visualización directa de la posición del gen

• Regiones de 1-2 millones de pb (cromatina condensada)

18

Mapeos Genético (ligación)

19

Linkage

“Tendencia de los alelos cercanos en un mismo cromosoma a transmitirse juntos, como una unidad intacta, durante la meiosis”

• Utiliza estudios familiares

• No requiere de FISH ni de hibridizaciones

• Único método que permite el mapeo de genes, incluyendo genes causantes de enf, detectables solamente como rasgos fenotípicos

• La mayoría de los genes generadores de enf genéticas caen estan dentro de esta categoría, ya que ni su bioquímica ni sus bases moleculares se han elucidado aún

El Análisis de ligamiento es la base del mapeo genético.

Si un par de genes está localizado en el mismo cromosoma, entonces están físicamente ligados y por lo tanto se heredarán juntos.

Haplotipo: grupo de alelos de loci íntimamente ligados que se encuentran en un individuo y que se heredan como una unidad.

Experimentos de cruces genéticos: muy pocos pares de genes muestran un ligamiento completo, Ligamiento parcial: algunas veces se heredan juntos y otras no.

Explicación: comportamiento de cromosomas durante la MEIOSIS.

Durante la meiosis I, cada cromosoma se alinea con su homólogo para formar un bivalente que contiene 4 copias (se distribuirá 1 por gameto).

Dentro del bivalente, los brazos del cromosoma (las cromátidas) pueden sufrir rompimientos físicos e intercambio de segmentos de ADN.

Este proceso se conoce como RECOMBINACIÓN

Recombinación

Intercambio de material genético

entre cromosomas durante la meiosis por la formación de enlaces físicos entre cromáticas no-hermanas (quiasmas).

Cromosomas parentales en hijos nunca son exactamente iguales a los cromosomas parentales heredados: variación entre individuos.

Existen puntos calientes (hot spots) de recombinación.

Del ligamiento parcial al Mapeo

Dos genes que están cercanos serán separados menos frecuentemente por recombinación que dos genes lejanos entre sí (estos últimos pueden comportarse como si estuvieran en cromosomas diferentes si están lo suficientemente separados)

La frecuencia con la que los genes son desligados por recombinación será directamente proporcional a la distancia que los separa en el cromosoma.

La Frecuencia de Recombinación es por lo tanto una medida de la distancia entre dos genes.

Construcción de Mapas a base de frecuencias de recombinación.

26

Si un marcador y la enfermedad se heredan juntos, la hipótesis es que están tan cerca que se heredan ligados

“A menor frecuencia de recombinación, más cercanos se encuentran los loci”

Construcción del Mapa

Genes Frec. de Recombinaciónm Entre m y v: 3.0%

v Entre m y s: 33.7%

w Entre v y w: 29.4%

s Entre w y s: 1.3%

s w v m

0 1.3 30.7 33.7

Mapa genético

Muestra el orden lineal de los genes a lo largo del cromosoma con las distancias entre genes adyacentes proporcional a la frecuencia de recombinación entre ellos. También son llamados mapas de ligamiento, mapas cromosómicos.

La unidad de distancia en un mapa genético se llama Unidad de Mapa: 1% de recombinación

Una unidad de mapa también es llamada Centimorgan (cM)

Ejemplo: dos genes que se recombinan con una frecuencia de 3.5% están separados por 3.5 unidades de mapa, o 3.5 cM

Físicamente 1 unidad de mapa se define como la longitud del cromosoma en la cual, en promedio, se forma 1 entrecruzamiento en cada 50 células que sufren meiosis.

Análisis de ligamiento: cruces dirigidos.

Se basa en el análisis de la progenie de cruces experimentales realizados entre padres de genotipos conocidos.

Se usan especies manejables, con ciclos de vida cortos.

Determinación del genotipo de gametos es posible pero laborioso y altamente complejo.

Se utilizan los cruces de prueba.

Doble heterocigota x doble homocigota: AaBb x AAbb

Análisis de ligamiento: análisis de genealogías.

En humanos no se pueden hacer cruces dirigidos.

Estudio de genealogías que presentan alguna enfermedad (fenotipo diferencial): casi siempre son imperfectas.

Análisis estadístico mediante Lod Score: Logarithm of the Odds (Log de la probabilidad) de que dos genes estén ligados.

Idealmente se deben usar varias genealogías para incrementar la significancia.

El análisis es menos problemático para familias con alto número de hijos y, preferiblemente, con tres generaciones disponibles.

Cómo se mide la distancia genética

Dos loci: están ligados?

1. Determinar la fracción de recombinación (θ) entre ambos loci: Si θ difiere significativamente de 0.5 implica ligamiento

completo Si es igual a 0.5 implica desligamiento completo

2. Determinar si una desviación de 0.5, si existe, es realmente significativa utilizando una herramienta estadística conocida como likelihood odds ratio: se examinan un grupo de datos familiares contando el número de hijos que muestran o no recombinación entre los loci.

Se calcula la probabilidad de observar datos en varios valores posibles de θ variando entre 0 y 0.5. Se calcula la relación:

Log10 Probab. de los datos si los loci están ligados : Lod Score (Z) Prob. de los dados si los loci no están ligados

• Si Z <1 ==> pocas probabilidades de ligación

• Si Z > 1 ==> los loci están ligados

• Z ≥ + 3 ==> evidencia definitiva de que los loci están ligados

EjemploEj. RP9: Retinitis Pigmentosa (D y d)

Dos loci A y B

1. Se estudia transmisión en genealogía, D podría estar ligado a B, pero no a A.

2. Se determinan parentales yrecombinates, y se calcula θ

entre D y B.3. Se calcula el Lod Score: 1.81.

Conclusión: Hay ligamiento entre D y B y no entre D y A, pero se deben estudiar familias más grandes, más familias.

34

Heterogeneidad de locus: síntomas clínicos idénticos pero causados por 2 o más loci

genéticos

El Proyecto Genoma Humano

Secuenciación del genoma humano 1990-2003 (borrador), 2006 (secuencia final).

Objetivos: Identificar todos los genes en el genoma humano. Determinar la secuencia de 3 billones de pb del genoma humano. Almacenar la información en bases de datos. Desarrollar y mejorar herramientas de análisis de datos. Análisis de la información del genoma (Expresión, Proteómica).

Análisis de la información: Complejidad y Volumen: se requieren tecnologías a escala genómica para el

análisis de datos, comparaciones con otros genomas, comparaciones entre familias génicas, etc.

Algunos puntos importantes

Estudio de genomas: necesario la secuenciación.

La secuenciación de moléculas de ADN tenía una limitación: fragmentos de ~ 750 pb.

La secuencia de una molécula larga debía ser construida de una serie de secuencias más pequeñas.

El método de escopeta (Shotgun method)

Método de escopeta

Dos limitaciones

1. El análisis de datos se vuelve extremadamente complejo conforme se incrementa el número de fragmentos (n fragmentos tienen 2n2-2n traslapes).

2. Secuencias repetitivas pueden generar errores.

El método de escopeta como único método de secuenciación es apropiado sólo para genomas pequeños (procariotas).

Para genomas grandes: generación de un Mapa Genético como guía.

Utilidad del genoma: el reto de la Biología

Determinar el número de genes, localización y función. Regulación génica. Organización de la secuencia del ADN. Estructura cromosómica y organización. Tipos de ADN no codificante, cantidad, distribución,

contenido de información y función. Coordinación de la expresión génica, síntesis de proteínas y

eventos post-traduccionales. Interacción de proteínas en máquinas moleculares complejas.

Utilidad del genoma: el reto de la Biología

Función génica predicha vrs determinada experimentalmente. Conservación evolutiva entre organismos. Proteomas (contenido proteico total y función) entre

organismos. Correlación de SNPs con salud y La Enfermedad. Predicción de susceptibilidad a enfermedades basada en

variación en la secuencia. Genes involucrados en rasgos complejos y enf. Multigénicas. Genética y genómica del desarrollo.

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano?

Algunos hallazgos:

• El genoma humano contiene 3 mil millones (3 billones) de pares de bases (A, C, T y G)

• Un gen consiste en promedio de 3000 pares de bases, pero los tamaños varían mucho

• El número total de genes se estima alrededor de 30 000 --- mucho menor que las estimaciones previas de 80.000 a 140.000----

• Casi todas las bases (99,9%) de nucleótidos son exactamente las mismas en todas las personas

• Las funciones son desconocidos para más del 50% de los genes descubiertos

•Presencia de regiones de genes densas (ricos en G y C), regiones de genes pobres (ricas en A y T ). Estas regiones suelen ser visibles a través de microscopio en forma de bandas claras y oscuras en los cromosomas.

• Los genes parecen estar concentrados en áreas al azar a lo largo del genoma, con vastas extensiones de ADN no codificante entre ellos.

• Repeticiones de C y G de hasta 30.000 pb a menudo se presentan junto a genes, formando una barrera entre los genes y el "ADN basura". Estas islas CpG se cree que ayudan a regular la actividad de los genes.

• El cromosoma 1 tiene la mayoría de los genes y el cromosoma Y tiene el menor número

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano?

• Menos del 2% del genoma codifica por proteínas

• Secuencias repetidas que no codifican por proteínas, en al menos el 50% del genoma humano

• Las secuencias repetitivas: se cree que no tienen funciones directas, sino que intervienen en la estructura y dinamica del cromosoma. Con el tiempo estas repeticiones remodelar la organización del genoma, creando nuevos genes, modificando y reorganizando genes existentes.

• El genoma humano tiene mas cantidad de secuencias repetitivas que otros organismos como: planta de mostaza (11%), gusano (7%), la mosca (3%).

¿Qué nos dice el proyecto de Genoma Humano?

Organismo Tamaño genoma (pb)

Genes estimados

Humano (Homo sapiens) 3 billion 30,000

Ratón (M. musculus) 2.6 billion 30,000

Planta de Mostaza (A. thaliana)

100 million 25,000

Nemátodo (C. elegans) 97 million 19,000

Mosca de la fruta (D. melanogaster)

137 million 13,000

Levadura (S. cerevisiae) 12.1 million 6,000

Bacteria (E. coli) 4.6 million 3,200

Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)

9700 9

Algunos animales cuyos genomas ya han sido secuenciados

HapMapAn NIH program to chart genetic variation

within the human genome

• Iniciado en 2002, el proyecto para construir un mapa de los patrones de SNPs que se producen en las poblaciones de África, Asia y los Estados Unidos

Consorcio de investigadores de seis países

Identificación de las regiones de ADN asociados con enfermedades complejas comunes Mapa útil para comprender cómo la variación genética contribuye a las respuestas en los factores ambientales

Beneficios Potenciales de la Investigación Genómica

Medicina Molecular

Genética Microbiana

Evaluación de Riesgos y Susceptibilidad

Bioarqueología, Antropología, Evolución y Migración Humana

Estudios forenses

Agricultura, Ganadería y Bioprocesos

Implicaciones éticas, legales y sociales

•Privacidad y confidencialidad de la información genética

•Dueños del genoma??? Patentes

•La equidad en el uso de la información genética. Ej: aseguradoras, patronos, tribunales de justicia, escuelas, agencias de adopción, abogados, militares, entre otros

•El impacto psicológico, la estigmatización y la discriminación debido a las diferencias genéticas de un individuo

•Reproducción: el consentimiento informado, toma de decisiones en materia reproductiva

•Clínica: la formación de los médicos y otros proveedores de servicios de salud, control y seguimiento de personas identificadas con trastornos genéticos y en general acerca de las capacidades, limitaciones y riesgos sociales.