TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN BIOTECNOLOGIA

WU~ACTERIZACI~N E IDENTIFICACI~N BIOQUÍMICA DE UN PRODUCTO DE FERMENTACI~N SÓLIDA, CON ACTIVIDAD

PROBI~TICA

PRESENTA

Q. F. B. Marcos Meneses Mayo. i

Director de Tesis: Dr. Gerardo Saucedo Castakieda. Co-asesor: Dr. Gustavo Viniegra González. Asesor Externo: Dr. Angel Rafael Trigos Landa.

AGRADECIMIENTOS:

A Dios:

Por permitirme relizar una meta más en este maravillo mundo.

A mis padres y hermano: I

CON EL CARIÑO DE SIEMPFE, agradeciendo el milagro de mi existencia Y sobre todo por creer en mi en cada una de las metas que he logrado.

I

A mis compañeros de la planta piloto 4 de biotecnología:

Alex, Martha, Jesús, Luciano, Tank, Cristobal, Araceli, Gerardo, Rosario, I nes.. . . . . . . . . . Por su apoyo y compañerismo durante mi estancia en esta universidad.

A mis asesores de tesis:

Dr. Gerardo Saucedo Castaheda Y Dr. Gustavo Viniegra González, agradeciendo su guia en este estudio y sobre todo por compartir SUS conocimientos en mi formación profesional.

Muy especialmente al Dr. Angel Rafael Trigos Landa

Por compartir esta experiencia de investigación, agradeciendo las atenciones que se brindaron en el laboratorio de Biotecnología y productos naturales de la Universidad de las Américas Puebla.

AI Grupo de investigación de la planta piloto 4 de biotecnologia:

Dr. Ernerto Favela Torres Dr. Mariano Gutierrez Rojas Dr. Sergio Huerta Ochoa

Agradeciendo su apoyo y momentos compartidos en este laboratorio de investigación.

Contenido I

CONTENIDO

Contenido Indice de Figuras Indice de Tablas

l. INTRODUCCION

2. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS

2. l. Fermentación sólida (es)

2.1.1. Ventajas y desventajas 2.1.2. Sustratos y microorganismos empleados

2.2. Pasta de copra

2.2.1. Produccih mundial de la pasta de copra

2.3. Probióticos

2.3. l . Importancia en la nutrición animal 2.3.2. Importancia industrial 2.3.3. Probióticos comerciaies en M&co

2.4. Rumiantes

2.4.1. Deftnición y clasfJ2cacfdn 2.4.2. Anatomía del conducto gastrointestinal de los rumiantes 2.4.3. Acidosis en rumiantes 2.4.4. Microorganlsmos ruminales y su entorno ambiental

i VI vi11

1

5

6

6 7

0

10

11

12 14 15

17

17 18 19 20

3. OBJETIVOS

Contenido I

23

3. l . Objetivo general 24

3.2 Objetivos específicos 24

4. MA”ERIALES Y MÉTODOS‘

,

35,

4.1. Microorgclnismos empleados 27

4.1.1. Conseroaciór y reactivación de cepas

4.2. Medios de cultivo u

4.2. l . Medio de cult ivo para hongosJlamentosos y levaduras 4.2.2. Medio de culiivo para microorganisrnos anaerobios

I

4.3. Materias primas y sustratos utilizados

4.4.Condiciones de cultivo en columnas de fermentación con aireación forzada y difusión simple

4.5 Tratamiento de muestras de productos obtenidos por FS I

4.5. l . Preparación de probióticos comerciales y productos de FS

4.5.2. Técnica de ultraJltraclón para el análisis de actividad probiótica

4.6. Evaluacidn de la actividad probiótica

4.7. Tratamiento de muestras realizado para probar el efecto probiótico

28

29

29 30

33

33

36

37

39

40

40

41

4.8.1. Conteo de esporas 4.8.2. pH 4.8.3 Nrdida de materia seca (PMS) 4.8.4 Actividad de q u a (awl 4.8.5. Humedad 4.8.6. Biomasa (Densidad óptica) 4.8.7. Biomasa (Peso seco) 4.8.8 Acid0 L-LCictico 4.8.9. Acidos gmsos volátiles 4.8.1 O AAncilisis de gases (Metabolímetro)

41 42 43 43 44 44 45 46 47 49

, 4.9. Identificación química de compuestos 49

4.9.1. Extracción con disolventes de diferente polaridad 50 4.9.2. Purificación de compuestos 52 4.9.3. Identflcactón de compuestos 55

5. RESULTADOS Y DISCUSION 56

5.1. Adaptacion y crecimiento de cepas de hongos fllrunentosos 67 en dos medios de cultivo (PDA y PCS)

5.1.1. Crecimiento radial en caja petri con medios 57

5.1.2. Crecimiento axial en columnas de FS, empleando 59 .

5.1.3. Comparación de la velocidad crecimiento axial y radial 61 5.1.4. Produccidn de biomasa en caja petri 63 5.1.5. Isoterma de adsorción de agua 64 5.1.6. Conclustones y discusión 65

PDA Y PCS

dijisidn simple

5.2. Fermentación sdlida 66

5.2.1. Resultados de la FS a dlferentes porcentajes de humedad 66 5.2.2. Resultados de la FS con cepas de hongosflamentosos y 67

levaduras S

Contenido IV

5.2.2.1. Análisis de gases 5.2.2.2. Producción instantánea de COZ con l a s cepas de

estudio 5.2.3. Conclusiones y discusión

5.3. Evaluación de la actividad probiótica de Productos comerciales con productos de F!3

5.3. l . Evolución deZ pH 5.3.2. Producción de biomasa 5.3.3. Consumo de ¿ícid0 láctico 5.3.4. Producción de ácidos grasos volátiles 5.3.5. Balance de materia 5.3.6. Conclusiones y discusión

5.4. Evaluacion de la actividad probiótica de extractos Obtenidos con diferentes disolventes

5.4. l . Extracción 5.4.2. Producción de biomasa 5.4.3. Evolución de pH 5.4.4. Consumo de ácid0 láctico 5.4.5. Producción de ácidos grasos volátiles 5.4.6. Balance de materia 5.4.7. Conclusiones y discusión

5.5. Evaluación de la actividad probiótica de fracciones obtenidas del extracto acuoso

5.5.1. Fraccionamiento en columna del extracto acuoso 5.5.2. DosiJcación para la evaluacih de fracciones obtenidas

del extracto acuoso

68 68

73

74

74 75 79

82 84 86

00

88 89 90 91

92 92 94

95

95 96

contenido v

5.5.3. Producción de biomasa 5.5.4 Evolución del pH 5.5.5. Consumo de k f d o ltictfco 5.5.6. Ptoducción de cicfdos grasos uolcítlles 5.5.7. Conclusiones y discusi6n

5.6. Identiíicación química de compuestos provenientes de la fracción 5 del extracto acuoso

5.6.1. Identtflcación de compuestos 5.6.2. Conclusiones y discusión

6. CONCLUSIONES y PERSPECTIVAS

7. BIBLIOGRAFIA

98 99 100 1 o1 102

104

104 1q6

110

113

8. ANEXOS 123

INDICE DE FIGURAS

Contenido

Figura 4. l. Estrategia experimental 26

Figura 4.2. Columnas tipo Raimbault con o sin dispositivo para medir gases 33

Figura 4.3. Dispositivo empleado para la evaluacibn del crecimiento axial . .. . 35

Figura 4.4. Dispositivo utilizado en la fermentación en medio s6lido 36 conectado aun metabolímetro

Figura 4.5. Tratamiento de muestras de productos obtenidos por FS 37

Figura 4.6. Preparaci6n de probi6ticos comerciales y productos de FS 38

Figura 4.7. Esquema del tratamiento de muestras provenientes del 41 cultivo con M.eZsdenti para la evaluaci6n de la actividad probi6tica

Figura 4.8. Curva patr6n de conversi6n de densidad 6ptica (DO) a concentraci6n de biomasa (en peso seco)

45

Figura 4.9. Extracci6n con disolventes 51

Figura 4.10. Crornatografia en columna gravitatoria 54

Figura 5.1. Crecimiento radial en medio PDA

Figura 5.2. Velocidad de crecimiento radial en medio PCS

57

50

Ngura 5.3. Velocidad de crecimiento axial en columnas de fermentaci6n 60

Figura 5.4. Velocidad de crecimiento radial en un cultivo de 120 h a 30" C 61

Figura 5.5. Velocidad de crecimiento axial en un cultivo de 180 h a 30" C 62

Ngura 5.6. Cuantlficaci6n de biomasa en dos medios de cultivo 63

Figura 5.7. Isotenna de adsorci6n de agua 64 \

Figura 5.8. GrMcos representativos de a n a s i s de gases en FS 69

Figura 5.9. Producci6n instanUinea de COZ con diferentes microorganismos 70

Figura 5.10. Producci6n total de COZ de las cepas probadas en ... ....... 71

Figura 5.1 1. Evoluci6n del pH durante el cultivo de M elsdenli con 74 Merente producto probi6tico y de FS

Figura 5.12. Producci6n de biomasa con probi6ticos comerciales.. . . . 76

Contenido VII

Figura 5.13. Producci6n de biomasa con productos de FS 77

Figura 5.14. Comparaci6n de la producci6n de biomasa de 3 productos.. . 78

Figura 5.15. Consumo de &ido fictico al adicionar al cultivo de.. ... Figura 5.16. Consumo de &cid0 l&ctico al adicionar al cultivo de 1W.elsdenil

Figura 5.17. Comparaci6n del. consumo de &cid0 lActico al adicionar

Figura 5.18. Concentraci6n~de 'biomksa de extraLtos obtenidos

3 productos de FS y 2 productos comerciales

con disolventes de distinta polaridad

Figura 5.19. Evoluci6n del pH en el cultivo de M. elsdenll adicionado ,

con extractos obtenidos con disolventes de diferente polaridad

Ngura 6.20. Consumo de &ido l&ctico de extractos obtenidos con disolventes de diferente polaridad

Figura 5.2 1. Secuencia de los 'raccionamientos obtenidgs de un .. .......

80

80

81

89.

90

91

96

Figura 5.22. Producci6n de bic masa por adici6n de fracciones.. . . . . . . 99

Figura 5.23. Evoluci6n del pH durante el cultiyo de M. elsdenU .. ... .. ... 100

Ngura 5.24. Consumo de &cid0 lactico durante .......... 101

Figura 5.25. Estructura química del manitol 105

Ngura 5.26. Espectro de FMN lH del manitol 107

Ngura 5.27. Espectro de RMN13C del manitol

F'igura 5.28. Espectro DEPT del manitol I

108

109

Contenido v l l l

1

t I 1 ! 1

INDICE DE TABLAS.

Tabla 2. l. Principales microorganismos utilizados en procesos de FS . 8

Tabla 2.2. Composici6n de la pasta de copra 9

Tabla 2.3. Producci6n mundial de las siete principales oleaginosas. 11

Tabla 2.4. Probi6ticos comerciales en MCxico.

Tabla 2.5. Condiciones ambientales del rumen .

Tabla 2.6. Principales microorganismos que habitan en el rumen agrupados según el sustrato que fermentan.

16

21

22

Tabla 4. l. Cepas empleadas durante el proceso de FS 27

Tabla 4.2. Composici6n del medio de cultivo para la propagaci6n

Tabla 4.3. Solución de sales para el medio de M.eZsdenii Tabla 4.4. Características de los disolventes utilizados

de M. elsdenii. 32

32 51

Tabla 5. l. Valores iniciales y Anales de los parbetros evaluados a diferentes 67 porcentajes de humedad en un proceso de FS con la cepa de A. oryzae 2094

Tabla 5.2. Comparaci6n de parbetros Anales de las FS con distinta cepa 72

Tabla 5.3. Porcentaje de Acidos grasos producidos al final del cultivo de 33 h. 77 adicionando 2% de probi6ticos comerciales, productos de FS o testigos.

Tabla 5.4. Coeficientes estequiomktricos en base al carbono al final del .. .... 85

Tabla 5.5. Porcentajes de AGVs al final del cultivo de 40 h 92

Tabla 5.6. Coeficientes estequiomktricos en base al carbono al final del ... 93

Tabla 5.6a. Coeficientes estequiomktricos en base al carbono al final del ... 93

Tabla 5.7. Fracciones agrupadas obtenidas del extracto acuoso 95

Tabla 5.8. Dosificaci6n de fracciones en el cultivo de M. elsdenil 97

Tabla 5.9. Producci6n de Acid0 acktico por adici6n de fracciones.. . . . . . 102

Tabla5.10. Asignaci6n de la señal de RMN 1% del manitol 106

XNTRODUCCION

1

1. INTRODUCCION

Los avances científ'icos realizados en el desarrollo de la alimentaci6n para animales durante últimos 20 años ha llevado a que una gran variedad de materias primas vegetales se hayan incorporado a la alimentacibn animal, haciendo de este un alimento balanceado compuesto a base de concentrados protCicos, granos de cereales, forrajes, pajas y rastrojos así como subproductos vegetales, entre otros (Wilson, 1.983 y Flores- Menkndez, 1989).

Uno de los factores determinantes que ha impulsado a establecer nuevas estrategias de alimentaci6n animal ha sido el crecimiento de la poblaci6n; la cual exige a los productores de ganado, avicultores, porcicultores y criadores de diversas especies animales de importancia para consumo humano, obtener prc)ductos de mejor calidad y mayores rendimientos en los animales que lo consumen. En respuesta a esta problemiitica actualmente se buscan alternativas biotecnol6gicas que permitan obtener productos de alta calidad sin que se alteren los sistemas ecol6gicos, como es el caso de la fermentaci6n s6lida (m), en la cual se utilizan productos de deshecho, sustratos agrícolas o residuos poco valorizados, obteniendo de ellos productos de alto nivel comercial como actdo cítrico, Acid0 gAlico, penicilina entre otros metabolitos secundarios (Barrios, et a l . 1988 y 1990; Ralmbault, 1980; Hang y Woodadams, 1987).

Por otra parte en el sector pecuario se estAn aplicando productos derivados de la biotecnología, dando lugar al uso de organismos específicos para prop6sitos especializados basados en el aislamiento de microorganismos de su habitat natural (Flores y Garcia, 1995), contribuyendo en mejores rendimientos en came y leche. Por ejemplo Williams, et a l , en 1991 reportan resultados satisfactorios en la produccidn de 4.1 @/día de leche en vacas.

En este sentido dentro del grupo de mlcroorganismos especificas encontramos a los probi6ticos, que son microorganismos y / o sustancias que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal. Los primeros cultivos microbianos utilizados como probi6ticos datan de principios de siglo con las investigaciones de Metchnikoff en 1907 sobre la longevidad de los habitantes de los países búLgaros debido a los altos consumos de leche fermentada con microorganismos como Lactobacllus ucfdophLlus (Hoyos y Cruz, 1990).

Posteriormente Lilly y Stillwell en 1965 utilizan el tCrmino "probibtico" para describir sustancias producidas por un protozoario que estimulaba el crecimiento de otros microorganismos. Actualmente dentro del grupo de microorganismos con actividad probi6tica se incluyen bacterias lActicas, hongos y levaduras, destacando su uso cepas de Saccharomyces cereutsiae y Aspergillus oryzae (Campos y Viniegra, 1994; Nisbet y Martin.1993). Estudios de Tapia, et al. en 1988 evaluaron la actividad probi6tica para rumiantes con cepas de Aspergillus niger, Mchoderma haniunum y Penicillium sp.

En este contexto se propone una alternativa de alimentaci6n animal, mediante el uso de un residuo agroindustrial la pasta de copra, ya que CE recientes estudios se ha utilizado como complemento nutritivo en rumiantes y en este sentido se busca ser aplicado como sustrato de F S , ya que podría ser enriquecido en proteina y simultheamente producir sustancias probi6ticas que posteriormente se emplearían en cantidades minimas en forrajes para la alimentaci6n animal (Roussos, et al. 1994; Pineda y Perez, 1996).

Con este propbsito el presente estudio evalu6 la actividad probi6tica de productos obtenidos por FS empleando como microorganismo modelo la bacteria mminal Megasphaera elsdenli (Ramirez-Islas, 1995), simultAneamente se realizaron estudios químicos para la elucidaci6n de compuestos responsables del efecto benCAco mediante el uso de tecnicas cromatograficas en capa fina, extracciones con disolventes de diferente polaridad, fraccionamiento en columnas de silica y la tdentiflcaci6n de molCculas mediante el empleo del equipo de resonancia magnCtico nuclear (RMN), Trigos, et al.1995; Herrera, 1997).

A s í al utilizar esta tecnología para producir probi6ticos vía F S , el concepto probi6tico continuar& aumentando debido a la lnvestigaci6n bAsica en este campo ya que en estudios realizados al respecto se ha demostrado que la adíci6n de cultivos de hongos, levaduras y bacterias productoras de Bcidos incorporadas a las dietas de animales domksticos puede alterar los patrones de su poblaci6n microbiana, ya sea que se trate de aves o de mamíferos j6venes (Soeyenbos, 1984).

3

Por otra parte el alcance que tiene este estudio es contribuir a la idenMcaci6n de los compuestos responsables del efecto probi6tico de cultivos obtenidos por F S , ya que hasta el momento no se tiene in.formaci6n precisa sobre la naturaleza de las mol&ulas, enzimas, metabolitos u 0t.m materia que este presente en el aditivo "probi6tico", esperando obtener mayor informaci6n si se realizan a futuro estudios de ingeniería genttica y quimica en donde se detecte esta capacidad para evaluar su potencial (Fuller, 1989).

4

ANTECEDENTECEDENTES BIBLIOGW~FICOS

5

2. ANTECEDENTES BIBUOORAFICOS

2.1. Fermentaci6n S6Uda m)

La F’S se define como un tipo de cultivo que emplea sustratos s6lid0s (bagazo, pasta de copra, residuos de cafe etc.), los cuales son materiales que retienen agua, son porosos y a partir de ellos se obtiene productos de inter& comercial. Este sistema es considerado como una tecnología innovadora, limpia y con poco impacto sobre el medio ambiente. Esta tecnologia es prometedora y en diversas partes del mundo tratan de desarrollar procesos empleando nuevas materias primas que sean transformadas en productos interesantes, adem6.s de ofrecer grandes ventajas como las que se muestran en la Secci6n 2. l. 1 (Mudgett, 1986; Hesseltlne, 1987)

2.1.1. Ventajas y desventajas

d Los sustratos s6lidos pueden requerir solo la adici6n de agua, aunque pueden aiiadirse tambien algunos nutrlentes.

d El bajo contenido de humedad reduce los problemas de contamlnacibn.

d Las condiciones del crecimiento flingico son similares a las de su hhbitat n a t u r a l .

4 La aireaci6n es facilitada por los espacios entre las partfculas del sustrato.

d El fermentado s6lido puede extraerse inmediatamente por adici6n directa de disolventes o mantenithdolo en congelaci6n antes de la extraccicjn.

d Los productos obtenidos pueden incorporarse directamente en el allmento de animales.

6

Desventajas:

Las fermentaciones con agitaci6n pueden involucrar altos requerimientos energ6ticos y daños al micelio.

La cantidad de in6culo puede ser grande y para su prodlucci6n deben mantenerse condiciones de asepsia rigurosa.

X Problema de Hrdida de humedad para l a s fermentaciones de larga duraci6n.

$( Elevaci6n excesiva de la temperatura.

X Dificultad en la regulaci6n de los partimetros de cultivo.

Por otra parte los procesos de F'S se vienen implementado desde tiempo aMs, por ejemplo, el caso particular de los quesos madurados en Francia. Actualmente se aplica para obtener alimentos fermentados, producir de enzimas, metabolitos secundarios, &idos orghicos, producci6n de alcohol, entre otros (Saucedo- Castañeda, 1991; Lonsane, et al. 1991).

2.1.2. Sustratos y microorganismo8 empleados

Lo soportes empleados comúnmente deben tener la particularidad de absorber los nutrimentos que se encuentren en soluci6n por ejemplo amberlita, vermiculita, esponja, poliuretano entre otros. TambiCn, es posible utilizar residuos agroindustriales como bagazo de caña, pulpa de cafe, pasta de copra (Barrios, et al. 1988; Auria, et al. 1990; Saucedo, et al. 1991).

Los microorganismos empleados en este tipo de proceso son muy variados, y según su actividad bioldgica se pueden aplicar a distintos campos de la investigaci6n como se aprecia en la Tabla 2. l.

7

Tabla 2.1. Principales microorganismos utilizados en procesos de FS.

secundarios AsmiUus niger Acidos orghicos Raimbault, 1980

SQccharwrryces sp Producci6n de alcohol Gibbons y Wetsby, 1988

AspergUrUs oyzae Suplemento para Huber, 1991

2.2. Pasta de copra

De la palma del coco [Cocus nucífera ) se obtiene la copra que es el nombre comercial que se le da al residuo del albumen del h t o de la palma del coco, que se obtiene al cortar a la mitad dicho fruto, extrayendo el líquido que contiene. Posteriormente, se asolea por varias semanas, hasta que alcanza un grado de humedad aproximado del 10%. determinado por los productores de copra por el olor, color, textura y sabor característicos. El producto obtenido se somete a un proceso industrial ya sea por prensado, vfa enzimAtica o por la adlci6n de disolventes, obteniendose dos productos principales: aceite de coco v msta de cog= (Agullar y Rueda, 1980; Flores-Menendez, 1989).

Dada la composici6n de la pasta de copra resulta ser un alimento proveedor de proteinas importantes para la alimentaci6n animal que podría ser utilizado en procesos de FS, (Flores y Garcia, 1995), obteniendo un material rico en azúcares y con bajo contenido de grasas dependiendo de la extracci6n utilizada (Fernhdez, 1987).

8

Antecedentes B i b U o g ~ c m s

En la Tabla 2.2 se aprecia que el aporte principal de este producto es la proteína (20%), y los carbohidratos ( 16.5%). por esto es aconsejable su uso como sustrato para la F S , adem& de que aportaria a la proteína como un subproducto obligado, y posiblemente la formaci6n de metabolitos que sean m& digeribles para el animal que lo consume.

Por otra parte dentro del grupo de aminocicidos esenciales de importancia se encuentran la arginina, fenilalanina, Usina e histidina, los cuales pueden ser utilizados por los microorganismos durante la FS y desdoblar a compuestos m& simples, enriqueciendo de esta forma el fermentado; de igual forma no sería necesario agregar fuente de carbono externa a la FS ya que la cantidad de azúcares solubles de la pasta de copra lo aportaría.

m

. Tabla 2.2. Composici6n de la pasta de copra (Maisons, 1991).

COMPONENTE It PORcENTAfE I#

Proteína 20 carbohidratos 16.5

A r m a 2 2 6 Feniialanina 0.78 I

Lisina 0.54

Histldina 0.36

Minerales 9.63

Glucosa 9.16

Humedad 7.0 1

Grasa 5.48

Fibra c d a II 4.10 \

La pasta de copra contiene algo menos de proteínas que el pienso de gluten de maíz y m& que el salvado de trigo, con un promedio de 2 1.3%. siendo estas de mejor calidad que las del pienso del gluten de maíz. Sin embargo, no debe suministrarse pasta de copra como Único suplemento proteico en la dieta animal al menos que se adicione W n típo de pasto.

9

An&ecedentes Bibliogrctficos

Uno de los factores importantes para administrar una pasta de copra de buena calidad es la presencia de un color blanquecino o pardo muy ligero; en el caso contrario este reflejaría que la temperatura utilizada durante la extracci6n del aceite de coco fue demasiado elevada y por ende la pasta se torna de color oscuro disminuyendo así su valor nutritivo (Flores-MenCndez, 1987).

2.2.1. Pioduccidn mundial de la pasta de copra

La produccidn mundial de semillas oleaginosas como aceites, tortas y harinas permanecieron estables en 1996 / 1997, con una prod.ucci6n de 26 1 millones de toneladas, y en 1998 esta ascendera a 281 millones de toneladas, es decir incrementar6 aproximadamente un 8 por ciento con respecto al aÍí0 pasado (FAO, 03/ 1998). En la Tabla 2.3 se presentan el listado de las principales oleaginosas de inter& mundial, así como el por ciento de produccitin de cada uno durante los años de 1994 a 1997, destacando que las importaciones netas de aceites y g m en este año, ser& producto de 6 países de importancia mundial (la India, Pakistm, MWco, Japh, la Uni6n Europea y la República de Corea).

Por lo que respecta a las importaciones netas de tortas y harinas oleaginosas, miis del 81 por ciento de los envíos totales ser& adquirido por los nueve grandes importadores tradicionales (la Uni6n Europea, Jap6n, la República de Corea, Mmco, Tailandia, Indonesia, Malasia, Filipinas y Egipto), adem& de China (FAO, 03/ 1998). En M&dco, la producci6n de copra se localiza principalmente en los estados de Guerrero (40.25%), Colima (26.86%), Tabasco (15.18%), Oaxaca (5.65%), y MichoacAn (3.83%), representando un 9 1.77% del total (INEGI, 1988; SARH, 1988 y1 992).

En otro sentido, resultados estadísticos mostraron que el consumo mundial de tortas y harinas oleaginosas aumentd 2.7 % como promedio al aiio, durante los dos últimos años y se preve que llegar& a unos 68 millones de toneladas de equivalente en protefna en 1998 (FAO, 03/ 1998).

10

Antecedentes BibZiogrc@ms

En M&dco, la pasta de copra tiene su principal destino en la aUmentaci6n a n i m a l , adem& de emplearse como adtim en algunas mezclas altmentarias, ya sea atravds de la elaboraci6n de alimentos balanceados o concentrados proteícos, debido a que la pasta de copra tiene gran capacidad de absorci6n para 133 rm5azas.

Tabla 2.3. prOducci6n mundial de las siete principales oleaginosas.

269.2 263.0

2.3. Pmbi6ticog

El conocimiento de los efectos bentflcos de algunas de las bacterias de la flora intestinal se inicia a principios de siglo con los trabajos de Metchnikoff; desde entonces, y a lo largo de estos casi 100 &os de estudios, autores muy diversos se han esforzado en conocer las distintas funciones de los microorganismos que pueblan el tract0 digestivo, a pesar de ello, algunas de sus acciones no es& bien precisadas (Smith, 1991).

Por otra parte, una vez comprobado que algunas bacterias intestlnales, adicionadas al pienso o al agua de bebida, determinaban una respuesta favorable en la producci6n animal se intento enmarcarlas en un grupo especifico (Gil-Rueda, 1997.

En 1965 Lffly y Stiwell usaron el ttSrmino probi6tico para describir las sustancias producidas por un protozoario que estimulaba el crecimiento de otros

microorganismos.

11

Antecedentes BibliogtcZficos

Posteriormente, Parker en 1974 describe a los probi6ticos con tres palabras "para la vida", despues en 1989 Fuller propone que los probi6ticos son un suplemento que tiene efecto benefic0 sobre la flora intestinal de los animales. Actualmente, un probi6tico es considerado como un aditivo usado en la dieta de hombre o animales, constituida por una mezcla de biomasa microbiana, metabolitos y enzimas que tienen efecto benefic0 sobre la fisiología del huesped (Wil l iams, 1991). Hay que destacar que el termlno pmbi6tico surgi6, en oposiC16n al antibí6tico cuyo significado "contra la vida" estA bien deflnida y consiste en eliminar o en mantener a un bajo nivel la poblaci6n de microorganismos pat6genos o indeseables.

a

, Los probi6ticos cuyo significado "en favor de la vida" pueden ser agrupados dentro de la categoría de compuestos promotores de crecimiento. Son todas las sustancias de cariicter nutritivo, incluyendo los microorganismos e incluso los antibi6ticos que gozan de esa duplicidad antag6nica de acci6n probi6tica. según la especie animal.

En el mercado existen dos grandes grupos: probidticos para humanos y probi6ticos para uso animal, en la mayoría de los casos se desconoce el funcionamiento de los probi6ticos, esto se debe en parte a la gran diversidad de compuestos existentes y a la gran gama de procesos para producirlos. Sin embargo se han hecho estudios en humanos y su importancia radica en mejorar la digesti6n de alimentos; en algunos casos actúa como inhibidor de la carcinogCnesis, incrementa en la resorci6n de calcio, decrece la intolerancia a la lactosa, ayuda en la síntesis de vitaminas y regula el sistema inmune (Havenaar y Josh, 1992; Havenaar y Spanhaak, 1994).

1

2.3.1. Importancia en la nutrici6n animal

El papel de los probi6ticos en la dieta de animales se centra en la digestibilidad de los alimentos a s i como de promover el crecimiento de bacterias presentes en el rumen incrementando la producci6n animal (Campos, et al. 1995).

12

Antececientes Bibiiogtcificos

Ademh participan en la degradacidn de alimentos POCOS digeribles (muy flbrosos o con alto contenido de celulosa), actuando como degradador primario de la fibra, incrementando el número de bacterias celulolíticas del rumen contribuyendo por otra parte en una mejor calidad y producci6n de leche (Williams, et al. 1991; Wiedmeier y Arambel, 1987).

Durante años los aditivos biol6gicos, que se han venido incorporando a la dieta de animales (especificamente levaduras), deben tener la capacidad de adherirse y multiplicarse en las ctlulas epitellales, a s € como colonizar del tracto digestivo (Gil- Rueda, 1997), por lo tanto los factores claves para utilizar los probi6ticos en forma exitosa son la presencia de mlcroorganismos viables y en cantidades suflcientes con alta capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal y con la habilidad para crecer en' el medio ambiente intestinal, donde el colonizante exitoso puede utilizar sustratos disponibles y resistir a agentes antibacterianos presentes en el medio.

m

Sin embargo no solo se han realizado estudios con levaduras como los reportados por Williams, et al. en 199 l. Tambien se han realizado estudios con hongos fllamentosos como los estudios reportados por Males y Johnson, 1990; Tapia, et al. 1988 y Nisbet y Martin en 1990, en donde evalúan probi6ticos de cultivos ffingicos en rumiantes y proponen que los principales efectos asociados a la utillzaci6n de estos cultivos son los siguientes:

a) Estimulan el crecimiento de los microorganismos del rumen. b) Incrementan la digestibilidad de los alimentos. c) Incrementan la producci6n de &cidos grasos vol&tiles de cadena

d) Promueven una mayor producci6n de leche. corta, propi6nic0, acttico y butirlco.

En lo referente a los estudios de evaluaci6n probi6tica, solo se han realizado bioensayos con bacterias aisladas del líquido ruminal como es el caso de Selenomonas ruminantiurn, Megasphaera elsdenit y consorcios microbianos ontenidos del líquido ruminal, en donde se evalúa el crecimiento microbiano, producci6n de &cidos grasos volhtiles, consumo de Acid0 Hctico, estabilidad al pH entre otros (Martin y Nisbet, 1990; Campos, et al. 1995; Wiedmeier y Arambel, 1987; Fuller, 1992 y 1989; Ramirez, et al. 1994; Ramirez-Islas, 1995; Campos y Viniegra en 1995, Bryant, 1956 y Nisbet y Martin en1991.

13

estudios de Deaville y Galbraith en 1990, en donde utiliza cabras de engorda, toros, vacas y becerros alimentandolos con probi6ticos y pastura, observando que con el solo uso de la pastura mejoraba la ganancia en peso de 0.5 a 0.80 kg. Willlams en 1991 y G6mez, et al. 1990 demostraron que con el uso del probi6tico Yea-sacc y un extracto de Aspergillus oyzae puede haber un cambio pequeño en la composicidn de la dieta diaria de los animales mejorando su producci6n.

Por otro lado Chademana, et al. 1990, no observa cambios con el uso de levaduras como probi6ticos, en este sentido hasta el momento existen controversias si el uso de probi6ticos de tipo fúngico tiene o no efecto alguno sobre la digestich del rumiante.

Esto se debe principamente a que existen pocos estudios que demuestren que los organismos de los extractos probidticos se encuentren viables en el momento en que se agrega al alimento, sin pensar que posiblemente los metabolitos producidos durante su cultivo son los responsables de tal efecto.

2.3.3. Probi6tfcos comerciales en Mexico

Actualmente se producen a nivel corn .erci , a l probi6ticos compuestos en su mayoría por microorganismos vivos (Aspergfllus oryzae, Saccharomyces cereuisiae. Lactobacillus bulgaticus, Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophflus, Enterococcus faecfum, Bfjldobactertum sp, Trlchoderma harzfanurn entre otros), enzimas y metabolitos los cuales se encuentran microencapsulados, en algunos casos e s t h enriquecidas con cromo y selenío, los cuales tienen efecto sobre el animal que lo consume sea aves, cerdos 6 rumiantes (Williams, 1991; Campos y Viniegra, 1994 y Hoyos, 1997).

Los principales probidticos comerciales en MWco son de exportacidn y el volumen comercializado (oferta) es difkil de evaluar ya que no existen fracciones arancelarias especificas que los identifiquen. Sin embargo se encuentran en el mercado los productos que se muestran en la Tabla 2.4 (Favela y Gutierrez, 1992; Alltech de Mkico, 1997).

15

Antecedentes Bibliagr-s

En este estudio se probaron 3 probi6ticos comerciales, Lacto-eacc con un contenido de 1 O millones de UFC / g de Lactobacfllus y Streptococcus microencapsulados, enzimas y cultivo de levaduras con 100 millones de UFC/g de la cepa 1026, Yea- sacc 8417 cuyo contenido principal son 100 millones de UFC/g de un cultivo de Saccharomyces cereufsfae, Yea-sacc 1026, con un contenido de 2.5 billones de celulas/g de las cepas de Saccharomyces cereufslae 1026 y 841 7 respectivamente.

Tabla 2.4. Probi6ticos comercfales en M6xico.

En la mayoría de los casos las características que debe cubrir un probi6tico antes de ser suministrado a la dieta animal cubren los siguientes aspectos (Hose y Sozzi, 1991; Smith, 1991; Tapia, et al. 1988; Hoyos, 1997).

d Ser m pat6geno para humanos y animales. d FAcil proliferaci6n in uitro. d F&il proliferaci6n fn uioo. d Promover un mayor crecmento en los m a l e s que lo consumen. d Estimular una mayor eficiencia en la utUaci6n de nutrientes. d Alta tolerancia a la bilis y acidez. d Productores de &cid0 Eictico. d Alta tasa de sobre vivencia despues del procesamiento (recuperaci6n. lio-do). d Ser adicionado en pequeñas cantidades aprox 2%.

16

La palabra rumiantes procede de la palabra latina, r u m i " ~ , que significa volver a masticar; así, los rumiantes son mamíferos que r u m i a n , con pezuñas y dedos pares. Los rumiantes se incluyen en la subclase denominada unguladolr ( M e r o s con pezuñas) y en el orden Arteriodactyla (dedos pares) y el sub-orden nupinatitia (Church, 1988).

Existen muchas especies diferentes con diversos tamaños corporales, formas y colores, que se distribuyen sobre una amplia variedad de zonas ch&ticas y agricolas. Su tamaño varia desde el ciervo-rat6n Hyemoschus o tragalus, muy pequeño, que puede pesar de 2 a 5 Kg hasta Jirafas con un peso aproximado de 1.9 toneladas (Church, 1988).

Uno de los rumiantes de inter& para la industria alimentaria son los que pertenecen a la Familia: Bovidae; genero Bovidae taurus o mejor conocido como ganado dom&tico, es un tipo de animal que puede consumir alimentos indigeribles por el hombre, como celulosa y nitr6geno no proteico, convirtiCndolos en nutrlmentos disponibles para el hombre gracias a los microorganismos que Wen simbi6ticamente en el rumen herbario.

2.4.2. Anatomía del conducto gastrointestinal de los rumiantes

Las características anatbmicas y fisiol6gicas que permiten la fermentaci6n de los alimentos en el sistema digestivo son: capacidad de est6mago o el intestino grueso, un trhsi to lento de los alimentos y un ambiente liquido amortiguado y prbximo a la neutralidad, así como la eliminaci6n continua de productos solubles de la fermentacl611, Dukes y Swenson, 1970.

17

Antecedentes Riblbgr4fiis

El retículo sirve como cavidad de fermentacibn intermikdntctmen es otra cavidad de fermentacibn en donde se produce la mayor parte de la energha para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos propios de este ambiente, la mayor parte de la conversi6n la realizan a traves de carbohidratos, grasas y proteinas que dan origen a la produccidn de metano, Acidos grasos volhtiles entre otros. El omaso sirve como cavidad de absorci6n de agua y nutrientes hidrosolubles, y el abo-0 como cavidad para la digestibn pt5ptica Church, 1988.

Dentro de las funciones principales de la rumia que diferencia a los rumiantes de otros herbívoros se encuentran los siguientes aspectos: los materiales herbhceos son procesados dos veces dentro de la boca y dos veces dentro de los compartimentos del rumen antes de pasar al est6mago; cuando la comida es primeramente ingerida, masticada, ensallvada y deglutida en esta condlci6n entra en el rumen que contiene grandes cantidades de agua (10 a 15 Its), bacterias, hongos y protozoarias que degradan la celulosa y la convierten en azúcares y hcidos orgtinicos, Brock, et al., 1987 y Josse, 1979.

Los animales monbgastricos se diferencian por tener un solo estbmago que únicamente es capaz de digerir carbohidratos en forma de azúcares simples que son absorbidos en su torrente circulatorio, ya que en el se encuentran grandes cantidades de glucosa pero no de Bcidos grasos de cadena corta. Sin embargo en la sangre de los rumiantes el 90% de la energía la obtienen de los &cidos grasos ya que son utilizados por los tejidos corporales del rumiante, ademits de que juegan un papel decisivo para el suministro de precursores de la leche, Josse, 1979 y Kaufmann, 1983.

De esta forma los Bcidos grasos producidos durante la fermentacibn tienen diferentes usos, por ejemplo el acetato provee de una fuente no específica de energía, y puede ser sintetizado en Bcidos grasos o cuerpos cet6nicos. El propionato regula la sintesis de la glucosa por el hígado y proporciona cerca de la mitad de glucosa total que entra al metabolismo, por lo tanto es una fuente específica de energía obtenida de carbohidratos y aminohcidos, no compartida por acetato y butirato. El butirato no es particularmente útil en la nutricibn ya que puede dar origen a acetato atravts de canales metab6licos y participar en la síntesis de @acosa, Josse, 1979.

78

Antecedentes BibZiogr4ficos

2.4.3. Acidosis en rumiantes

La acidosis es una enfermedad relacionada con la dieta de los rumiantes, causada por un aumento súbito en el consumo de carbohidratos de f&il fennentaci6n. Por otro lado existen cambios en la poblaci6n microbiana del rumen y en los productos de la fermentacibn mismos que se absorciben en grandes cantidades en forma de hcidos grasos voktiles y'de &cid0 lhctico, con lo cual pasan al torrente sanguíneo y provocan acidosis sistemica.

La prevenci6n se centra en la adaptad611 gradual de dietas ricas en carbohidratos de fAcil ferm~ntazi6n y en un manejo cuidadoso de la distribuci6n de las mismas (Huntington, 1993 J . Miller, 1989).

La acidosis esta deflnida c3mo el estado de acidez ,patol6gicamente elevada de la sangre, en los rumiantes el 1.Crmino se amplía para incluir situaciones de acidez en el rumen, dando origen a problemas agudos, mismos que amenazan la vida del animal, o sub-agudo en donde se manifiesta un descenso en el consumo del pienso y en la ganancia en peso (Huntington, 1993).

La etiología de la acidosis tiene dos fases importantes:

1) Un aumento brusco en el consumo de carbohidratos de fAcil fermentaci6n. seguido de una ferplentaci6n rApida en el rumen con formaci6n de Acidos que alteran el perfil de la poblacibn microbiana del rumen.

2) Absorci6n de &cidos hacia la corriente sanguínea que determina la acidosis.

En el caso 1 generalmente se manifiesta cuando el animal consume concentraciones elevadas de carbohidratos intracelulares, tubkrculos o raíces que contienen azúcares, o cereales en grano que contienen almid6n. En primera instancia actúan las bacterias amilolíticas, las cuales producen AGVs y lactato como productos de su fennentaci6n.

Cuando aparece lactato en rumiantes alimentados con forrajes es predominante el L-Lactato, si hay un aumento súbito en el consumo de carbohidratos de fhcil fermentaci6n origina una acumulacih de lactato en el rumen, y el cociente isomCrico cambia en una relacidn 5050 de L-Lactato:D- Lactato. Sin embargo el lactato puede ser absorbido y salir del rumen por la ingesta, o bien por el consumo de bacterias lactolíticas como es el caso de pegasphaem ekdenff . Tambih pueden proliferar especies bacterianas y levaduras productoras de etanol; provocando una intoxicaci6n lo que explicaría en parte el comportamiento de los rumiantes afectados por la acidosis. ,

En el caso 2 Los Acidos producidos en el rumen son absorbidos hacia la comente sanguínea, donde se acumulan y constituyen la base de la acidosis siskmica. El pH de la sangre desciende y se produce un desequilibrio de electr6litos debido tanto a la perdida hacia la luz del intestino como a elevadas concentraciones de &cidos. La alta osmolaridad del quimo y la diarrea determinan que la sangre pierda agua y el bazo libere eritrocitos en respuesta a un estres ftsiol6gico general provocando hemoconcentraci6n. En casos graves, la acidosis interfiere sobre la funci6n renal y transporte de oxigeno, produciendo la rotura de arteriolas perifericas, particularmente en las extremidades, hecho que se manifiesta como lamlnitis, infurosa, 6 acidosis 1Actica (Huntington, 1993 y Miller, 1989).

2.4.4. Microorganirpmos ruminale3 y su entorno ambiental

Los tipos de microorganismos que se desarrollan y se mantienen en el rumen son aquellos que se han adaptado a las condiciones específicas del ecosistema, en este sentido los microorganismos que predominan son principalmente ’ los sacarolíticos, seguido de protozoarios, hongos y bacterias celul6ticas, lactoliticas, amilolíticas, proteoliticas, metanoghicas, las que consumen lípidos, pectina, urea y otros sustratos; como se muestra en la Tabla 2.6, (Church, 1988; Hungate, 1969 y Tokoyama y Johnson, 1993).

1

Por otra parte Martin y Rusell en 1988 mencionan que una de las bacterias que se encuentran en mayor porcentaje (80%), del total de las bacterias del rumen son Selenomonas turninantiurn y Megasphaera ekdenif. Selenomonas tumfnantfurn

fue aislada por Bryan en 1956, existiendo hoy diferentes variedades de este genero,

20

entre las que destacan las fermentadoras de lactato, variedad lactlliticas, cepas HD4, PC18 y GA31, adem& de cepas no fementadoras de lactato variedad bryantil reportada por Martin y Rusell, 1988.

Por otro lado la baja concentracic5n de oxígeno en el rumen estimula a 10s microorganismos a desarrollarse en ausencia de oxígeno, llamados anaerobios obligados. Sin embargo pueden encontrarse, aunque en menor cantidad anaerobios facultativos, entonces el rumen es considerado como una ch.mara de fermentaci6n en la cual la poblaci6n microbiana se encuentra en un medio de cultivo específico con las condiciones adecuadas para favorecer el crecimiento de la microflora presente. En la Tabla 2.5. se muestran las condiciones de crecimiento de microorganismos en el rumen.

Tabla 2.5. Condiciones ambientales del rumen (Perez-Gavtlh, 1990 y Tokoyama y Jhonson, 1993).

compuesta aproximadamente por 65% de COZ, 27% de CH4, 7% de N2, 0.6% de 02. 0.2% de Hz y 0.01% de

21

Antecedente!s Bfbliogrcvicos

Tabla 2.6. principales microorganismos que habitan en el rumen,

Celulosa

Utilizan azúcares

ruminantiurn Methanobacterium formicicum Methanomicrobium mobie Butyvibdoflrisolvens Bacteroides ruminicola Lachnospim multiparus Succfnivibrlo dextrinosolvens Treponema bryantii Streptococcus bovis Bacteroides ruminicola Succfniuibdo dextrinosolvens Selenomonas sp Ruminicoccus bmmii Treponema s p

Productoras de metano

PeCtina

Urea

Productoras de amoniaco

22

ObJetioos

OBJETIVOS

23

3. OBJETXVOS

O

3.1. Objetivo General

8 Contribucibn a la caracterfiaci6n y evaluaci6n de productos de FS como aditivos con actividad probi6tica, empleando un

a bioensayo con la bacteria ruminal Megaspahemelsdenll.

3.2. Objetivos Particulares

* Obtener productos de fermentaci6n s6lida (m) utilizando cepas silvestres y cepas tipo GRAS de hongos filamentosos y levaduras empleando como sustrato pasta de copra.

3k Evaluar mediante un bioensayo con la bacteria Megasphaem elsdenfl. el efecto probi6tico de los productos obtenidos por F S , comparando con probi6ticos comerciales.

* Contribuir a la idenMcaci6n de compuestos provenientes del cultivo en medio s6lido como posibles candidatos de actividad probi6tica, mismos que se podrfan evaluar en estudios posteriores.

24

I

.:fateriaits y Métodos

Muterides y Métodos

25

4. MATERIALES Y METODOS

En esta seccibn se presenta la metodologfa y materiales utilizados, a s € mismo en la Figura 4.1 se muestra en forma general la estrategia experimental usada para l o s diversos an&lisis realizados.

Reacti6cibn y e conservaci6n de cepas

FERMENTACION EN MEDIO SOLIDO con pasta de copra

I Obtencion de pasta de copra fermentada

con diferentes microorganismos

Tratamiento de muestras / Megasphaemelsdenll

Acidos @ama vo~tilcs Addo Uctico

Biomasa PH

I Extracci6n con disolventes de diferente polaridad Puriffcaci6n

Elecci6n del mejor producto de FS con actividad probicjtica I

I Fs masiva y Liofllizado

Figura 4. l. Estrategia experimental.

26

4.1 naicroorganisrnas empleados

a) Hongos y levaduras

En este estudio se probaron 4 cepas de hongos fbmentosos 5 2 t.< ievaduras. Las cepas a y b que se muestran en la Tabla 4.1 tienen certiflcaci6n de cepas tipo C M , la cepa c fue alslada de: pasta de copra en un estudio rea1Lxkh por Flores y Garcia en 1995, la cepa d fue aislada del queso roquefortii en un estudio realizado ,

por Pineda y Perez en 1996, la cepa e fue obtenida del cepario de CBS - 2863 de la Universidad Aut6noma Metropolitana y la cepa f fue donada por el profesor Marlano Garcia Garibay de esta misma 1 Jniversidad.

' .

Tabla 4. l. Cepas empleadas durante 'el proceso de FS.

b) Bacteria ruminal

La evaluaci6n Ide la actividad probidtica que se presenta en el Secci6n 7 , se r-6 con la cepa 390 de Megasphaeraelsdenii, donada por la Coleccidn Española de Cultivos Tipo (CECT), es una bacteria de orlgen ruminal coco Gram negativo, se encuentra en un gran numero de animales (Stewart y Bryant, 1988). Crece en un internalo de temperatura de 25 a 40" C, como fuente de carbono puede utillzar glucosa, hctosa y lactato en donde se presenta su mejor crecimiento: con glicerol, maltosa, manitol, sorbitol y sacarosa su crecimiento es variable, y no crece con arablnosa, celobiosa, dextrina, galactosa, inulina, manosa ni rafinosa. El pH fhal del cultivo con el empleo de glucosa o fructosa ea de 4 a 5 y con lactato de 7.8 a 8 (Bergey's manual of determinative bacteriology, 1994)

27

4.1 . 1 . Consenmci6n y reactivaci6n de las cepas

Las cepas de hongos y levaduras despues de haberse propagado durante 72 h a 30" C sobre medio pasta de copra simple (ES), se conservaron en glicerol al 50% a 4" C, Ver secci6n 4.2. l. Con este metodo de consewaci6n se pueden almacenar durante 1 aiio aproximadamente sin que se alteren las estructuras de reproducci6n de los microorganismos (Aqukhuatl- Ramos, 1989).

,

Procedimiento: .

1.- Preparar tubos de en!;;aye con tapa de rosca conteniendo medio ES, esterilizar, @CUI l a r el tubo y dejar solidlffcar.

2.- Inocular por picadura con cada una de las cepas e incubar durante un período de 72 h a 30" C. 3

3.- Colonizada la superficie del medio, agregar 5 mi de una soluci6n de glicerol al 50% previamente esterilizado durante 15 min / 15 lbs 12 1" C.

4.- Sellar los tubos y almacenar a temperatura ambiente o de preferencia en refilgeracibn.

El cultivo de #f. ekdenlf, fue propagado por 48 h, se consewd en glicerol al 40%. Al glicerol utilizado se le acondicfon6 una atm6sfera de COZ y N2 durante 5 min y despues se esteriliz6 15 min 15 lbs 12 1" C. Posteriormente se adicion6, 1 ml de glicerol esteril a 1 ml de cultivo propagado bajo condiciones de esterilidad y se guard6 a - 20°C.

La reactivaci6n de la cepa de M. elsdenlf, se realiz6 con el medio que se describe en la secci6n 4.2.2, realizando resiembras cada 24 h durante 72 h; para ello se tom6 el 10 % del volumen del cultivo previo como in6cul0, es decir despues de 24, 48 y 72 h. utilizando el último indculo de 72 h para re-inocular en cultivos posteriores.

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4.2. Medios de cultivo

Las cepas de hongos y levaduras se cultivaron en dos medios enriquecidos: agar papa dextrosa (PDA) y medio pasta de copra simple (PCS), se inocularon por picadura y se incubaron durante 120 h a 30' C . a

El cultivo de M. ekdenif se re&6 en condiciones anaerobias durante 35 h a 37" C, con agitaci6n continua. Se tom6 como referencia el medio de cultivo 19 para Peptococcus, recomendado por la Colecci6n Española de Cultivos Tipo. En este estudio el medio de cultivo fue modificado reduciendo el 75% de su fuente de nitr6geno y cambiando la fuente de carbono glucosa por &cid0 kictico. Ver Tabla 4.2 y 4.'3.

4.2.1. Medio de cultivo para hongos f?tlnmentoaos y levaduras

Se utiliz6 agar de la marca comercial Bioxdn y se prepar6 según las indicaciones de la misma.

b) Medio PCS:

Se prepara siguiendo la metodología que a continuaci6n se describe.

1.- Pesar 300 g de pasta de copra en un matraz erlenmeyer de 2000 m l ' adicionar 1.5 litros de agua destilada para obtener un volumen fhal de un litro de infusi6n.

2.- Calentar 15 minutos con agitaci6n sin llegar a ebullici6n aprox 70" C.

3.- Filtrar con gasa para separar los alidos m& gruesos.

4.- Flltrar el contenido del matraz con papel ffltro Whatman No 3.

29

S.-

6.-

7.-

8.-

Pesar 16 g de agar-agar.

Adicionar un litro de la infusi6n, mezclar y ajustar a pH = 5.4.

Esterilizar en autoclave a 12 1" C, 15 lbs/plug 2 15 min.

Vertir el contenido del matraz en cajas petri y dejar sohUcar.

' . Para inocular el sustrato pasta de copra (Seccibn 4.4b), se propag6 cada cepa

en 50 m1 del medio PCS durante 72 h a 35" C en matraces de 250 ml, y se resuspendieron las esporas coc 50 ml de una soluci6n al 10% de Tween 80 esttkll. Las esporas recolectadas se,con! aron en Cha.ra de Neubauer, ver Secci6n 4.8. l.

4.2.2. Medio de cultivo para microorganisrnos anaerobioa

El medio de cultivo se prepara según los componentes de las Tablas 4.2 y 4.3. I

Procedimiento:

1.- Ebullir durante 30 min 1.1 litros de medio de cultivo en un matraz erlenmeyer de 2 Its.

2.- Introducir basta el fondo del matraz una corriente de Coa, flujo para desplazar el 02 disuelto en la fase líquida, y se espera a que el medio vire a un color rosa, en ese momento adicionar 0.5 g de clorhidrato de cisteína y dejar de calentar.

3.- Agitar el contenido del matraz para solubikar el reactivo adicionado e introducir un electrodo de pH y hacer mediciones a intervalos regulares de tiempo hasta alcanzar un pH entre 7-7.5. NOTA El medio de cultivo debe estar incoloro, si persiste el color rosado calentar un poco m6.s sin llegar a ebullici6n.

30

4.- Si el pH desciende muy dpidamente, por efecto del coz, adicionar unas gotas de NaOH 8 N 6 incorporar una corriente de N2 para amorti+=- $1 !:H. Cuando el pH se encuentra en el intervalo antes mencionado y el medio esta incoloro, se retira la corriente de C02 .

6.- Colocar 50 ml del medio de cultivo en frascos ser.ol6gicos con la ayuda de una pipeta, la cual debeh ser llenada con una atmbsfera de COZ; sellar con tap611 de hule y arillo de aluminio. En el frasco serol6gico debed introducirse previamente una corriente de COZ y ser llenado con el medio de cultivo. El llenado en frascos serol6gicos es únicamente para preparar el pre-in6culo y realizar las cincticas de fermentaci6n.

6.- Esterilizar 15 mln, 15 lbs, 12 1' C.

7.- Corroborar que el contenido de los frascos serol6gicos estCn en condiciones de anaerobi6sis (sin color), para posteriormente inocular .

8.- Inocular el contenido del frasco serol6gico (50 mI) con 10 % de in6culo de M. elsdenli; obtenido así, el pre-in6cul0, mismo que se incuba durante 24 h a 37" C.

NOTA: Algunos frascos serol6gicos fueron llenados con 100 ml de cultivo, mismos que se utilizaron para las cinCticas de fermentaci6n a los que se les agreg6 (2 %) de probi6tic0, producto de FS o testigos, ademhs del 10 % de un pre-in6culo de M. elsdenff.

9.- Adicionado el in6culo y el aditivo a cada frasco serol6gico (100 d), se mezcla Y se retiran 5 trd mismos que se introducen en tubos de ensaye con tap6n de rosca (estefles y en condiciones de anaerobi6sis) y se repite el mismo procedtmiento hasta obtener los tubos necesarios para la realizacidn de la cinCtica de fermentaci6n.

31

Tabla 4.2. Composlci6n del medio de cultivo para la propagacidn de M. elsdenit.

MEDIO BASAL

Tabla 4.3. Soluci6n de sales para el medío de M. elsdenll.

32

.iaterialeS y M&todos

Las columnas se colocaron sobre un burbujeador por medio del cual se hacia pasar aire humidiflcado al interior de la columna, proporcionando así, condiciones aerobias al sistema. En la parte inferior de la columna se coloz~ una torunda de algod6n y sobre esta un papel filtro, que impedía que el material a fermentar pasara al orificio inferior de la columaa.

NOTA: En todos los casos la pasta de copra recibi6 un pretratamiento que consisti6 en un tamizado delpartícula en una malla con tamaño de poro de 8 a 20, estandarizando así el tamaño pn un rango no mayor de 2.36 m., y se esterilk6 a 12 1" C. 15 lbs durante 30 mia, así mismo l a s columnas de fermentaci6n fueron esterilizadas con un algod6n y papel ffltro en el interior de las mismas.

a) Aireación por difusi6n simple

Humedad de la pasta de copra 65% I

pH inicial Cantidad de in6culo

Densidad de empaque * a W

Temperatura de incubaci6n Tiempo de incubaci6n Aireaci6n Tamaño dt pptícula de la

g de material por columna pasta de copra

de fennentaci6n DiAmetro de la columna Altura de la columna

5.4

Bocado de 1 cm 2 medio PCS /con crecfmiento miceliar de 60 h de cultivo 0.85 g/cm 3

0.992

30" C 180 h Difusi6n simple > 2.36 mrn

130g

3.6 cm 20 cm

El cultivo en esta etapa experimental,' fue realizado dentro de una incubadora marca Felisa, bajo las condiciones arriba mencionadas. En la Figura 4.3. se ilustra el tipo de columna usada, así como la colocacl6n de las mismas durante el experimento.

34

Estas condiciones heron utilizadas para evaluar el cr:cz.ineto axial de los diferentes hongos filamentosos en FS, siguiendo la metcc;ci,-$a descrita por RaLmbault y Alazard en 1980.

Figura 4.3. Dispositivo empleado para la evaluaci6n del crecimiento axial en columnas.

L a FS con aireacidn forzada se realiz6 bajo las condiciones de cultivo, que se presentan a continuaci6n; utilizando el dispositivo que se ilustra en la Figura 4.4.

b) Aireaci6n forzada

humedad de la pasta de copra pH inicial Cantidad de in6culo Densidad de empaque aw Temperatura de incubaci6n Tiempo de incubaci6n Aireaci6n Tamaño de partícula de la pasta de copra g de material por columna de fennentaci6n Diíhnetro de la columna Altura de la columna

60%, o lo indicado en el texto 5- 5.5 I X 10 6 - 1x 10 7 esporas/d 0.7 g/cm 3 0.992 2 0.002 30" C 40 - 80 h (depende de cada cepa) 1 vkgm > 2.36 mm

130 g

3.6 cm 20 cm

35

En la Secci6n 5 se realiz6 un estudio bajo estas condiciones de cultivo, variando el porcentaje de humedad a 50.55.60 y 65 %,

GI

? B

Figura 4.4. Dispositivo utilizado en la fermentaci6n en medio sdlido, conectad1 un mehbolfmetro en donde: ( 1 ) Regulador de temperatura, (2) Term6metro. Distribuidor de aire, (4) Columnas de fermentaci6n. (5) Burbujeadores, (6) Baño agua, (7) Columnas con sílica gel, (8) Metabolímetro.

GI

? B

Figura 4.4. Dispositivo utilizado en la fermentaci6n en medio sdlido, conectad1 un mehbolfmetro en donde: ( 1 ) Regulador de temperatura, (2) Term6metro. Distribuidor de aire, (4) Columnas de fermentaci6n. (5) Burbujeadores, (6) Baño agua, (7) Columnas con sílica gel, (8) Metabolímetro.

Da

(3) de

La metodología empleada para analizar los gases producidos durante la fermentaci6n se describe en la Secci6n 4.8.10.

4.6. Watamiento de muestras de productos obtenidos por FS

Los productos de fermentaci6n obtenidos recibieron un pretratamiento antes de realizar los anaisis correspondientes, mismo que se detalla en la Fig& 4.5.

36

Resuspender 1 Kg en 12.5 Its de agua destilada y agitar 1 hora

I Filtrar en malla de

ser4miia de 120 Duntos v

I Filtrar en p a p e l , Whatman No 43

86lidos

rermeaao pamculas menores a 30.000 Daltons

Resuspender a g en 50 ml y agitar 30 min

Filtrar con papel Whatman No 45

I

durante 10 min

H20

I Concentrado partículas mayores

rL1 Liofllizado

a 30,OOO Daltons (Desechar)

, Figura 4.5. Tratamiento de muestras de Productos obtenidos por FS.

4.6.1. Preparaci6n de probi6ticos comerciales y productos de FS para en análisis de actividad probi6tica

Los productos obtenidos por FS, se secaron a temperatura ambiente hasta que perdieron su humedad. Los probi6ticos comerciales y productos de FS se prepararon bajo la tCcnica reportada por Nisbet y Martin en 1990, descrita a continuaci6n e ilustrada en la Figura 4.6.

37

Procedimiento:

1.- Resuspender 4 g de probi6tico 6 producto de FS en 50 m1 de agua

destilada y filtrada.

2.- Agitar durante 1 h, y posteriormente filtrar en un matraz con papel

Whatman No 45.

3.- Medir el pH de cada producto filtrado.

4.- El flltrado resultante se burbujea con COZ durante 10 min.

5.- El líquido burbujeado se esterillza por filtracih utilizando una membrana

Millipore de 0.45 pm, mediante el empleo de una jeringa estkril de 5 ml.

NOTA Todo el proceso se realiza en una atmdsfera anaerobia y en condiciones de esterilidad.

6.- El filtrado se deposita en un frasco estCril que previan=ente se le acondicion6 una atm6sfera de COZ .

50 m1 de agua destilada Agitacih i 1 hora. i

I ~

1

Filtrar papelwhatman No,45

Figura 4.6. Preparaci6n de probi6ticos comerciales y productos de FS.

38

Evaluados todos los productos de FS se eligi6 el que pr: 3enL.S mejor actividad probi6tica realizando para ello una nueva FS (Ver secci6n 5.L). Asi se obtuvo aproximadamente 1 Kg del nuevo materiai fermentado, mismo que se seco y se trat6 de la siguiente manera:

a) Se parti6 de un lote de 1 kg. de material fermentado y seco.

b) Se adicionaron 12,5 Its de agua destilada, se agit6 por 1 h y se ffltr6 al vacío en una malla de serigrafia de 120 puntos, enconlrhdose despues del filtrado 28 g/l de &lidos solubles.

c) Posteriormente se filtr6 en papel Whatman No 43 y se obtuvieron 10 Its del ffltrado que corresponden al 80 % de partículas en suspensibn, el 20% restante fueron perdidas.

Posteriormente los 10 Its obtenidos se filtraron con membranas de 30,000 Daltons usando la tCcnica de ultrafiltraci6n, metodo que permite aislar los microorganismos de un líquido o de una suspensi6n. liberando únicamente partículas en soluci6n.

4.5.2. TCcnica de ultrafiltración

Esta metodología se utW6 como un paso previo al liofilizado del producto de FS elegido. Se utilizaron membranas de 30 O00 Daltos (Superficie = 60 x 600 cm 2),

18°C de temperatura y un flujo de 10 m l l m i n ,

Procedimiento de ia tCcnica:

1.- Colocar en la cAmara que contiene el equipo un m-0 de 10 membranas para ultraflltracibn de 30,000 Daltons, intercalando en cada caso un separador de membranas.

2.- Cerrar la c&mw a presi6n y colocar las mangueras de entrada y salida del f€ltrado.

39

3.- Realizar una prueba de integridad con agua destilada, este paso es de inter& ya que se comprueba si el equipo esta libre de fugas, tanto en mangueras y man6metros. Si no existen fugas continuar con el paso 4, de lo contrario iniciar el proceso (el equipo trabajo con un presi6n de 10 lbs).

4.- Colocar la manguera en el recipiente que contiene el material a flltrar, encender la bomba y estabilizar el flujo de salida del permeado a 10 ml/min.

5.- Se obtienen dos soluciones: Un permeado que contiene partículas menores a 30,000 Daltons, y un concentrado que contiene partículas mayores a 30,000 Daltons.

6.- Apagar la bomba del equlpo, desmontarlo y lavar las membranas en una soluci6n de 0.05 NaOH y guardar en una solucidn de NaOH a la misma concentraci6n.

Con este tratamiento de los 1 0 Its iniciales se recuperaron 5 Its (permeado), encontrhdose inmersos d i d o s solubles < a 30,000 Daltos. Posteriormente se liofllizaron los 5 Its obteniendo 150 g de s6lidos solubles. El lioflkado se realiz6 en el centro de productos bi6ticos (CEPROBI) de la UNAM, en Yautepec, Morelos.

4.6. Evaluaci6n de la actividad probi6tica

Los experimentos con productos de FS y probi6ticos comerciales se evaluaron mediante el anaisis de biomasa por densidad 6ptica, Bcido lActico (equipo YSI modelo 2700). Bcidos grasos vol&iles, propi6nic0, acCtico y butírico (cromatograffa de gases) y pH. Los experimentos se hicieron por duplicado tomando muestras a intervalos de tiempo regulares durante 35 h de cultivo. L a temperatura de incubacidn fue de 37°C (Campos y Viniegra. 1995).Ver detalle de las tCcnicas en la Secci6n 4.8.2b, 4.8.6, 4.8.8, 4.8.9.

4.7. Tratamiento de muestras realizado para probar el efecto probi6tico

Las muestras obtenidas del cultivo con M. elsdenff se procesaron siguiendo el esquema que se presenta en la Figura 4.7.

40

Muestra (S ml) 1

Centrifugar 5000 rpm lurante 20 min.

Sedimento -m Sobrenadante

I Resuspender en 5 ml de Ffltrar en I membrana agua destilada y Altrada de 0.45 pm

I i 50 ,u1 l o 0 0 p1

I Mezclar con 1 O0 pl de

Anasis de concentraci6n de AnUsis lie consumo biomasa de Bcido IAcUco

Figura 4.7. Esquema del tratamiento de muestras provenientes del cultivo con M. elsdenli para la evaluacidn de la actividad probi6tica.

I

4.8. Thnicaa analíticas

En esta secci6n se describen a detalle las tCcnicas analiticas utilizadas en este estudio.

4.8.1 Conteo de esporas. AOAC, ( 1987)

41

2.- Se coloca una gota de la suspensidn en ambos extrc::-ncs de la c h a r a de Neubauer y se procede al conteo de esporas.

3.- Se cuentan las esporas en 9 cuadros al azar, de 1 c a n p de la c h a r a de Neubauer.

4.- Si la muestra esta muy concentrada se recomienda hacer diluciones y se procede al paso 3. Se recomienda que las esporas que se cuentan por cuadro no exceda de 20, ya que puede hacer un error en el conteo si se excede esta cantidad.

O

5.- Obtenido el conteo se saca el promedio general de las esporas contadas.

CglCulOs:

NO de esporas por cuadro (promedio) x 25 (No de cuadros de la caUnara) x (10 volumen de a c&mara) x (diluci6n) = Esporas por ml de soluci6n.

4.8.2. pH. AOAC, ( 1987)

Se determin6 con el uso de un potenci6metro Conductronic pH 20. Antes de usarse el potenci6metro se debe calibrar con soluciones standard de buffer de pH conocidos pH 4 y 7. Los electrodos del potenci6metro se lavan con agua destilada y se sumergen en la soluci6n a medir. El pH se lee en la escala del aparato. Las instrucciones detalladas para el manejo de este equipo se presenta a continuaci6n.

a) Muestras s6Udas. AOAC, 1987.

Para el caso de las muestras provenientes de la fermentaci6n s6lida se procede 1

de la siguiente manera:

1.- Se calibra el equipo con estbdares de pH conocidos (4 y 7) y se lava el electrodo con agua destilada y se seca con papel absorbente.

2.- Resuspender 0.5 g de muestra en 5 ml de agua destilada y homogeneizar con la ayuda de un agitador magnCtico durante 1 minuto.

42

3.- Medir el pH directamente en la suspensi6n acuosa resultante.

4.- Lavar el electrodo con agua destilada y secar con papel absorbente y se continúa con el paso 3.

bl Muestras líquidas. AOAC, 1987.

O

Se realizan los mismos pasos que el inciso a, omitiendo el paso 2 para este tipo de muestras.

4.8.3. P6rdida de materia seca (PMS). AOAC, 1987.

I

1.- Pesar la columna de fermentaci6n antes de empacar con el sustrato a

2.- Pesar la columna con el material a fermentar. 3.- Pesar la columna con el material fermentado al Anal del proceso.

fermentar.

Para realizar los cAlculos es necesario conocer tambitn la humedad inicial y final del producto. para conocer la materia seca al final del proceso, ver Secci6n 4.8.5.

CglcutOS: MSI - MSF/ MSI X 100.

En donde MSI= Materia seca inicial. MSF= Materia seca ilnal.

4.8.4. Actividad de agua a,, AOAC, (1987)

Se realiz6 en un equipo marca AQUA-LAB modelo CX-2

1.- Calibrar el equipo con agua destilada (depositar en una charola provista por el equipo), hasta que en la pantalla indique una actividad de agua de 1. 2.- Colocar 1 g de muestra y extender en una charola. 3.- Introducir la charola en el orificio del equipo y cerrar el compartimento. 4.- Cuando se escuche la alarma que indica el ttrmino del proceso, el equipo reportarí3 el resultado en la pantalla.

1

43

4.8.5. Humedad. AOAC, 1987.

1.- Pesar 1 g de material de estudio y depositarlo en un recipiente (vaso de precipitado 6 charola de aluminio), que previamente se llev6 a peso constante y anotar su peso.

2.- Colocar el recipiente en estufa a 70" C, y retirar transcurrido 24 h.

3.- Colocar el recipiente en un deshumidificador y esperar hasta que la muestra registre peso constante.

4.- Pesar el recipiente y anotar el resultado.

CBlculos: P 1 - m/p1 x 100

En donde: P1= Peso del recipiente con muestra al inicio del proceso. P2 = Peso del recipiente con muestra al mal del proceso.

4.8.6. Biomasa (Densidad 6ptica)

Se cuantiAc6 la producci6n de biomasa microbiana en un espectrofot6metro marca Shimatzu, empleando la tCcnica de turbidimetría a una longitud de onda de 660 nm reportada por Campos y Viniegra, 1995 y Ramirez-Islas, 1995. Se utillz6 como testigo agua destilada y filtrada y se analizaron muestras a intervalos regulares de tiempo.

Procedimiento:

1.- Obtenida la muestra del cultivo con M. elsdenfl(5 ml), colocar en un tubo su contenido y centrifúgar a 5000 rpm durante 20 minutos.

2.- Separar el sobrenadante con la ayuda de una jeringa y guardar para estudios de AGVs y Acid0 l&ctico.

44

3.- Resuspender las cClulas en 5 ml de agua destilada y flltrada, agitar con ayuda de un vortex.

4.- Programar el equipo y calibrar con agua destilada y filtrada para r e m a r lecturas a 660 nm.

5.- Colocar la muestra en un celda (aprox 1 ml), y colocarla en el receptor de muestras del equipo, cerrar el compartimento y registrar el resultado.

4.8.7. Biomasa (Peso seco). AOAC, (1987).

Para conocer la concentraci6n de biomasa de M. elsdenii se realiz6 una curva patr6n a partir de un cultivo de 20 h de incubaci6n con un volumen de 500 ml, se tomaron muestras de 1 a 8 ml en tubos de centrífuga, que previamente se llevaron a peso constante. Los resultados de la curva patr6n de conversi6n de (DO) en concentraci6n de biomasa para el cultivo de M. elsdenil, se presentan en la Figura 4.8.

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

O

y= 2.5" + 0.0848 Rz= 0.990

O o. 1 0.2 0.3 0.4 Concentración de biomasa ( g h )

Figura 4.8. C u m patr6n de conversih de densidad Bptica a concentraci6n de biomasa (en peso seco).

45

Con la obtencidn del peso seco de las cClulas se constmy6 una curva patrdn de peso seco de biomasa/ml contra la densidad 6ptica (D.O), en donde se observa que, en el rango de 0.075 - 0.39 g de biomasa/L y 0.24 - 1 unidades de absorbancia, la relacidn es lineal entre ambas. Tamblen se presenta la ecuaci6n de regresi6n lineal con su correspondiente coeficiente de correlacidn el cual indica que el ajuste realizado es confiable.

4.8.8. Acido ELBctico . Se reallzd con un equipo automatizado marca YSI, modelo 2700 que tiene la

capacidad de medir &cid0 &caco y glucosa, detectando concentraciones a bajo de 0.5 g/L. El equipo posee controles de kcido Ectico y glucosa: la muestra problema se introduce en un tubo capilar provisto por el equipo, el cual absorbe 20 pul de muestra y reporta los resultadm en un lapso no mayor a 2 min. El YSI posee un sensor enzimktico que detecta una o muchas reaccionqs catalítlcas que dan como producto final per6xido l e hidrdgeno '(H202), el cual es oxidado electroquimicamente. Depenciiendo del analisis que se realize se cambia la membrana del equipo, en este estudio la enzima L-Lactato oxidasa fue inmovilizada en la membrana de L-Lactato del equipo YSI. Ref. Manual de operacidn del equipo YSI.

La reaccibn es la siguiente:

L-Lactato + 02 Hz02 + Piruvato L-Lactato oxidasa I

Procedimiento: (Equipo enzim6tico YSI).

1.- Obtenida la muestra del cultivo (5 m l ) , colocar en un tubo de centrífuga su contenido y centrifugar a 5000 rpm durante 25 minutos.

2.- Separar el sobrenadante con la ayuda de una jeringa y mtrar con membrana de 45 p (colocar 1 ml en un tubo Eppendorf).

46

3.- Si se sospecha que la muestra tiene una concentraci6n mayor de 0.5 g/L, se recomienda hacer una diluci6n; esto con el prop6sito de no rebasar la linealidad del equipo,

4.- Encender el equipo y calibrar con un e s m d a r de glucosa 2.5 g/L y L-Lactato 0.5 g/L. El equipo indicarA en la pantalla si esta listo para procesar.

5.- Insertar el tubo que contiene la muestra en el capilar el equipo y esperar a que aspire 20 pl de su contenido.

6.- El equipo reporta automAticamente el resultado.

4.8.9. Acidos grasos volhtiles (AGVs). AOAC, (1987)

La cromatografia cuantitativa se basa en la separaci6n de los componentes de una mezcla de sustancias a travCs de las dlferencias de afinidad con el soporte con el que esta empacada la columna. En este estudio se midi6 la aparici6n de &ido acCtico, propi6nico y butírico, producto del consumo de Acid0 lactico que se uso como fuente de carbono.

Se utiliz6 un cromatografo de gases marca Varian, provisto de un analizador automático adaptado para 48 muestras, conectado a un integrador marca Varian. Se utili26 un detector de ionizaci6n de flama y se utW6 una columna de aprox 1.6 m de largo que consiste en un tubo de acero inoxidable de 1 /8 de pulgada, la columna fue llenada con porapac, las condiciones para el anidisis fueron: 180" C en la columna, 270" C en el inyector, 260" C en el detector auxiliar (1) y 50" C en el detector (2).

Se utilizaron estandares de 0.5, 0.75 y 1 g/L de una mezcla de Acid0 propi6nic0, acCtico y butírico; las muestras se diluyeron a 0.5 g/L para prolongar la vida útil de la columna y se lav6 la columna con una soluci6n de acetona:Acido clorhídrico 3 N a intervalos de 4 muestras. Los tiempos de retenci6n típicos de los %cidos grasos analizados y la tCcnica detallada se presenta a continuaci6n.

47

Acido adtico Acido propi6nico Acid0 butirico

Tiempo de retención (minutos)

O. 87 1.55 2.36

1.- Obtenida la muestra del cultivo (5 ml), colocar en .un tubo d su contenido y centrlfugar a 5000 rpm durante 25 minutos.

e centrífuga

2.- Separar el sobrenadante con la ayuda de una jeringa y filtrar con m6mhrana de 45 ,u colocar 1 m1 del ffltrado en un tubo con tap6n de rosca, provisto de una membrana de hule para evitar la volatilizaci6n de los compuestos.

3.- Adicionar 100 y1 de una soluci6n de HCL 3N a 1 mi del flltrado. Este paso se realiza para acidificar la muestra y disociar sus componentes, evitando que se retengan los compuestos en la columna.

4.- Se procede al encendido del equipo, abriendo las Wla del tanque de N2 para estabilizar el equipo.

5.- Encender la flama del equipo, para ello se abren las vdvulas de los tanques de hidrbgeno y aire, oprimir la tecla Shiff-Ignite (20 seg) y esperar a que en la pantalla aparezca que la flarna esta encendida (verificar con la tecla Status).

, 6.- Dejar estabillzando el equipo por 12 h.

7,- Encender el integrador y programar atenuacidn = 16, velocidad de carta 0.5, tiempo de integraci6n 3.5 m i n , Nivel 1000 2 2, observacidn del ruido no mayor a 50.

1

8.- Programar el equipo con la cantidad de testigos, muestras y lavados de la

9.- Iniciar la programaci6n y reportar los resultados. columna.

48

4.8.10. AnAlisis de gases (Metabolímetro)

El metabolímetro o calorímetro es un sistema de medici6n que tiene como prop6sito medir el metabolismo basal de algún ser viviente (Durken, 1979), midiendo fundamentalmente las concentraciones de los gases flsiol6gicos (Oxígeno y bi6xido de carbono) durante el ciclo de respiraci6n; pensando que el metabolismo basal es principalmente un proceso de combusti6n observable por el consumo de Oxígeno y producci6n de bihddo de carbono (Cadena, et al. 1993).

El equipo utilizado fue desarrollado en f.a Universidad Aut6noma Metropolitana Unidad Iztapalapa; consta de un detector infrarrojo para COZ y un detector paramagnCtico para 02. Es un sistema de a n a s i s tCrmico y deflecci6n basados en la fuerte afinidad de O2 por un c a m p magnetic0 y un medidor de flujo de la mezcla de gases que entra al sistema. El equipo esta provisto de una computadora que permite realizar la calibraci6n automAtica de los detectores, la programaci6n de la frecuencia del an&Usis y almacenamlento de datos de forma continua con capacidad para 11 muestras.

La calibraci6n se realiza cada 4 h mediante el suministro de flujo de N2, y de una mezcla de concentraciones conocidas de C02 y 0 2 . El programa almacena en forma de tablas los resultados del a n U i s de COZ y O2 en porciento, y el flujo del gas en ml/min (Saucedo-Castañeda, 1991 y Saucedo, et al. 1996).

El an&liSis se llev6 acabo en columnas de fermentaci6n tipo Raimbault descritas en la Secci6n 4.4b, monitoreando la producci6n de C 0 2 y 02 durante un periodo de 120 h.

4.9. Identificaci6n quimica de compuestos

La identificaci6n de los componentes de una mezcla implica, primero, la separaclbn de ellos en compuestos individuales y, segundo la caracterizaci6n de cada uno de estos íiltimos, es por ello que la separacidn de los compuestos debe ser tan cuantitativa como sea posible para obtener idea aproximada del porcentaje real de cada componente.

49

Es por ello que los anasis quimicos para determinar las estructuras o composici6n de un material de estudio deben ser selectivos o tener un grado de sensibilidad elevado para asegurar que los resultados sean confiables. Para la identificacibn de grupos funcionales de moltculas presentes en un probibtico se utilizaron las ttcnicas que a continuaci6n se describen.

Para ello se parti6 de 120 g de un producto de FS elegido (fermentado sdlido con P. roquefortfi) realizando extracciones sucesivas con disolventes de diferente polaridad, puriflcaci6n de compuestos e identificaci6n quimica.

4.9.1. Extraccidn con disolventes de diferente poladdad

Se realizaron extracciones con Hexano, Acetato de etilo, Etanol y Agua (Ver Tabla 4.4), el mttodo consiste en extraer mediante un extractor de flujo continuo los compuestos producidos durante la fermentaci6n s6lida siguiendo la presente ttcnica.

1.- Pesar 120 g del producto a extraer, y colocarlo en un cono de papel ffltro.

2.- Colocar el cono en un soxtler, embonar el soMler en un matraz bola de 250 ml que contiene perlas de vidrio (parte inferior), y en la parte superior del soxtler colocar un refiigerante, sujetar estos materiales a un soporte (Ver Figura 4.9).

3.- Adicionar 200 ml de Hexano (previamente destilado), y colocar el matraz bola en una parrilla y esperar a que el disolvente empiece a ebullir observando reflujo en el sistema,

4.- Si el disolvente ebulle pero no refluja, colocar papel aluminio en las paredes del soxtler para conservar la temperatura y permitir que se evapore el disolvente y empiece a recircular.

6.- Esperar 24 h a flujo constante y cambiar de disolvente (Acetato B ETOH y Agua), y realizar el mismo procedimiento a parUr del punto 3.

50

6.- Recuperar el extracto de Hexano en un matraz bola de 250 ml y concentrar con la ayuda de un rotavapor, realizar el mismo procedtmiento para las extracciones sucesivas

7.- Colocar el concentrado en un vaso de precipitado (previamente llevado a peso constante), y dejar evaporar el residuo de disolvente.

8.- Pesar el vaso de pre,Apitado y por diferencia de peso obtener los gramos de extracto recuperado: coh Hexa'no, Acetato de etilo, Etanol, y Agua.

.c" Refrigerante

a-, Soxtler

Figura 4.9. Extracci6n con disolventes.

51

Del producto inicial (120 g ), se recupeararon 0.32 g del extracto con hexano, 0.71 g del extracto con acetato de etllo, 7.42 g de extracto etan6lico y 97.75 g de extracto acuoso. A cada uno de los extractos se les realiz6 el an&.bis de actividad probi6tica descrito en las Secciones 4.8.2b3, 4.8.6, 4.8.8 y 4.8.9.

4.9.2. Purificaci6n de compuestos

O

Se utilizaron columnas gravitatorias compactadas en seco con gel de sílice marca Merck en dos tamaños de malla, 35-70 (0,2-0.5 mm) y.230-400 (0.040-0.063). Se emplearon disolventes de grado industrial y se purificaron por destilaci6n a traves de una columna de rectificaci6n. La eluci6n de los compuestos se hizo utilizando un gradiente de polaridades, comenzando con hexano puro y mezclas de h e b o - acetato de etilo, acetato de etilo, acetato de etilo- etanol, etanol, etanol- agua y finahando con agua.

Se realizaron cromatografias en capa fina sobre soporte de vidrio, empleando gel de silice marca Merck 60 GF 254. revelando con luz ultravioleta de onda corta y onda larga (254 - 365 nm) y mediante el empleo de vapores de iodo.

La purificaci6n consiste en el aislamiento de compuestos a partir de extracciones sucesivas con disolventes de distinta polaridad, para este fin se utiliz6 la tCcnica convencional de cromatogrda en columna gravitatoria, cristallzaci6n y cromatograffa en capa fha. La confbmaci6n de un compuesto puro se realiza por el ancllisis de punto de iüsi6n y se compara en tablas.

Obtenido el concentrado de inter& se procede de la siguiente manera.

a) CromatografZa en columna pavitatoria

1.- En una columna cromato@ca de 50 cm de largo por 4 cm de ditimetro (Ver Figura 4. lo), colocar una cama de algod6n de aprox 0.5 mm de espesor y empacar con gel de sílice marca Merck de tamaño de partícula entre 0.2 - 0.5 m m ,

hasta una altura de 5 cm.

2.- Agregar gel de sílice marca Merck de 0.040 - 0.063 mm hasta una altura de 20 cm aprox, y colocar una cama de algod6n de 5 cm de espesor, colocapdo encima

52

de esta la cabeza de la columna (Mezcla del 80 g de extracto acuoso con una porci6n de gel de sílice).

3.- Agregar 500 ml de Hexano al 100% y abrir la llave de la columna y esperar a que fluya el disolvente.

NOTA En este estudio se eluy6 con las siguientes mezclas de disolventes: Hexano (1 OO%), Hexano-Acetato (80:20), Hexano-Acetato (60:40), Hexano-Acetato (20:80), Acetato (loo%), Acetato-Etanol (5:95), Acetato-Etanol (95:5), Acetato- Etanol (90: lo), Acetato-Etanol (85: 15), Acetato-Etanol (80:20), Etanol (loo%), Etanol-Agua (80:20), Etanol-Agua (60:40), Etanol-Agua (40:60), Etanol-Agua (20:80), Etanol-Agua (80:ZO) y Agua (100%).

4.- Reciblr 250 ml de cada eluci6n en un matraz bola de 700 ml y concentrar en rotavapor. Este concentrado corresponde a una fracci6n.

S.- Colocar el concentrado en un vaso de precipitado (previamente llevado a peso constante), lavando 3 veces el matraz bola para recuperar los residuos de las paredes del matraz.

6.- Dejar evaporar el residuo de disolvente contenido en el vaso de precipitado.

La adicidn del disolvente debe ser de lo menos polar a lo m8s polar, considerando que la gel de sílice es polar y retiene a los compuestos con esta afinidad, por lo tanto los compuestos polares suelen ser los primeros en obtenerse.

Posteriormente se realiza una cromatografia en capa Ana para observar los componentes presentes en cada fracci6n y poder agrupar algunas fracciones que presenten el mismo corrimiento en placa.

53

Algodón - Mwstra 8 - b

0.2 -0.5 m

O. 040-0.063 mm

Figura 4.10. CromatogI-afia en columna gravitatoria.

b) Cristalizaciiin

La cristalizaci6n se puede observar cuando se ha evaporado por completo el disolvente contenido en el vaso de precipitado (Punto 6 de la tkcnica anterior). La cristalizacidn no se presenta en la mayoría de los casos, pero es indicativo en ocasiones de la presencia de un compuesto puro y significa el final de la purificaci6n. Cuando no se presentan cristales, se realiza una cromatografía en capa flna, en donde se pueden agrupar por bloques las fracciones que presenten las mismas características cromatografkas y se procede a una nueva puriflcaci6n en columna gravitatoria. Obtenidos los cristales se somete la muestra a una anfilisis de RMN 1H y 1%.

54

c) Cromatografía en capa fina

Las placas cromatogMcas se realizan empleando gel de s l k e marca Merk 60 GF-254 sobre soportes de vidrio, la tCcnica se presenta a continuación.

1.- Preparar una placa cromatogrMca con gel de sílice Merk GF-254.

2.- Seca la placa cromatogrmca y con el uso de capilares se toman pequeñas muestras de las fracciones obtenidas, y se colocan en la placa. Las muestras deben eluirse con el disolvente adecuado según la polaridad de los productos a separar.

3.- Se coloca la placa en una cámara que contiene el disolvente indicado para eluir la muestra y se deja correr hasta una tercera parte de la placa cromatogfica.

4.- Se deja secar la placa y se observa en luz ultravioleta a dos longitudes de onda 365 nm y 254 nm. En la placa se observara los componentes de cada fYacci6n representado por manchas de color fluorescente bien definidas.

5.- La placa cromatográflca tambien puede ser revelada con vapores de Iodo, en donde se observan manchas de color café.

4.9.3. Identificación de compuestos

La elucidaci6n estructural de los metabolitos aislados se efectuó mediante el empleo de tecnicas espectrosc6picas utilizando un equipo de resonancia magnetic0 nuclear (lH, 13C), Gemini 200 marca Varian. Los puntos de fusi611 fueron leídos en un aparato Fisher-Johns y no e s t h corregidos.

55

I

,

.

Resultados y Discusión

56

Resuitados y Discusión

5.1. ADAPTACI~N Y CRECIMIENTO DE CEPAS HONGOS FILAMENTOSOS EN DOS MEDIOS DE CULTIVO lpDA Y PCS)

En esta parte experimental se presentan los resultados de adaptaci6n de 4 cepas de hongos Alamentosos al cultivarse en medio PDA 3' pasta de copra simple (PCS) durante 120 h a 30" C. Se analiz6 el crecimiento radial, axial y la cuantiflcaci6n de biomasa en ambos medios de cultivo. Así mismo se reallzzi una isotenna de adsorci6n de agua de pasta de copra para conocer la humedad y actividad de agua id6nea para realizar cultivos en fermentaci6n s6lida.

5. l. l. Crecimiento radial en caja Petri con medios PDA y PCS

En las Figuras 5.1 y 5.2 se muestra el crecimiento radial de 4 hongos Alamentosos; cuyo objeto fue medir la capacidad de invasi6n micellar en un medio de cultivo para hongos (PDA) y en un medio de infusi6n pasta de copra simple (ES), siendo el modelo de estudio cajas Petri de 10 cm de dihetro.

Y U

Y

O O 20 40 60 80 1 O 0 120

Tiempo (h)

Figura 6.1. Creclmiento radial en medio PDA de (A) P. roquefomi, (*)R. nigrlcczns, ( X ) A. oryzae 2094, ( X ) A. oryzae 2095 incubados a 30" C en cajas Petri.

57

Resultados y Discusión

En la Figura 5.1 se observa que la cepa de R. nfgrfcans es la que tiene una invasic5n micellar miis riipida, teniendo un comportamiento similar la cepa de P. roquefortif misma que presenta su fase exponencial entre las 20 y 60 horas de cultivo. Respecto a las cepas de A. oyzae 2094 y 2095 mostraron un perfil muy similar durante el cultivo, siendo estas las de menor invasi6n micellar.

Hay que destacar que estos resultados coinciden con los reportados por Pineda y Perez en 1996, en donde observan que la cepa de R. nfgrfcans y P. roquefortll son las que invade en menor tiempo el sustrato, así mismo Flores y Garcia en 1995 reportan que las cepas que tienen mejor velocidad de crecimiento radial son Rhizopuscon3.11 cm/dia,Aspergillus 1.93cm/díayPenlctlZum0.14cm/dia.

5 9 r

O o 20 40 60 80 100 120

Tiempo (h)

Figura 6.2. Crecimiento radial en medio PCS de( A) P. roquefortif, (*)R. nigrlcans, ( X ) A. oryzae 2094, ( X ) A. oryzae 2095 incubadas a 30" C en cajas Petri.

58

En la Figura 5.2. se muestra el crecimiento radial en PCS en donde se observa que todas las cepas tienen un perfil de crecimiento micellar similar ai de la Figura 5. l . Sin embargo hay que destacar que en todos los casos la invasibn en caja Petri se manifiesta en un periodo de cultivo miis corto (50-70 h), lo que indica que el medio PCS tiene probablemente m& nutrientes disponibles, propios de los s6lidos solubles de la pasta de copra.

El crecimiento radial expresado anteriormente es un metodo bgsico para estudiar la fisiología de los microorganismos. El diAnxtro de las colonias y la velocidad de crecimiento radial (VCR) son par-etros empleados en diversos estudios microbiol6gicos como los reportados por Trinci en 1969, en donde menciona que la velocidad de crecimiento hifal en hongos tiene un comportamiento lineal y que puede ser expresado en termino de velocidad empleando para ello las pendientes propias de cada cepa, obteniendo así las velocidades reales de invasi6n miceliar en cultivos de hongos filamentosos. En la Secci6n 5.3 se presenta la comparaci6n de las velocidades de crecimiento radial de cada cepa evaluada en medio PDA y P C S .

5.1.2. Crecimiento axial en columnas de FS empleando difusi¿ín skmplc

La capacidad de invasi6n observada al realizar el andisis de crecimiento axial y crecimiento radial coinciden en ambos casos, sin embargo hay que resaltar que en el cultivo axial se esperaba una ínvasi6n total en las columnas, sin embargo no se present6 así debido posiblemente a que este tipo de anhlisis se realiz6 por dffisi6n simple (sin aireaci6n constante a 30" C), existiendo la posibilidad de que la humedad inicial (55%) del cultivo de la pasta de copra, se fuera perdiendo con el transcurso del tiempo, ello impidi6 posiblemente, que los microorganismos perdieran la capacidad de invasi6n, ya que es sabido que necesitan un mínimo de humedad y actividad de agua para realizar sus actividades metab6lícas. Con ello se puede justiflcar que el crecimiento axial en columna no result6 el esperado (invasi6n compketa).

59

14

12

10

8

6

4

2

O O 20 40 60 80 100 120 140 160 1UC

Tiempo (h)

Figura 6.3. Crecimiento axLal en columnas de fermentaci6n. aireadas pcrr diíüsi6n simple. En donde: (A) P. roquefortll, (e) R. nigrtcam, ( X ) A. oqzae 2094.

( X ) A. oryzae 2095.

En la Figura 5.3 se expresan los resultados de crecimiento axial en columna de F S con pasta de copra por difusi6n simple, observado que la cepa de R. nigrlcans invade completamente la columna a l final del cultivo. Las cepas restantes presentan una invasi6n &S lenta en una cuarta parte de la columna y no presentan invasi6n aparente desde las 60 h.

Con este estudio se pretendía conocer la adaptaci6n de microorganismos al sustrato (pasta de copra), sin embargo los resultados hacen suponer que es necesario que los mlcroorganismos se encuentre en un ambiente id6neo para realizar SU funciones metab6licas y que la limitante en este tipo de procesos es entre otros, es la falta de una aireaci6n constante durante el cultivo.

60

b.1.3. Comparacibn de la velocidad de crecimiento axial y radial

En la Figura 5.4 se muestra la velocidad de invasi6n radial ex dos medios de cultivo PDA y PCS, mismas que se calcularon con el valor de la pendiente en la parte lineal de crecimiento; observando que las cepas que tienen mayor velocidad de crecimiento en caja petri son las mismas que invaden con mayor rapidez el sustrato (Figura 5.5).

f 2.0 Y - 1.8 II m 1 1.6 o 1.4

.t = 1.2 E 1.0 8 0.8

0.6 0.4

+r

.I

u W

... 1 0.2

IFigura 8.4. Velocidad de crecimiento radial en un cultivo de 120 h a 30" C de las cepas (A) R. nfgricans, (B) P. roquefortll, (C) A. oyzae 2094 y (D) A. oyzae 2095. En

donde: 6 medio PDA y 0 medio PCS

61

Resultados y Discusidn

€ 1.2

.m ?5

I 1 O CI c .S 0.8 E e 0.6 8 0.4

= 0.2 B o

.I

V

v n Y o I

A B C D CEPAS

Figura 5.5. Velocidad de crecimiento axial en un cultivo de 180 h a 30" C en pasta de copra en donde: (A) R. nfgrlcans, (B) P. roquefortif, (C) A oryzae 2094 y

(D) A. oyzae 2095.

Con el analisis de velocidad de crecimiento axial y radial expresado con valores de la pendiente es posible seleccionar las cepas de hongos Alamentosos a utilizar en cultivos en medio &lido, así mismo es indicativo del comportamiento y adaptaci6n de las cepas a un sustrato determinado, por ejemplo la velocidad de crecimiento radial en medio PDA y P a , en donde se observa que hay dHerencías al utilizar dfferentes medios de cultivo, en donde el indicativo principal es la densidad de la colonia e invasi6n micellar. Según Trinci en 1969 menciona que existe una variaci6n de la densidad de la colonia dependiendo del habitat en donde se encuentre el hongo fllamentoso, existiendo mayor extensi611 y dimetro de la colonia en sustratos con mejores nutrientes de donde adquieren la fuente de energía necesaria para realizar sus funciones metab6licas. Así mismo menciona que l a s colonias de hongos nunca tiene una densidad mayor que las bacterias o levaduras y la causa principal es probablemente porque en la fase hifal existe una limitaci6n de oxígeno.

62

Resultados y Mscusi6n

6.1.4. Produccih de biomasa en caja petri

En la Figura 5.6 se expresa la producci6n de biomasa al Anal del cultivo en dos medios de cultivo, en donde se observa que existen diferencias marcadas al

utilizar uno u otro medio, indicando que existe mejor adaptad611 de 10s microorganismos en medio PCS. TambiCn se puede apreciar que la producci6n de biomasa es de 2 a 3 veces mayor en el medio PCS que en el medio PDA. Sin embargo al relacionar densidad de biomasa con la velocidad de crecimiento radial no edste ninguna correlaci6n, caso específico el de la cepa de R. nfgrlcans, así mismo las 3 cepas restantes mostraron una velocidad de crecimiento m& lenta pero su produccidn de biomasa fue mayor.

T cy 0.4 E

U Qa

ao.1

O

T

A B c 0 Cepas

Figura 5.6. Cuantificaci6n de biomasa en dos medios de cultivo (0 ) PDA y ( ) PCS despuds de 120 h de cultivo en donde: A) R. nigrfcans, B) P. roquefortii, C) A. oyzae

2094, C) A. oryzae 2095.

El antWis de producci6n de biomasa es importante ya que muestra en prtmer lugar la adaptaci6n de mkroorganismos a diferentes tipos de sustratos y en segundo la capacidad de reproducci6n de los mismos.

En procesos de FS se requiere que el microorganismo a utilizar tenga una alta producci6n de biomasa, con ello se garantiza que al mezclar el sustrato con el in6culo únicamente se encuentre presente el microorganismo de estudio.

63

Hesuitados y Discusión

5.1.5. Isoterma de adsorción de agua

L a capacidad de adsorción de agua de un sustrato es indicativo de la capacidad de retener agua suficiente para que un microorganismo pueda realizar su

funciones metabólicas en sistemas de baja actividad de agua. Esto es importante. puesto que el crecimiento. esporulación, producción de enzimas y metabolitos están directamente innuenciados por la a\v (Gervnis. et al. 1988). I

0

8

80

60

40

20

O

O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Actividad de agua (aw)

Figura 5.7. Isoterma de adsorción de agua.

En la Figura 5.7 se presenta la relación de humedad - actividad de agua en el sustrato pasta de copra, encontrando que el punto de saturación se presenta a 78% 1

de humedad, registrando una actividad de agua de 0.995.

Con la isoterma se determini> la susceptibilidad del sustrato para ser utilizado en la fermentación sólida y con los resultados obtenidos se presume que la pasta de copra cs un sustrato potencialmente atractivo para el desarrollo de hongos filarnentosos: en base a este resultado se eligió la humedad de 60 % y 0.991 para los procesos de fermentación sólida.

64

ResuLtndos y Discusión

5.1.6. Conclusiones y discusión

Las cepas probadas mostraron una mejor adaptación en el medio PCS que en PDA. esto puede deberse a que este tipo de sustratos tenga mejores nutrientes de los cuales el microorganismo adquieren la fuente de energía para realizar sus

funciones metabólicas, Trinci, 1969.

Al relacionar la velocidad de crecimiento radial y axial se observó que l a s cepas que tienen mayor velocidad de crecimiento en caja petri son las mismas que invaden el sustrato pasta de copra.

a

Las cepas que mostraron mejor adaptacidn en el sustrato fueron las de R. nigricans y P. roquefortii, resultados que coincide con los reportes de b e d a y Perez en 1996 y Flores y Garcia, en 1995.

La densidad de crecimiento de las cepas probadas no esta directamente relacionada con la velocidad de invasión rniceliar en el sustrato pasta de copra. Los resultados obtenidos concuerdan con la teoría de Trinci. 1969 ya clue el cultivo con PCS se observó mejor densidad de biomasa que en el medio PDA y en el caso de la cepa de P. roquefortii se observó un incremento de biomass 3 veces mayor en PCS que en PDA. Según Trinci en menciona que existe una variación de la densidad de la colonia dependiendo del hábitat en donde se cncuentre el hongo filamentoso, existiendo mayor extensión y d i h e t r o de la colonia en sustratos con mejores nutrientes.

La isoterma de adsorción de agua de la pasta de copra determina la región de ex~erhnentación (% humedad - m), adecuada para este sustrato. encontrando que

para valores cercanos a 60 % la a v es relativamente alta (0.99 1).

65

66

Resultados y Discusi6n

Tabla 5.1. Valores iniciales y finales de los parhmetros evaluados a diferentes porcentajes de humedad en un proceso de FS con la cepa de A. oryzae 2094.

% Humedad Inicial Final

43 52 49 63

55 70

, 6 0 68

66 70

El anidisis de Hrdida de materia seca cs asociado a la oxidaci6n de la materia orghica en bi6xido de carbono que se pierde en la fase gaseosa. En este estudio la humedad a 55 % inicial result6 ser la mejor opci6n para el proceso de FS, ya que se observ6 una Hrdida de materia orghica de 32 %, seguido del anidisis con una humedad inicial de 49% obteniendo una Hrdida del 26%. Con estos resultados podemos decir que la PMS es consecuencia de la actividad metab6lica del microorganismo mismo que se manifest6 bajo condiciones controladas de cultivo que se mostr6 en la Secci6n 4.4 inciso a.

6.2.2. Resultados de la FS con cepas de hongos f?itnmentosos y levaduras

Con los resultados obtenidos de la Seccibn 5.2.1 se realizaron 6 F S , 4 de ellas con hongos Alamentosos y 2 con las levaduras K. marxianus y S. custelll. El cultivo partid de una humedad inicial de 55%, temperatura de 30" C y condiciones de cultivo reportadas en el inciso b de la Secci6n 4.4. El estudio fue monitoreado realizando an6lisis de gases, pH, @rada de materia seca y actividad de agua. El tiempo de cultivo fue diferente para cada cepa encontrhdose en un rango de 40 a 70 h, dependiendo la actividad metab6lica de cada microorganismo, observado con el anuis de respirometrh.

67

ResuLtados y Discusi6n

5.2.2.1. Anrllisis de gasea

P Para la evaluaci6n de la fomacidn de C 0 2 y consumo de O,, se consider6

que la concentracidn de estos compuestos en el aire es de 0.03% y 20.9%

respectivamente.

En la Figura 6.1 se muestra un ejemplo tipico de respirometría de la cepa de A. o y z a e 2095 durante la FS. En el gritfico (A ), se muestra la evoluci6n de CO, en pbrciento a la salida de la columna de fennentaci6n, mismo que fue registrado a la entrada del respir6metro (metabolímetro). El g M c o (C) muestra la producci6n total de COP producido durante el cultivo expresado en mg de CO,/g de materia seca inicial, este calculo se obtiene tomando en cuenta el flujo de aire de entrada al respir6metr0, representado en la Figura (D), de esta forma tenemos la producci6n total de CO,, que se puede comprobar con los resultados de perdida de materia seca. El grato (B) muestra la tasa instantftnea de producci6n de COP, reportada en mg de CO, / h g materia seca inicial que se obtiene empleando los datos del flujo de aire de entrada durante el proceso de FS.

5.2.2.2. Producci6n instanthea de COZ con las cepas de estudio

La Figura 5.8 ilustra la tasa de producci6n instanthea de C02, en donde se observa que la fase exponencial es diferente en cada tipo de microorganismo y nos da idea del estado flsiol6gico (fase de retardo, exponencial y estacionaria) del microorganismo de estudio en tiempo real sin interrumpir el cultivo ni toma de muestras destructivas, Saucedo- Castaiieda, 1991.

68

Zesuitados y Discusfdn

B A

O 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70

C

D 1201 t

100.

80

20 4 I

.. 40

.. 60

..

O 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 mempo m) mempo m1

Figura 6.8. GrWcos representativos del anusis de gases en FS.

69

a

25

20

15

10

5

O

Figura 5.9. Producción instantanea de C02 con diferentes microorganismos. En

En donde: m A. onJzae 2094, n A. oryzae 2095. R. nigrlcans, O P. roquefortii, I S. castelli, 3 K. marxianus.

En el gráfico de la Figura 5.9 se aprecia que la cepa de P. roquefortif alcanza la mayor producci6n (25 mg de C 0 2 / h g NISI). en un tiempo de cultivo de 43 h, seguido por las cepas de A. oryzae 2094 1 8 mg C 0 2 a 24 h y 2 1 mg C02 a 38 h), A. oyzae 2095 (18 rng @O2 a 38 h) y a. nigrtcans (20 mg c02 a 24h).

También se puede apreciar que ek cultivo con Ba cepa de A. oryzae 2094 presentó dos picos de producci6n de C02, este comportamiento del cultivo fue similar al reportado por Pineda y Perez en 1996, en donde obtienen el primer picÓ de producción las 24 h con 7 mg de CO2 y el segundo pico a las 30 h con 11.5 mg de COZ. Sin embargo se desconoce porque se presenta este tipo de comportamiento.

En primera instancia podría parecer presencia de algún agente extraño al cultivo, pero los reportes indican que posiblemente exista la presencia de algún tipo de mecanismo que actúe a destiempo durante el cultivo y con ello se inicie nuevamente la producci6n de CO2.

70

Hay que destacar que estos resultados coinciden con la pérdida de materia seca evaluada ai final del cultívo, (Tabla 5.2) por lo que hay que considerar que el análisis de gases es un buen método para relacionar la producción de C O Z y

pkrdida de materia. seca. En todos los casos se obsewa que la fase de retardo es de aproximadamente 8 h y que pueden ser atribuidos ai tiempo de germinacibn de esporas en las condiciones de estudio. o

bl

500

4-00

300

200

100

O O 20 40 60 70

En la Figura 5.10 se observa que Ea cepa de P. roquefortlf, A. oryzea 2094 y 2095, son las que tienen la mayor prociuccb6n total de COZ, produciendo 500, 550, 450 mg CSz/g MSI respectivamente. Los resultados obtenidos de las cepas de S. caste¿¿¿ y K. marxianus son comparables C Q H ~ los estudios realizados por Pineda y Perez en 1996, en donde obtienen un total E40 y 160 mg C 0 2 / g MSI, en este estudio se obtuvieron 150 y 140 mg COZ respectivamente.

71

En la Tabla 5.2 se puede comparar los resultados de las fermentaciones con distintas cepas, en donde se aprecia que la mayor perdida de materia seca se presenta en los hongos fllsunentosos, a s í como la tasa mtbdmas de producci6n de COZ, esto sugiere que estoti , microorg&~mos* tienen m e c a m o s especacm que permiten la invasi6n al sustrato, caso contrario al de las cepas de levaduras que presenta una invasi6n mas lenta, y esto puede deberse a que los hongos filamentosos tienen Mas que le permiten invadir con mayor rapidez el sustrato, dato que se confirma con l c s resultados obtenidos en la secci6n anterior de los anasis de velocidad de dreci~ niento radial.

' *

En el caso del an$&& de pH se obsem6 que en todos los casos aument6 en dos unidades, la actividad de agua present6 una varla'ci6n entre el inicio y final del cultivo de f 0.2 en todos los casos.

I

Tabla 6.2 Comparaci6n de pax4metros ffnales de las F 3 con distinta cepa

Microorganismo

S. casteltl

72

Resultados y Discusidn

5.2.3. Conclusiones y discusión

O Humedades iniciales mayores a 60 % no favorecen las condiciones de cultivo, ya que posiblemente el sistema se limita en 02 por problemas de transferencia de masa.

En el primer grupo de resultados las humedades iniciales de 49 y 55 %

fueron las que presentaron mejor actividad metab6lica. resultado que se relaciona con la PMS 26 y 32 % respectivamente, de esta forma fue posible establecer las condiciones iddneas de cultivo en FS para hongos filamentosos y levaduras. Con estos resultados se decidi6 utilizar una humedad inicial de 55 % con una a, de 0.989.

a

Con respecto al segundo grupo de anus is fue posible obtener el material disponible de la fermentacidn con cada cepa para los anasis de actividad probi6tica que se presenta en la Secci6n 5.3.

El an2il.isis de gases fue indicativo de la actividad microbiana de cada una de las cepas, así como del tiempo en que se presentan las diferentes fases de crecimiento y tiempo de fermentaci6n.

Las cepas que presentaron mayor actividad microbiana en la FS de la pasta de copra fueron en general las cepas de hongos fllamentosos no así las cepas de levaduras.

L a mayor perdida de materia seca se present6 con la cepa de R. nigrlcuns con un 40.1%, la cepa de A. o y z a e 2094, P. roquefortii y A. o y z a e 2095 presentaron una perdida de 29.3, 28 y 27.5 % respectivamente.

73

5.3. EVALUACIóN DE LA ACTIVIDAD PROBIOTICA 2 E PRODUCTOS OBTENIDOS DE FS CON PRODUCTOS COMERCIALES

En esta secci6n se presentan los resultados obtenidos ai cvaiuar 6 productos obtenidos por FS descritos en secciones anteriores, mismos que fueron evaluados con 3 probi6ticos comerciales Lacto-sacc, Yea-sacc 8417 y Yea-sacc 1026. El estudio se realiz6 mediante el empleo de cultivos anaerobios, utilizaud la bacteria de origen ruminal M. elsdentt. Los, testigos de fueron agua destilada y filtrada, así como '

pasta de volAtiles biomasa adicion6 FS .

copra sin fermentar. Se realiz&on adimiis a n a s i s de pH, Acidos gragos (propi6nic0, acetic0 y butírico), consumo de Bcido lAcUco y producci6n de por duplicado: el tiempo de cultivo fue de 33 h a 37°C. En cada caso se en una relaci6n (v/v) '21 2% del control, probi6tico comercial 6 'producto de

5.3. l. Evoluci6n del pH

4 I I I I I I I I I I I 4 I

O 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

Figura 5.1 1. Evoluci6n del pH durante el cultivo de M. elsdenff con diferentes probi6ticos, productos de FS o testigos. En donde: (A) P. roqueJortil, (4) R. nfgrfcans, ( X ) A oryzae 2094, ( X ) A. oryzue 2095, (o) Lacto-sacc, ( S ) K rnarxfanus, ( O) S castell¿ (m) Agua, ( 0) yea-sacc 1026 (A) Yea-sacc 8417, ( -) Pasta de copra sin fermentar.

74

En la Figura 5.1 1 se puede apreciar que tanto los produc'cs cic 5 , probi6ticos comerciales y testigos tienen una tendencia a estabilizarse en un rango de pH entre 6.5 - 8, a excepci6n del producto fermentado con la cepa Cc I-:. .':zarxLanm, que permanece a un pH Acido. En este estudio se observ6 que pH's iniciales menores a 5 no hay actividad biol6gica. ya que el intervalo óptimo de crecimiento para esta

.bacteria es de 6.5 - 7. Por ello es conveniente que los valores de pH al inicio de la fermentación se encuentre en el rango antes mencionado ya que estA directamente relacionado con la producci6n de biomasa. En algunas. investigaciones se ha demostrado que la incorporaci6n de cultivos de hongos han contrarrestado en algunos casos la caída del pH despuCs de la ingesta (Fuller, R. 1989). En este estudio se esperaba que al adicionar el 2% de un aditivo el p H permaneciera constante o tendiera a estabilizarse a pH 6 ó 7, sin embargo se puede apreciar que existen variaciones importantes con la adición de diferentes aditivos, ya sea probi6ticos, productos de FS o testigos.

6.3.2. Producción de biomasa

En la Figura 5.12 se presentan la evoluci6n de la producci6n de biomasa al adicionar al cultivo 2% de probi6ticos comerciales ó testigos (agua y pasta de copra sin fermentar). En este estudio se observ6 que al adicionar probi6ticos comerciales la biomasa incrementa a valores de 0.55 g/L y permanece estable despues de 15 horas de cultivo. Por otro lado cuando al cultivo se le adiciona solo agua la biomasa llega a un m&dmo de 0.5 g / L entre las 10 y 15 horas de cultivo y posteriormente disminuye su producci6n. Un dato importante en este anfilisis es que la pasta de copra sin fermentar no presenta efecto sobre el crecimiento de M. elsdenft ya que el rniudmo valor se presenta a las 30 h con 0.23 g/L. Por otro lado si este resultado se compara con la cinCtica que se presenta en la Figura 5.13 se aprecia que la pasta de copra al ser fermentada con diferente cepa, existe un incremento notable con valores de biomasa que van de 0.4 a 0.6 g/L. Esto es importante ya que indica que la pasta de copra sin fermentar no favorece en gran medida el crecimiento de M. elsdenfi; pero si la pasta de copra, es sometida a un proceso fermentativo es posible obtener algunos compuestos que favorecen en gran medida el crecimiento y la estabilizaci6n de la biomasa de M. elsdenff en el cultivo.

75

Resultados y Discusión

a

U Q)

0.6

0.5

0.4

0.3

o. 2

o. 1

O

l- 1

I I I I I I I I I

O 5 10 15 20 25 3 0 35 Tiempo (h)

Figura 5.12. Producci6n de biomasa con probi6ticos comerciales y testigos. En donde: ( - ) Pasta de copra sin fermentar, ( o) Lacto-sacc, (M) Agua, (O) Yea-sacc

1026, ( A) Yea-sacc 84 17.

En la Figura 5.13 se muestran la evoluci6n de biomasa al adicionar al cultivo de M. ekdenff productos de FS; donde se aprecia que el perfil de produccidn de biomasa es muy similar cuando se adicionan probi6ticos comerciales (Figura 5 12). Esto significa que durante la fermentaci6n de la pasta de copra con diferentes aicroorganismos se sintetizaron posiblemente algunos biomolkculas o compuestos que son potencialmente activos y que son utilizados por la bacteria ruminal M. ekdenti para su crecimiento; con lo cual estabiliza su biomasa microbiana durante la mayor parte del cultivo.

1

76

Resultados y Dfscersit5n

(u U

O. 7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

o. 1

O

T

O 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (h)

Pigura 5.13. Producci6n de biomasa con productos de FS. En donde: ( o) S. castellf, (X ) A. oryzae 2095, ( A) P. roquefortil, . ( X ) A. oryzae 2094, ( n)K.

marxianus,(e)R. nfgricans.

Si se compara en tCrminos de biomasa miudma alcanzada y estabilidad del cultivo se encontr6 que hay 2 de los productos de FS (P. roqueJortfl y A. oryzae 2095 que son comparables con el efecto obtenido con el probi6tico comercial Lacto-sacc).

Por otro lado, el efecto del uso producto de la FS, S. castellf fue comparable con el probi6tico comercial Yea - sacc 841 7. Esto nos permite suponer que los productos de FS pueden ser potencialmente atractivos para ser utilizados como aditivos en la alimentacih animal, ya que de igual forma como los productos comerciales aportan un efecto benefic0 en el cultivo. ver Figura 5.14.

77

Resultados g Discusi&n

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

o. 1

O O 5 10 1 S 20 25 3 0 3 5

Tiempo (h)

Figura 6.14. Compamcidn de la producci6n de biomasa de 3 productos de F S con 2 probi6ticos comerciales. En donde: (o) Lacto-sacc, ( A) Yea-sacc 8417, (m) Agua,

( A) P . roquefortil, ( X ) A. oryzae 2095, ( o) S . castelk

En diversos estudios se ha mencionado que extractos fermentados de A. oyzae (Amaferm), extractos de S. cerevfsiae han tenido efecto sobre el numero de bacterias ruminales (estudios In oleo), existiendo efecto sobre microorganismos aislados del rumen (S. rurnlnantiurn y M. elsdenil), Nisbet y Martin, 1990 y 1991 , Wiedmeier y Arambel, 1987 y Chiquette, 1995.

En la mayoría de los casos el control utilizado es agua, y al realizar la cinCtica de crecimiento microbian0 se observan diferencias signiAcativas en cuanto a su producci6n, Ejemplo de ello en los estudios de Campos, et al. 1995 en donde prueba probidticos a base de extractos de A. oryzae, A. nfger y S. cereofslae observando diferencias significativas (PC 0.05) de efecto probi6tico en producci6n de biomasa, proteína y Acid0 acCtico, al incorporar estos aditivos.

78

A diferencia de otros estudios en este se prob6 el efecto probibtico de la pasta de copra fermentada con diferentes microorganismos, teniendo cDmo teoría que al fermentarse el sustrato pasta de copra se liberan metabolitos que Lieilen un efecto sobre el microorganismo que lo consume. Por lo tanto en este estudio se observ6 que los productos de F3 (adicionando únicamente la fracci6n soluble), estimulan el crecimiento de M. elsdenii.

5.3.3. Consumo de ácid0 láctico

Las Figuras 5.15, 5.16 y 5.17 muestran el perfil de consumo del Bcido lBctico durante el cultivo con M. elsdenii, en donde se observa que el comportamiento es muy similar no existiendo diferencias aparentes en el promedio global de los anBlisis. Si se observa a detalle cada una de las figuras se puede apreciar la velocidad de consumo en cada caso. Por ejemplo en la Figura 5.16 se presenta el consumo de ticido lactic0 de los productos de FS en donde se observa un comportamiento similar de asimilaci6n de Bcido L-LActico hacia las 18 h de cultivo con excepci6n del extracto fermentado de K. marxlanus, el cual no alcanza a consumirse totalmente despuCs de 33 h de cultivo, dejando un remanente de aproximadamente 2 g de Acid0 L-LActico.

En la Figura 5.15 se presenta el consumo de ticido lfictico al adicionar al cultivo probi6ticos comerciales 6 testigos, y se observa que con el uso de probi6ticos comerciales el consumo total se presenta hacia las 22 h de cultivo, por otro lado la adici6n de pasta de copra sin fermentar no se consume totalmente al termino del cultivo.

79

Resultados y Discusi6n

5.0

4.0

3,O

2 .o

1 .o

0,o

i5

O 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (h)

Figura 5.15. Consumo de Acid0 Uctico al adicionar al cultivo de M. elsdenff probi6ticos comerciales o testigos. En donde: (I) Pasta de copra. ( o) Lactosacc,

(O) Yea -saw 1026 ( m ) Agua, (A) Yea-sacc 8417.

5.0

0.0

O 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (h)

Figura 5.16. Consumo de &ido l&cUco al adicionar al cultivo de M. elsdenft productos de F S . En donde: (O) S. castelll, (X ) A. oryzae 2095, ( A) P. roquefomf,

( x ) A. oryzae 2094, (o) K. marxlanus, (e) R. nfgrlcans.

80

Resultados y Discusión

En la Figura 5.17 se agruparon únicamente aquellos probibticos comerciales con mejor actividad probi6tica, con los mejores productos de FS similares en crecimiento microbiano, logrando observar que no hay diferencias apreciables al utilizar el sustrato 8cido l&ctico ya que todos los cultivos lo consumen en un intervalo de 15 a 24 h.

5.0

4.0

3 .O

2,o

1 #O

0.0 O 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h) Figura 5.17. ComparacKh del consumo de Bcido lfrctico al adicionar 3 productos de FS y 2 probi6ticos comerciales. En donde: (o) Lactosacc,

( A) Yea-sacc 841 7, ( A) P. roquefortif, ( X ) A. oyzae 2095, ( m) Agua, (O) S. castelli.

El objetivo de este analisis e r a conocer la capacidad de consumo de la fuente de carbono (8cido lBctico), con la presencia de diferentes aditivos; observando que no existe diferencia aparente entre ellos. Sin embargo al reallzar los maisis de formaci6n de producto de fermentaci6n(8cidos grasos volhtiles), se observaron diferencias en todos los casos, resultados que se presentan en la Tabla 5.3.

81

ResuLLados !y Discusidn

8.3.4. Producci6n de dcidoe grasos VoMtiles

El an&Usis de Acidos grasos volAtiles es importante ya que a partir de ellos el rumiante obtiene la mayoría de la energía requerida para su metabolismo. la producci6n de acttico puede constituir las reservas de lípidos a travts de la lipogenesis, produciendo algunos trigllctridos componentes de la leche, mientras que el butirato se canalizaría para la producci6n de tejido adiposo con lipidos de mayor peso molecular. L a fermentaci6n propi6nica es considerada glucogenica y por tanto es posible utilizarlo como fuente de energía en la biosíntesis de macromoltculas como las proteínas,

En este estudio se puede observar que en promedio existe mayor formaci6n de Acidos grasos volAtiles en productos de FS que en probi6ticos comerciales, destacando que en orden de producci6n se encuentra el acttico seguido del propi6nico y butirico.

En la Tabla 5.3 se presenta el por ciento de producci6n de AGVs (propi6nic0, acetic0 y butírico), de cada uno de los cultivos al adicionar al cultivo de LM. ekderzft 2% de probi6ticos comerciales, productos de FS o testigos.

En cuanto a la fonnaci6n de Acidos grasos, se observ6 en todos los casos que hay mayor formaci6n de &ido acttico, seguido por Acid0 propi6nico y en menor cantidad Acido butírico. Estos resultados son comparables con los realizados por Campos, et al. 1995, en donde obtienen diferencias significativas (p< 0.05) con la adici6n de probi6ticos a base de microorganismos (hongos 6 levaduras), obteniendo en todos los casos mayor produccibn de Acid0 acttico.

Lo importante de esta tabla es la comparaci6n de fonnaci6n de producto al adicionar diferente tipo de aditivo; por ejemplo si se compara la producci6n de Acido acttico se observa que la mayor producci6n se alcanza con la adici6n de cultivos provenientes de FS, alcanzando en promedio un 60% de producci6n de Acido acCtico.

82

Resuitados y Mscusi6n

Tabla 5.3. Porcentaje de &cidos grasos producidos al Anal del cultivo de 33 h adicionando 2% de probi6ticos comerciales, productos de FS o testigos.

Adicidn de 2 % de producto de FS, % Butírico

probiótico comercial

A. oryzae 2094

51.52 47 Agua

2.78 38.4 1 58.81 K. mamfanus 2.2 43.43 58.11 S. custellf

2.12 41.87 56.01 P. roqueforttf 2.12 31.64 - 66.23 R. ntgrlcans 3.35 33.10 63.55 A. oryzae 2095

36.91 28.45 34.64

1.48

Lacto-sacc 37.78 31.84 30.38

Yea-sacc 1026 60.9 35.6 3 5

Yea-sacc 84 17

1.53 39.91 5 8 . 5 6 Pasta de copra S/FS

14.73 46.47 38.79

Por otro lado se aprecia que aún al adicionar pasta de copra sin fermentar se alcanza el mismo porcentaje de producci6n (60%), y en menor porcentaje (40 %) se presenta cuando se adicionan probi6ticos comerciales.

Respecto a la producci6n de &ido propi6nico existe un rango de producci6n entre 30 y 45 % en todos los casos; en cuanto a la producci6n de Acido butirico exlsten diferencias notables al adicionar al cultivo el probi6tico Lacto-sacc 6 Yea- sacc 84 17 o A. oryzae 2094, ya que son los que producen mayor cantidad de este Acido. Los otros aditivos presentaron una producci6n de Acido propi6nico menor, encontrhdose 2.5 % en promedio.

Obtenido estos resultados se compar6 la producci6n de los tres &cidos @asos volhtiles, con los mejores productos de FS y probibticos comerciales para ello la comparaci6n se hizo en base a que existieron 3 productos de FS y 2 probi6ticos comerciales con similar produccl6n de biomasa, parhetro importante para evaluar el efecto probi6tico.

83

Resultados y Discusi6n

A s í tenemos la siguientes apreciaciones: Se obse1v6 que al adicionar al cultivo el probi6tico comercial Lacto-sacc 6 productos de FS A. oryzae 2095 6 Y. roQuefortu existen diferencias de producci6n de &cid0 acCtico, favoreciendo en mayor porcentaje (60 %) por la adici6n de productos de FS; no hay diferencias en la producci6n de Acido propi6nico en ambos casos y existen diferencias de producci6n de Bcido butírico favorecido por la adici6n del probi6tico Lacto-sacc.

Por otro lado al comparar el probi6tico comercial Yea-sacc 84 17 con S. castellf se observa que existe mayor produccidn de &cid0 acCtico al adicionar al cultivo S. custellf, en cuanto a la producci6n de propi6nico no hay diferencia aparente y al producir Acido butírico se favorece con Yea-sacc 84 17.

La importáncia de producci6n de Acidos grasos se basa principalmente en la uUlizaci6n de estos Acidos como fuente de energía para que el rumiante realice sus funciones metab6licas, en segunda instancia son importantes ya que a partir de ellos se puede canalizar mejoras en la producci6n de carne o leche en los animales que lo consuman. El estudio realizado a pesar de ser fn uftro puede dar idea de lo que podría suceder en un sistema d s complejo ya sea In ufuo o In s f & .

NOTA Los datos de las cincticas de producci6n de AGVs de cada producto de F S , probi6ticos comerciales y testigos se presentan en el anexo 1

5.3.5. Balance de materia

Los balances de materia y energia son ampliamente utilizados en procesos bioquímicos, en biotecnología son poco usados por la complejidad que representan dichos procesos, ya que a veces resulta dificil medir la mayoría de las variables involucradas en el proceso como son: el consumo de fuente de carbono, nitr6geno y oxígeno, así como la producci6n de biomasa, CO;! y producto(s) fonnados(s).

En este sentido en este estudio se realiz6 únicamente el balance de carbono de sustrato y productos, considerando que la composici6n elemental de la biomasa se seleccion6 en base a la formula elemental CH1.8100.5 1N0.21, reportada por Roels en 1980, obtenida de un promedio de la composicidn de biomasa de los siguientes microorganismos.

84

candida utiifs CHI .8@0.56N0.20

KlebsfeUaaerogenes CH1.7500.43N0.22 Sccharonyces cereufsiae CHI .8 100.5 1NO. 17 Pamcoccus denftrifcans CH1.8100.51N0.20 Escherfchia coli CH1.7700.49N0.24 Aembacteraervgenes CH1.8300.55N0.25

En la Tabla 5.4. se muestran los coeficientes estequiomCtrfcos calculados en base a la fi-acci6n de carbono de cada molCcula, el mayor rendimiento corresponde a la producci6n de kid0 acCtico y seguido de kid0 propi6nico y COZ. En general se puede apreciar que el porciento de rendimiento en promedio es de 40% en la mapria de los casos: exceptuando el rendimiento al adicionar IC mQlXlQnu (20%) y pasta de copar s / n , en donde no se observ6 efecto benCflco del cultivo con M. elsdenff.

o

I

0.54 0.03 41 S. casteUf

33 0.02 O. 55 0.41 0.24 O. 10 Agua

20 0.02 0.20 0.25 0.24 0.06 K marxianus 40 0.02 0.49 0.61 0.24 O. 18

Lacto-sacc 0.23 0.24 0.42 0.43

28 .d - 0.01 0.27 0.33 ~ 0.24i ~~~~~~ 0.26 ~ ~~~~ ~

Pasta de copra s/FS 30 O. 03 0.28 0.40 0.24 0.18 Yea-sacc 1026 122 O. 73 1 .O3 1.38 0.24 0.26 Yea-sacc 84 17 47 0.46

Si se comparan los rendimientos de P. roquefortff y A. oryzae 2095 con el probi6tico Lacto-sacc no hay diferencias entre ellos, pero si existe diferencia al comparar S. castellf con el probi6tico comercial Yea-sacc 84 17.

En general se observa que existe un mayor rendimiento al adicionar al cultivo de M. productos de FS que probi6ticos comerciales, lo cual garantiza que estos productos pueden ser atractivos para ser suministrados en la dieta de rumiantes.

NOTA Los c;Uculos del balance de carbono se presentan en el anexo 25

85

5.3.6. Conclusiones y discusi6n

Los productos de FS P. roquefortlf, A. oryzae 2095 son comparables con el efecto probi6tico del probi6tico comercial Lacto-sacc.

El probi6tico comercial Yea- sacc 841 7 es comparable con el efecto probi6tico del producto de F3 S. castelk a

En todos los casos estudiados existe un consumo. total de Bcido hkCtiC0

hacia las 17 horas de cultivo, a excepci6n de la pasta de copra sin fermentar y el fermentado con K. nuux lQ~us .

' Con pH's iniciales menores a 5 no hay actividad bioMgica, ya que el intervalo 6ptimo de crecimiento para esta bacteria es de 6.5 - 7.

En cuanto a los perfiles de las fermentaciones, predomin6 el Bcido acCtico y propi6nico productos deseables en la fermentaci6n ruminal. ya que este Bcido puede constituir las reservas de lípidos a traves de la lipogenesis, produciendo algunos MglicCridos componentes de la leche, en el caso del &cid0 propi6nico es considerado glucogt5nico y por tanto es posible utilizarlo como fuente de energía en la biosfntesis de macromolt5culas como las proteínas.

Al comparar los productos obtenidos de la FS con probi6ticos comerciales, fue posible establecer similitudes entre ambos; a su vez se eligi6 un producto de FS tomando como criterio los resultados de actividad probi6tica de cada uno. En base a este criterio se tenían dos opciones: A. oryzae 2095 6 P. roquefortlf ya que eran comparables con el probi6tico comercial Lacto-sacc. Al comparar el rendimiento' no existi6 una diferencia significativa, solo existían diferencias en la producci6n de Acidos grasos. Por lo tanto se eligi6 el producto en base a su comportamiento fermentativo (FS); en este sentido se encontr6 que ambos productos despues de la fermentaci6n s6lida presentaron una p6rdida de materia seca de 30%, sin embargo al realizar un anidisis en microscopio 6ptico se observ6 que en el fermentado con P. roquefortff la invasi6n miceliar se present6 tanto el la parte externa de la columna como en la matriz de la mtsma, algo que no ocurri6 con ninguno de los otros fermentados, de tal manera que se pens6 que posiblemente en este material se podrían encontrar algunos compuestos m& simples que el microorganismo pudiera

1

86

S.3.6. Conclusiones y discusi6n

Los productos de FS P. roqueforttf, A. oyzae 2095 son comparables con el efecto probi6tico del probi6tico comercial Lacto-sacc.

El probidtico comero2ial Yea- sacc 8417 es comparable con el efecto probi6tico del producto de FS S. castelk

, 8

En todos los casos aestudiados’existe un consumo total de k id0 Uctico hacia las 17 horas de cultivo, a excepci6n de la pasta de copra sin fermentar y el fermentado con K. MQfxLcLRus.

Con pH’s iniciales mmores a 5 no hay acttvidad biol6gica, ya que el intervalo 6pUmo de crecimiento para esta bacteria es de 6.5 - 7.

En cuanto a los perfiles de las fermentaciones, pedomin6 el kid0 acetic0 y propi6nico productos deseables en la fermentaci6n ruminal. ya que este Acid0 puede constituir las reservas de lípidos a traves de la lipogenesis, produciendo algunos triglicCridos componentes de la leche, en el caso del &Ado propi6nico es considerado glucogenico y por tanto es posible utilizarlo como fuente de energía en la biosíntesis de macromol&xdas como las proteínas.

Al comparar los productos obtenidos de la FS con probi6ticos comerciales, fue posible establecer similitudes entre ambos; a su vez se eligi6 un producto de FS tomando como criteqio los resultados de actividad probi6tica de cada uno. En base a este criterio se tenían dos opciones: A. oryzae 2095 6 P. roqueforttt ya que eran comparables con el probi6tico comercial Lacto-sacc. Al comparar el rendimiento no existi6 una diferencia significativa, solo existían diferencias en la producci6n de &idos grasos. Por lo tanto se eligi6 el producto en base a su comportamiento fermentativo (m); en este sentido se encontr6 que ambos productos despues de la fermentaci6n s6lida presentaron una pkrdida de materia seca de 30%, sin embargo al realizar un anhlisis en microscopio 6ptico se observ6 que en el fermentado con P. roqueforttt la invasi6n micellar se present6 tanto el la parte externa de la columna como en la matriz de la misma, algo que no ocurri6 con ninguno de los otros fermentados, de tal manera que se pens6 que posiblemente en este materlal se podrían encontrar algunos compuestos m& simples que el microorganismo pudiera

86

.

Resultados y Discusi6n

O

utilizar como fuente de carbono en estudios posteriores. De esta forma se seleccion6 el fermentado de P. roquefortti en estudios de identificaci6n de compuestos con posible actividad probi6tica. Hay que destacar que el fermentado con A. oyzae 2095 tambiCn se pudo haber estudiado, sin embargo este estudio pretendía seleccionar uno de ellos pero se abre la posibilidad de estudiar otros productos de FS en un futuro.

El elegir productos de FS resultaría una alternativa de utWaci6n en la nutrici6n a n i m a l , a la par se propone una nueva estrategia que permita vislumbrar que los microorganismos probi6ticos no son los únicos responsables de presentar efectos benCAcos en el huCsped.

' El estudio global de esta secci6n a pesar de ser In uftro, da idea de lo que puede pasar al ser administrado el producto de FS en la dieta de rumiantes, no omitiendo que pueden existir cambios metab6licos al involucrar m8s de un microorf2anismo en la fermentaci6n ruminal.

07

"

Resultados y Discusión

6.4. EVALUACI~N DE LA ACTIVIDAD PROBI~TICA DE EXTRACTOS OBTENIDOS CON DIFERENTES DISOLVENTES

En esta Secci6n se presentan los resultados de la evaluaci6n probi6ticadel producto de FS f. roquefortlf, elegido el la Secci6n 5.3. Para realizar este estudio el producto elegido se liofiliz6 y ';e obtuvieron 150 g, de los cuales 120 g se utilizaron para realizar extracciones sucesivas con disolventes de distinta polaridad, partiendo de hexano, acetato de etilo, etznol y agua.

A cada extracto se le -ealizaron analisis de pH, producci6n de biomasa, consumo de acid0 lhctico y produccibn de AGVs,, empleando un cultivo de M. elsdenff. AdemAs de los frac Aones probadas se tuvieron 2 testigos: un liofilizado sin proceso de extracci6n y aln lioflkado tratado a 75" C durante 24 h. Este tratamiento se realiz6 debido a que en las extracciones con los diferentes disolventes la temperatura de extracci6n m i 6 de 68 a 92" C, de tal manera que se tom6 como temperatura promedio 75" C para corroborar si eldstia algtín efecto de temperatura al ser adicionado al cultivo de M. elsdenff.

5.4.1. Extraccidh ,

Se realizaron extracciones con: hexano, acetato de etilo, etanol y agua, dejando a reflujo durante 24 h en el equipo soxther. Se recuperaron 0.32 g de la extracci6n con hexano, 0.71 g con acetato de etilo, 7.42 g de etanol y 97.75 g de extracto acuoso.

88

Resultados y Discusi6n

5.4.2. Producción de biomasa

En la Figura 5.18 se presentan los resultados obtenidos de la cuantlficaci6n de biomasa, en donde se puede apreciar que el extracto acuoso presenta un incremento de biomasa de 0.65 g/ L hacia las 12 horas de cultivo, seguido de los controles lioflbado y liofflizado tratado a 75" C. este resultado muestra que los compuestos responsables de la estimulaci6n de crecimiento se encuentra en el extracto acuoso. Por otro lacio si se compara este graflco con los reportados en la Secci6n 5.3 (g-cos de biomasa) se aprecia claramente que al adicionar el extracto acuoso al cultivo sigue el mismo patr6n en producci6n de biomasa, de tal forma que con este resultado se demuest.ra que el extracto acuoso es potencialmente bioactlvo. Ademas fue posible establecer que hasta una temperatura de 75" C no existe un efecto negativo sobre la prpduc:ci6n de biomasa.

I /

+,

I I 1 I 5 10 15 20 26 30 35 40

Tfempo m) Figura 5.18. Concentracidn de biomasa de extractos obtenidos con disolventes

distinta polaridad, en donde: (A) extracto acuoso, (O ) extracto etanblico, (m) extracto de acetato de etilo, ( o) lioflllzado, (O ) Uofilizado tratado a 75" C.

89

de

ResuLtados y Dfscusi6n

5.4.3. Evoluci6n del pH

En el graflco 5.19 Se presenta la evoluci6n del pH durante el tiempo de cultivo, en donde se aprecia que los pH's al Anal del proceso permanecen en un intervalo de 6 a 6.5 unidadcs de pH, destacando que el pH del extracto acuoso tiende a estar mas estable entre el intervalo de pH deseable para el cultlvo de M. eisdenU, y que esta relaciorado directamente con la producci6n de biomasa. Hay que destacar que el control de pH fue cuidado desde el proceso de esterilizaci6n, sin embargo se presentaron variaciones importantes entre los diferentes cultivos.

X p.

6.8

6.6

6.4

6.2

6

5.8

5.6

5.4

5.2 5-7

I-- , I I I I I I I I

O 5 10 15 20 25 30 35 40 T i - P o ( h 1

Figura 5.19. Evoluci6n del pH en el cultivo de M. elsdenff, adicionado con extractos obtenidos con disolventes de distinta polaridad, en donde:(A) extracto acuoso, (0) extracto etandlico, (m) extracto de acetato de etilo, (o) liofllizado, (0) liofflizado tratado a 75" C.

90

Resuitados y Discusi6n

5.4.4. Consurno de ácid0 Utctico

En el grhfico 5.20 se puede apreciar que existe un consumo total de &cid0 lhctico entre las 12 a 2 0 lloras de cultivo, este comportamiento es similar al reportado en la Secci6n ac.terior (grhficos de L-LActico), en donde existe una *

reproducibilidad entre ambps grAficos, es impohante mencionar que los cultivog en los que se adicion6 etanol y acetato de etilo tardan m& tiempo en consumir el Acido lactic0 debido p H Acid0 que existia a las 15 horas de cultivo y mismos que se manifest6 en el escaso crecimiento.

4.0

3.5 5 3.0

m w 9 2.5 E 2.0 3 A 1.5

1 .o 0.5

0.0

-I-

I

O I - 7 - I

10 20 30 40

Figura 5.20. Consumo de &cid0 l&cuco de extractos obtenidos con disolventes de distinta polaridad, en donde:( A) Agua, (O ) etanol, ( m ) acetato de etilo, ( O ) liofilizado,

(0) liofillzado tratado a 75" C.

91

5.4.5. Produdtin de &idos grasos volfitiles

En la Tabla 5.5 se presenta el porcentaje de Acidos grasos volAtiles producidos al mal del cultivo con M. ebdenft, en donde se aprecia que en el extracto acuoso y extracto de acetato de etilo es donde se produce mayor cantidad de Acid0 acCtko.

Una de las aportaciones Lrnportmtqs de este anzilbis es la obsemci6n de una mayor eficiencia en la produkcibn de acttico y propi6nico. Este incremento podría ser consecuencia del proceso d'? extraccidn, en donde se concentracidn compuestos con características similares dc: polaridad, mismo que al ser adicionado al cultivo con M. elsdenff presentara un efkto benCfico en la produccidn de estos &idos. Otro de los puntos importantes, es .que el patrdn de fennentacibn fue muy similar al reportado en la secci6n anterio.' con lo cual se garantiza una alta reproducibilidad de los andlisis.

,

I

NOTA: Los datos de producci6n de AGVs de cada uno de los extractos evaluados se presentan en el anexo 3.

8.4.6. Balance de materia

En la Tabla 5.6 se presentan los coeficientes estequiornt5tricos en base a la fracci6n de carbono de cada producto.de fermentación de M. elsdentf por la adlci6n de dfferentes extractos, el mayor rendlmiento corresponde al actdo acCtico seguido del zicldo pmpibnico y Coz, Si se compara la Tabla 5.6 con la 5.6a se puede observar que la adici6n de l o s diferentes extractos a l culttvo de M. elsdenii tienen un efecto

92

benefic0 en la producci6n de &cid0 propi6nico. incrementando dos veces su producci6n. Con respecto a la producci6n de Acid0 acetico no existen diferencias de producci6n al adicionar el miamo producto de P. roquefortff despues de extracciones sucesivas con diferentes disolvmtes.

De este an8lisis se eQi6 el extracto acuoso por ser el que presentaba mejor actividad benefica sobre el cultivo de M. elsdenfi, ya que present6 un mejor rendimiento en los diferentes pi-oductos de la fermentaci6n.

czrbono al Anal del cultivo.

Lfofilizado 74 O 1.13 0.60 0.24 O. 17 Liopllzado 75" c 77 O 1.23 O. 56 0.24 O. 15

Tabla 5.6a. Coeficientes estequiomc5tricos en base a carbono al final del cultivo por I

Lacto-sacc.

NOTA: Los cAlculos de balance de carbono de los productos formados durante el cultivo de M. elsdenii con la adicidn de diferentes extractos se presenta en el anexo 4.

93

Resultados y Discusi6n

5.4.7. Conclusiones y discusión

El extracto acuoso mostr6 tener mejor efecto sobre los productos de fennentaci6n del cultivo con M'. elsdenii, mismo que present6 el mayor porcentaje de recuperaci6n (85 %).

Este resultado muestra que posiblemente los compuestos responsables deda actividad probi6tica se encuentra en el extracto acuoso.

Existe reproducibilldad en los resultados dea biomasa, consumo'de Uictico y producci6n de AGVs como los obtenidos en los ensayos de la Secci6n 5.3.

En todos los casos la fer mentaci6n que se favoreci6 fue la acCtica, seguida de la fermentaci6n propi6nica. no presen-dose producci6n de ácido butírico.

La importancia de estd parte experimental fue conocer el extracto m8s bioactivo para así poder realizar un fraccionamitnto en columna y poder elucidar los posibles compuestos presentes en el extracto. Ademas de aportar informaci6n del comportamiento microbiano al utillzar solo una porci6n del producto liofilizado.

94

Resuitados y Discusit5n

5.5. EVALUACI~N DE LA ACTIVIDAD PROBIOTICA DE FRACCIONES OBTENIDAS DEL EXTRACTO ACUOSO

En esta Secci6n se presentan los resultados obtenidos del fraccionamiento en columna del extracto acuoso, así como del anidisis de resultados de actividad probidtica al ser adicionados a. el cultivo de M. elsdenif.

I .

5.5.1. Fraccionamiento en columna del extracto acuoso

En la Secci6n 5.4 se iizo referencia del extracto con mejor actividad probi6tica (extracto acuoso). St: part16 de 80 g de extracto acuoso, de los cuales se recuper6 el 77.15 % (61.72 g), !;e obtuvieron 28 fracciones que fueron eluídas con diferentes mezclas de disolvenles, monitoreadas atrave de cromatogrdla en capa fina. Se agruparon las 28 frac1;iones según su polaridad, quedando un total de 8 fracciones, mismas que fueror. adicionados a un cultivo con M. elsdenif ver Tabla 5.7. I

Tabla 5.7. Fracciones agrupadas obtenidas del extracto acuoso.

Fracciones Muestras actrupadas Materia ( g )

1

ACE-ETOH (80:201 + ETOH 2 ' a.34 ACE-ETOH (95:5, 90: 10, 85: 15) + ETOH 0.37

I

3

ETOH-H20 140:601 13.44 4

ETOH-Hz0 (80:20, 60~40) 9.32

5 b6.81 ETOH-Hz0 (20:80) + Hz0 6 H z 0 1,6,7,8. 5.69

7 PI20 2.3.4.5. 3.60

8

6 1.72 RECUPERADO

H 2 0 9.10, 11.12. O. 15

95

5.5.2. Dasificaci6n para la ewaluaci6n de fracciones obtenidas del extracto acuoso

Hexano

Acetato de e tilo

Etanol

Perdida

TOTAL 120 g

A continuación se muestran los calculos realizados para utilizar una dosiflcaci6n adecuada de las sub-fracciones obtenidas bajo el siguiente criterio de dosiflcaci6n. LOS resultados se muestran en la Tabla 5.8.

I 1

A B 8 7 6 5 3 / 4 2 1

36

Resultados D i s c u s i h

En donde:

A = Representa el efecto del conjunto de compuestos presentes en el extracto acuoso, tomando como dosis 0.056 g / 100 mi de cultivo.

1,2,3,4,5,6,7 y 8 = Representa el efecto de cada sub-fkacci6n soluble en agua. y en este caso se toma como dosis. inicial (0.056 g por el % de cada fracci6n/ 100) = g/ 100 ml de la sub-fracci6n. ,

B = Representa el efecto de LFI sumatoria de 1,2,3,4,5,6,7 y 8, indicando en este caso si todos las sub- fiaccioncs tienen efecto común o individual.

.

A - B = Representa el efecto de la pkrdida del material durante el proceso de fi-agmentacibn.

A s í tenemos la siguiente tabla. %

Tabla 5.8. Dosifkacijn de fracciones en el cultivo de M. elsderzff. I

Muestra (g

Fracd6n Muestras agrupadas SOLUBILIDAD Dosis Porcentaje despub de

fraccionar (dl ~ecupcrado I 1 1 I

1

ETOH-HvO (80:20. 60:40) 332.86 3.00846 15.10 9.32 ' 3

ACE-ETOH (80:20) + ETOH 83.57 0.002 12 3.79 2.34 2

ACE-ETOH (95:5, 90:lO. 85:15) + ETOH 13.2 1 3.00034 0.60 0.37

~~

5 ETOH-Hz0 (20:80) + H20 957.50 3.02433 43.44 26.8 1 ~~ ~ ~~ ~~~~ ~~

6 H z 0 1.6.7.8. 203.2 1 3.005 16 9.22 5.69

7

PROT 1.2. 3. 4. 5.50 3.00014 0.25 O. 15 a Hz0 2.3.4.5. 128.57 3.00327 5.83 3.60

,RmperadÓn 2204.43 100.0 61.72

Rrdidas I 18.28 I 22.84 I 648.2 1 I

97

Resultados y Discusi6n

Para la obtenci6n de porcentaje recuperado de cada fkacci6n se parti6 de que 6 1.72 g eran el 100 %.

Ejemplo de la fracci6n 1 : * . 0.6 X 0.056/ 100 = 0.00034 g/ 100 ml = Dosificuci6n

La solubilidad se obtuyo con el siguiente criteric: sabíamos que el extracto liofilizado tenía 28 g/L de s6lhios solubles, por lo tanto se hicieron los siguientes c~lculos:

I

0.37 g (recuperados) x1000 m1 /28 g= 13.21 ml = Solubilidad

I

5.5.3. Prducci6n de biomasa

En la Figura 5.22 se presenta la produccidn de biomasa de M. elsdenff al adicionar al cultivo diversas fracciones provenientes del extracto acuoso, el grato muestra que al adicionar el control l iowado, extracto acuoso y la suma de las 8 fracciones es donde,hay mayor estimulaci6n de crecimiento como era de esperarse, ya que en estos controles se encuentran presentes una gran variedad de compuestos bioactivos. Lo importante de esta cinCtica es que la hcc i6n 5 es la que presenta un mayor incremento sobre la producci6n de biomasa de M. elsdentf y ademh el cultivo se mantiene estable durante todo el cultivo, esto es importante ya que sigue el mismo perfil reportado en los capítulos 5.3 y 5.4; la única desventaja esta parte experimental es que la biomasa alcanzada no present6 la misma producci6n de las secciones anteriores (0.5 g/L en promedio), en este experimento la m-a biomasa alcanzada fue de 0.076 g/L y fue observada en el cultivo donde se adicion6 liofilizado, por lo mismo los datos de todas las cineticas fueron normalizados tomando como valor m&I.mo 0.076 g/L de biomasa.

98

~ e s u i t a d o s y Dbcusibn

Por otro lado lo que se esperaba de este anidisis era observar cambios en la producci6n de biomasa por la estimulaci6n de alguna de las fracciones adicionadas al cultivo de M. elsdenli, sin embargo no se logr6 reproducir los resultados de los a n - i s , pero aun con esta deflciencia es posible suponer que la fracci6n bioactiva es la fracci6n 5, sin embargo faltan argumentos que precisen esta estimaci6n.

1

0.8

0.8 E;

8 0.4 :S h *

!I o*2 8

O I I I 1 I I I I I 1 1 I 1

O 4 8 12 10 20 24 28

Tiempo (h)

-F1 I F2 I F3

F4 - F0 F6

I F7 I F8 -X- SUMA F1 A F81 - EXT. ACUCHO - LIOFILIZNW)

CONTROL AGUA

F"igura 5.22. Producci6n de biomasa por adici6n de fracciones obtenidas del extracto acuoso, en el cultivo de M. elsdenfl.

5.5.4. Evolucidn del pH

La Figura 5.23 muestra la evoluci6n del pH en el cultivo de M. elsdenfl al adicionar diferentes fracciones provenientes del extracto acuoso, observando que el p H desciende durante el cultivo y permanece a pH 6 despues de las 7 horas de cultivo.

En esta parte experimental nuevamente se present6 un problema de pH, aun cuando fue controlado desde la preparaci6n del medio de cultivo, por lo tanto se presentaron modificaciones y esto conllev6 a que el cultivo de M. elsdenfl no desarrollara un crecimiento adecuado.

99

Figuro 6.28. Evoluci6n del pH durante el eultim de M. elsdenff al adicionar fracciones provenientes del extracto acuoso.

6.S.8. C O M ~ ~ O de dcido ELhctico I

En la Flgura 5.24 se muestra que no exlsU6 un consumo de sustrato durante el cultivo en ninguno de loe casos, esto es atrlbulble posiblemente al efecto del pH al inicio del cultivo ya que no fue favorable para que el microorgmismo a c M sus mecanismos para consumir el sustrato y por ende trasformar a producto. Sin embargo en algunos caso8 existi4 la producci6n de Acid0 acCtiM, pero en pequeda cantidad.

I O0

t

o 4 8 12 16 20 24 28

wura 5.24. Consumo de Acido- Lhctico durante el cultivo de M. elsdenff al adicionar fracciones provenientes del extracto acuoso.

5.5.6. Produccibn de ácidos graso8 VoMtilea

En la Tabla 5.9 se presenta la producci6n de Bcido acetic0 que fue el Único &ido graso producto de la fermentaci6n de M. e2sdenlf al adicionar diferentes fracciones. En la tabla se aprecia que aunque la cantidad es mínima hay una mayor producci6n en las fracciones 1 a 5, lo que indica que el subfraccionar el producto de la extracci6n acuosa estimul6 la producci6n de este &ido graso en el cultivo de M. ekdenil. Por otro lado si se compara la produccih de acCtico con respecto a los Controles (liofikado, suma de 8 fracciones, extracto acuoso), se aprecia que la eficiencia de producci6n es escasa, ello quiere decir que posiblemente al subfraccionar exista una concentraci6n de compuestos que al ser adicionados al cultivo de M. elsdenif incrementen su producci6n en AGVs. Sin embargo esto es solo una estimaci6n de lo que podría suceder en el cultivo, para corroborar esta informacibn serfa necesario re8112aT un nuevo experimento que sea reproducible con 10s reportados en las secciones 5.3 y 5.4.

Con estas desventajas que se tuvieron en esta parte experlmentai es poslble suponer que SI eldste una estimulacibn en el crecimiento y producci6n de mdabolitos por M. elsdenff durante el cultivo.

1 o1

Tabla 6.9. Pn>ducci6n de ticido acetic0 por adicibn de hcciones provenientes del extracto acuso al final del cultivo con M. elsdenli.

Fracci6n adicionada

5.8.7. Conclusiones y dbcutsi6n

En general los resultados de esta seccibn no fueron los esperados ya que el microorganismo no se pudo desarrollar por efecto del pH, sin embargo se observaron algunas dfferencias en cuanto a la producci6n de blomasa y produccibn de &cidos grasos vohtiles.

Se observ6 que de las 8 fracciones analizadas la fracci6n 5 estimul6 el crecimiento de M. elsdenll en cultivo y gener6 una producci6n de &ido acetic0 de 0.55 g /L al flnal del cultivo.

La produccidn de ficido acCtico fue favorecida en las fracciones 1 a 5, obteniendo Mores de 0.55 a 1.28 g/L, ocurriendo el caso contrario en el 10s Controles Suma de 8 bcciones, extracto acuoso y liofillzado donde presentaron valores de 0.31 , 0.26 Y 48 g/L respecthrzunente.

102

La fracci6n 5 fue elegida para realizar un nuevo subfiaccionamiento por presentar un perfll similar de biornasa y producci6n de AGVs como los reportados en las secciones anteriores.

Aunque 10s resultados no son reproducibles en esta parte experimental, se pudieron notar algunos perffles de fennentaci6n similares a los obtenidos en secciones anteriores, sin embargo es posible suponer que 92. existe una estimulacl6n en el crecimiento y producci6n de metabolites por M. ekadenii durante el cultivo. Por ello es aconsejable realizar otro estudio para corroborar estos resultados ya que este estudio solo nos proporciona una estimaci6n de lo que podria suceder en el cultivo.

103

5.0. DENTIFICACION Q-CA DE COlWUESTOS PROVENIENTES DE LA FR#LCCIOTU E5 DEL EXTRACTO ACUOSO

En esta seccl6n se presentan los resultados del fCacclonamlento en columna de la fraccidn 5 que fue ekgida en la secci6n anterior por presentar mejor estimulacfdn en el cultivo de M. elsdenii. En la seccidn anterior se recuperaron 26.81 g de la fiaccibn 5, en esta parte experimental se utilizaron 10 g que fueron eluidos primeramente con una mezcla de etanol - agua 9 0 : 10 y posteriormente con agua, recuperando el 100 % de en un total de 44 subhcciones, 36 de las cuales se

recuperaron con etanol- agua 90: 10 y las 8 restantes con agua.

Durante el proceso de evaporacibn de los disolventes presentes en cada subfiacci6n 8e observ6 en algunos casos )a presencia de compuestos cristalfnos en las prlmeras 6 subfracciones obtenidas; posteriormente se realizb una CrOmatograRa en placa y se wpo la subfraccibn 3 y 4 ya que presentaban las mismas caracterlsticas de corrimiento en placa y la presencia de cristales amorfos de color amarillo- pardo, a la que se le denomln6 subhcci6n A.

De las 44 subfracciones recuperadas pmnientes de la fracci6n 5 del extracto acuosos se eligib fa subfracci6n A para realizar estudios de identlAcacl6n qufmlca, recuperando en este caso 0.57 g. El compuesto identiflcado de esta subfraccidn A fue el manit01 (Figura 5.26), present6 un punto de fusl6n de 153" C con un Rf de 0.72 eluído COA etanol - agua 90:10, su estructura se determfn6 atraves de los resultados espectrosc6picos de RMN 1I-I y RMN 13C. los cuales se compararon con los reportados por Trigos, et al. 1995.

104

1 CHzOH

H

HO- H

H OH

sCHzOH

Figura 6.26. Estructura química del manitol.

El manitol pertenece a la familia de los alcoholes hexaoxhídrílicos, a@updos como compuestos del sorbltol, ducitol y manitol, teniendo como diferencia configuraciones distintas en sus centros de disfmetría.

El espectro de R M N 1H (Figura 5.20), se obtuvo diluyendo la subfkacci6n A en agua deuterada y los picos que se observan entre la regi6n 3.8 ppm y 3.4 ppm corresponden a una señal compleja que indica los protones de la molt5cula. El pico de la regi6n 4.7 ppm indica la sefial de protones de la moKcula de agua.

En el espectro de RMN * 3C (Figura 5.27), se muestran tres señales simples a 73.6 ppm , 71.5 ppm, y 65.2 ppm, que debido a un efecto de simetría en el manitol, corresponde a los 6 carbonos presentes en el compuesto.

Con la ayuda del experimento DEFT (Figura 5.28) se identiflcaron 2 señales para carbonos terciarios a 73.6 y 71.5 ppm y una señal a 08.2 para carbono secundario. El total de las asignaciones se presenta en la Tabla 5.10.

105

Tabla 6.10. Asignaci6n de la señal de RMN 13C del manitol (6, D20, 50 MHz).

5.6.2. Conclusiones y discusion

En esta parte experimental obtuvieron 44 subfracciones provenientes de la fraccidn 5 del extracto acuoso, de los cuales las primeras 6 subfracciones presentaron formas cristalinas.

Se logró identificar un compuesto de la subfkaccidn agrupada 3 y 4 denominado manitol.

De este trabajo se abre la posibilidad de seguir estudiando cada una de las subfracciones obtenidas mediante el empleo de columnas de purificaci6n para la obtencidn de diversos tipos de compuestos y valuarlos bajo un bioensayo con la bacteria mminal M. elsdenil.

106

a

Y Discusión

7

1 07

I

I

108

' .

Resuitdos y Discusión

a

Conclusiones 3 Perspectivcu

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

110

Conciusiones y Perspectivas

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

1.- Se seleccionaron cepas de hongos filamentosos con velocidad de crecimiento rápido (40-60 h), crecidas sobre pasta de copra húmeda (60%) y sin agregar nutrientes.

2.- Se propuso una metodología para la evaluaci6n de la actividad probtbtica de productos de fermentación sólida, mediante anasis de pH, biomasa, áciclo 1Actico y ácidos grasos volfitiles.

3.- El efecto probi6tico de dos productos de fermentaci6n (P. roquefortli v A. oryzae

2095) son comparables con el efecto benCflco del probiótico Lacto-sacc, así mismo el efecto probiótico del producto de fermentación (S. castelli). es comparable con el efecto del probi6tico Yea-sacc 84 17.

4.- El estudio de pasta de copra sin fermentar adicionada al cultivo de M. ekdenli no mostró estimulación el crecimiento y formaci6n de producto de M. elsdenff, lo que indica que los otros productos fermentados formaron durante el proceso algunas moléculas o compuestos que favorecieron el crecimlento y formaci6n de productos durante el cultivo.

5. - Del producto de fermentación (P. roquefortlf), se logró identificar que en la fracción acuosa se encuentran los compuestos con mayor estimulación probibtica.

6.- S e identificó un compuesto proveniente del extracto acuoso (manitol), recuperando 0.56 g que corresponden al 0.46 % del liofilizado de P. roquefortlf.

7.- El aporte principal de este trabajo fue elucidar al menos un compuesto como posible precursor de actividad probi6tica. Sin embargo hasta el momento no se sabe si el azúcar identificado es el responsable de dicha actividad, lo que si se puede suponer es que por e1 hecho de ser un azúcar sea fkilmente metabolizable y estimule el crecimiento de M. elsdenff.

Conclusiones y Perspectivas

8.- Otro aporte importante de este trahjo fue establecer que la actividad benCflca en el estudio con M. elsdenit mostr6 que el uso de cultivos en medio s6iido pueden ser potencialmente atractivos como estimuladores de crecimfento y produccidn de metabolitos de importancia en la alimentacidn animal. Por otra parte al adicionar productos de FS 6 probibticos comerciales al cultivo de M. elsdenii únicamente se adicionaron partículas solubles, es decir cero células 6 microorganismos, con lo cual se demuestra que el efecto probi6tlco no es debido a la presencia de microorganismos en un cultivo, si no posiblemente a algunas sustancias o compuestos propios de los microorganismos o productos residuales de la fennentaci6n, esto es importante ya que generalmente se ha mencionado por diversos autores que la actividad probi6tica es atribuible en su mayoría a microorganismos, sea hongos o levaduras.

9.- Con este estudio se habrk la posibilidad de estudiar los productos de fermentaci6n s6lida como procesos en los cuales se pueda obtener un provecho benéfico para el animal que lo consume. Así mismo resultaría interesarzte evaluar a detalle el proceso de fermentaci6n, analizando a intervalos de tiempo los productos que se vayan formando, analisis de actividad probi6tica. ídentificaci6n de compuestos bioactivos en estudios in oftro y por liltimo estudios In oiuo. Sin embargo este tipo de procesos requiere de tiempo para poder elucidar los compuestos con bioactividad y asegurar con estudios in vivo la actividad benkflca del compuesto.

112

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122

124

!

Sonxntajee de &cidos gmws volWles a diferentes horas de cultiww de probi6ticoe comerciales, productos de fenaentad6n s6lida y testigos.

, i

125

Porcentajes de dddos graso6 VoUtiles a diferente8 horas de cultivos de probi6ticolr comerdales, productos de fermentad611 duda y testigos.

1 26

ANEXO1

Porcentqjea de Addoe grascm volAtilw a diferentes horas de cultivo0 de probi6ticos comerdales, I.mductw de fermentad6n s6Uda y t-tigos.

127

128

/h'wxo 2 C~lculos para el balance de carbono de los productos de fermentacibn obtenidos a partlr de la adicic5n de productos de FS, probibtlcos comerciales 6 testigos.

3.7 6 CH3CHOH-COOH ------ > O . 5 9 CH3CH2COOH +O. S 9CH3COOH + O a 8 6 CH3CH2CH2COOH + O. 17 CHlmOm NQ2t + c 0 2 ACID0 LACTIC0 ACID0 PROPIONIC0 ACID0 ACETIC0 ACID0 BUTIRICO BIOMASA

ac lTaC36 ac 12338 x I ra 4c 12448 1c 12

a0 l(P3d8 20 16242 20 1fpZsaQ 20 le232 10 1N

18#61.BW 1 4 w 1 4 0 1

ai 6 6H 6 4H 4 8H 8 1H lm 20 lC a2 12

TOTAL 90 g/mol 74gfmol Wml Saa/mol 24.01 glmol 44 glmol

Fracclbn de carbono por molkula:

icldo lictlco Propldnlco Ac6tlco Butlrlco FC= 0.4 fC= 0.49 FC= 0.40 FC= 0.55

d o) 8 Cdlculos:

BlOmclSa FC= 0.48

c o2 FC= 0.27

Ejemplo para &ido &tic0 0.4 x 9.4 (g de &do I&ctico al inicio del cuKivo 6 g de producto)= 3.76 g de C de Acid0 IActico

Balance de carbono:

3.769 c k. IMW """""""""- > 0.59 g C Propi6nico + 0.59 g C Ac6tico + 0.86 g C Butírico + 0.17 g C &omasa + 0.27 g C de CO2

3.76 g C aC. lactic0 = 2.45 g C de Producto

Porcontaje de efklencle de producch

9.76 -100% 2.45 X 65.15 %

GRAMOS DE SUSTRATO Y DE FRACClON DE CARBONO DE SUSTRATO Y DE PRO DUCT0 PRODUCTO ,

Cultivo drdithros

0.27 a48 a55 a40 0.49 0.4 a5 o. 1 13 1.0 9.6 A. orytn2095

0.27 0.48 a55 0.40 0.49 a 4 a 4 1.6 15 12 9.4 A. oryrpe2094

FC COZ FCBlanrrOa FC Butkb FC Adtic0 FC Ropi6nko u&b g Bkmoro g &Rbico g Acatico Q Propi6nico g k t h

I

R- 0.27 a48 a55 a40 a49 a 4 0.4 0.1 1 .5 1.1 9.7 P. rorluefwtu .:- j

0.27 0.48 0.55 am a49 a 4 0.3 0.1 1.5 0.7 95 - . , I

S casteii

AGUA

0.27 0.48 0.55 a40 a49 a 4 0.1 0.0 0.6 0.4 L 9.8 K. llwxlllwcc

0.27 -, a48 a55 0.40 a49 a 4 0.4 0.0 1 .S 1.0 9.6

I 9.8

0.27 a48 a55 0.40 a49 a4 a 5 0.8 1.1 0.9 9.4 IACTOSACC

0.27 0.48 a55 a40 a49 0.4 02 0.0 1 .o 1.1

r Y. 1026

0.27 O.# a40 I ass 0.49 a 4 0.6 1.3 35 4.2 9.5 Y.8417

0.27 a48 a55 0.40 a49 0.4 a 4 0.1 1 .o 0.6 9.6

I 9.8 0.27 * 0.48 : a40 '( I Q55 0.49 0.4 0.5 0.8 1 0.0 a6 .A

2 BALANCE DE CARBONO.

NOTA: Los valores de producto reportados en l a s tablas son al final del cultivo.

132

tiofllitaao a oc

O 4 12

Accttco %/L

1.6

22

0.2

1.4

2.6 3.0 2.3

1

I

-0 4 Lo8 catculoa be reolitaron como se describe en el ancx02. En lar tabla8 se reporta el bafance de crabono de productos al adicionar al cultivo de M. elsdenii diferentes extractos provenientes del producto de fermentaci6n de P. roquefortii.

1