Universidad de Antioquia
Facultad de Ingeniería
Escuela Ambiental
Grupo GeoLimna
2013
Prof. Néstor J. Aguirre R. Dr. rer. nat
Métodos de campo y de laboratorio para estudios de calidad de agua dulce
Métodos de campo y de laboratorio para el estudio de algas fitoplanctónicas
En la figura 1, se presenta el método de campo para el estudio de algas microscópicas
de agua dulce.
Recipientes
plásticos y
Rotular
Inicio
Botella
Kemmerer
Red
fitoplancton
10 μm, 2μm
Metodología en campo
Tomar muestra con
Lugol al
10%
Nevera a 4ºC
(Gel, Hielo)
Transferir a
Fijar con
Transportar en
Variación
vertical 100%,
50%, 1%
Integrar la
zona fótica
Toda la
columna
Estudios de:
N. Aguirre
F F
Figura 1. Método de campo de algas fitoplanctónicas
Las muestras de agua superficial para el conteo de algas se tomarán directamente en
recipientes plásticos de un litro. Para la recolección de la muestra de agua se emplea una
botella muestreadora tipo Kemmerer y el agua se transfiere inmediatamente a un
recipiente de plástico. La recolección de algas en los sitios con presencia de bloom se
realiza mediante el empleo de una red de fitoplancton en la superficie del bloom. Las
muestras de agua para el conteo algal se fijarán con 10 ml de lugol por cada 100 ml de
muestra. El material colectado se transporta en neveras de teflón refrigeradas con geles
hasta el laboratorio.
Las muestras de fitoplancton también pueden obtenerse al integrar la zona fótica por
medio del volumen derivado de tres secciones en la columna de agua correspondientes a
la subsuperficie, al 50% y 1% de atenuación en la intensidad lumínica. Es deseable
embalar las muestras en recipientes oscuros y protegidos de la luz para evitar el efecto
de la luz sobre el lugol.
En la figura 2, se presenta el método de laboratorio para el análisis de las muestras de
algas.
Metodología en Laboratorio
Cámara de
Utermöhl
1,10,50 ml
Observar en el
microscopio
invertido.
400X
Densidad
de
organismos
(Ros, 1979)
Medir 20
células según
Hillebrand et
al., (1999)
Biomasa de
cada
spp=[ρ*vol.]
Strathmann
(1967) y Davies
et al., (1984)
Cámara
S-R
1ml
Agitar muestra y depositar en:
Esperar 24 H y
Determinar y contar en
Para spp dominantes
Obtener
Para biovolumen
n: número de organismos contados , s: área mm2
del campo visual, h: altura de cámara mm, c:
número de campos contados , F: 103mm3/1ml
30 Campos, 1 r, o hasta curva
saturada (Uehlinger, 1964)
Contar, medir y dibujar para obtener
biovolumen
N:Org/ml
= nF
sch
bis 100 ml
N. Aguirre
F
F
F
Figura 2. Método de laboratorio de algas fitoplanctónicas
Antes de la observación en el laboratorio, las muestras se deben agitar suavemente y el
procedimiento empezará depositándose volúmenes conocidos en cámaras de
sedimentación tipo Ütermohl durante 24 horas.
Para la observación de las muestras se puede emplear un microscopio invertido Leica
DMIN, provisto de una reglilla ocular utilizando una cámara de conteo de capacidad
conocida. Las observaciones al microscopio se efectúan según Ros (1979) en Ramírez,
(2000) por medio de un conteo en 30 campos con una magnificación total de 400X, para
ello se seleccionan varias áreas o campos de observación siguiendo un sistema de
muestreo al azar (Uehlinger, 1964). Las determinaciones de los taxa fitoplanctónicos se
realizarán mínimo hasta el nivel de género.
La cuantificación de organismos por mililitro será realizada según la siguiente fórmula
sugerida por Ros (1979):
Organismos por mililitro cuando se cuentan campos = nF/ sch
n= número de organismos contados
s= superficie en mm2 del campo del microscopio
c= número de campos contados
h= altura de la cámara en mm
F= factor de conversión= 103 mm
3/ 1ml
Al final del conteo por campos aleatorios, se efectúa un recorrido exploratorio de toda la
cámara para registrar el total de las especies o morfotipos. Lo importante es diferenciar
los elementos que constituyen el conjunto de algas de las muestras. Los análisis
numéricos posteriores requieren que el observador pueda diferenciar cada morfotipo de
alga y su densidad.
Para la determinación de especies o morfotipos se emplean claves taxonpomicas y
referencias bibliográficas como las siguientes: BOURRELLY (1966, 1968, 1985);
PRESCOTT et al., (1982); STREBEL Y KRAUTER (1988); Das Phytoplankton des
Süßwasser (Hrsg. HUBER-PESTALOZZI, 1938): Band XVI Teil 1 Blaualgen (1938), Band
XVI Teil 2, 1. Hälfte Chrysophyceae (1976), Band XVI Teil 4 Euglenophyceae (1955),
Band XVI Teil 5 Chlorophyceae (1961), Band XVI Teil 7, 1. Hälfte Chlorophyceae
(1983); Süßwasserflora von Mitteleuropa (ETTL et al. Hrsg. 1983, 1985a, 1985b, 1984,
1988, 1990, 1991a, 1991b, 1997a, 1997b) y Ramírez (2000).
Determinación del Biovolumen o volumen celular
Para estimar el biovolumen de algas planctónicas, se puede determinar el volumen
celular medio obtenido a partir de las dimensiones de mínimo 20 células seleccionadas
aleatoriamente en el microscopio. La equivalencia de la forma celular a un sólido
geométrico se efectúa según Hillebrand et al., (1999). La densidad absoluta (en org/ml)
de un taxa, así como el promedio del número de células de algas que forman colonias
será multiplicado por su volumen celular medio para obtener un estimativo de la
biomasa de cada taxa.
Las densidades de los taxa según los registros del conteo se sumarán y se obtendrá la
densidad algal en el sitio de colecta. Valores superiores a 30000 cel/ml pueden
considerarse altos.
El resultado final de la estimación de la biomasa será expresado en su volumen celular
(µm3/ml) por volumen de agua.
VC medio= ∑ Vi * (n)-1
Donde:
VC medio: volumen celular medio (µm3)
Vi : Volumen celular individual
n= número de individuos medidos
Luego,
Biovolumen (µm3/ml) = (VC medio) * número medio de células * densidad absoluta
(org/ml)
Métodos de campo y de laboratorio para el estudio de algas perifíticas
Para obtener muestras de algas perifíticas se realizará una remoción por medio de
cepillos plásticos del material adherido a sustratos como piedras, troncos, hojas que
estén sumergidas en el lecho de la corriente. Como unidad de área para efectuar la
remoción sobre los sustratos encontrados se utilizará un cuadrante de 8 cm2, el cual se
utilizará 30 veces al azar en el sitio de muestreo. Para ello puede emplearse un marco
de una diapositiva. En la figura 3, se presenta el método de campo para obtener
muestras de perfiton.
Figura 3. Método de campo para el perifiton
Para la observación de las muestras ficoperifíticas se utilizará un microscopio invertido
Leica DMIN, provisto de una reglilla ocular. Para el montaje de la muestra se utilizará
la cámara de conteo Sedgwick-Rafter de 1ml de capacidad (Wetzel & Likens, 1990).
Para análisis cuantitativos las muestras se estandarizan en un volumen de 100 ml.
Luego la muestra se agita en un recipiente plástico de arriba abajo 10 veces e
inmediatamente con una pipeta se extrae un mililitro de muestra para su disposición en
la cámara de conteo (figura 4).
Figura 4. Método de laboratorio para el perifiton
Para efectuar el conteo de algas perifíticas en la cámara se seleccionarán 30 campos de
observación siguiendo un sistema de muestreo al azar (Uehlinger, 1964). El conteo se
realiza con una magnificación total de 400X. La determinación taxonómica se basará en
las mismas claves y referencias bibliográficas para la determinación de algas
planctónicas. Valores superiores a 30000 cel/cm2 pueden considerarse altos.
Metodos de campo y de laboratorio para la determinación de la producción
primaria
En la figura 5, se presenta los métodos de campo y de laboratorio para la determinación
de la producción primaria acuática por el método del oxígeno propuesto por Gaarder
and Gran (1927).
Productividad PrimariaInicio
Botellas claras y
oscuras, medición O2
(Gaarder & Gran,
1927)
Disco Secchi;
Quantómetro Botella
Kemmerer
6 Botella
Winkler
por cada Z
Botella inicial
R= 2
4 botellas
Winkler:
en Z elegida
2 botellas
oscuras
(C2) y 2
claras
(C3)
PPB=
C3 – C2
PPN=
C3 – C1
ResP.=
C1 – C2
0
¿Regla de
decisión ?
Se basa en el método de
Tomar muestra de agua en
zona eufótica (100%, 50%,
25%, 10%,1%) con
Determinar ambiente
lumínico con
Llenar
Determinar C1 = concentración O2
Incubar t0
Medir O2
ti
N. Aguirre
F
FAnalizar resultados
Figura 5. Método para determinar la producción primaria en el agua.
El método del oxígeno empleando botellas claras para simular la actividad fotosíntética
y oscuras para simular la respiración acuática fue desarrollado por Gaarder y Gran en
1927, y a pesar de ser un método aproximado, es una herramienta valiosa para
determinar la producción primaria bruta en el agua.
El método consiste en tomar la muestra de agua a analizar en una determinada
profundidad. Esta profundidad se obtiene mediante la medición previa de la
transparencia Secchi y estimando la profundidad de la zona fótica. Luego se eligen las
profundidades de extinción de la luz a las que se incubarán las botellas que contienen
las muestras de agua.
Se deben llenar seis botellas con las precauciones necesarias para determinar el oxígeno
disuelto. Las botellas tipo Winkler pueden ser de 100 a 300 ml de capacidad. Dos de las
botellas estarán pintadas de negro o recubiertas con papel aluminio para evitar la
entrada de luz (botellas oscuras); las otras dos, estarán en su condición normal (botellas
claras). En la quinta y sexta botellas, debe determinarse la concentración inicial de
oxígeno en el agua (C1). Las botellas deben emplearse teniendo en cuenta las réplicas
que permitan controlar el error experimental.
Luego del llenado de las cinco botellas, todas excepto las que contienen el agua para la
medición de la concentración inicial de oxígeno, se incuban in situ en el agua a la
misma profundidad de extracción donde se tomó la muestra. Todo esto, debe hacerse
rápidamente y manteniendo las botellas resguardadas de la luz directa para evitar el
shock lumínico de las algas. Si se trabaja a tres profundidades, se tendrán entonces seis
botellas claras, seis botellas oscuras y seis botellas para la concentración de oxígeno
inicial (Ramírez, 1991a).
El tiempo de exposición de las botellas cambiará según la cantidad de plancton que
contenga el agua (sistemas eutróficos = 30-60 minutos, sistemas oligotróficos = 1-4
horas). Después del tiempo de exposición, se determina la concentración de oxígeno en
cada una de las botellas mediante el método de Winkler o directamente mediante un
oxímetro. En la botella clara se mide la producción de oxígeno por fotosíntesis (C3) y su
aumento se interpreta como una medida del carbono asimilado por la comunidad allí
existente. En la botella oscura se mide el consumo de oxígeno por respiración (C2)
(Ramírez, 1991a). Los cálculos de PPB en mg C/ m3/h, se obtienen así:
PPB mg C/ m3/h= 0,312* (C3-C2)*1000 Cole (1983)
T*PQ
T= tiempo de incubación de las botellas en horas.
PQ= Cociente fotosintético= 1,2
Regla de decisión (ver Margalef, 1983, Esteves, 1998):
Valores entre 0-75 mg C/ m3/h corresponden a ambientes oligoproductivos
Valores entre 75-250 mg C/ m3/h corresponden a ambientes mesoproductivos
Valores > a 250 mg C/ m3/h corresponden a ambientes euproductivos
Clorofila a.
Para la determinación cuantitativa de la clorofila a y de otras formas de clorofila, son
muy empleados los métodos espectrofotométricos. Entre éstos, figuran métodos
monocromáticos como el propuesto por Talling y Driver (1963, en Ramírez 1991b).
Cl a = 11.9 A665*v / Vz
Donde A= A665nm antes de acidificar el extracto-A750nm antes de acidificar el extracto/
A665nm después de acidificar el extracto-A750nm después de acidificar el extracto
v= volumen del extracto en ml.
V=Volumen filtrado en Litros.
Z=Ancho de la celda de cuarzo en cm.
En la figura 6, se presenta el método de determinación de la clorofila a.
Clorofila “A” Inicio
Espectrofotométricos:
-Talling & driver (1963)
-Vollenweider (1971)
-Parsons & Strickland (1963)
-Sartory y Grobbelaar
(1984)
V= volumen conocido
Filtro Millipore φ 0.45μm
<0.5 atm.
Botella Rϋttner
0.5-1L
Nevera de teflón
y refrigerar 4ºC
Etanol .
Baño maría
Centrifugar
5’. 3500
rpm(2n)
Espectrofotómetro
PT
Espectrofotómetro
Feopigmentos
Se basa en métodos
Tomar muestra con
Transportar a laboratorio en
Filtrar en la oscuridad
Extraer clorofila
Medir Abs. (665nm , 750nm)
Adicionar HCl
N. Aguirre
F
F
Recipientes plásticos
Oscuros rotulados.
500ml
Transferir a
F
Figura 6. Método para determinar la concentración de clorofila a en el agua.
La cantidad de agua a filtrar depende de la observaciones de campo y de microscopio
sobre la densidad algal esperada. 500ml pueden ser un volumen suficiente para
ambientes ricos en fitopláncteres y 1000ml para ambientes de aguas transparentes.
Después de la extracción de la muestra, la filtración del agua debe efectuarse lo más
rápido posible, evitando incidencia de luz muy fuerte y altas temperaturas. La presión
durante la extracción no debe exceder de 0.5 atmósferas. Los filtros más utilizados para
filtrar las muestras de agua son H.A. Millipore de celulosa con poro de 0.45 um
(Ramírez, 1991b).
Para la extracción de la Clorofila a se sugiere emplear el Et-OH Etanol grado analítico
en baño maría. Por su parte se sugiere un tiempo de centrifugación de 5 minutos a una
velocidad de 3500 rpm. Valores mayores a 10 ug/L de clorofila a pueden considerarse
altos.
Métodos para el estudio de protozoos de vida libre
Los métodos para el estudio de la comunidad de protozoos heterótrofos y mixotróficos
en los ambientes de agua dulce son diversos. Sin embargo para efectos del estudio de
esta comunidad de microorganismos se tendrán en cuenta los siguientes métodos de
estudio. Un primer acercamiento al estudio de los flagelados heterotróficos se realizará
a través de la clasificación por tamaño según los criterios establecidos por Auer & Arndt
(2001), así:
Criterios de tamaño para el estudio de los flagelados:
Pequeños (< 5 Um)
Medios (5-10 Um)
Grandes (> 10 Um)
Metodos para el análisis de muestras in vivo. Las muestras de protozoos obtenidas se
transportarán al laboratorio con una temperatura igual al sitio de toma de muestra, luego
serán observadas usando la técnica de conteo in vivo empleando un microscopio con
control de temperatura y evitando su agitación. Estas muestras se analizan como
máximo, una hora después de la toma de la muestra (Mathes & Arndt, 1995). Con éste
método se puede determinar la abundancia, el biovolumen y el taxón (Massana & Güde,
1991; Gasol, 1993; Arndt et al., 2000).
Metodos para el análisis de muestras fijadas. Se preparan muestras fijas con el fin de
realizar un estudio detallado de los taxa. Para ello, las muestras de protozoarios se fijan
en una solución de formaldehido al 0,6% y se emplea un microscopio de
epifluorescencia usando 4’,6 diamidino-2-phenylindol (DAPI) como reactivo de tinción
(Güde et al., 1985).
En la figurar 7 se presentan los métodos para el análisis de los protozoos de vida libre
en el agua dulce.
Figura 7. Método de campo para el estudio de protozoos de vida libre.
Análisis de muestras al microscopio. Para el análisis de muestras al microscopio se
emplean cámaras de diferentes tamaños (10ul, 50 ul, 400 ul, 2 – 10 ml). La
diferenciación entre los flagelados de nutrición autotrófica y los de nutrición
heterotrófica, se establece a través de un microscopio de epifluorescencia siguiendo los
criterios propuestos por Davis & Sieburth (1982). En la figura 8 se presenta el método
de laboratorio para el estudio de protozoos de vida libre.
Figura 8. Método de laboratorio para el estudio de protozoos de vida libre.
El biovolumen de los organismos se determina por la medición de las formas
geométricas de los organismos (Premke & Arndt, 2000). Estas mediciones se efectúan
empleando un microscopio Zeiss Axioplan con magnificación desde 40X hasta 1000X y
equipado con contraste de fases y contraste de interferencia óptico. Al menos se tiene
cuenta un mínimo de tres alícuotas (2-
Determinación de taxa. Para la determinación taxonómica se tiene en cuenta la
sistemática propuesta por Corliss (1979) y Patterson & Larsen (1991). También se
emplearán las guías taxonómicas de Patterson et al., (1989); Larsen & Patterson,
(1990); Voers et al.,(1995); Tong et al., (1998); Bernard et al., (2000).
Métodos de campo y de laboratorio para el estudio del zooplancton
En la figura 9 se presenta el método de campo para obtener muestras de zooplancton en
ambientes de agua dulce.
Metodología en campo
Inicio
Botella Schindler
Vol.: 5L (15 Litros )
Red
Zooplancton
45 μm
Flujometro
Tiempo ,
velocidad,
GPS
Recipientes
plásticos
Rotulados
100ml
Nevera a
4ºC
(Gel, hielo)
Determinar
Tomar muestra con
Para
medir con
Transportar en
Formaldehido al
4%
Tomar
muestra con
botella
integradora
Variación
vertical:
100%,
50%,1%
Integrar
zona Fótica
Toda la
columna
Fijar con
Transferir a
Estudios de:
N. Aguirre
F F
Figura 9. Métodos de campo para el estudio del zooplancton
Como se observa en la figura 9, las muestras de agua pueden ser colectadas con el
empleo de una botella tipo Kemmerer, Schindler o Ruttner. Las muestras volumétricas
se pueden obtener a diferentes profundidades en la columna de agua, integrando zonas
específicas de la columna de agua o teniendo en cuenta un criterio lumínico. Estas
muestras permiten realizar análisis cuantitativos de riqueza de especies o de densidad
zooplactónica expresada en No de organismos/100ml. Densidades mayores a 200
organismos/100 ml se pueden considerar altas.
También pueden obtenerse muestras a través de arrastres subsuperficiales en el agua
empleando redes de 0,45 um de diámetro, en cuyo caso el análisis arroja resultados
cualitativos. El formaldehido al 4% suele ser el reactivo empleado para la fijación de
muestras. También puede adicionarse vaselina líquida para evitar el daño de estructuras
como toracopodos o furcas.
En la figura 10, se presenta la metodología para el análisis de las muestras al
microscopio. Usualmente este análisis permite la determinación de taxa. Si los
zoopláncteres son pequeños <100 um, el conteo de estos se realiza en el microscopio
con el objetivo de 4X. Si los zooplacteres son grandes >100 um los organismos se
determinan en el microscopio pero se cuentan en un estereomicroscopio usando una caja
de Petri.
Metodología en Laboratorio
Agitar
Organismos 1 ml
Wetzel y Likens (2000)
ρ ρ
Ind/Litro
Disectar en
Estereomicroscopio
Depositar 1 ml de muestra en
Determinar y contar Spp?
r = 5
Observar en Microscopio
Invertido 40X
(obj. 4X)
Cámara
S-R
N. Aguirre
F
F
F
Figura 10. Métodos de laboratorio para el estudio del zooplancton
La densidad de zooplancton se estima mediante el conteo de los organismos presentes
en la muestra completa en caso de abundancias bajas, para lo contrario se contarán los
organismos presentes en 5 alícuotas de 1 ml cada una. Estas se depositan en una caja de
Petri y se observan al estereomicroscopio. Posteriormente se determinará el valor medio
de las cinco alícuotas contadas, se multiplicará por el volumen de la submuestra y se
dividirá por el volumen total filtrado (Wetzel y Likens, 2000). Las densidades serán
reportadas en ind./100ml. La determinación de zooplancton se realiza empleando las
claves de Edmondson (1959); Elmoor-Loureiro (1997); Paggi (1975); Sendacz y Kubo
(1982), STREBEL Y KRAUTER (1988); Villabona et al., (2009).
Métodos para el estudio de plantas acuáticas
Las plantas acuáticas pueden distribuirse en diferentes lugares de los biotopos acuáticos.
Así se pueden encontrar plantas emergentes, de hojas flotantes, sumergidas y flotantes
libres (Aguirre et al., 2011).
Las plantas acuáticas se pueden determinar directamente en campo con el empleo de
claves taxonómicas. Sin embargo, algunas especies de difícil identificación deben
colectarse, esto teniendo en cuenta su sistema radicular, tallo, hojas y estructuras
florales, con el fin de ser determinadas en un herbario. Si la muestra debe conservarse,
se procede a prensar y secar el material en campo. La prensa consiste en listones de
madera cruzados y sujetados con correas. Las plantas pueden recibir por aspersión o
inyección alcohol con el fin de conservar el material hasta su arribo al herbario.
Además de las instrucciones generales, Schmidt-Mumm (2002) también propone
recomendaciones sobre colecta y preservación de material macrofítico especifico para
cada grupo. A las plantas errantes emergentes de mayor tamaño como Eichhornia
crassipes, se les debe eliminar hojas, tallos y raíces excesivas, además de una incisión
en las hojas y peciolos inflados para lograr el aplanamiento de la planta. Macrófitas de
menor talla como las errantes emergentes: Lemna, Spirodela, Azolla y Salvinia y como
las errantes sumergidas (Riccia y Wolffia) se deben colectar empleando una red de
acuario.
Las plantas acuáticas se conservan en recipientes plásticos con alcohol al 75%. Las
plantas acuáticas se pueden muestrear sobre líneas transectas de 100 m sobre las cual se
registra el espécimen. Si se requiere un análisis cuantitativo de cobertura, se dispone de
un cuadrante de 1 m de lado cada 10 m sobre la línea transecta. El material vegetal
incluído en este cuadrante se cuenta registrando el número de individuos por taxa, y se
pesa al menos cuatro ejemplares de cada especie para registrar la biomasa húmeda
(Aguirre et al., 2011).
Macroinvertebrados acuáticos.
Para el muestreo de los macroinvertebrados acuáticos se emplea un red tipo surber, con
la cual se obtienen muestras cuantitativas. Adicionalmente, se toman muestras
cualitativas empleando redes triangular y de pantalla. También se obtienen muestras
cualitativas capturando manualmente los organismos adheridos a sustratos como
piedras, troncos, hojarasca y plantas acuáticas.
Los macroinvertebrados colectados se fijan en alcohol y en recipientes plásticos
rotulados se transportan al laboratorio. Adicionalmente, se determina la velocidad de la
corriente, el perímetro húmedo y el caudal del ambiente lótico empleandose un
correntómetro. Se recomienda tener en cuenta información adicional para análisis de
resultados como la hora del día en que se realizó el muestreo, la altitud, la descripción
general del sitio, características del entorno, registro de lluvias, entre otros aspectos.
En el laboratorio, la muestra a analizar se deposita con suficiente alcohol en una caja de
Petri. Se separan con pinzas los diferentes taxa con base en afinidades morfológicas y
luego se procede a la determinación de las taxa teniendo en cuenta las referencias el uso
del estereomicroscopio y claves taxonómicas. Se esquematiza y analiza la relación de
cada uno de los taxa observados con la calidad del agua.
Los principales niveles empleadas generalmente en la identificación de los taxa siguen
la siguiente jerarquización taxonómica: Reino, Phyllum, Clase, Orden, Familia, Género
y Especie. Cada una de estas categorías o niveles taxonómicos a su vez, pueden formar
subcategorías. El nombre científico de un organismo consta del género y de un segundo
término en minúscula que es la especie. Los trabajos especializados de McCafferty
(1981), Needham y Needham (1982), Roldán(1988), Müller(1995) y Roldán (2003) son
algunas de las fuentes de consulta utilizadas para la determinación de los
macroinvertebrados en el laboratorio y el análisis de la calidad de agua basada en
bioindicadores.
Referencias Bibliograficas
Aguirre, N., Caicedo, O., Y González, E. 2011. Las plantas acuáticas del sistema
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