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UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
ESCUELA DE MEDICINA
INMUNOLOGÍA
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VALORACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR IN VITRO
Por: Sofía Jaramillo Q.
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OBJETIVOS
GENERALES:
• Identificar los procedimientos de laboratorio que permiten la valoración de la inmunidad celular in vitro.
ESPECÍFICOS:• Identificar los procedimientos
de laboratorio que se emplean para evaluar la inmunidad celular.
• Esquematizar las fases del estudio de la inmunidad celular en los procedimientos de laboratorio.
• Definir los criterios clínicos para la solicitud de éstos análisis.
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CONOCIMIENTOS PREVIOS
• Desarrollo, diferenciación, propiedades particulares y funciones de los Monocitos, Neutrófilos, Basófilos, NK, LT y LB.
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ORIGEN DE LOS ESTUDIOS SOBRE INMUNIDAD CELULAR
Estudios en otras especies: aves y mamíferos
Pacientes con inmunodeficiencias
Ac. Monoclonales
Análisis funcionales in vitro
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• Test de Actividad Fagocítica • Directa• Indirecta
• P. De Proliferación Celular• Ensayo de
Proliferación• Reacción
linfocitaria mixta• LT-CD4• Prueba del IFN-• ELISPOT• Citometría de
Flujo (Citoquinas internas)
• LT-CD8 y NK• ADCC
VALORACIÓN FUNCIONAL
• Microscopía de fluorescencia
• Citometría de flujo• IF• RIA
RECUENTO
• Cualitativa• M.
Inmunoquímico• Células
Formadoras de Rosetas
• Cuantitativa• M. Físicos• S. Magnética• S. Por afinidad
de columnas• M.
Inmunoquímico• -Globulina
Antihumana• Citometría de
Flujo con FACS
IDENTIFICA CIÓN
• M. Físicos• Fycoll-Hypaque• Adhesión
selectiva• Ms: vidrio,
plástico• LB, LT: nylon,
algodón• M.
Inmunoquímicos• Poblaciones• Subpoblaciones
SEPARACIÓN
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MATERIALES
SUSTRATO CELULAR:
• Citología: • Suspensiones frescas de sangre (plasma) *
• Histología:• Usual:
• Punción M.O.*• Transoperatorios• Biopsias• Post mortem
• Especial: • Punciones de extracción de líquido
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TÉCNICA HISTOLÓGICA
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PROCEDIMIENTOS
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA PROCESAMIENTO FIJACIÓN INCLUSIÓN
CORTE COLORACIÓN ANÁLISIS
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SEPARACIÓN
AISLAMIENTO POR CENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE DE DENSIDAD: TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE
Separación de mononucleares [Ms y Linfocitos (LB, LT)]de granulocitos (Ns, Bas)
SEPARACIÓN POR ADHESIÓN SELECTIVA
Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plástico y se separan de los linfocitos
Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodón (se obtienen poblaciones separadas de LB y LT)
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TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE
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ADHESIÓN SELECTIVA
LT Ms
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IDENTIFICACIÓN
Cualitativa
M. Inmunoquímico• Células Formadoras de Rosetas
CuantitativaM. Físicos• S. Magnética• S. Por afinidad de columnas• Cargas eléctricas (LB , LT)• Aglutininas
• Maní: Timocitos inmaduros• Soja: LB
M. Inmunoquímico• CD• -Globulina Antihumana• Citometría de Flujo con FACS
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CÉLULAS FORMADORAS DE ROSETA E
• Receptor SRBC o CD2• CA linfoide
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MÉTODOS FÍSICOS
MAGNÉTICA POR AFINIDAD DE COLUMNAS
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Ag para LT
Producción de Ac. a los LT
• Timocitos, LT sp., LT cultivo cont., LT leucémicos cabras o conejos
• Hibridoma murino• Demostración de
especificidad
globulina+fluorocromo
Identificación de los marcadores de LT por el antisuero resultante
• IF Directa• Microscopio de
fluorescencia• Citómetro de
flujo*• Tinción vital con
azul trípano• Análisis de
liberación de Cr51 (RIA)
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IDENTIFICACIÓN LT: MARCADORES ESPECÍFICOS
TIPO DE CÉLULA DETECTADO CD
Timocitos de la cortezaCélulas de Langerhans CD1
Células formadoras de rosetasLTNK
CD2
LT madurosReceptor para Ag. En LT CD3
LT colaboradores/inductoresMonocitos CD4
LT maduros CD6
TimocitosNK CD7
LT supresores/ctx.NK CD8
Relación LT-CD4/LT-CD8:
2/1
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RECUENTO
Microscopía de fluorescencia
Citometría de flujo
IF
RIA
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CITOMETRÍA DE FLUJO
PROCEDIMIENTO: RESULTADOS:
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APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
Tipificación del Fenotipo
Leucocitario
• Inmunodeficiencias• Pronóstico• Seguimiento de
inmuno y quimioterapia
• Seguimiento de la reconstitución inmunitaria
TIPIFICACIÓN DEL FENOTIPO
TUMORAL
• Clasificación de leucemias y linfomas
• Determinación de la clonalidad
• Diferenciación entre neoplasias de células hemato y no hematopoyéticas
• Pronóstico
ANÁLISIS DEL ADN
• Aneuploidía• Cinética del ciclo
celular
OTRAS APLICACIONES
• Reticulocitos• Detección de Ig.
Relacionadas con Px.
• Pruebas cruzadas en transplantes
• Citogenética
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VALORACIÓN FUNCIONALTest de Actividad
Fagocítica
Migración
Ingestión
Digestión•Degranulación: Fagocitosis frustrada
•Muerte Intracelular: NBT, Quimioluminiscencia, 502ª de S. aureus
Prueba de Proliferación
Celular
Ensayo de Prolifera ción•Leucocrito+Mitógeno (específico)
•Medir el estado global de la respuesta celular
Reacción linfocitaria mixta•CPA (MHC-II)•Inmunidad transfucional
•Dx. Exposición previa
LT-CD4
Prueba del IFN-
ELISPOT
Citometría de Flujo
(Citoquinas internas←Ac.)
LT-CD8 y NK
LT-CD8: Determinación de lisis celular
(CMH-I)←Cr51
NK: Líneas de
células
tumorales
ADCC
Células+Ac
Ms, Ns, Es, NK
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PROLIFERACIÓN CELULAR
ENSAYO DE PROLIFERACIÓN REACCIÓN LINFOCITARIA MIXTA
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LT-CD8: CITOTOXICIDAD
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ADCC
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IMPORTANCIA
FISIOLÓGICA
Inmunidad antiinfecciosa
Inmunidad transfusional
Inmunidad tumoral
PATOLÓGICA
Trastornos de inmunodeficiencia
Enfermedades autoinmunitarias
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AVERIGUAR
• Nombres de mitógenos específicos.• Importancia del cultivo mixto linfocitario en la medicina transfusional.• Líneas de células tumorales empleadas en los ensayos de laboratorio para la
valoración de la actividad de los NK.• Citoquinas implicadas en la :
– Migración– Adherencia – Lisis mediada por Ms.
• Indique la importancia de la citometría de flujo en la estadificación del VIH.• Consultar las causas de variación (en ↓ y en ↑) de la relación LT-CD4/LT-CD8.• Señale las diferencias entre Th1 y Th2.• Enumere los Ag. Relacionados con células leucémicas.
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BIBLIOGRAFÍA• Balcells, A.; Soriano, M. La Clínica y el Laboratorio. 9na. Edición. Editorial Marín.
Barcelona – España. 1973.• Henry, B.; et all. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Editorial Marbán Libros. Madrid
– España. 2010.• Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. 6ta. Edición. Editorial Mc
Graw-Hill. México D.F.-México. 2007. • Prieto, J. Yuste, J. La Clínica y El Laboratorio Balcells. 21era. Edición. Editorial Elsevier
Masson. Barcelona – España. 2010.• Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. 4ta. Edición Revisada. Ed.
Médica Panamericana. Madrid - España. 2012.• Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de Rojas.
15ta. Edición. Corporación para las Investigaciones Biológicas. Medellín – Colombia. 2010.
• Stites, D.; Stobo, J.; Wells, J. Inmunología Básica y Clínica. 6ta. Edición. Editorial El Manual Moderno. México D.F. – México. 1988.
• Stites, D.; Terr, A. Inmunología Básica y Clínica. 7ma. Edición. Editorial El Manual Moderno. México D.F. – México. 1993.