VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA DETERMINAR
TRAZAS DE PANCREATINA POSTERIOR AL PROCESO DE LIMPIEZA DE
EQUIPOS EN PHARMETIQUE S.A.
KEVIN ENRIQUE LÓPEZ ROJAS
Estudiante
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS
Cartagena de Indias, 2019
VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA DETERMINAR
TRAZAS DE PANCREATINA POSTERIOR AL PROCESO DE LIMPIEZA DE
EQUIPOS EN PHARMETIQUE S.A.
KEVIN ENRIQUE LÓPEZ ROJAS
Estudiante Pasante de Química Farmacéutica
SINDY JIMÉNEZ CONTRERAS, Q.F.
Coordinadora de Control de Calidad de Pharmetique S.A.
Jefe Inmediato
LUCÍA ÁLVAREZ ÁLVAREZ, Q.F., Esp.
Directora
Propuesta de grado presentada en modalidad pasantía como pre-requisito
para optar al título de Químico Farmacéutico
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS
Cartagena de Indias, 2019
Nota De Aprobación Del Jurado
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Presidente Del Jurado
____________________________
Jurado
____________________________
Jurado
La Universidad de Cartagena ni el jurado examinador, se hacen
responsables de los conceptos emitidos en el presente trabajo.
Contenido
1.Resumen .............................................................................................................. 9
2.Introducción ........................................................................................................ 10
3.Metodología ........................................................................................................ 12
3.1.Revisión Bibliográfica ...................................................................................... 12
3.2.Determinación del límite de aceptación de limpieza ........................................ 12
3.3.Toma de muestras .......................................................................................... 14
3.4. Elaboración del protocolo de validación .......................................................... 16
3.4.1.Parámetros operativos ................................................................................. 16
3.4.2.Materiales, reactivos y soluciones a preparar .............................................. 17
4.Procedimiento de reacción enzimática ............................................................... 19
4.1.Parámetros de validación ................................................................................ 20
5.Resultados ......................................................................................................... 25
5.1.Determinación del límite de aceptación de limpieza ........................................ 25
5.2.Parámetros de validación ................................................................................ 25
5.2.1.Especificidad o selectividad .......................................................................... 25
5.2.2.LOQ Y LOD .................................................................................................. 30
5.2.3.Linealidad ..................................................................................................... 34
5.2.4.Exactitud ....................................................................................................... 37
5.2.5.Precisión ....................................................................................................... 43
5.2.6.Estabilidad de las muestras .......................................................................... 46
6.Conclusiones ...................................................................................................... 51
7.Referencias bibliográficas .................................................................................. 51
Tablas
Tabla 1 Parámetros Operativos ............................................................................. 16
Tabla 2 Procedimiento de reacción enzimática ..................................................... 19
Tabla 3 Disoluciones de amilasa MP .................................................................... 22
Tabla 4 Alicuotas a aplicar para las superficies..................................................... 22
Tabla 5 Estabilidad de las muestras ...................................................................... 24
Tabla 6 Resultados de especificidad o selectividad .............................................. 25
Tabla 7 Datos de curva de bajas concentraciones ................................................ 30
Tabla 8 Consolidado de datos de curva de bajas concentraciones ....................... 31
Tabla 9 Datos de curva de altas concentraciones ................................................. 31
Tabla 10 Datos de absorbancias de muestras de LOQ ......................................... 33
Tabla 11 Datos de absorbancias de muestras de LOD ......................................... 34
Tabla 12 Datos del ensayo de linealidad ............................................................... 35
Tabla 13 Consolidado de datos de ensayo de linealidad ...................................... 35
Tabla 14 Datos de regresión lineal ........................................................................ 36
Tabla 15 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
pintura epóxica. ..................................................................................................... 37
Tabla 16 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
vidrio. ..................................................................................................................... 38
Tabla 17 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
aluminio. ................................................................................................................ 39
Tabla 18 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de acero
inoxidable .............................................................................................................. 40
Tabla 19 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
acrílico ................................................................................................................... 41
Tabla 20 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
plástico .................................................................................................................. 42
Tabla 21 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de LOQ ....... 44
Tabla 22 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 100% ..... 45
Tabla 23 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 120% ..... 45
Tabla 24 Estabilidad de muestra a t0 .................................................................... 46
Tabla 25 Estabilidad de muestras a t6h expuestas a la luz ................................... 46
Tabla 26 Estabilidad de muestras a t6h protegidas de la luz ................................ 47
Tabla 27 Resultados de t6h vs t0 expuestas a la luz ............................................ 47
Tabla 28 Resultados de t6h vs t0 protegidas de la luz .......................................... 47
Tabla 29 Estabilidad de muestras a t12h expuestas a la luz ................................. 48
Tabla 30 Estabilidad de muestras a t12h protegidas de la luz .............................. 48
Tabla 31 Resultados de t12h vs t0 protegido de la luz .......................................... 49
Tabla 32 Resultados de tiempo 12h vs t0 protegido de la luz ............................... 49
Tabla 33 Estabilidad de muestras t24h expuestas a la luz .................................... 49
Tabla 34 Estabilidad de muestras t24h protegidas de la luz ................................. 50
Tabla 35 Resultados de t24h vs t0 protegido de la luz .......................................... 50
Tabla 36 Resultados de t24h vs t0 protegido de la luz .......................................... 50
Figuras
Figura 1 Hisopo Clean Tips Swabs ....................................................................... 15
Figura 2 Plantilla para muestreo ............................................................................ 15
Figura 3 Barrido vertical de muestreo ................................................................... 15
Figura 4 Barrido horizontal de muestreo ............................................................... 16
Figura 5 Espectro del blanco/diluente. .................................................................. 26
Figura 6 Espectro de LAL de amilasa ................................................................... 27
Figura 7 Espectro de detergente Aerowash Plus 5% ............................................ 27
Figura 8 Etanol 96 ................................................................................................. 28
Figura 9 Etanol 70% .............................................................................................. 28
Figura 10 Timsen 0,16% ....................................................................................... 29
Figura 11 Timsen 0,1% ......................................................................................... 29
Figura 14 Curva de calibración a bajas concentraciones ...................................... 31
Figura 15 Curva de calibración a altas concentraciones ....................................... 32
Figura 16 Curva de linealidad................................................................................ 36
9
1. Resumen
En el presente trabajo de pasantía se validó una metodología analítica de limpieza
que determinó trazas de pancreatina como apoyo al proceso de limpieza de
equipos, y así se obtuvo la evidencia documentada en conformidad con los
principios de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y Buenas Prácticas de
Laboratorio (BPL), de acuerdo a la directriz de la conferencia internacional de
armonización (ICH) vigente. Para esto se aplicaron las normas exigidas para
validaciones por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como requisito
importante, siguiendo las normas de BPM.
Se determinó el límite de aceptación de limpieza (LAL) de pancreatina que puede
existir en el equipo de producción y área de trabajo posterior al procedimiento de
limpieza basándose en la dosis mínima, dosis máxima, toxicidad y genotoxicidad
del principio activo.
Se establecieron superficies como puntos críticos específicos en los equipos de
producción y áreas de trabajo, los cuales se simularon dentro del laboratorio de
control de calidad de Pharmetique S.A., para efectos de la validación.
Las muestras fueron tomadas por el método de hisopado y analizadas con el
método analítico de espectrofotometría UV para determinar el consumo de almidon
ocasionado por la enzima amilasa y de esta manera obtener la concentración de
amilasa remanente, los resultados obtenidos de las muestras se compararon con el
LAL, y fueron menores, soporte técnico para que los procedimientos de limpieza
fueran validados, dando conformidad a lo esperado y quedó comprobado que dicha
metodología logra determinar trazas de pancreatina posterior al proceso de limpieza
de equipos y áreas involucradas en la manufactura del medicamento Leprit
enzimático.
10
2. Introducción
Pharmetique S.A, nombrado en adelante bajo las siglas PhQ S.A., es una compañía
farmacéutica del grupo Carval comprometida con la salud de millones de personas
en América Latina, con presencia en 14 países, que desarrolla, manufactura y
comercializa un amplio portafolio de medicamentos que cubren las principales
necesidades de salud de los latinoamericanos. PhQ S.A. Adquirió la trayectoria y
experiencia de más de 30 años de Laboratorios La Santé y se constituye como una
potente organización farmacéutica con una nueva estrategia y arquitectura de
marca que le permitirá entrar al mercado de los medicamentos altamente
especializados y de biotecnología en el área de la oncología y la inmunología. (PhQ
S.A., 2016).
El grupo farmacéutico compuesto por Laboratorios La Santé S.A., Manufacturera
Mundial Farmacéutica S.A. y PhQ S.A. se compromete con sus clientes, autoridades
y accionistas en cumplir con los requerimientos de calidad mediante estándares
locales e internacionales con el fin de brindar a los pacientes productos seguros y
eficaces. Entre directivos y colaboradores, desarrollan, manufacturan, licencian y
comercializan los productos aplicando las normativas regulatorias, las buenas
prácticas de manufactura y las buenas prácticas de laboratorio exigidas en los
mercados de interés. El talento humano, los recursos, los productos y procesos
están asociados a una cultura de calidad, enfocada a la mejora continua e
innovación en la cadena de suministros, buscando impactos positivos en los
elementos económicos, ambientales y sociales de la industria farmacéutica, en el
grupo de clientes y partes interesadas: accionistas, colaboradores, profesionales de
la salud, pacientes, proveedores, gobierno, ambiente y comunidad.1
PhQ S.A. cuenta con cinco unidades de negocio de amplio portafolio que están
dedicadas a la producción de medicamentos de: cuidado primario, cuidado
1 Hernández Hernández, A., Ramírez Angarita, A. J., & Rubiano Rodríguez, A. R. Propuesta de mejora para el proceso de calidad de la gestión de la cadena de suministro para la empresa Pharmetique labs S.A. bajo los lineamientos de la norma NTC iso 9001: 2015.
11
especializado, genéricos de prescripción y de venta libre, y prestación de servicios
de manufactura para compañías multinacionales de investigación. (PhQ S.A.,
2016).
La estrategia de crecimiento de PhQ S.A. se basa en tres pilares: un portafolio de
nuevos productos, un programa de apertura de operación en nuevos países y el
lanzamiento de la línea de medicamentos especializados y de biotecnología. La
visión de PhQ S.A., es ser el laboratorio farmacéutico de mejor desempeño a nivel
de crecimiento y liderazgo de mercado, aportando al desarrollo sostenible a los
países de América Latina donde se tiene presencia. (PhQ S.A., 2016).
La Calidad, además de ser uno de los valores fundamentales que se implementan
PhQ S.A., es también una de las especificaciones más importantes en el producto
terminado, por lo tanto este parámetro debe estar completamente aprobado con el
fin de cumplir con las buenas prácticas de manufactura (BPM), buenas prácticas de
laboratorio (BPL), las expectativas de las autoridades sanitarias y de los clientes a
los que se les realiza maquila de productos. El área de control de calidad (QC) de
PhQ S.A. se encarga de llevar a cabo los análisis pertinentes para satisfacer las
necesidades y exigencias de los clientes, dentro de ellos se encuentran los análisis
para determinación de sustancias remanentes posterior a la fabricación de
productos en los equipos; estas metodologías de análisis deben ser validadas antes
de ser implementados dentro del laboratorio de QC.
Los procedimientos de limpieza adecuados desempeñan un papel importante en la
prevención de contaminación cruzada. (Invima, 2018). Las validaciones de limpieza
son fundamentales en laboratorios multiproducto donde se comparten equipos para
diferentes categorías de productos y debe ser ejecutada, entre otros, para equipos,
áreas y procedimientos de sanitización. La vigencia de la limpieza de los equipos
de fabricación, accesorios, utensilios y todas las tuberías debe establecerse con
base en los resultados de la validación. (Invima, 2018).
12
Palabras clave: Validación de limpieza, Buenas Prácticas De Manufactura (BPM),
Buenas Practicas de Laboratorio (BPL), actividad enzimática de amilasa (A.E.A.),
Limite de Aceptación de Limpieza (LAL).
3. Metodología
3.1. Revisión Bibliográfica
Se llevó a cabo la revisión bibliográfica sobre las características tanto del principio
activo como del producto leprit enzimático. Se revisaron protocolos y documentos
estándares operativos con los cuales se llevan a cabo las limpiezas y sanitización
de los equipos involucrados en la producción y envase del producto leprit
enzimático.
3.2. Determinación del límite de aceptación de limpieza
Se tuvo en cuenta para calcular el límite de aceptación de limpieza, LAL, una matriz
de productos peores casos generada por el área de servicios farmacéuticos de Phq
S.A., en el cual se especificaron variables como: equipos involucrados en la
manufactura de los productos, áreas de los equipos en las cuales hay contacto con
el producto, dosis mínimas diarias de los medicamentos o fármacos y dosis daría
más alta del próximo medicamento o fármaco que se fabricara en el mismo equipo.
Para determinar el LAL, se tomó como referencia la técnica de reporte N°29 de la
Parental Drug Association, PDA por sus siglas en inglés, “Puntos a considerar para
validaciones de limpieza”, en el cual se plantea que se puede determinar el límite
de aceptación de limpieza (LAL), teniendo en cuenta la dosis mínima diaria del
medicamento A en µ/día, el factor de seguridad recomendado por la PDA para
medicamentos de administración por vía oral cuyo valor es de 0,001, el tamaño del
lote del en Kg, la dosis máxima diaria en mg/día del medicamento B, y la sumatoria
de las áreas que comparten los dos productos en cm2. Se planteó la ecuación 1
para ello.
13
LAL = MDDxSFxTLBx1000
LDDxAS
(Parental Drug Association, 2012)
Ecuación 1 Nivel aceptable de residuos.
Donde:
MDD: Dosis diaria mínima del medicamento problema.
SF: Factor de seguridad (0.001).
TLB: Tamaño del lote del medicamento B.
LDD: Dosis diaria más alta del medicamento B que se fabricará en el mismo equipo
AS: Sumatoria de las áreas compartidas en el equipos.
(Parental Drug Association, 2012).
Los valores para el cálculo del ARL son los siguientes:
MDD: 150000 µg/día
TLB: 38,68 Kg
LDD: 1,65g/día
AS: 123148 cm2
Reemplazando los valores en la ecuación 1, se obtiene lo siguiente:
𝐿𝐴𝐿 = 150000
µ𝑔𝑑í𝑎
𝑥0,001𝑥38,68𝐾𝑔𝑥1000𝑔
1,65𝑔
𝑑𝑖𝑎𝑥123148𝑐𝑚2𝑥1𝐾𝑔
= 28,55µ𝑔/𝑐𝑚2
Teniendo en cuenta que el activo a determinar en la validación es una enzima, la
cantidad de la misma debe expresarse en unidades USP, considerando que la
materia prima de pancreatina utilizada en la manufactura del medicamento A posee
una potencia aproximada de 100 UUSP de amilasa/mg de pancreatina, se hace la
conversión planteada en la ecuación 2.
14
𝑈𝑈𝑆𝑃
𝑐𝑚2=
28,55µg
cm2𝑥1𝑚𝑔𝑥100𝑈𝑈𝑆𝑃
1000µgx1mg= 2,86 𝑈𝑈𝑆𝑃/𝑐𝑚2
(Rojas, J., Sierra, N., 2017)
Ecuación 2 Unidades USP/cm2
Rojas, J., en su libro “Como Validar Sus Metodologías Analíticas” sugiere que el
área de muestreo de las superficies por el método de hisopado para determinar
trazas de principios activos sea de 5cm2 por cada 0,4 mL del solvente de muestreo
utilizado en el proceso de recuperación del hisopo. Teniendo en cuenta que en los
ensayos de pre-validación y estandarización de los parámetros y condiciones de la
metodología analítica se determinó que el volumen de solvente de muestreo a
utilizar en la recuperación del activo posterior al proceso de muestreo por hisopado
sobre las superficies fuese de 2mL, debido a que durante el proceso de reacción
enzimática, descrito en la tabla 2, se utiliza 1mL de la solución de recuperación del
hisopo. Por lo cual se determinó que el área mínima de muestreo sobre las
superficies fuese de 25cm2/2mL. Por lo cual se hace la ecuación 3:
𝑈𝑈𝑆𝑃
𝑚𝐿=
2,86𝑈𝑈𝑆𝑃𝑐𝑚2 𝑥25𝑐𝑚2
2𝑚𝐿= 35,7
𝑈𝑈𝑆𝑃
𝑚𝐿
(Rojas, J., Sierra, N., 2017)
Ecuación 3 Unidades USP/mL
Se obtuvo la concentración de 35,7 UUSP de amilasa/mL de solvente de muestreo,
este valor fue considerado como LAL y concentración de trabajo con la cual fue
llevada a cabo la validación de la metodología analítica.
3.3. Toma de muestras
Las muestras se tomaron realizando un barrido sobre las superficies de pintura
epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado farmacéutico,
15
definidas como críticas en el proceso de limpieza, utilizando el hisopo de referencia
indicada, el cual se detalla en la figura 1.
El muestreo se realizó siguiendo los pasos detallados en las figuras 2 a 4:
Se tomó el hisopo de referencia indicado
(Fisher scientific, 2019)
Figura 1 Hisopo Clean Tips Swabs
Se humedeció el hisopo con el solvente de muestreo (diluente), detallado en
el punto 3.4.2
Se colocó una plantilla de un área conocida para la toma de muestra sobre
el punto a muestrear, como se ejemplifica en la figura 2.
Figura 2 Plantilla para muestreo
Se realizó un barrido vertical sobre la superficie con el hisopo, empezando
en un extremo del área y terminando en el extremo opuesto, tal como se
detalla en la figura 3.
Inicio
Final
Figura 3 Barrido vertical de muestreo
16
Se giró el hisopo 180° y se realizó un nuevo barrido en el mismo sentido, bajo
las mismas condiciones.
Se realizó un barrido horizontal sobre la superficie con el hisopo, empezando
en un extremo del área y terminando en el extremo opuesto, tal como se
detalla en la figura 4
Inicio Final
Figura 4 Barrido horizontal de muestreo
Se giró el hisopo 180° y se realizó un nuevo barrido en el mismo sentido, bajo
las mismas condiciones.
Se introdujo el hisopo en un vial de muestreo y se cortó el mango de este.
3.4. Elaboración del protocolo de validación
Se elaboró un protocolo experimental en el cual quedaron descritos los parámetros
de validación, las condiciones del análisis, las soluciones y reactivos que se
prepararon, en conformidad con los principios de BPM y BPL, con el cual se obtuvo
evidencia documentada la cual garantizó que la metodología analítica fue adecuada
y permitió obtener datos confiables y reproducibles.
3.4.1. Parámetros operativos
Los parámetros operativos se describen en la Tabla 1.
Tabla 1 Parámetros Operativos
Producto Leprit enzimático
Sustancia a Determinar Pancreatina.
Criterio de Análisis Limpieza de equipos
17
3.4.2. Materiales, reactivos y soluciones a preparar
Los reactivos y las soluciones preparadas que se utilizaron para llevar a cabo la
validación de la metodología analítica de limpieza de describen a continuación.
Hisopo para muestreo
Se utilizaron hisopos (MARCA TEXWIPE). Descritos en la figura 1.
Solución diluente
Se pesó 13,6 g de fosfato monobásico de potasio grado reactivo (GR) y se disolvió
en agua para preparar 500 mL de solución. Se pesó 14,2 g de fosfato dibásico de
sodio anhidro GR y se disolvió en agua para preparar 500 mL de solución.
Se mezcló 51 mL de solución de fosfato monobásico de potasio GR con 49 mL de
solución de fosfato dibásico de sodio GR. Se ajustó a un pH de 6,8 mediante la
adición gota a gota de hidróxido de sodio 0,1N o ácido clorhídrico 0,1N.
Solución de cloruro de sodio
Se pesó 11,7 g de cloruro de sodio y se disolvió en agua para preparar 1000 mL de
solución.
Solución de almidón
Se pesó 2,5 g de almidón y se disolvió en 15 mL de agua, se agregó esta mezcla
a 200 mL de agua hirviendo. Se enjuagó el vaso de precipitado con 15 mL de agua,
se agregó a la solución caliente y se calentó hasta ebullición mezclando
Técnica analítica Espectrofotometría UV
Longitud de onda de referencia 590nm
Rango de barrido 550-690 nm
18
continuamente. Se enfrió a temperatura ambiente y se agregó agua para preparar
250 mL.
Solución de yodo/yoduro de potasio
Se pesó aproximadamente 28 mg de yodo y 28 mg de yoduro de potasio en un
balón de 50 mL, se agregó 2 mL de alcohol etílico al 96%, se llevó a vortex hasta
completa disolución y se completó a volumen con agua.
Solución de ácido clorhídrico 6N
Se agregó con precaución 510 mL de ácido clorhídrico al 37% a 300 mL de agua,
se homogenizó y completó hasta 1000 mL con agua desmineralizada.
Soluciones de detergente, inactivante y sanitizante
Detergente AEROWASH Plus 5%, Timsen al 0,16 %, Alcohol (Etanol) al 70%,
Alcohol (Etanol) al 96%.
Estas soluciones se utilizaron para determinar si existe interferencia a la longitud de
onda establecida en el protocolo, ya que estas son utilizadas para la limpieza de los
equipos de producción.
Solución estándar madre de amilasa
Se pesó 20 mg de estándar USP de Amilasa y Proteasa, cuya potencia es de 344
UUSP/mg, en un balón aforado de 50 mL, se solubilizó con diluente previamente
refrigerado (2°C - 8°C), se completó volumen y se agitó en vortex durante 2 minutos,
para obtener una concentración aproximada de 137,6 UUSP/mL de amilasa.
Solución estándar LAL de amilasa
De la solución anterior se tomó una alícuota de 2,6 mL y se pasó a un balón aforado
de 10 mL, se completó a volumen con diluente y se homogenizó en vortex durante
19
2 minutos para obtener uno solución de aproximadamente 35,7 U USP/mL de
amilasa.
Solución madre de amilasa materia prima
Se pesó 142,76 mg de pancreatina MP, cuya potencia es de 100 UUSP/mg, en un
balón aforado de 20 mL, se disolvió con diluente previamente refrigerado (2°C-8°C),
se completó a volumen y se llevó a vortex durante 2 minutos, para obtener una
concentración aproximada de amilasa de 713,8 UUSP/mL.
Solución equivalente al LAL de amilasa materia prima
De la solución anterior se tomó una alícuota de 5 mL y se pasó a un balón aforado
de 10 mL, se completó a volumen con diluente y se homogenizó en vortex durante
2 minutos, para obtener una solución de aproximadamente 356,9 U USP/mL de
amilasa. Esta solución se preparó con el propósito de tener una muestra de la
pancreatina MP utilizada en la fabricación del producto leprit enzimático, la cual fue
utilizada en la determinación de los parámetros exactitud y estabilidad de la
muestra.
4. Procedimiento de reacción enzimática
El procedimiento que se llevó a cabo para ejecutar la reacción enzimática in vitro se
describe en la tabla 2. Cada tubo de ensayo donde se llevó a cabo la reacción se
marcó de la siguiente manera, B para el blanco de la reacción enzimática, S para el
estándar LAL de pancreatina y M# para las muestras, identificándolas con los
números respectivos de los puntos de muestreos.
Tabla 2 Procedimiento de reacción enzimática
Reactivos B(µL) S(µL) M#(µL) M#(µL)
Solución de almidón 1000 1000 1000 1000
Diluente 1000 1000 1000 1000
Solución de NaCl 500 500 500 500
Solución de Yodo/Yoduro 100 100 100 100
20
Incubar a 37°C por 5 minutos
Diluente 1000 -- -- --
Solución de estándar LAL -- 1000 -- --
M# -- -- 1000 --
M# -- -- -- 1000
Reacción por 7 minutos a 37°C cronometrados
Solución de HCL 6N 500 500 500 500
4.1 Parámetros de validación
Los parámetros que se llevaron a cabo en la validación, con la finalidad de cumplir
con lo establecido por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus
siglas en ingles), se describen a continuación.
Especificidad o selectividad
Este parámetro evaluó bajo el procedimiento de reacción enzimática descrito en el
punto 4 y se determinaron las posibles interferencias entre la pancreatina, en
placebo de leprit enzimático, la solución diluente utilizada para el análisis, y las
sustancias utilizadas en la limpieza de las áreas involucradas descritas en el punto
3.4.2.
LOQ Y LOD
Se determinó el LOQ teniendo en cuenta la concentración de menor coeficiente de
variación en la curva de bajas concentraciones y se determinó el LOD teniendo en
cuenta la ecuación 4.
LOD =(3,3 ∗ LOQ)
10⁄
Ecuación 4 Limite de detección
(Rojas, J., Sierra, N., 2017)
21
Se verificó experimentalmente que el coeficiente de variación entre la respuesta del
equipo fue menor a 10%, haciendo una lectura de 6 muestras preparadas a
concentración de LOQ. Posteriormente, se verificó que existe absorbancia a la
longitud de onda de referencia haciendo una lectura de 6 muestras preparadas a
concentración de LOD calculado según la ecuación 4.
Linealidad
Se evaluó la linealidad con la finalidad de comprobar la existencia de una relación
lineal entre la señal generada por el equipo y la concentración de la sustancia de
interés.
Se prepararon soluciones a concentraciones desde el LOQ, 60%, 80%, 100% y
120% del límite de aceptación de limpieza, con el objetivo de garantizar que exista
una relación desde la concentración mínima cuantificable por la metodología hasta
la concentración máxima a evaluar.
Exactitud
El parámetro de exactitud se evaluó con el objetivo de determinar el porcentaje de
recuperación de amilasa sobre superficies caracterizadas como críticas tales como
pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado
farmacéutico.
Se prepararon diluciones de amilasa MP por triplicado en balones aforados de 10mL
a concentraciones de LOQ, 100% y 120% como sugiere Rojas, J., de la manera en
la que se indica en la tabla 3, a partir de la solución madre de amilasa preparada en
el punto 3.4.2, y se aplicaron alícuotas de estas soluciones sobre las superficies
siguiendo las indicaciones de la tabla 4, se muestrearon por el método de hisopado
las superficies anteriormente mencionadas, a los tres niveles de concentración
establecidos cada uno preparado por triplicado, para un total de 9 datos de
porcentaje de recuperación por superficie, se calculó el promedio de los porcentajes
de recuperación, la desviación estándar y los coeficientes de variación de las
22
muestras, este último dato es críticos para la aceptación del parámetro, por lo tanto
debe ser menor a 15% (Rojas, J., Sierra, N., 2017)
Tabla 3 Disoluciones de amilasa MP
CONCENTRACIÓN DE AMILASA
ALÍCUOTA A TOMAR DE LA SOLUCIÓN
MADRE DE AMILASA (mL)
% U USP/mL
LOQ 14,32 LOQ
100 35,7 5
120 42,84 6
Tabla 4 Alícuotas a aplicar para las superficies
CONCENTRACIÓN DE AMILASA
CONCENTRACIÓN DE AMILASA (U USP/mL)
VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN
A VERTER (mL)
40% = LOQ 14,32 0,2
100 % 35,7 0,2
120 % 42,84 0,2
Se prepararon las diluciones a trabajar sobre las superficies tal y como lo muestra
la tabla 3, de tal forma que al adicionar sobre cada superficie el volumen indicado
en la tabla 4 para cada concentración, quedó depositada sobre ella la concentración
de amilasa especificada en la misma tabla. Posterior al muestreo, se procedió a
recuperar con 2mL de diluente, tal como se indica en el punto 3.2.
Se planteó la ecuación 5 con la cual se determinó el porcentaje de recuperación de
pancreatina sobre las superficies críticas en el proceso:
% de recuperacion de amilasa
= {((A. B − A. Mta) ∗ P. Std ∗ Pot. Std ∗ Vol. Std ∗ V. Std. Rx ∗ VF. Mp ∗ VF. Eq ∗ FD)
((A. B − A. Std LAL) ∗ VF. SM ∗ VF. Std ∗ P. Mp ∗ Pot. Mp ∗ Vol. Mp ∗ A. %R ∗ 1mL)}
∗ 100
(Rojas, J., Sierra, N., 2017)
Ecuación 5 Porcentaje de recuperación de amilasa
23
Donde:
-A.B: señal generada por el blanco.
-A.Mta: señal generada por la muestra.
-A.Std LAL: señal generada por el estándar LAL.
-P.Std: peso en mg del estándar de pancreatina.
-Pot.Std: potencia U USP/mg del estándar utilizado.
-VF.SM: volumen en mL al cual se llevara la solución madre de amilasa
-Vol.Std: volumen en mL utilizado de la solución madre de amilasa para la solución
LAL.
-VF.Std: volumen en mL al cual se llevara la solución LAL de amilasa.
-V.Std.Rx: volumen en mL utilizado de la solución LAL para la reacción enzimática.
-P.Mp: peso en mg de la materia prima de pancreatina utilizado preparar la solución
madre.
-Pot.Mp: potencia en U USP/mg de la materia prima de pancreatina.
-VF.Mp: volumen en mL al cual se llevara la solución madre de materia prima de
pancreatina.
-Vol.Mp: volumen en mL utilizado de la solución de materia prima para la solución
equivalente a LAL de pancreatina.
-VF.Eq: volumen en mL al cual se llevara la solución equivalente a LAL de
pancreatina materia prima.
-A. %R: alícuota en mL tomada de la solución equivalente a LAL para aplicar sobre
la superficie crítica.
-FD: volumen en mL de diluente a adicionar a los hisopos posterior al muestreo
sobre la superficie.
-Vol.Rx: volumen en mL utilizado de la muestra para la reacción enzimática.
Precisión
Se determinó la precisión del método llevando a cabo los parámetros de
repetibilidad y precisión intermedia descritos a continuación:
o Repetibilidad
24
Se tomó los datos de coeficientes de variación (CV) obtenidos en los muestreos de
los materiales que fueron ensayados en el parámetro de exactitud y con ellos se
determinó la repetibilidad de la metodología analítica de limpieza.
Se tuvo en cuenta el número de muestras como única variable para calcular el dato
de CV de los porcentajes de recuperación.
o Precisión intermedia
Para esto se realizó la preparación descrita en el parámetro de exactitud cambiando
de analista y día de ejecución. Se tomó los datos obtenidos en ensayo de exactitud
y comparó con los de este ensayo y así se determinó la precisión intermedia del
método.
Estabilidad de las muestras
Se determinó la estabilidad de las muestras con el fin de establecer la influencia de
condiciones de almacenamiento, como los son el tiempo de almacenamiento
posterior al muestreo y la exposición a la luz de las muestras. Las condiciones con
las que se evaluó la este parámetro se describen en la tabla 5.
Tabla 5 Estabilidad de las muestras
PARÁMETRO
MUESTRAS
M1**
M2** M3** M4**
FRASCO
AMBAR
TUBO DE
ENSAYO
FRASCO
AMBAR
TUBO DE
ENSAYO
FRASCO
AMBAR
TUBO DE
ENSAYO
Tiempo de
almacenamiento*
0
horas 6 horas 12 horas 24 horas
Exposición a la
luz No No Si No Si No Si
*Tiempo comprendido entre el muestreo y el análisis por espectrofotometría uv.
**Todas las muestras deberán ser preparadas por duplicado.
Se determinó el porcentaje de recuperación de la estabilidad de las muestras
utilizando la ecuación 5.
25
5. Resultados
5.1 Determinación del límite de aceptación de limpieza
El LAL determinado durante ensayos de pre-validación y estandarización de los
parámetros de la metodología analítica, fue de 35,7 UUSP/mL, este valor es
indispensable para llevar a cabo una validación de metodología analítica de
limpieza, ya que en este es la concentración de trabajo de la validación de la
metodología analítica y con la cual se compararon las soluciones y muestras
analizadas.
5.2 Parámetros de validación
A continuación se detallan los resultados obtenidos en la validación de cada uno de
los parámetros estudiados.
5.2.1 Especificidad o selectividad
En la tabla 6 se muestran los resultados de las absorbancias producidas por cada
una de las muestras evaluadas en este parámetro. Al realizarse el estudio sobre un
ensayo de reacción enzimática en retroceso por consumo de almidón utilizando una
solución de yodo como indicador de intensidad de color, se debe calcular la
diferencia entre el blanco de reactivo, el cual es referencia de que no hubo consumo
de almidón en la muestra, y la absorbancia emitida por la muestra a longitud de
onda de 590nm.
Tabla 6 Resultados de especificidad o selectividad
Muestra Absorbancia (nm) Diferencia (nm)
Diluente-Blanco 1,28402171 0
Estándar LAL de amilasa 0,92815902 0,35586269
Detergente Aerowash Plus 5% 1,23525385 0,04876786
Etanol 70% 1,22088947 0,06313224
26
Etanol 96% 1,23948802 0,04453369
Timsen 0,16% 0,77144756 0,51257415
Timsen 0,1% 1,06344300 0,22057871
De acuerdo con los resultados obtenidos se confirma que la metodología analítica
es específica y selectiva para determinar trazas de pancreatina posterior al proceso
de limpieza de equipos, debido a que las diferencias de absorbancias entre el blanco
y las muestras críticas evaluadas no interfieren y se encuentran por debajo de la
señal emitida por el estándar de amilasa al LAL, a excepción de la solución de
timsen al 0,16%, por lo cual se prepara y se analiza como muestra una solución de
concentración más diluida simulando el proceso de enjuague de los equipos,
garantizando así que esta sustancia no interfiere con la señal la amilasa, siendo la
diferencia de esta absorbancias inferior a la del LAL .Los espectros obtenidos de las
muestras críticas se ejemplifican desde la figura 5 hasta la figura 11.
Figura 5 Espectro del blanco/diluente.
27
Figura 6 Espectro de LAL de amilasa
Figura 7 Espectro de detergente Aerowash Plus 5%
28
Figura 8 Etanol 96
Figura 9 Etanol 70%
29
Figura 10 Timsen 0,16%
Figura 11 Timsen 0,1%
30
Cabe resaltar que la lectura del blanco en la reacción, como lo indica la tabla 2, por
el método de espectrofotometría UV se realizó una única vez por día, en el caso de
la especificidad/selectividad quedó expresado el resultado de la absorbancia del
blanco de reacción en la tabla 6, este valor no es relacionado con los demás
ensayos de los parámetros ya que estos fueron realizados en días distintos, por lo
tanto el valor del blanco se omite para estos ensayos y únicamente se coloca en las
tablas de resultados las diferencias obtenidas entre el la lectura del blanco del día
de análisis y las muestras analizadas.
5.2.2 LOQ Y LOD
LOQ
Se estableció el límite de cuantificación teniendo en cuenta el método de curvas de
calibración, tanto a bajas concentraciones como a altas concentraciones, los
resultados obtenidos de estas curvas de calibración se muestran en las tablas 7 a
la 9 y figuras 14 y 15.
Tabla 7 Datos de curva de bajas concentraciones
% De
LAL Concentración (uusp/mL) Mta #lectura Señal
Promedio
muestras SD
CV
muestras
10% 3,580
1 1 0,067441873
0,09209 0,03 30,24%* 2 0,068513600
2 1 0,116071938
2 0,116329022
15%
5,370
1 1 0,112428720
0,12079 0,01 6,27%
2 0,116477546
2 1 0,125814932
2 0,128418982
20% 7,160
1 1 0,142335828
0,13950 0,01 4,88% 2 0,147783999
2 1 0,133489312
2 0,134370900
30% 10,740
1 1 0,179905665
0,17569 0,01 3,90% 2 0,182774038
2 1 0,167912757
2 0,172173522
40% 14,320
1 1 0,232410066
0,22807 0,01 2,89% 2 0,234943232
2 1 0,223365025
2 0,221568515
31
*Debido al coeficiente de variación superior a 15%, según Rojas, J., de la
concentración de 3,58 UUSP/mL, se concluye que a dicha concentración no se
puede cuantificar con exactitud y precisión muestras de amilasa, por lo cual este
valor se omite para la determinación de LOD y LOQ.
Tabla 8 Consolidado de datos de curva de bajas concentraciones
X (UUSP/mL) Y(Absorbancia)
3,58 0,09209
5,37 0,12079
7,16 0,13950
10,74 0,17569
14,32 0,22807
Con los datos obtenidos en el consolidado de curva de bajas concentraciones se
realizó la Figura 14, en la cual se detalla la ecuación de la recta, y el coeficiente de
correlación, el cual indica que existe una relación lineal entre X y Y.
Figura 12 Curva de calibración a bajas concentraciones
Tabla 9 Datos de curva de altas concentraciones
% De LAL
Concentración (UUSP/mL)
Muestra #lectura Señal (Abs)
Promedio muestras SD CV
muestras
40 14,32
1 1 0,23241007
0,228071710 0,006595 2,891651 2 0,23494323
2 1 0,22336502
2 0,22156851
y = 0,0122x + 0,0511R² = 0,9935
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ab
sorb
anci
a
Concentracion (UUSP/mL)
Curva de calibracion (Bajas concentraciones)
32
60 21,487
1 1 0,28129037
0,281685146 0,000484 0,171862 2 0,28126818
2 1 0,28194282
2 0,28223921
80 28,65
1 1 0,42204832
0,396753764 0,029687 7,482482 2 0,42286452
2 1 0,37030276
2 0,37179946
100 35,81
1 1 0,45457904
0,463805230 0,009298 2,004637 2 0,45704492
2 1 0,47119502
2 0,47240194
120 42,97
1 1 0,5482985
0,546978236 0,001242 0,227027 2 0,54776888
2 1 0,54604517
2 0,5458004
Con los datos obtenidos en la curva de altas concentraciones se realizó la Figura
15, en la cual se detalla la ecuación de la recta, y el coeficiente de correlación, el
cual indica que existe una relación lineal entre X y Y.
Figura 13 Curva de calibración a altas concentraciones
y = 0,0114x + 0,0555R² = 0,9905
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración (UUSP/mL)
Curva de calibracion (Altas concentraciones)
33
Se determinó el LOQ teniendo en cuenta la menor concentración en UUSP/mL a la
cual se obtuvo coeficiente de variación menor a 15% con respecto a la curva de
bajas concentraciones, obteniéndose el valor de 5,37 UUSP/mL. Se realizó la
confirmación de este valor por medio de la lectura de 6 muestras preparadas a
concentración de 5,37 UUSP/mL, los resultados obtenidos se encuentran en las
tabla 10.
Tabla 10 Datos de absorbancias de muestras de LOQ
MUESTRA ABSORBANCIA
#1 0,07780725
# 2 0,07792420
# 3 0,07783238
# 4 0,07781126
# 5 0,07777592
# 6 0,07792800
PROMEDIO 0,07784650
SD 0,0000642
% CV 0,083%
La metodología analítica cuantifica con exactitud y precisión cantidades mayores o
iguales a 5,37 UUSP/mL, que corresponde al 15% de concentración del límite de
aceptación de limpieza. Se tuvo un coeficiente de variación de 0,083% cumpliendo
así con la especificación (<15%), según Rojas, J.
LOD
Se calculó el límite de detección con la ecuación 4, utilizando el LOQ determinado
en el punto 5.2.2 y se obtuvo como resultado para el LOD un valor de 1,772
UUSP/mL, el cual corresponde al 4,95% de la concentración del LAL. Se realizó la
confirmación de este valor por medio de la lectura de 6 muestras preparadas a
concentración de 1,772 UUSP/mL,
34
LOD =(3,3 ∗ 5,37)
10⁄ = 1,772𝑈𝑈𝑆𝑃
𝑚𝐿
Ecuación 4 Limite de detección
Los resultados obtenidos de la lectura de 6 muestras preparadas a concentración
de 1,772 UUSP/mL se encuentran en la Tabla 11.
Tabla 11 Datos de absorbancias de muestras de LOD
MUESTRA
LOD ABSORBANCIA
# 1 0,02358968
# 2 0,02383985
# 3 0,02391265
# 4 0,02405671
# 5 0,02411532
# 6 0,02429615
PROMEDIO 0,02396840
SD 0,000245
% CV 1,022
5.2.3 Linealidad
Se comprobó que existe una relación lineal entre la absorbancia generado por el
equipo y la concentración de amilasa en las muestras analizadas. Los niveles de
concentración ensayados fueron establecidos con base al límite de aceptación de
limpieza, en un rango comprendido desde la concentración de LOQ, 60%, 80%,
100% y 120%, en dicho intervalo se encontró que la metodología de análisis es
lineal para la cuantificación de trazas de amilasa, reportándose los resultados
obtenidos en las tablas 12 a la 15 y la figura 16.
35
Tabla 12 Datos del ensayo de linealidad
(%) (uusp/ml) Mta #Lectura Señal
(Abs) Promedio SD
CV
(%)
LOQ 5,370
1 1 0,1527584
0,1467171 0,009 6,1 2 0,1559273
2 1 0,1386475
2 0,1395352
60% 21,480
1 1 0,3045838
0,3018741 0,005 1,6 2 0,3072473
2 1 0,2987859
2 0,2968796
80% 28,640
1 1 0,3809662
0,38140 0,00 0,15 2 0,3809148
2 1 0,3815917
2 0,3821153
100% 35,800
1 1 0,4598324
0,45449 0,01 1,21 2 0,4512671
2 1 0,4484729
2 0,4583829
120% 42,960
1 1 0,5442328
0,52680 0,02 3,88 2 0,5447284
2 1 0,5089828
2 0,5092642
Tabla 13 Consolidado de datos de ensayo de linealidad
% de LAL X (UUSP/mL) Y (Absorbancia)
LOQ 5,37 0,14672
60 21,48 0,30187
80 28,64 0,38140
100 35,80 0,45449
120 42,96 0,52680
36
Con los datos obtenidos en la curva de linealidad se realizó la Figura 16, en la cual
se detalla la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación, el cual indica que
existe una relación lineal entre X y Y.
Figura 14 Curva de linealidad
Los datos de regresión lineal obtenidos de la curva de linealidad (Figura 16), se
detallan en la Tabla12.
Tabla 14 Datos de regresión lineal
R2 0,9995
Pendiente (m) 0,0102
Intercepto (b) 0,0894
El coeficiente de correlación obtenido en el ensayo de linealidad fue de 0,9995,
cumpliendo así con el criterio de aceptación para validaciones de metodologías
analíticas de trazas (R2 >0,9800), recomendado por Rojas, J.
y = 0,0102x + 0,0894R² = 0,9995
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
Ab
sorb
anci
a
Concentracion (UUSP/mL
Linealidad
37
5.2.4 Exactitud
Se determinó el porcentaje de recuperación de amilasa en superficies de pintura
epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado farmacéutico,
simulando diferentes concentraciones sobre un área de 25 cm2.
Estas superficies fueron muestreadas y analizadas de acuerdo a los parámetros y
condiciones establecidas en el punto 4.3.
Las concentraciones evaluadas en este ensayo fueron de 15%, 100% y 120%, cada
una realizándose por triplicado. Los resultados obtenidos se registran en las tablas
15 a 18 para cada material, respectivamente.
Tabla 15 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
pintura epóxica.
Mtra #lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 100,71
100,96 0,35 0,35%
Promedio
2 101,21
101,46
LOQ 2
1 101,48
101,55 0,10 0,10%
Desviación
2 101,63
0,44
LOQ 3
1 101,77
101,85 0,12 0,11%
CV
2 101,93 0,43%
100% 1
1 96,96
97,00 0,05 0,05%
Promedio
2 97,04
103,09
100% 2
1 106,46
106,30 0,22 0,21%
Desviación
2 106,15
4,72
100% 3
1 105,95
105,97 0,04 0,04%
CV
2 106,00
4,58%
38
120% 1
1 89,12
89,15 0,04 0,04%
Promedio
2 89,18
94,75
120% 2
1 103,58
103,64 0,08 0,08%
Desviación
2 103,69
6,96
120% 3
1 91,45
91,48 0,05 0,05%
CV
2 91,51
7,34%
ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS
Promedio 99,77
Desviación 6,07
C.V.* 6,08%
Mínimo 89,12
Máximo 106,46
Tabla 16 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
vidrio.
Mtra #Lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 90,57
91,08 0,71 0,78%
Promedio
2 91,58
94,91
LOQ 2
1 96,00
96,25 0,34 0,36%
Desviación
2 96,49
3,04
LOQ 3
1 97,08
97,41 0,46 0,47%
CV
2 97,73 3,20%
100% 1
1 99,42
99,34 0,11 0,11%
Promedio
2 99,26
95,00
100% 2
1 98,16
98,07 0,13 0,14%
Desviación
2 97,97
5,76
100% 3
1 87,65
87,61 0,06 0,07%
CV
2 87,56
6,06%
39
120% 1
1 92,06
92,03 0,04 0,05%
Promedio
2 92,00
96,98
120% 2
1 97,78
97,77 0,02 0,02%
Desviación
2 97,75
4,12
120% 3
1 101,13
101,14 0,02 0,02%
CV
2 101,15
4,25%
ESTADÍSTICOS
CONSOLIDADOS
Promedio 95,63
Desviación 4,42
C.V.* 4,62%
Mínimo 87,56
Máximo 101,15
Tabla 17 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
aluminio.
Mtra #Lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 91,88
91,54 0,48 0,53%
Promedio
2 91,20
90,75
LOQ 2
1 89,98
89,73 0,35 0,39%
Desviación
2 89,48
0,88
LOQ 3
1 90,76
90,98 0,31 0,34%
CV
2 91,20 0,97%
100% 1
1 106,45
106,46 0,02 0,02%
Promedio
2 106,47
113,45
100% 2
1 112,06
112,02 0,05 0,05%
Desviación
2 111,98
6,98
100% 3 1 121,95 121,87 0,11 0,09%
CV
40
2 121,79
6,15%
120% 1
1 92,09
92,16 0,09 0,10%
Promedio
2 92,22
99,71
120% 2
1 104,69
104,70 0,02 0,02%
Desviación
2 104,72
5,95
120% 3
1 102,19
102,28 0,12 0,12%
CV
2 102,37
5,97%
ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS
Promedio 101,30
Desviación 11,16
C.V.* 11,02%
Mínimo 89,48
Máximo 121,95
Tabla 18 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de acero
inoxidable
Mtra #lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 91,55
90,98 0,82 0,90%
Promedio
2 90,40
89,26
LOQ 2
1 88,35
88,34 0,01 0,01%
Desviación
2 88,33
1,38
LOQ 3
1 88,45
88,47 0,03 0,04%
CV
2 88,50 1,54%
100% 1
1 99,10
98,99 0,16 0,16%
Promedio
2 98,88
109,43
100% 2
1 112,39
112,36 0,04 0,03%
Desviación
2 112,34
8,35
100% 3 1 116,96 116,95 0,01 0,01%
CV
41
2 116,94
7,63%
120% 1
1 94,59
94,63 0,05 0,05%
Promedio
2 94,66
98,74
120% 2
1 101,60
101,60 0,00 0,00%
Desviación
2 101,61
3,26
120% 3
1 99,96
99,98 0,03 0,03%
CV
2 100,00
3,31%
ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS
Promedio 99,15
Desviación 10,10
C.V.* 10,19%
Mínimo 88,33
Máximo 116,96
Tabla 19 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
acrílico
Mtra #Lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 101,84
101,89 0,07 0,07%
Promedio
2 101,94
102,50
LOQ 2
1 102,19
102,23 0,05 0,05%
Desviación
2 102,27
0,75
LOQ 3
1 102,90
103,37 0,65 0,63%
CV
2 103,83 0,73%
100% 1
1 103,44
102,87 0,81 0,79%
Promedio
2 102,30
102,47
100% 2
1 102,16
102,15 0,00 0,00%
Desviación
2 102,15
0,49
100% 3 1 102,34 102,39 0,07 0,07%
CV
42
2 102,44
0,48%
120% 1
1 108,01
108,02 0,02 0,02%
Promedio
2 108,04
108,18
120% 2
1 108,18
108,22 0,05 0,05%
Desviación
2 108,25
0,13
120% 3
1 108,29
108,30 0,00 0,00%
CV
2 108,30
0,12%
ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS
Promedio 104,38
Desviación 2,88
C.V.* 2,76%
Mínimo 101,84
Máximo 108,30
Tabla 20 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de
plástico
Mtra #Lectura % Recuperación Promedio Desviación CV
LOQ 1
1 84,85
86,15 1,84 2,13%
Promedio
2 87,44
91,10
LOQ 2
1 93,38
93,40 0,03 0,03%
Desviación
2 93,42
3,93
LOQ 3
1 93,71
93,75 0,06 0,07%
CV
2 93,79 4,31%
100% 1
1 91,56
91,69 0,18 0,20%
Promedio
2 91,82
92,02
100% 2
1 92,02
92,07 0,08 0,09%
Desviación
2 92,13
0,30
43
100% 3
1 92,25
92,31 0,08 0,08%
CV
2 92,36
0,32%
120% 1
1 96,16
96,32 0,22 0,23%
Promedio
2 96,47
96,64
120% 2
1 96,59
96,67 0,12 0,12%
Desviación
2 96,76
0,29
120% 3
1 96,88
96,92 0,05 0,06%
CV
2 96,95
0,30%
ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS
Promedio 93,25
Desviación 3,35
C.V.* 3,60%
Mínimo 84,85
Máximo 96,95
Los porcentajes de recuperación promedios obtenidos fueron los siguientes:
Pintura epóxica: 99,8%; Vidrio: 95,6%; Aluminio: 101,3%; Acero inoxidable:
99,1%; Acrílico: 104,4%; Plástico: 93,3%. Cumpliendo así con el criterio de
aceptación de porcentaje de recuperación >=50%.
5.2.5 Precisión
Repetibilidad
Se evaluó la repetibilidad del método a partir de los datos obtenidos del ensayo de
exactitud a las concentraciones de LOQ, 100%, 120%, obteniéndose coeficientes
de variación entre muestras de 6,08%, 4,62%, 11,02%, 10,19%, 2,76%, 3,60% para
las superficies de Pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y
plástico grado farmacéutico respectivamente, cumpliendo así con el criterio de
aceptación de un coeficiente de variación ≤ 15%, valor aceptado para validaciones,
44
según Rojas, J., en su libro como validar sus metodologías analíticas, para
determinación de trazas.
Precisión intermedia
Se evaluó la precisión intermedia en dos días diferentes, con dos analistas
diferentes, verificándose a todas las concentraciones trabajadas en el parámetro de
exactitud, LOQ, 100% y 120%, obteniéndose coeficientes de variación entre las
muestras de los dos días de 1,87%, 3,15%, 2,41% para las superficie plástico, que
obtuvo menor porcentaje de recuperación en exactitud, cumpliéndose con el criterio
de aceptación de un coeficiente de variación ≤15%. Los resultados obtenidos para
promedios de porcentajes de recuperación, desviación estándar, y coeficiente de
variación para concentraciones de LOQ, 100% y 120% se detallan en la Tabla 21 a
la tabla 23 respectivamente.
Tabla 21 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de LOQ
Precisión intermedia
Muestra Día % Recuperación Promedio
LOQ REP1
1 91,08
87,52
2 83,96
LOQ REP2
1 96,25
90,08
2 83,91
LOQ REP3
1 97,41
90,67
2 83,92
Promedio 89,42
Desviación 1,67
CV 1,87%
45
Tabla 22 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 100%
Precisión intermedia
Muestra Día % Recuperación Promedio
100% REP1
1 99,34
102,72
2 106,10
100% REP2
1 98,07
102,14
2 106,22
100% REP3
1 87,61
96,97
2 106,3
Promedio 100,61
Desviación 3,17
CV 3,15%
Tabla 23 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de
120%
Precisión intermedia
Muestra Día % Recuperación Promedio
120% REP1
1 92,03
95,24
2 98,45
120% REP2
1 97,77
98,08
2 98,38
120% REP3
1 101,14
99,92
2 98,71
46
Promedio 97,75%
Desviación 2,36
CV 2,41%
5.2.6 Estabilidad de las muestras
Se determinó el porcentaje de recuperación considerando las variables de tiempo
de almacenamiento, protegidas y expuestas a luz. Se determinó para muestras
recién preparadas, frente a muestras almacenadas en tubos de ensayo durante 6,
12 y 24 horas, tanto expuestas a la luz como protegidas de la luz. Se realizó el
ensayo de estabilidad de las muestras con soluciones de materia prima de
pancreatina equivalentes al límite de aceptación de estándar de amilasa. Los
resultados obtenidos se encuentran en las tablas 24 hasta la 35.
Tabla 24 Estabilidad de muestra a t0
% Recuperación t0 muestras recién preparadas
Tipo Muestra #Lectura % De recuperación Promedio Desviación CV
M1
1 96,97
97,45 0,68 0,69
2 97,92
Tabla 25 Estabilidad de muestras a t6h expuestas a la luz
% Recuperación t6h muestras expuestas a la luz
Tipo Muestra #Lectura % De recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 85,60615
87,02 2,01 2,3%
2 88,44183
M2 REP2
1 85,60451
86,37 10,9 1,26%
2 87,14095
DESVIACION
0,46
CV 0,53%
47
Tabla 26 Estabilidad de muestras a t6h protegidas de la luz
% Recuperación t6h muestras protegidas de la luz
Tipo muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 88,82147
88,88 0,08 0,10%
2 88,94093
M2 REP2
1 89,18252
89,25 0,09 0,1
2 89,30999
Desviación 0,26
CV 0,29%
Tabla 27 Resultados de t6h vs t0 expuestas a la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 6h VS tiempo 0h/ expuesta a la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 6 h 86,70 92,07 7,60 8,26%
Tabla 28 Resultados de t6h vs t0
protegidas de la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 6h VS tiempo 0h / Protegida de la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 6 h 89,07 93,26 5,93 6,36%
48
Tabla 29 Estabilidad de muestras a t12h expuestas a la luz
% Recuperación t12h muestras expuestas a la luz
Tipo Muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 78,29
78,82 0,75 0,95%
2 79,35
M2 REP2
1 80,32
80,29 0,05 0,06%
2 80.25
Desviación 1,04
CV 1,30%
Tabla 30 Estabilidad de muestras a t12h protegidas de la luz
% Recuperación t12h muestras protegidas de la luz
Tipo Muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 83,45
83,51 0,08 0,09%
2 83,56
M2 REP2
1 85,37
85,39 0,02 0,02%
2 85,40
DESVIACIÓN 1,33
CV 1,57%
49
Tabla 31 Resultados de t12h vs t0 protegido de la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 12h VS tiempo 0h/ expuesta a la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 12 h 79,55 88,50 12,66 14,30%
Tabla 32 Resultados de tiempo 12h
vs t0 protegido de la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 12h VS tiempo 0h / Protegida de la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 12 h 84,45 90,95 9,20 10,11
Tabla 33 Estabilidad de muestras t24h expuestas a la luz
% Recuperación t24h muestras expuestas a la luz
Tipo Muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 231,11
230,97 0,21 0,09%
2 230,82
M2 REP2
1 234,34
234,24 0,15 0,06%
2 234,13
DESVIACION 1,89
CV 0,81%
50
Tabla 34 Estabilidad de muestras t24h protegidas de la luz
% Recuperación t24h muestras protegidas de la luz
Tipo Muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV
M2 REP1
1 234,87
235,44 0,82 0,35%
2 236,02
M2 REP2
1 230,66
230,99 0,47 2 231,33
DESVIACION 2,63
CV 1,13
Tabla 35 Resultados de t24h vs t0 protegido de la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 24h VS tiempo 0h/ expuesta a la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 24 h 233,22 165,33 96,01 58,07
Tabla 36 Resultados de t24h vs t0 protegido de la luz
Estabilidad de la muestras a tiempo 24h VS tiempo 0h / Protegida de la luz
t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV
t= 24 h 232,60 165,02 95,57 57,91
Con los resultados obtenidos en el ensayo de estabilidad de las muestras se logró
demostrar que las muestras son estables hasta un tiempo máximo de 12h
almacenadas tanto expuestas como protegidas de la luz, obteniéndose coeficientes
de variación menores a 15%.
51
6. Conclusiones
Se determinó el límite de aceptación de limpieza máximo aceptable de amilasa que
puede estar presente en las áreas involucradas en la manufactura el producto leprit
enzimático después de realizar los procedimientos de limpieza, el cual fue de 35,7
UUSP/mL.
Para en análisis de trazas de pancreatina se establecieron puntos críticos tales
como pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado
farmacéutico.
Se validó la metodología analítica por espectrofotometría UV teniendo un
coeficiente de correlación de linealidad de 0,9995, coeficientes de variación en la
precisión de 1,87%, 3,15%, 2,41% para concentraciones de LOQ, 100% y 120%
del LAL y se obtuvo un porcentaje de recuperación mínimo de 93,3% para la
superficie de plástico, la cual fue catalogada como critica, cumpliendo así con las
especificaciones y los criterios de aceptación establecidos.
La validación de la metodología analítica para determinar trazas de pancreatina
posterior al proceso de limpieza de equipos en PhQ S.A., cumple con los criterios
de aceptación establecidos para la validación (Limite de detección, Limite de
cuantificación, Linealidad, Exactitud, Precisión y estabilidad de la muestra).
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