UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
TEMA:
ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y QUÍMICO COMPARATIVO DE LAS
SEMILLAS DE MIMUSOPS sp EN DOS ESTADOS DE MADURACIÓN.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
AUTORES:
Dario Rafael Panchana Tigrero
Anmar Madelein Velásquez Chalco
TUTOR:
QF. KATHERINE ELIZABETH BUSTAMANTE PESANTES. MSc
GUAYAQUIL-ECUADOR
2018
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, queremos agradecer a Dios, por permitirnos llegar a este
momento especial de nuestras vidas, sus fortalezas y bendiciones son uno de
los cimientos fundamentales de este trabajo. También infinitas gracias a nuestros
padres y familias, por todo el apoyo incondicional a lo largo de estos años de
estudio, sus palabras de aliento, sus cariños en la cercanía y a la distancia, sus
increíbles consejos que hacen posible lo imposible y nos dan ese empuje para
llegar a nuestras metas.
Agradecer sin duda a nuestros grandes compañeros, amigos y ahora colegas,
personas que empezaron como extraños y en la actualidad nada sería lo mismo
sin ellos, mil gracias.
A nuestra tutora Q.F. Katherine Bustamante, con mención especial para la Dra.
Migdalia Miranda, profesionales en su labor, compartiendo sus conocimientos,
creciendo junto a nosotros en la realización de esta investigación; sus
enseñanzas, esfuerzos y dedicación complementan de manera idónea lo que es
para nosotros un logro a nivel profesional y personal.
I
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado con mucho afecto y cariño para nuestros padres,
personas que, en su humildad y gran corazón, formaron con amor, cansancio,
dedicación y esmero a los profesionales que somos hoy en día, esto no sería
posible sin ellos.
Dedicamos también este logro a la Dra. Migdalia Miranda, por prestar su tiempo
y esfuerzo en la culminación de esta tesis, que a pesar de que tuvo muchos
altibajos durante la experimentación, siempre supo cómo resolverlos y sacar
adelante la investigación junto a nosotros mientras aprendíamos de nuestros
errores.
II
RESUMEN
Originalmente de Asia, el género Misumops ha sido empleado de forma
tradicional a través de los años. Diferentes especies introducidas a América
demostraron poseer agentes químicos de interés, siendo la variante en estudio
denominada como Mimusops sp, según la clasificación genética y taxonómica.
Mediante el trabajo de investigación se sometió a las semillas en los estados de
maduración verde y madura, a un estudio farmacognóstico y químico. Se informa
de las diferencias entre sus dimensiones, también se reporta sobre algunas
propiedades fisicoquímicas las cuales entran dentro del rango de la farmacopea
para drogas vegetales, la presencia de compuestos grasos, triterpenos-
esteroides, azúcares reductores, taninos y saponinas como sus compuestos más
destacados. Las diferencias más relevantes se encuentran en el extracto
alcohólico, donde las estructuras encontradas no presentan coincidencia entre
semillas verdes y maduras, no pudiéndose elucidar los esqueletos de saponinas.
Palabras claves: Agentes químicos, semillas, Mimusops, saponósidos
triterpénicos, parámetros, screening, fitoquímica
III
ABSTRACT
Originally from Asia, the Misumops genre has been used traditionally
over the years. Different species introduced to America showed that they are
chemical agents of interest, being the variant in the study as Misumops sp,
according to the genetic and taxonomic classification. Through the research work,
a pharmacognostic and chemical study was submitted to the seeds in the stages
of green and mature maturation. It is reported the differences between its
dimensions, it is also reported on some physicochemical properties, which fall
within the range of the pharmacopoeia for plant drugs, the presence of fatty
compounds, triterpenes-steroids, reducing sugars, tannins and saponins as their
compounds more featured. The most relevant differences are found in the
alcoholic extract, where the found structures do not coincide between green and
mature seeds, and the skeletons of saponins can not be elucidated.
Keywords: Chemical agents, seeds, Mimusops, triterpene saponosides,
parameters, screening, phytochemistry
IV
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
CAPÍTULO I: PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................... 3
I.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................... 3
I.2 PROBLEMA ......................................................................................................... 3
I.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ...................................................................... 4
I.4 OBJETIVOS GENERALES ................................................................................... 5
I.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 5
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ................................................................................. 6
II.1 ANTECEDENTES ............................................................................................... 6
II.2 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS ................................................................. 11
II.2.1 Saponinas. Generalidades .......................................................................... 11
II.2.2 Características químicas ............................................................................. 12
II.2.3 Saponinas triterpénicas: Principales núcleos estructurales, Métodos de
extracción y caracterización. Reacciones de identificación y biosíntesis .............. 15
II.2.3. Saponinas esteroidales: Principales núcleos estructurales, Métodos de
extracción y caracterización. Reacciones de identificación .................................. 18
II.2.4. Extracción y purificación de las saponinas esteroidales ............................. 19
II.3 GLOSARIO DE TÉRMINOS .............................................................................. 22
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS................................................................ 24
Ill.1 Método de la investigación ................................................................................ 24
Ill.1.1 Variables .................................................................................................... 24
llI.1.2 Criterios de inclusión y exclusión ................................................................ 24
llI.1.3 Operacionalización de las variables ............................................................ 24
llI.2 Recolección ...................................................................................................... 25
llI.3 Secado ............................................................................................................. 25
llI.4 Evaluación macro morfológica .......................................................................... 26
llI.5 Propiedades físicoquímicas: Humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en
HCl, Sustancias solubles. ........................................................................................ 26
llI.5.1 Humedad residual ...................................................................................... 26
llI.5.2 Cenizas totales ........................................................................................... 27
llI.5.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ...................................................... 27
V
llI.5.4 Sustancias solubles .................................................................................... 28
llI.6 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico ...................................................... 29
llI.7 Macerado y concentrado de la muestra vegetal ................................................ 30
III.8 Determinación de Rendimiento Porcentual ....................................................... 31
III.9 Reacción de silanización .................................................................................. 32
III.10 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM .............................. 32
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 33
lV.1 Evaluación macro morfológica .......................................................................... 33
lV.2 Parámetros físicoquímicos: .............................................................................. 35
IV.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico ........................ 37
IV.4 Extracción y análisis de los extractos alcohólicos de las semillas ..................... 40
IV.4.1 Extracción .................................................................................................. 40
IV.2 Análisis de los extractos alcohólicos ............................................................. 41
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................... 48
V.1 CONCLUSIONES ............................................................................................. 48
V.2 RECOMENDACIONES ..................................................................................... 49
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 50
VI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Operacionalización de las variables ................................................... 24
Tabla II. Cálculos estadísticos del largo y ancho de las semillas ..................... 34
Tabla III. Parámetros físicoquímicos de las semillas de Mimusops sp ............. 35
Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp ...................... 37
Tabla V. Rendimiento porcentual de compuestos solubles en etanol de las
semillas de Mimusops sp ................................................................................. 40
Tabla VI. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de
los frutos verdes de Mimusops sp .................................................................... 43
Tabla VII. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de
los frutos maduros de Mimusops sp ................................................................. 45
VII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Saponinas encontradas en tres especies de Mimusops .................. 10
Figura 2: Estructura química de las saponinas ............................................... 12
Figura 3: Sintesis del 2,3-oxidoescualeno. Esquema de síntesis del precursor
de las agliconas triterpenicas y esteroidales, el 2,3-oxidoescualeno, IPP:
isopentanil pirofosfato, DMPP: dimetilalil pirofosfato, GPP: geranil pirofosfato,
FPP: farnesil pirofosfato ................................................................................... 15
Figura 4: Estructura química de los 3 grupos de saponinas triterpénicas. ...... 16
Figura 5: Núcleos esteroidales con actividad farmacológica .......................... 19
Figura 6: Esquema de extracción del material vegetal para el tamizaje
fitoquímico ........................................................................................................ 29
Figura 7: Ensayos a realizar en cada extracto................................................ 30
Figura 8: Estudio macro morfológico de semillas y endospermo: A) semilla
madura con cascara; B) endospermo semilla madura; C) semilla verde con
cascara; D) endospermo de semilla verde ....................................................... 33
Figura 9: Cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos alcohólicos de
las semillas de Mimusops sp en dos estados de maduración .......................... 42
Figura 10: Algunas estructuras identificadas en el extracto alcohólico de las
semillas de los frutos verdes ............................................................................ 44
Figura 11: Algunas estructuras identificadas en el extracto alcohólico de las
semillas de los frutos maduros ......................................................................... 47
VIII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Extracción, secado y pesado de la muestra ..................................... 59
Anexo 2: Preparación de extractos para tamizaje Fitoquímico ........................ 60
Anexo 3: Resultados varios en el screening fitoquímico .................................. 61
Anexo 4: Pruebas Físico Químicas ................................................................. 62
Anexo 5: Reporte de plagio de URKUND ........................................................ 63
IX
1
INTRODUCCIÓN
El reino vegetal ha dotado a la humanidad de innumerables beneficios
gracias a las designadas “plantas medicinales”, las cuales poseen propiedades
farmacológicas procedentes de sus constituyentes divididos en dos grandes
grupos, metabolitos primarios y secundarios, estos últimos realizan varias
actividades biológicas, como antioxidantes, anti-inflamatoria, anticancerígena,
antitumoral, antidiabética y muchas más. En conjunto, las plantas sintetizan una
gran variedad de metabolitos secundarios, ya sea como parte del crecimiento y
desarrollo normal de sí misma, o en respuesta al ataque de patógenos o al
estrés. (Vélez-Terranova, 2014; Haralampidis y col., 2002; Singh y col., 2017)
Las saponinas son un grupo importante de metabolitos secundarios de las
plantas y se encuentran diseminadas por todo el reino vegetal. El nombre de
saponina se deriva de “sapo”, la palabra latina para jabón, ya que estas
moléculas tienen propiedades surfactantes y dan espumas estables como jabón
en solución acuosa. (Haralampidis y col., 2002)
Casos como asma, catarros, bronquitis, exceso de mucosidad densa,
enfisema pulmonar, entre otros, pueden ser tratadas mediante saponinas, las
cuales ejercen su acción irritativa a nivel de las mucosas gástricas, lo que permite
un aumento en la secreción de todas las glándulas, que a su vez, favorece a los
bronquios y por consiguiente lleva al tratamiento de las anomalías antes
mencionadas. (López, 2001)
2
Se resaltan además sus efectos diuréticos, estudios demuestran que
plantas con saponinas suelen ser utilizadas con frecuencia para depuraciones
sanguíneas, dolencias reumáticas e impurezas cutáneas, estimulando la
producción de orina y en resultado, la eliminación de material tóxico de manera
más fácil. (López, 2001)
Estos metabolitos secundarios intervienen también en la resorción de
otros principios activos de origen vegetal, siendo un factor decisivo en plantas
medicinales, ya que pueden esperarse grandes resultados a partir de pequeñas
cantidades de las mismas. Estudios señalan que la familia Sapotaceae posee
esta clase de compuestos, recientemente encontrados en el género Manilkara y
el género Mimusops. (Valdés y col, 2015)
3
CAPÍTULO I: PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN
I.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El área científica – investigativa ha logrado un gran desarrollo a partir de
los estudios farmacognósticos, donde se han diferenciado y clasificados
diferentes especies vegetales con componentes químicos de importantes
actividades farmacológicas.
El Ecuador es un país con una gran cantidad de recursos naturales debido
a su gran biodiversidad. De igual forma, muchos pobladores dependen de las
plantas medicinales como único recurso para tratar sus enfermedades. Sin
embargo, los estudios sobre la flora medicinal del Ecuador que sustenten su uso
tradicional son escasos, así como los estudios de separación y caracterización
de sus metabolitos secundarios.
Este trabajo pretende abordar el estudio de los componentes saponósidos
de clase triterpénica en Mimusops sp. que crece en el Ecuador.
Por ello se plantea el siguiente problema de investigación:
I.2 PROBLEMA
¿Presentarán las semillas de la especie Mimusops sp. en sus diferentes
estados de maduración compuestos saponósidos triterpénicos?
4
I.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA
Los compuestos saponósidos son un grupo de metabolitos importantes
en el reino vegetal que tiene un origen biosintético común: vía ácido mevalónico
y unidades isoprenoides. Su principal propiedad física es que en solución acuosa
son agentes tensioactivos, es decir, son capaces de formar espuma (poder
afrógeno), formar emulsiones y son difíciles de cristalizar.
Dentro de su distribución taxonómica, investigaciones resaltan que la
mayor parte de estos compuestos son de tipo “triterpénico”, derivado de una
unión de seis unidades de isopreno, capaz de ejercer diferentes beneficios para
los mamíferos, entre ellos citamos: su acción expectorante, antitusiva,
antiinflamatoria, antiulcerosa y antiespasmódica.
Además, gracias a su marcado poder como tensoactivo, las saponinas
triterpénicas son ampliamente usadas en la industria cosmética, haciéndolos una
pieza clave de la industrialización en la actualidad.
El género Mimusops ha sido investigado desde hace algunos años,
encontrándose cierta evidencia de que en sus frutos y semillas se concentran un
importante número de estos compuestos saponósidos, más específicamente
triterpenos.
De ello radica el interés científico de este trabajo, el cual consiste en
demostrar la presencia de estos importantes compuestos, poder identificarlos y
5
conocer si su presencia y concentración depende o no del estado de
maduración en que se encuentren las semillas de esta especie.
I.4 OBJETIVOS GENERALES
Realizar el estudio Farmacognóstico y Químico de la semilla de
Mimusops sp., en dos estados de maduración.
I.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Evaluar los parámetros físicos-químicos de las semillas de Mimusops
sp. en dos estados de maduración.
Realizar el tamizaje fitoquímico comparativo de la semilla de Mimusops
sp. en dos estados de maduración.
Identificar las fracciones alcohólicas de las semillas estudiadas.
6
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO
II.1 ANTECEDENTES:
Las especies pertenecientes al género Mimusops se distribuyen
ampliamente en India y se informa que se utilizan en la medicina tradicional. En
un esfuerzo por comprender las diversas actividades biológicas que muestran
estas plantas, se iniciaron varias investigaciones fitoquímicas, que condujeron
principalmente al aislamiento de las saponinas triterpenoides. (Eskander y col.
2006)
Mimusops laurifolia (Forssk.) Friis, también conocido como Binectaria
laurifolia Forssk. y M. schimperi A. Rich. (Friis, 1981), es una de estas especies,
cultivada en Egipto, Uganda y Sudán. Es un árbol de hoja perenne, con
pequeños frutos que contienen de una a tres semillas duras y brillantes, y que
se utilizó durante mucho tiempo en el antiguo Egipto, ya que las semillas y
ramitas frondosas, utilizadas como ramos de flores para el funeral, se
encontraron en las tumbas faraónicas. (Ohara y col., 2001)
Más recientemente, esta planta recuperó popularidad ya que el extracto
fue patentado para efectos de acondicionamiento y humectación de la piel, como
parte de los preparados utilizados en cosméticos, formulaciones de baño y
detergentes (Ohara y col., 2001).
7
Se aislaron nueve saponinas de las semillas de Mimusops laurifolia. Sus
estructuras se establecieron utilizando espectroscopía de RMN de una y dos
dimensiones y espectrometría de masas. Tres de ellas resultaron ser nuevas
saponinas bidesmosídicas que poseen ácido 16a-hidroxiprotobásico como
aglicona y se identifican como: 3-O-(b-D-apiofuranosil-(1→3)-b-D-
glucuronopiranosil)-28-O-(a-L-rhamnopiranosil-(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-
a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico,
3-O-(b-D-glucopiranosil-(1→3)-b-D-glucopiranosil)-28-O-(a-L-rhamnopiranosil-
(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-
arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico y 3-O-(b-D-glucopiranosil-
(1→6)-b-D-glucopiranosil-(1→6)- b-D-glucopiranosil)-28-O-(a-L-
rhamnopiranosil-(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-
arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico, junto con seis saponinas
conocidas: butirosida C, arganinas A, C y D, Mi-saponina A y saponina 5 de M.
hexandra más tarde nombrada tieghemelin A, del extracto de la semilla.
(Eskander y col. 2006).
Para su extracción y aislamiento el polvo de semilla desgrasado de M.
laurifolia se extrajo con MeOH, y luego el extracto de MeOH se precipitó con
acetona. Después de la diálisis frente al agua, la mezcla de saponina en bruto
se purificó usando una combinación de columna C-18 de fase inversa y
cromatografía en columna de gel de sílice. Los pasos finales de la purificación
fueron TLC preparativa o semiprep. HPLC sobre fase inversa C-18 y proporcionó
nueve saponinas mencionadas anteriormente. (Eskander y col. 2006)
8
Otra referencia sobre este género recae en Mimusops elengi Linn.
(Familia - Sapotaceae) es un árbol de hoja perenne. Es conocido como Bakulah
en Sanskrit y Bakul en Marathi. La planta es un árbol enorme, que crece de 12 a
15 metros de altura, con corteza de color gris oscuro. Las flores fragantes
florecen de enero a marzo. Comienza a producir frutos de enero a mayo. La fruta
es una baya, amarilla, ovoide de 2.5 cm de largo. Encierra una (raramente dos)
semillas. (Gopalkrishnan y Shimpi, 2010)
La planta goza de una considerable reputación en la medicina india como
astringente, tónico y en el tratamiento de la diarrea. A largo de los años se han
realizado diferentes investigaciones y en una de ellas se informó el aislamiento
y la elucidación de la estructura de cuatro nuevas saponinas triterpenoides,
mimusopsides A y 13, mirnusopin y mimusopsin, de las semillas de la planta
(Sahu y col, 1995)
Otra fracción de saponina de esta planta condujo al aislamiento y la
elucidación estructural de una nueva saponina menor, mimusin, junto con dos
conocidos, Mi-saponina A y 16g-hidroxi Mi- saponina A de las semillas
desgrasadas de la planta. (Sahu y col. 1997)
La técnica de extracción y aislamiento de saponinas en los ensayos fue
de la siguiente manera, las semillas en polvo secadas al aire de M.elengi (2 kg)
se extrajeron sucesivamente con éter de petróleo (60-80ºC), CHCl3 y MeOH en
condiciones de reflujo. El extracto de MeOH se repartió entre n-BuOH y H2O.
9
La capa orgánica se concentró a sequedad a presión reducida para dar un
residuo (30 g) que se cromatografió sobre gel de sílice (500 g). (Sahu y col. 1997)
De los granos de semilla desgrasada de tres especies de Mimusops se
aislaron diferentes tipos de saponinas, en el extracto de M. elengi contenía los
compuestos conocidos Mi-saponina A (I), arganina C (2), butirósido C (3) y una
nueva saponina 4, de M. hexandra, las saponinas 1 y 3 se aislaron con los dos
nuevos compuestos 5 y 6 y por último el extracto de M. manilkara contenía Mi-
saponina A (I) y saponina 6. (Lavaud y col, 1996)
Las saponinas 1, 3, 4 y 5 (véase figura 1) son bisdesmosidas del ácido
protobasárico mientras que las saponinas 2 y 6 contienen ácido 16a-
hidroxiprotobasico como aglicona. Para este estudio la extracción y el
aislamiento de las saponinas se realizó de siguiente manera; las semillas se
separaron y decorticaron para obtener los granos (2 kg cada uno). El polvo de
núcleo desgrasado de cada especie se extrajo repetidamente con EtOH. El
extracto concentrado se purificó por adición de un gran exceso de Me2CO.
(Lavaud y col, 1996)
11
Los extractos brutos se disolvieron en H2O y luego se purificaron por
diálisis frente a agua pura (20 ml por 1 g de extracto). Después de 96 horas, el
contenido del tubo se congeló y se liofilizó. Para M. elengi y M. hexandra, 4 g de
cada extracto bruto dieron 1,4 g y 1,2 g de mezcla de saponina dializada
respectivamente; para M. manilkara, 10 g de extracto se sometieron a diálisis
para dar 935 mg de saponinas. El extracto de etanol se purificó usando una
combinación de cromatografía en columna de gel de sílice, TLC preparativa o
columna C18 en fase reversa. (Lavaud y col, 1996)
II.2 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS
II.2.1 Saponinas. Generalidades
También llamados saponósidos, son estructuras constituidas por un
esqueleto esteroidal o triterpénico, a los cuales se los denomina como “aglicona”
o “sapogenina”, reemplazados por oligosacáridos mediante uniones
glucosídicas que les otorgan una naturaleza anfipática, a los cuales le deben sus
propiedades tensoactivas y hemolíticas (Figura 2). (Heng y col.,2006)
Son heterósidos muy extendidos en el reino vegetal. Caracterizados
principalmente por una espuma persistente, resultante del contacto de estos
metabolitos con el agua y que a su vez resulta ser una propiedad muy útil que
ha sido empleada a lo largo del mundo. Pueden también aumentar la
12
permeabilidad de las paredes celulares y de destruir los hematíes por
hemólisis, capacidades que aumentan su valor farmacológico. (Lopez, 2001)
Figura 2: Estructura química de las saponinas
Obtenidas de (Flores, 2013)
Sus efectos como antiinflamatorio, anti agregante plaquetario, hipo
colesterolémico, broncolítico, lieshmanicida, anti-protozoos, anti trichomonas e
insecticida, así como su actividad citotóxica frente a varias neoplasias, son solo
otros ejemplos del amplio margen de usos para las saponinas. (Mena, 2015)
II.2.2 Características químicas
De acuerdo con su composición química, podemos clasificar a las
saponinas en dos grandes familias, las de base gonano (o tipo esteroidal) y los
derivados del escualeno (o tipo triterpenoide). Ambas al someterse a hidrolisis
13
rinden de 2 a 6 residuos de monosacáridos, y una aglicona, que es una porción
carbonada policíclica a la que se denomina genéricamente como sapogenina.
(Hernandez, 2005)
Estos metabolitos poseen una solubilidad facilitada, que se relaciona a
varias características como (Cuéllar,1983; Rodríguez, 1986):
- Residuos de monosacáridos
- Alto peso molecular
- Otros grupos polares en la sapogenina
Tanto en saponinas triterpénicas como esteroidales, el enlace glucosídico
esta dictaminado por el (-OH) en el C-3 del anillo A de la sapogenina. Las de
clase triterpénicas se encuentran primordialmente en dicotiledóneas
(sapotaceae), mientras que las de clase esteroidal en monocotiledóneas
(dioscoráceas, liliáceas y amarilidáceas). (Hernandez, 1997)
De acuerdo con el número de sustituciones, se pueden encontrar
agliconas (Kuljanabhagavad y Wink, 2009; Güçlü-Üstündağ y Mazza, 2007):
- Monoglicosiladas o monodesmosídicas
- Diglicosiladas o bidesmosídicas
- Triglicosiladas o tridesmosídicas
Si solo poseen un oligosacárido unido al C-3 serán monodesmosídicas,
14
si tienen dos cadenas de carbohidratos (uno de ellos unido por enlace éter al C-
3, y otro unido por enlace éster al C-28 si de saponinas triterpénicas se tratase)
serán bidesmosídica, y si cuentan con tres cadenas de azúcares serán
tridesmosídica (Kuljanabhagavad y Wink, 2009; Güçlü-Üstündağ y Mazza,
2007).
Principalmente se encontrarán pentosas, hexosas o ácidos urónicos como
oligosacáridos unidos a la aglicona. Una característica muy útil y empleada en
metodologías para la elucidación y cuantificación de estos compuestos, es que
no toleran alteraciones bruscas de pH, la separación de las uniones O-
glucosídicas podrían generarse a partir de cantidades muy básicas o ácidas,
separando la sapogenina del oligosacárido (Diab y col.,2012).
Al referirse a su estabilidad térmica, los compuestos saponósidos logran
resistir temperaturas superiores a 150°C e inferiores a 400°C, superado este
último, la molécula es degradada a átomos de carbono por un proceso de
carbonificación, lo que posibilita el uso de procesos de extracción
convencionales favorecidos por calor. Además, gracias a la unión estructural de
un grupo apolar (esteroide o triterpeno) y un grupo polar (azúcar), las saponinas
otorgan una elevada actividad superficial. Agentes estabilizantes,
emulsificadores en productos cosméticos e higiene, y detergentes naturales han
sido creados a partir de este atributo (Yang y col., 2010).
15
II.2.3 Saponinas triterpénicas: Principales núcleos estructurales, Métodos
de extracción y caracterización. Reacciones de identificación y biosíntesis
Las saponinas triterpénicas presentan una estructura policíclica,
normalmente tetra o pentacíclica, la biosíntesis discurre por la vía isoprenoide,
en la que tres unidades isoprenoides (moléculas de 5C) se unen cabeza-cola
(1´-5) resultando un compuesto de 15C, el farnesildifosfato (FPP). La unión de
moléculas de FPP da lugar al escualeno (compuesto lineal de 30C), catalizada
por la enzima escualenosintasa; la molécula de escualeno es oxidada para dar
el 2,3-oxidoescualeno, a partir del cual se inicia la biosíntesis de las saponinas
triterpénicas (figura 3) (Jaramillo, 2014).
Figura 3: Sintesis del 2,3-oxidoescualeno. Esquema de síntesis del precursor
de las agliconas triterpenicas y esteroidales, el 2,3-oxidoescualeno, IPP:
isopentanil pirofosfato, DMPP: dimetilalil pirofosfato, GPP: geranil pirofosfato,
FPP: farnesil pirofosfato.
Obtenido de (Mastrogiovanni, 2012)
16
Las saponinas triterpenoides se encuentran principalmente en las
dicotiledóneas. Aproximadamente 60 familias de este taxón producen este tipo
de saponina, incluyendo Apiaceae, Araliaceae, Caryophyllaceae,
Chenopodiaceae, Fabaceae, Hippocastanceae, Primulaceae, Ranunculaceae,
Sapotaceae y Theaceae. (Evans, 2009)
Las saponinas triterpenoides se pueden clasificar en tres grupos
representados por: (figura 4) (Lopez, 2001).
Figura 4: Estructura química de los 3 grupos de saponinas triterpénicas.
Obtenidas de (Evans, 2009)
Los ácidos triterpenoides relacionados se forman a partir de estos
mediante el reemplazo de un grupo metilo por un grupo carboxilo en las
posiciones 4, 17 o 20. Los materiales vegetales a menudo contienen estas
saponinas en cantidades considerables. (Valencia, 2005)
La extracción de estos compuestos a partir de diferentes materiales
biológicos ha sido evidenciada bajo múltiples procesos, pero, dado su carácter
17
polar, muchas metodologías concuerdan en que los saponósidos triterpénicos
pueden ser extraídos en condiciones de caliente o frio, usando generalmente
solventes como agua o alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol o
butanol). (Hernández y col., 2005).
Pruebas cuali-cuantitativas para saponinas
El ensayo de formación de espuma, así como la técnica de hemólisis de
eritrocitos constituyen métodos sencillos y rápidos para detectar la presencia de
saponinas en un extracto (Miranda y Cuellar, 2001). La técnica de hemólisis es
además, un método espectrofotométrico convencional que permite no sólo
cuantificar las saponinas sino también determinar su actividad hemolítica.
(Cheok y col., 2014; Habicht y col., 2011)
También se puede partir de un extracto alcohólico de la muestra vegetal
para realizar la prueba de Liebermann-Burchard, la cual consiste en tomar una
porción del extracto y añadir 4 mL de anhídrido acético, 4 mL de cloroformo y
enfriar de 0-2ºC. Luego adicionar 4 gotas de ácido sulfúrico. La aparición de una
coloración azulada que pasa a anaranjado para luego volverse verde, indica que
la reacción es positiva. (Valencia y col, 2005).
18
II.2.3. Saponinas esteroidales: Principales núcleos estructurales, Métodos
de extracción y caracterización. Reacciones de identificación
Distribuidas mayormente en plantas monocotiledóneas (Liliaceae,
Agavaceae, Dioscoreaceae y Amaryllidaceae) y en menor proporción en otras
especies (Dicotiledóneas: Solanaceae y Scrofulariaceae), las saponinas
esteroidales son estructuras complejas conformadas por, una parte hidrófila las
cuales están constituidas por unidades de monosacáridos, y un núcleo esteroidal
hidrófobo. (Dueñas, 2016)
La industria de hormonas esteroidales utiliza aquellas saponinas que
tienen en su estructura a la diosgenina y la hecogenina como aglicona para su
producción, a su vez, existen otros importantes núcleos esteroidales con
actividad farmacológica (figura 5). (Luengo, 2001).
Las saponinas esteroidales son de gran importancia farmacéutica
debido a su relación con compuestos tales como las hormonas sexuales, la
cortisona, esteroides diuréticos, vitamina D y los glucósidos cardíacos. Algunos
son usados como materiales de partida para la síntesis de estos compuestos
(Luengo, 2001).
19
Figura 5: Núcleos esteroidales con actividad farmacológica
Obtenido de (Evans, 2009)
II.2.4. Extracción y purificación de las saponinas esteroidales
En los métodos de extracción de las saponinas esteroidales, usualmente
se obtiene un extracto en polvo seco, que posteriormente es diluido en metanol,
etanol o en una solución con 50% de etanol o metanol a temperatura ambiente.
Existen técnicas convencionales de extracción como la maceración, Soxhlet,
extracción por reflujo, y técnicas no convencionales, amigables con el ambiente,
como la extracción por ultrasonido, microondas y extracción
20
acelerada de solventes (ACE). Usualmente el extracto es concentrado, y
fraccionado con acetato de etilo y n-butanol. Para su separación y purificación
se utilizan comúnmente la cromatografía en capa fina (TLC) con gel de sílice
usando como fase móvil cloroformo y metanol o cloroformo, metanol y agua.
(Meagher y col. 2001; Skhirtladze y col. 2006; Temraz y col. 2006; Theunis y col.
2007; Kim y col. 2008; Cheok y col. 2014).
Para la elucidación de la estructura de la saponina, por métodos
convencionales, se inicia con una hidrólisis ácida separando la parte glucídica
de la saponina. La estructura de los azúcares es identificada, por ejemplo, por
cromatografía de líquidos (HPLC), y la aglicona es identificada ya sea por IR o
por TLC (Oleszek y Bialy 2006).
Debido a que las saponinas esteroidales saturadas no presentan
absorción en la UV, es muy complicado la elucidación de su estructura por
métodos convencionales. Sin embargo, existen otros métodos más robustos en
donde se puede conocer de forma más puntual la estructura de la saponina como
es el caso de la resonancia magnética nuclear (RMN) o la espectrometría de
masas (MS) (Oleszek 2002).
Al utilizar la espectrometría de masas para el análisis de las saponinas,
se pueden usar diferentes fuentes de ionización suave, como lo son (Kind y
Fiehn 2010):
21
Electroespray (ESI), que es usada para moléculas
ionizables disueltas en un solvente polar volátil bombardeadas a través
de un capilar de acero mediante nitrógeno formando un aerosol de
pequeñas gotas con moléculas cargadas promovidas por un campo
eléctrico.
Bombardeo rápido de haz atómico (FAB), donde la muestra
es disuelta en una matriz líquida (por ejemplo, glicerol) no volátil que es
bombardeada por un rayo atómico de un gas inerte (Ar, Xe).
Desorción laser asistida por una matriz (MALDI), la muestra
es mezclada con una matriz de moléculas altamente ionizable (por
ejemplo, 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)). La matriz ayuda a ionizar la
muestra una vez que el haz del láser incide sobre la mezcla de matriz-
muestra, y exista a los iones por el impacto tanto de la muestra como los
de la matriz.
Una vez que la muestra es ionizada a través de ESI, FAB o MALDI, la
muestra ionizada es conducida a través de cuadrupolos o túneles de tipo de
vuelo para detectar la relación de masa carga (m/z) del compuesto, por lo que al
realizar el análisis por espectrometría de masas no solo se tiene conocimiento
sobre el peso de la molécula, sino que también da una idea de cómo están
enlazadas las moléculas de acuerdo a su ionización (Sahu y col. 2008; Zhu y col.
2010; Kang y col. 2012). Varias investigaciones en saponinas contenidas en
plantas se han identificado por HPLC-MS (Li y col. 2006).
22
Sin embargo, para su identificación molecular se requiere que sean
estructuras aisladas y que se conozca el peso esperado aproximado, así como
también se recomienda realizar otros análisis complementarios para confirmar
su estructura, como lo es el IR o RMN (Li y col. 2006).
Finalmente es importante mencionar, que los efectos de la temperatura
afectan fuertemente la extracción de las saponinas y por ende su eficiencia en
la purificación y en la caracterización debido a que las saponinas podrían ser
hidrolizadas a una polaridad más baja a temperaturas por arriba de los 60 °C.
Este cambio en la polaridad afectaría las actividades biológicas que pudieran
tener las saponinas, como por ejemplo su actividad anti-microbiana (Zhang y col.
2013).
II.3 GLOSARIO DE TÉRMINOS
Aglicona: aglucona o genina en química orgánica es el agrupamiento no
glucídico de un heterósido. Es el compuesto sin azúcares que queda tras
reemplazar por un átomo de hidrógeno el grupo glicosilo de un glucósido.
Sapogenina: Cualquier tipo de compuesto orgánico que se da en muchas
especies de plantas como derivados de los grupos esteroideos y triterpenoides
en forma de glucósidos, las saponinas.
Glucósido: Los glucósidos son moléculas compuestas por un glúcido
(generalmente monosacáridos) y un compuesto no glucídico. Los glucósidos
desempeñan numerosos papeles importantes en los organismos vivos.
23
Heterósido: Son compuestos formados por la asociación de un glúcido
y un cuerpo activo no azucarado llamado Genina o Aglucon.
24
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS
Ill.1 Método de la investigación
El modelo empleado en el trabajo de titulación es el diseño
experimental, análisis-síntesis, y discusión de resultados
Ill.1.1 Variables
Variable independiente: Estado de madurez de los frutos
Variable dependiente: compuestos saponósidos
Variable interviniente: época del año
llI.1.2 Criterios de inclusión y exclusión
Criterio de inclusión: todos los frutos verdes y maduros
Criterio de exclusión: frutos en estado de putrefacción
llI.1.3 Operacionalización de las variables
Tabla I. Operacionalización de las variables
Variables Indicadores Tipo
Dependiente:
Compuestos
saponósidos:
esteroidales y/o
Análisis por
Cromatografía
gaseosa-
Espectometría de
Cuantitativo
25
triterpénicos masas
Independiente:
Estado de
madurez
Fruto verde y
maduro
Cualitativo
Interviniente:
Época del año
Estado fenológico Cualitativo
Elaborado por autores
llI.2 Recolección
La especie vegetal utilizada fue la semilla de Mimusops sp., para lo cual
se recolectó el fruto, en una zona de vegetación natural “Jardin Botánico” de la
Ciudad de Guayaquil, Ecuador, el 12 de Mayo del 2018. La especie vegetal se
encontraba en estado de floración-fructificación.
Los frutos recolectados fueron lavados con agua corriente y dejados en
refrigeración hasta el inicio de la experimentación. De éstos fueron extraídas las
semillas, las cuales se clasificaron en semillas de frutos verdes y maduros, según
las características de los frutos.
llI.3 Secado
Tanto las semillas del fruto verde como del fruto maduro pasaron por el
proceso de descortezación, y luego, dejadas a sequedad en estufa con una
temperatura de 50°C durante 24h.
26
llI.4 Evaluación macro morfológica
Se emplearon alrededor de 100 frutos entre verdes y maduros, de los
cuales se extrajo las semillas, clasificándolas, y anotando sus caracteres como
formas, dimensiones, entre otros.
llI.5 Propiedades físicoquímicas: Humedad, cenizas totales, cenizas
insolubles en HCl, Sustancias solubles.
Para la realización de los parámetros fisicoquímicos se siguieron los
procedimientos planteados por WHO 2011 y los ensayos se hicieron por
triplicado.
llI.5.1 Humedad residual
Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó
una estufa a 105°C marca alemana Mettler Toledo y para pesar, se usó una
balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4
Expresión de los resultados.
Dónde: Hg: Perdida en peso por desecación; M2: masa de la cápsula
con la muestra de ensayos (g); M1: masa de la cápsula con la muestra de
27
ensayo desecada (g); M: masa de la cápsula vacía; 100: factor matemático
para calculo
llI.5.2 Cenizas totales
Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E
por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern
Modelo: ABS-220-4. Se partió de 2 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta
obtener cenizas blancas.
Expresión de los resultados.
Dónde: C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada; M: masa del
crisol vacío (g); M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g); M2: masa del
crisol con la ceniza (g); 100: factor matemático para cálculo
llI.5.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
A las cenizas totales obtenidas según la técnica, se le añadieron de 2-3
mL de ácido clorhídrico al 10 %. El crisol se tapó con un vidrio reloj y se calentó
sobre un baño de agua hirviente durante diez minutos. Se lavó el vidrio reloj con
5 mL de agua caliente y se unió al contenido del crisol. La solución se filtró a
través de un papel de filtro libre de cenizas; se lavó el residuo con agua caliente
y se lo transfirió con el papel incluido al crisol. Se incineró en la mufla modelo
MLW Eliktro Modelo: 245.3E a una temperatura de 700-750º C durante
28
dos horas. Posteriormente se colocó en una desecadora, hasta que alcanzó la
temperatura ambiente para poder pesar.
Expresión de los resultados.
Dónde: B: porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base
Hidratada; M: masa del crisol vacío (g); M1: masa de crisol con muestra vegetal
deseca (g); M2: masa del crisol con la cenizas insolubles (g); 100: factor
matemático para cálculo
llI.5.4 Sustancias solubles
Este ensayo se determinó a partir de 5 g de la droga. Los disolventes
utilizados fueron agua, alcohol al 98 % y hexano.
Expresión de los resultados.
Dónde: Ss: sustancias solubles (%); H: humedad de la muestra (%); 500
y 100: factores matemáticos para los cálculos; R: residuo de la muestra (g); M:
masa de la muestra (g)
29
llI.6 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico se realizó a las semillas, según procedimiento
descrito por Miranda y Cuellar (2001).
Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente,
a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con
éter di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo,
alcohólico y acuoso, los cuales se sometieron a diferentes ensayos (figura 6)
(figura 7).
Extracción
Figura 6: Esquema de extracción del material vegetal para el tamizaje
fitoquímico.
Fuente: Autor
30
Figura 7: Ensayos a realizar en cada extracto
Fuente: Autor
llI.7 Macerado y concentrado de la muestra vegetal
Maceración
Se empleó el método de maceración por 7 días, usando como disolvente
alcohol al 98% para la extracción de los componentes de las semillas del fruto
verde y maduro. Las muestras se maceraron en recipientes cerrados y cubiertos
con papel aluminio para evitar el contacto con la luz durante el tiempo
establecido, con agitación recurrente cada día.
Concentrado
Una vez finalizado el proceso de macerado, los extractos se filtraron
empleando gasas y papel filtro para la obtención de extractos sin residuos,
31
posteriormente se concentraron en un rotaevaporador de marca alemana
Heildoph Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida, 100rpm
y a temperatura de 60 °C aproximadamente, hasta eliminación casi total del
disolvente.
III.8 Determinación de Rendimiento Porcentual
Se parte del pequeño volumen recuperado del balón luego del proceso de
concentrado, el mismo será transferido a un “beaker” o vaso de precipitación
Pirex de 100mL el cual fue pesado previamente.
Luego, se pesó el vaso junto a la muestra y se anota dicho valor, a
continuación se sometió a calor en estufa a una temperatura de 50°C hasta
sequedad de la muestra.
Cuando la muestra se secó a totalidad, se retiró de la estufa y dejó enfriar
aproximadamente 5 minutos en un desecador. Concluido ese tiempo se pesó
nuevamente el vaso con la muestra seca.
La fórmula empleada para los cálculos de rendimiento porcentual fue la
siguiente:
Donde:
𝑅% = 𝑃
𝑃
𝑒
𝑒
𝑠
𝑠
𝑜
𝑜
𝑚
𝑟𝑒
𝑢
𝑠
𝑒
𝑖𝑑
𝑠𝑡
𝑢
𝑟
𝑜
𝑎 𝑥 100
Peso residuo = peso final – vaso vacío
Peso muestra = (vaso + muestra) – vaso vacío
32
III.9 Reacción de silanización
Los extractos metanólicos fueron silanizados utilizando 50 µL de BSTF
[bis (trimetylsilyl)-trifluorocetamida; Merck] durante 45 min a 110º C, antes de ser
sometido a análisis por el sistema acoplado CG-EM (Huetos, 2004).
III.10 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM
Los extractos silanizados se analizaron mediante el uso de un
cromatógrafo de gases Agilent Technologies acoplado a un espectrómetro de
masas (sistema 7890A GC y 5975C inerte XL MSD con detector de triple eje).
Las condiciones de trabajo fueron las siguientes: Columna capilar HP-5, 5%
Phenyl Methyl Siloxan 325° C: 30 m x 320 µm x 0.25 µm. La temperatura inicial
del horno se mantuvo a 70° C durante 2,0 minutos, luego se aumentó a 300° C
a 5° C/min, donde se mantuvo por 6 minutos. Tiempo de corrida 52 min. El
espectrómetro de masas fue operado a 70eV en modo full scan desde 40-1000
μ ma. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuadrupolo 150° C.
Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas portador
helio a 1 mL/min. Los compuestos se identificaron mediante la comparación de
sus espectros de masas y la referencia de masa de Wiley 9th con NIST 2011 MS
Library tomando en cuenta aquellos con un porcentaje de similitud del 95% o
superior.
33
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
lV.1 Evaluación macro morfológica:
Para la evaluación macro morfológica de las semillas con corteza, así
como para el endospermo de las mismas, se toma en consideración las
dimensiones de largo y ancho.
Las semillas son previamente extraídas de frutos amarillentos con
contorno redondeado definido y característico, de estos se puede extraer entre
dos a tres semillas (figura 8).
Figura 8: Estudio macro morfológico de semillas y endospermo: A) semilla
madura con cascara; B) endospermo semilla madura; C) semilla verde con
cascara; D) endospermo de semilla verde
Fuente: Autor
D C
A B
34
Se efectúa un análisis estadístico comparativo de las dimensiones
establecidas y se reportan los resultados en la tabla II.
Tabla II. Cálculos estadísticos del largo y ancho de las semillas
PARÁMETROS CÁLCULOS ESTADÍSTICOS
VALOR
MEDIO
(cm)
DESVIACIÓN
ESTANDAR
CV
SEMILLA CON
CASCARA
LARGO SV 1,65 0,140 0,054
SM 1,79 0,097 0,01
ANCHO SV 1,17 0,213 0,08
SM 1,20 0,097 0,09
ENDOSPERMO LARGO EV 1,41 0,093 0,064
EM 1,43 0,095 0,069
ANCHO EV 1,01 0,078 0,074
EM 0,93 0,091 0,073
Elaborado por autores
En el estado de maduración verde se obtienen dimensiones de 1.65cm de
largo y 1.17cm de ancho para la semilla con cascara, teniendo un incremento al
madurar, dando unas dimensiones de 1.79 X 1.20cm. Se aprecia además un
color café de la cascara de la semilla verde, pasando a un café más oscuro al
madurar.
Al contraponer las longitudes con otra especie de la misma familia como
lo es M. elengi cuyas dimensiones son de 1.5cm a 1.9cm de largo y de 1.2 a
1.4 de ancho, se denotara la diferencia para la muestra estudiada.
35
Para el endospermo de la semilla verde se obtuvieron valores de 1.41 X
1.01cm, mientras que en el endospermo proveniente de la semilla madura
disminuía ligeramente su grosor, siendo sus dimensiones 1.43 X 0.93cm.
Se observa entonces luego de la evaluación, las diferencias existentes
entre semillas verdes y maduras con respecto a los parámetros estudiados.
lV.2 Parámetros físicoquímicos:
A las semillas de la especie de estudio se le determinó los parámetros de
calidad: humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en HCl, sustancias
solubles en agua y etanol 90%.
Los resultados de dichos parámetros se presentan en la tabla III.
Tabla III. Parámetros físicoquímicos de las semillas de Mimusops sp.
PARÁMETRO PORCENTAJE
SV SM
HUMEDAD RESIDUAL 10,39% 10,90%
CENIZAS TOTALES 3,20% 3,41%
CENIZAS INSOLUBLES EN HCl 0,90% 1,20%
SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA 54,24% 51,08%
SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL 90% 30,90% 25,23%
Elaborado por autores
Debido a que el estudio está enfocado en una muestra vegetal, la
determinación de humedad residual es primordial, ya que complementa la
36
calidad del método utilizado en el secado evaluado. Las Normas y Farmacopeas
establecen, en dependencia del material vegetal, un contenido de humedad
residual entre 8 y 14 % (LouZhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuellar, 2001).
El análisis arrojó un valor de 10.39% de humedad residual para las
semillas verdes, mientras que en las semillas maduras existe un incremento del
0.6%, ambas dentro del rango establecido.
La determinación de las sustancias solubles es un parámetro importante
para conocer la naturaleza de las sustancias presentes en las drogas y, para
determinar el mejor disolvente a emplear en la extracción de dichos compuestos
(Miranda y Cuellar, 2001). En la determinación de sustancias solubles los
resultados arrojaron porcentajes elevados en agua a comparación del alcohol lo
que nos sugiere la naturaleza mayormente polar de los componentes de la
muestra.
Para comprobar de manera relativa si la muestra ha sido adulterada con
material orgánico o cuerpos extraños, se realiza la determinación de cenizas
totales. Este ensayo indicativo de la calidad y pureza de la muestra trabajada
estable un contenido de máximo el 5% para cenizas totales según la
Farmacopea. (LouZhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuellar, 2001).
Para semillas verdes el porcentaje de cenizas totales fue de 3.20%, en
contraste con las semillas maduras las cuales presentaron un porcentaje de
37
3.41%. Los valores encontrados cumplen con lo establecido en la norma. La
cantidad de cenizas insolubles en HCl es también un parámetro que ayuda a
evaluar la pureza de la droga. Al analizar los resultados se pudo observar que el
porcentaje de estas cenizas insolubles fue de 0.9% para semillas verdes y 1.2%
para semillas maduras, valores que se encuentran dentro del límite establecido
(alrededor del 2 % para plantas medicinales) (LouZhi-cen, 1980; WHO 1998).
IV.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico:
A los extractos obtenidos según la metodología utilizada, se les realizaron
los ensayos cualitativos correspondientes a cada extracto, los resultados se
muestran en la tabla IV.
Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp.
EXTRACTO ETÉREO
ENSAYO METABOLITO RESULTADO
SV SM
SUDAN ACEITES Y GRASAS + +
BALJET LACTONAS Y COUMARINAS - -
LIEBERMANN-BUCHARD TRITERPENOS Y ESTEROIDES + +
DRAGENDORFF ALCALOIDES - -
EXTRACTO ALCOHÓLICO
ENSAYO METABOLITO RESULTADO
SV SM
DRAGENDORFF ALCALOIDES - +
38
BALJET LACTONAS Y COUMARINAS - -
ESPUMA SAPONINAS + +++
FEHLING AZUCARES REDUCTORES + +
LIEBERMANN-BUCHARD TRITERPENOS Y ESTEROIDES + +
SHINODA FLAVONOIDES - -
CLORURO FERRICO TANINOS + -
NINHIDRINA AMINOACIDOS +++ ++++
ANTOCIANIDINA ANTOCIANIDINA + -
BORNTRAGER QUINONAS - -
RESINAS RESINAS - -
CATEQUINAS CATEQUINAS - -
EXTRACTO ACUOSO
ENSAYO METABOLITO RESULTADO
SV SM
DRAGENDORFF ALCALOIDES - +
ESPUMA SAPONINAS +++ ++
CLORURO FERRICO TANINOS + -
FEHLING AZUCARES REDUCTORES + +
SHINODA FLAVONOIDES - -
MUCILLAGOS MUCILAGOS - -
Elaborado por autores
Los metabolitos hallados en el análisis fueron representados con “-” al ser
negativos y con “+” al ser positivos, incrementando o disminuyendo las cruces
en dependencia de la intensidad del color o la cantidad de precipitado presente.
Observando los análisis correspondientes al extracto etéreo,
evidenciamos la presencia de aceites y grasas, lactonas y coumarinas, así
39
como núcleos triterpenico y esteroidales definidos por el color rojo y verde en el
ensayo de Lieberman tanto en semillas verdes como maduras. No existen
alcaloides en ninguna de las semillas.
Pasando al extracto alcohólico nos encontramos con varias diferencias
entre las semillas verdes y maduras, es el caso de los alcaloides, donde la
fracción madura dio positivo para Dragendorff, caso contrario de las semillas
verdes que mantienen el negativo como ocurrió en el extracto etéreo. El ensayo
de saponinas también dejo huella de la diferencia entre estados de maduración,
esta vez ambas semillas reflejan positivo para espumas, pero las semillas verdes
en menor proporción en contraste con las maduras. Sigue esta secuencia de
alter ego los ensayos de taninos y antocianidinas, en ambos casos, el resultado
es negativo para las semillas verdes, y positivo para semillas maduras.
Se denota la ausencia de flavonoides, resinas, quinonas y catequinas en
la muestra vegetal.
En el extracto acuoso, el ensayo de espumas para saponinas mostró
mayor intensidad en las semillas verdes que en su contraparte maduras, en
cambio, las semillas maduras mantienen la presencia de un ligero porcentaje de
alcaloides que no poseen las verdes. Positivo en ambos casos para taninos y
sustancias reductoras.
Aunque la especie estudiada carece de reportes acerca de su
composición química, para otras especies del género se han informado
40
diferentes compuestos. Los resultados obtenidos para los compuestos grasos
concuerdan con lo informado por Sathish y col., 2015 y Chivandi y col., 2016; los
triterpenos y esteroides han sido informados por Misra y col., 1974. Para la
especie también han sido informados diferentes taninos y compuestos fenólicos
por Chanda y Nagi, 2010; Fayek y col. 2012 y Baky y col , 2016.
IV.4 Extracción y análisis de los extractos alcohólicos de las semillas
IV.4.1 Extracción
A partir de los endospermos de las semillas, se obtuvo un concentrado en
bruto de las saponinas mediante el método de maceración por 7 días en etanol.
Los rendimientos de los mismos están expuestos en la tabla V.
Tabla V. Rendimiento porcentual de compuestos solubles en etanol de las
semillas de Mimusops sp.
RENDIMIENTO (%)
FRUTOS VERDES 5.22
FRUTOS MADUROS 32.90
Elaborado por autores
Se aprecia de esta manera que las semillas del fruto maduro tienen una
supremacía considerable en el rendimiento porcentual de saponinas en
contraste con las semillas verdes.
41
IV.2 Análisis de los extractos alcohólicos
Los extractos alcohólicos de las semillas fueron primeramente silanizados
para ser analizados por el sistema acoplado CG-EM.
El cromatograma gaseoso analítico de los extractos alcohólicos de las
semillas de los frutos verdes y maduros, se exponen en la figura 9.
Ambos cromatogramas resultan complejos, pero se observan diferencias
marcadas entre ellos. Para el extracto de las semillas de los frutos verdes, el
equipo registró un total de 228 compuestos, mientras que para las semillas
maduras, el total de compuestos registrados fue de 195.
42
Figura 9: Cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos alcohólicos de
las semillas de Mimusops sp en dos estados de maduración
Para el extracto alcohólico de las semillas verdes, se lograron identificar
un total de 13 componentes de los cuales el ácido octanodioico fue el mayoritario
(17,16 %); con similar abundancia se encontró la oleoamida (amida del ácido
oleico), con un 17,02 %. Otros compuestos con abundancia relativa superior al
10 % fueron: Ácido trans-9-Octadecenoico (16,16 %); Ácido docosanoico (12,58
%) y el Ácido-9,12-Octadecadienoico (11,73 %) (tabla VI).
43
Tabla VI. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de
los frutos verdes de Mimusops sp.
SEMILLA FRUTO VERDE
Pic
o
Tr
min
Compuesto % Abundancia
1 15.64 Àcido pentanodioico 0,42
2 17.16 Isoeugenol 2,14
3 19.47 Ácido benzoico 0,28
4 20.45 Valenceno 9,58
5 22.58 Ácido octanodioico 17,16
6 22.83 γ-cadineno 6,15
7 26.68 Ácido sebácico 5,29
8 31.97 2-etil-hexano-1,2-diol 0,71
9 32.81 Ácido trans-9-Octadecenoico 16,16
10 34.19 Ácido-9,12-Octadecadienoico 11,73
11 34.79 Ácido nonadecanoico 0,71
12 35.21 Oleamida 17,02
13 39.48 Ácido docosanoico 12,58
Elaborado por autores
Se destaca por tanto un predominio de compuestos de naturaleza ácida
en el extracto. Se debe señalar también la presencia de sesquiterpenoides y de
un compuesto fenólico como componentes del extracto. Algunos de los
compuestos identificados para el extracto se presentan en la figura 10.
44
Valenceno γ-cadineno
Oleamida Isoeugenol
Figura 10: Algunas estructuras identificadas en el extracto alcohólico de las
semillas de los frutos verdes
45
Para el extracto alcohólico de las semillas de los frutos maduros se
lograron identificar un total de 19 compuestos ninguno de ellos coincidente con
los encontrados en las semillas de los frutos verdes, por lo que puede inferirse
que durante la maduración ocurren transformaciones químicas que pudieron
haber influido en estos resultados (tabla VII).
Tabla VII. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas
de los frutos maduros de Mimusops sp.
SEMILLA FRUTO MADURO
Pico Tr
min
Compuesto % Abundancia.
1 14.22 Muruleno-B 0,11
2 14.82 2(3H)-Furanona, dihidro-3,4-bis 0,11
3 18.00 L-Treitol 1,33
4 18.17 meso-Eritiritol 3,67
5 18.99 Nootkatona 2,66
6 26.23 7.α.-(1,2-epoxi-1-metiletil)-2α.-hydroxy-4a.β.-
metil- 2,3,4,4a,5,6 Inositol
8,34
7 27.40 Cariofileno 14,57
8 31.72 9cis-11.trans-octadecadienoato de etilo 7,11
9 32.15 Palmitamida 8,0
10 32.35 Ácido esteárico, etil éster 9,34
11 35.31 Oleoamida 23,47
12 40.22 3-.α.-Mannobiosa 3,67
13 43.26 D-(+)-Galactopiranosa 6,45
14 45.31 4-O-β-Galactopiranosil-D-mannopiranosa 4,22
15 46.10 (+)-α-Tocoferol 5,11
16 47.88 rafinosa 1,77
Elaborado por autores
46
El componente mayoritario para este extracto fue la oleoamida con un
23,47 % de abundancia y con porcentajes superiores al 10% se encontró al
cariofileno con 14,57 % . Se debe destacar en este extracto la ausencia de
ácidos carboxílicos, aunque se encontraron algunos derivados como amidas y
ésteres. Característica de este extracto resultó también la presencia de algunos
azúcares, que no estuvieron presentes en los extractos de las semillas de los
frutos verdes.
A pesar de que para las semillas de los frutos se ha reportado la presencia
de saponinas, en este trabajo, no pudieron ser identificadas, lo cual puede
atribuirse al disolvente empleado o al método de extracción utilizado.
Algunas de las estructuras identificadas en este extracto se grafican en la
figura 11.
47
Treitol Eritiritol
α-muuruleno Criofileno
Notkatona α-tocoferol
Figura 11: Algunas estructuras identificadas en el extracto alcohólico de las
semillas de los frutos maduros
48
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
V.1 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permitieron arribar a las siguientes
conclusiones:
Se evaluaron los parámetros fisicoquímicos de las semillas de los frutos
verdes y maduros y los resultados se encuentran dentro de los rangos
establecidos en la farmacopea para drogas vegetales. No se encontraron
diferencias marcadas entre las semillas de los frutos verdes y maduros.
Como componentes mayoritarios en el análisis cualitativo de las semillas de
los frutos verdes y maduros se encontraron: compuestos grasos, triterpenos-
esteroides, azúcares reductores, taninos y saponinas, los cuales se
encuentran informados para el género.
Por el método de extracción, el disolvente utilizado y el método de detección
empleado, no se pudieron identificar las saponinas en los extractos obtenidos.
Se encontraron diferencias entre los extractos de las semillas de los frutos
verdes y maduros, no existiendo coincidencia en los componentes
identificados para cada uno de ellos.
49
V.2 RECOMENDACIONES
Evaluar otros disolventes, método de extracción y de identificación para
estudiar los extractos de las semillas de los frutos de Mimusops sp
50
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59
ANEXOS
Anexo 1: Extracción, secado y pesado de la muestra
Frutos verdes y maduros luego de su recolección en el jardín botánico.
Extracción de las semillas de Mimusops sp, y posterior la obtención del
endospermo
Secado de la muestra en estufa, toma de peso para sus posteriores análisis.
60
Anexo 2: Preparación de extractos para tamizaje Fitoquímico
Peso aproximado de 23g de ambas semillas para realizar los extractos etéreos,
alcohólicos y acuosos
Trasvasado del peso correspondiente a los envases ámbar para su extracción
en el solvente de turno
Obtención de los extractos etéreos, alcohólicos y acuosos para las pruebas de
tamizaje fitoquímico.
61
Anexo 3: Resultados varios en el screening fitoquímico
Ensayo de Lieberman – Buchard Ensayo de Fehling
Ensayo de Cloruro Férrico Ensayo de Espuma
SV
S
M
62
Anexo 4: Pruebas Físico Químicas
Se pesó un aproximado de 2g para ensayo de cenizas
Muestra llevada a mufla por un tiempo de 2 horas
Obtención de las cenizas de las semillas de Mimusops sp.