UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFacultad de Ciencias Químicas
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
ESTUDIOS ESTRUCTURALES YAPLICACIONES BIOTECNOLOGICAS DELA LISOZIMA DEL BACTERIOFAGO Cp-I
DE NEUMOCOCO
Jesús Miguel Sanz Morales
Madrid, 1992
Colección Tesis Doctorales. NY 206/92
© Jesús Miguel Sanz Morales
Edita e imprime la Editorial de la UniversidadComplutense de Madrid. Servicio de Reprograf la.Escuela de Estomatología. Ciudad Universitaria.Madrid, 1992.Ricoh 3700Depósito Legal: M-25119-1992
La Tesis Doctoral de O. ..J.2’¿CL.SNLZ....
MORAL Es
Titalada “ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y APLICACIONES BIO--
DE NEUMOCOCO”Dinctor Dr.-D. 2OSEL. GARCíA hQZ..t~24.rtIt~iQ.CAI?CIA
CON ZALEZfa leída a la Facultad-da CTENCIAS QUíMICAS
t. la ISiVERSIIMO CUU’AJflDISE E MORID, el dfada dc 19 5tL.. amta el tribumícastitaido por las sigulates Profesores:¡‘nsineor U. FRANCISCO GARCíA BLANCO
VOCALwocat U. JOSE MANUEL GUISAN ~WIJASVOCAL ..DS~’AUUEL.A~I’WA.MQ~Inswrrwao U. FRANCISCO GAVILANES VRA¿400
hablase, recibido la cal ificacido de
tn/2PÉ 6//(bfl7t/&?J9
Madrid. a ¿ de 1e.191/.
EL SECRETARIO DEL TRIBUNAL.
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFacultad d. Ciencias Quimkm
O.p.narnenw de Bioqimk. y Siologia Molecular
ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y APUCACIONES SIOTECNOLOGICAS DE LA
LISOZIMA DEL BACTERIOFAGO Cp-I DE NEUMOCOCO
Memori. que pan optar al Grado de Doctor en CiencIas Q,jimicaz pinenca:
JESUS MIGUEL SANZ MORALES
Dnctores de la Tesis
Dr. José Luis Gama LópezInvesdgador Científico
Dr. Pdm Cerda GonzálezColaborador Científico
Consejo Sopenor de Investigaciones Científicas
Madrid, 1991
A mis podres
A mi hwmono
III
Quisiera ex ~esa,desde aqul 0,1 gratitud a todas aquellos personas que, de alguna u otra maneje.
me hat, ayudado e ¡o realización de este trabajo experimental es, el Centro de Investigaciones Siológicas
{C.I.B de/Canse, Supe’ior de lnveszigacionn Ciestificas.
De manera especial, quiero agradecer a mis directores José Luis Garcia López y Pedro Gorcio
Gonzñlez la formación cientifice que de ellos he recibido. Son persones que han demostrado conm/gouna paciencia, profesíonalidad. amistad y calidad humano de tal magnitud que no me habría importado
ser su becaria predoctarol durante décadas
Par acre parte, deseo expresar mí mós sincera agradecimienca olOr. Rabeos López par habermeaceptado en su laboratorio, asi como par sus sabios consejos. comentarios y sugerencias y su apoyo en
todo mon,enta. De igual manera, agradezco al Dr. Ernesto Gardo su colaboración en muchas aspectosde este trabajo y su constante ayudo pro fesianal y moral o la largo de mi estancia en el laboratorio.Asimismo ¡a Dro. Concepción Ronda ha sido para mi una amiga entrolloble en lo que siempre encontré
afecta y comprensión.
Agradezco profundamente al resto de mis campolleras del laboratorio, los doctores Eduardo Dfox,
Alicia Romero, Jasé Mario Sónchez-Puelles y Chrisúan Craus. así coma o Moría Auxiliadora Prieto y Anasabed Rodrigan. su disposición a crear alrededor mía un ambiente inigualable de amistad y
coropalierisma. Asimismo. lo excelente asistencia técnico de Eloisa Cano Manad Carrasco y RemediosCalón ha facilitado enormesner’te la realización de este trabaja experimental.
Quiera agradecer o os doctores José Loynez, Pilar lAsebioga, y Margarita Menéndez su
colaboración en ¡os trabajos de calorimetría. Asimismo, agradezco a Santiago Rodríguez de Córdoba,
José Manuel Andres., y Enrique Méndez coda o ayuda y colaboración que han prestado en diversasaspectos de este trabajo. tombié, agradezco a Fernanda Dio, su inestimable ayuda en les labores de
ordenador.
Mi agradecimiento al director del departamento de Aioquimníca y biología molecular, Dr. José
Gavilanes. par bebes facilitado ¡o lectura de esta Tesis, y a la Dra. Fdícisímo Moco por haber aceptadoser ponente dele misma.
Quiero recordar aquí a los miembros del CAS, que de alguna manero han colaborado en estetrabajo. do modo especia! a Aurelia Hurtado, Roso Olor y José Blanco por su dedicación en los labores
de delineación fo:agrafia
Por ti/timo, agradezco o mi familia todo el apoyo y carilla que me han profesado durante este
tiesnpa.
Li presente trabajo ha sido realizado gracias a la concesión de une Seca de Formación de Personal
Investigador del Ministerio de Educación y Ciencia.
TV
ABREV <fURA~
• deleción; incrernerrcAp arnp/cil/naóATP desoxiadenosína S-rr¡fosfaroCD d/croísmo circularCi 1 CurioCm cloranfenicolCp . capacidad caloríficacpni Cuentas por minutoDa 1 daitenDEAE N,N-dietilan,inoetanolDSC calorimetría d/ferencial de barridoDTNB 5.S-dírio-bis-(2-n/crobenzoico)EA ecano/aminaEDTA etilend/aminotetraacetatoe
280 coeficiente de extinción molar a 280 nmg : aceleración de la gravedadoC /ncremento de energi~ libreGEWI. : lisoÉma de huevo de gansooH : incremento de crica/pía
enralpía de van’t Ho!!HEWL lisos/ma de huevo de gallinaIAA ácido yodoacét’coIPTO isopropil.B-D-ciogabctop/ranósidoK - grado Kelv,nKan kanamícinaIt., constante de disociaciónlcb :1000 paresde bases
constante de Stern-VolmerLB : medio de cultivo de Luna y BertanyLMT gel de agarosa de bajo punto de fusiónLTA ácido lípeteicoicoMr : masa molecular relativaN : med/da de la concentración celular por nefelometríaNAO N-acetilglucosaminaNAM ácido t4-acetílmurám,coONPG o-nicrofenil-galactósidoPACE . eleccroforesis en geles de poliacn,lamidaPoIlk : fragmento Klenow de la DNA pol/merasa 1 de E. cotíp/p : relación pesolpesopi.’ : -elación pesolvolumen3 1 resistenciaRBS : sitio de unión al nbosomaoS incremento de entropíaSDS : dodecil sulfato sódicoT4L lisos/ma del bacteriófago 14Tc : tecracicí/naTM : tampón Tr/s-ma/cato
temperatura de fusiónTris 2-am/no-2-h/drolan~edlpror~ano-k3-dioJe : elipc/c/dad molarUFC : unidades formador., de coloniaY/y : relac/ón vo/umen,volumenX-GAL 1 5.bromo-4.cloro-3.indolild3-o.galaccopiranósido
INDICE
1. INTRODUCCION Pág.
1. ESTRUCrURA DE LA PARED BACTERIANA 2
.1. Estructura del peptidoglicano
3.2. Los ácidos teicoicos 7
1.3. La pared ce/ula, de Streptococcus poeumoniae 8
2. ENZIMAS QUE DEGRADAN EL PEPTIDOGLICANO /3
2.3 Autalisinas bacterianas 13
2.2. EnzImas líticas de bacteriófagos 14
2.2.1. Enzimas l.’ticas de lagos que infectan a bacterias Gram.negativas /4
2 2 2 Enzimas líticas de lagos que ¡níectan a bacterias Gran,-positivas 1 5
2.3. Las enzimas L/tios deS. prieutnonioe y sus bacteriófagos /6
2 3. 1 . La pr/ncípa/ auto//s/ria de neumococo (LYTA) 1 6
23.1.1 Eíprocesodeactrvac/án(convevsión) Ii
2.3.1.2. lnhibicion de la actividad catalítica de la amidasa LYTA 8
2.3.2. Características de la glucosamir,/dasa de neumococo /9
2-3.3. Enz/mas líticas de bacteriófagos que infectan a 5. pneumeníae 9
2.4. Estructura modular del., enzimas liticas de &pneumoniae y sus
bacteriófagos 21
3. LAS LISOZIMAS . . . ... 26
Xl. Tipos de lisozimas 26
3.2 Mecanismode acción de l.~ lisodmas . . 27
3.3. Papel biológIco d. las I¡sozímas.... 30
tOBjETIVOS.... 32
II MATERIALES Y METODOS
1. ESTIRPES BACTERIANAS BACTERIOFAGOS Y PLASM/DOS 35
2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO 35
LI. 5. poeumoníae.
2.2. E.colí.
3. CURACION FENOTIPICA DE NEUMOCOCO 38
4. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFORMACION GENETICA 38
5. OBTENCION DE EXTRACTOS CRUDOS DE CULTIVOS
CELULARES 38
6. TECHICAS DE FRACCIONAMIENTO SUSCELULAR EN E. cefi 39
6.1. Fraccionamiento subceíular mediante choqus osmótico 39
61. FraccionamIento subeelular mediante la formación de esferoplastos 40
7. OBTENCION DE LAS PAREDES CELULARES DE NEUMOCOCO 40
7.1. Marcaj. radiactivo de las paredes celulares 40
7.2. Aislamiento y purificación de /as paredes celulares 4!
8. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA 4/
SI. Detern,inación de la actividad de las enzimas que hidrolizan la
pared celular de neumococo 4/
8.1.1. Ensayo enzímáríco de los extractos obtenidos de E. cotí 4/
8.1.2. Ensayo enzimático de las proteínas purificadas 42
8.1.3. Caracterización del tipo de actividad lítica 43
8.2 Ensayo de actividad de 8-galactosidasa .43
9. PURIPICACION DE LAS ENZIMAS LíTICAS DE PARED DE
NEUMOCOCOY DE SUS BACTERIOFAGOS 43
9.1. Purificación mediante cromatografía de afinidad en
Sepharosa-colina 43
ti. Purificación del. lísozima CPu por crornatografia de
penetrabilidad 44
9.3. Purificación de la lisorima CPL7 44
9.4. Purificacion desde geles de poliacrilamida 45
lo. VALORACION DE CONCENTRACIONES DE PROTEíNA PURA 45
II. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN CELES DE POLIACRILAMIDA-
-SDS . 46
Ii. DETERMIhACION DE SECUENCIAS N-TERMINALES DE
PROTEíNAS .. . .46
IX. PREPARACION DE PLASMIDOS . . 46
¡4. MANIPULACION DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMUN EN
BIOLOGíA MOLECULAR 46
15. ELEC-rROFORESIS DEL DNA EN GELES DE AGAROSA.. 47
¡6. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE LOS FRAGMENTOS
DEDNA 47
16.1. Geles de poíía&Iarnida 47
16.2. Técnica del Genecíean 48
16.3. Celes deaproe. de baje punto de fusión 48
17. SECUENCIACION DEL DNA 48
IB. MUTAGENESIS DIRIGIDA 48
19. TECNICA DE WESTERN.BLOT” 49
20. MICROSCOPIA ELECTRONICA 49
21. PREDICCION DE ESTRUCTURA SECUNDARIA . 49
22. DICROíSMO CIRCULAR 50
23. VALORACION DE CISTEINAS LIBRES Y BLOQUEO CON /AA 50
24. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA SI
25. EXPERIMENTOS DE CALORIMETRíA Sí
254. Calorimetrí, diferencial de barrído 5/
25.2. Calorimetría isoterma en flujo Sí
III RESULTADOS
1. NUEVO METODO DE PURIFICACION DE LAS ENZIMAS LíTICAS
DEPENDIENTES DE COLINA DE NEUMOCOCO Y SUS
BACTER/OFAGOS 54
.1. Estudio de/a conversión de la amidas. LYTA con análogos
de colina ... .54
Li. Purificación de las enzimas dependientes de colina en un solo paso
mediante columnas de DEAE-celuíosa SS
1.2.1. Punficación de la amídasa LYTA. a bomogerie¡dad electroforética SS
.2.2. Purif/cación de otras murein hídrolasas SS
1.2.3. Optimización de las condic/ones de purif¡cacíón 58
1.2.4. Uso de otros tipos de tesina 62
2. CARACTERíSTICAS GENERALES DE LA LISOZIMA CODIFICADA
POR EL BACTERIOFACO Cp-l <LISOZIMA CPLI> 63
2.1. Construcción de urs vector que hiperexpresa lalisozimaCPLí 63
2.2. Condiciones óptimas de producción de 1. lisozima CPLI 65
2.3. Algunos datos bioquímicos de la lisozima CPLI 65
2.4. Análisis estructural de la lisozirna CPLI 67
2.4.1. Estudios de dicroísmo circular 67
2.4.1.1. Efecto de d/versos agentes sobre los espectros de dicroísmo circular 67
2.4.2, Predicción de la estructura secundana de la lisozima CPLI 7
2.4.3. Experimentos de apagamiento de fluorescencia 73
2.4.4, Valoración de cisreinas libres en la lisozíma CPLI 77
2.5. Localización subceluíar de la lisozin,aCPLI en Escherichia colí 77
3. CARACTERIZACION DE LA INTERACCION DE LA LISOZIMA CPLI
CONCOLINA 79
3.1. Termodinámica de la unión de colina ala Iisozima CPLI 79
3.2. Cambios conforniacionales de la lisazíma CPU inducidos por
colina 79
3.2.1. Estudios de dicroísmocircul,r 79
3.2.2. Experimentos de fluorescencia 82
4. LA ESTRUCTURA MODULAR DE LAS LISOZIMAS DE LOS
BACTER/OFAGOS Cp-l Y Cp-7 85
4.1. Estudios sobre .l dominio C-terminaí de la lisozínia CPLI obtenido por
ingeniería genética (C-CPLI) SS
4.1.1. donación y expresión de la región 3’ del gen cpU 85
4.1.2. Purificación del, proteína C.CPLI 85
Ex
4.í .3. Estur ,sde dicroísmo circular 87
4.1.4. Inhib~i6n de la actividad lítica de las mure/n h/droíasas de neumococo
por la proteína C-CPI. 1 90
4.1.5. valorac/ón de la osteína libre de la proteína C-CPLI 90
4.2. Obtención dél dominio N-termninaí de la ¡isozima CPLI (N-CPLI) por
ingeniería genética 92
4.2.1, Actividad de la proteína N.CPLI 92
4.3. Experimentos de proteoíisis controlada 96
4.3/. Obtención de los dom/n/os N-termina/es de las lisos/mas CPLI y CPL7
(Iragmentos FI y Fi) por digestión controlada con tripsina 96
4.3.1.1, Análisis estructnral de los polipéptidos FI y F7 98
4.3.I.2.Análislsfunc.orialdelasproteinasFlyFi 99
4.3.2. D/gestión con otras enzimas proteoliticas /05
LA. Estudios calorin,étrlcosde la estabilidad tánricade la IlsozImaCPLl ... lOS
4.4.1.Estudios de DSCsobre la proteína completa /05
4 4.1.1 Efectod.lpH 108
4 4.2 Estudios sobre el dominio C-tern,in 113
4 4 3 Estudios sobre el dominio N-terminal 113
4 4.4 Efecto de la colina sobre la desnaturalización térmica de la lisos/ma CPLI /16
5. MECANISMODÉREACCIONDELA USOZIMA CPLI 120
S.l. Mutagénosis dirigida del gen cpll.. . /20
1 1 Introducción de aminoácidos polares 1 20
5 .2 Actrndad enzimática de los mutances 123
1.3 Introducción de un aminoácido apolar ¡24
5.2. Análisis estructural y funcional de los mutantes /26
5.3. Actividad de iosmutantesinviva 126
5.4. Requerimiento del componente peptidico del peptidoglicano
para la actividad lítica de la lísozíma CPL 1 128
6. APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS DE LOS DOMINIOS
C’TERMiNALES DE LAS PEPTIDOGLICAN-HIDROLASAS DF
S.PNEUMOMAE . . ... 3/
-y
6.1. Fusiones del dominio C-terrninal de la icor/rna CPQI con la
8-galactosidasa /3/
6.1,1. Obtención de la proreina h/brída C-CPLI .fl.galactos¡desa con e] dom,nio de
reconocim/ento de colina como región N-terminal /3/
6.1.2. Inmovilización de a proteína en columna /33
6,1,3. Construcc/ón de la proteína h¾idaB-galaczosídasa-C-CPL
(C-CPLI como revón C-terminal) /35
6.2. Construcción de una proteina de fusión C-LYTA-TcRftS.l /38
6.2.1 - Purif/cación de la proteína híbrida C-LYTA-TcRI38. 1 /40
IV DISCUSION
1. UN NUEVO METODO DE PURIFICACION DE LAS PEPTIDOGLICAN.
HIDROLASAS DE NEUMOCOCO DEPENDIENTES DE COLINA 145
2. CARACTERíSTICAS GENERALES DE LA LISOZIMA CPLI Y DE SU
INTERACCION CON COLINA 48
3. LA ESTRUCTURA MODULAR DE LAS LISOZIMAS CPLI Y CPL7 152
4.MECANISMODEREACCIONDELALISOZIMACPLI 57
5. APLICACIONES BIOTECNOLOGJCAS DE LOS DOMINIOS
C.TERMINALES DE LAS PEPTIDOGLICAN-l-/IDROLASAS DE
5. PNEUMOHIAE 162
Y CONCLUSIONES 67
VI BIBLIOGRAFíA. ni
1 INTRODUCCION
IN PR001W 0 0 N
1. ESTRUCTURA DE LA PARED BACTER~ANA
Las bacterias, al igual que otros microorganismos, han ten/do que desarrollar una estructura
protectora a modo de exoesqueleto que les permitiera la adaptación a un med/o externe de
características muy diferentes al med/o intracelular. Dicha estructura protectora es la
denominada pared bacteriana, integrada por distintos g/icolíp/dos y heteropolisacáridos, la cual
recubre por entero la membrana plasmática. La función primordial de la pared bacteriana es la
protecc/ón de la célula frente al med/o externo, pues entre ambos existe una diferencia de
presión osmótica superior a 20 atmósferas. Asimismo, la pared bacteriana restringe la difusión de
solutos y conf/ere a la bacteria su morfología tipica.
La pared celular puede aislarse en forma nsolubie manteniendo inalteradas sus
características morfológicas (Shockman y Barret. 983). La pared así obtenida puede contener.
dependiendo de las especies, diversos tipcs de polímeros tales como ácidos teico/cos y
teicurónicos. polisacáridos ác/dos o neutros, compuestos glicopeptídicos y lípidos complejos. En
el caso de las cubacterias, el componente glicopeptidico de la pared se denom/na peptidogí/cano.
mureina o muropéptido. El peptidoglicano, que constituye en peso el 50% de la pared
bacteriana, está formado a su vez por cadenas polisacaridicas lineales interconectadas entre sí por
medio de puentes peptídicos, y a él se asociar otros componentes accesorios característicos que
diferencian a las bacterias Gram-positivas de las Gram-negativas. El peptidoglicano se dispone en
un numero de capas que depende de las especies, y su espesor varia entre /5 y 40 nm. La pared
celular de las bacterias Cram-positivas representa entre el /5 y el 30% del peso seco de la
bacteria, y posee estructura sri/aminar. Aunque se pensaba que la pared celular de las bacterias
Gram-negativas era una manocapa, estudios más recientes /nd/can que puede poseer tamb/én un
cierto carácter muid/am/nar (Lab/schinski y cok.. /985).
El estudio de la pared de las bacterias Crann-negativas ha mostrado una disposición de tres
capas bien diferenciadas entre sí tanto estructural como funciona/mente: <1) la membrana
interna, con func/ones metabólicas; (2) el peptidogí/cano, y (3) la membrana externa, que
desempeña funciones de relación con e/exterior, y que se une cova/eneemente al peptidogí/cano,
contribuyendo a la resistencia mecánica de la pared (Nikaido y Vaar-a, 1985>.
3Nt~oOucooN
1.1. Estructuradel peptidoglicano
El componente po/isacaríd/co del peptidogí/cano está constituido de polímeros alternantes
de residuos de 2-N-acetilamido-2.-desoxi-o-glucosa (N-aceti/glucosam/na. NAG) y 2-fi]-
acet/farnino-3-O-<o- ¡ -carboxietil>-2-desoxi.o-glucasa <ácido N-acecflmur,n-,ica, NAN) unidos
entre sí mediante uniones glicosidicas /3-1 4. A veces, los grupos acetilo se encuentran sustituidos
como acil y gl/cos/l derivados. El NAMpuede estar acetilado o fosforilado en el carbono 6. lo
que permite la formación de puentes de hidrogeno con cadenas adyacentes glicán/cas. Los gnspcs
carboxílo de los restos de NA1-1 pueden hallarse sustituidos por cadenas laterales tetrapeptíd/cas
del tipo L-al.nii-o-isoglutami/-t.-R3-n-alanina (figura 1 A>, aunque este esquema puede variar segÉn
las espec/es. Por ejemplo. el residuo de o-alarma puede no existir o estar sustituido por L-seflria
o glicina. El grupo cr-carboxilo del ácido isoglutárnico puede permanecer libre, am/dado o
sustituido por una glicina o por una glicinamida. Tamb rs puede encontrarse el ác/do treo-3-
hi&oxigtutámico sustitnyenóo al ácido /soglutámico. El residuo R3 puede ser t-a/anina. 2.-
homoserina, Ácido c-glutámico, t-diaminobutir/co, L-d/aminopimklico o meso-diaminopimélico.:>
orn/tina o 2,/is/na, En la mayoría de las bacterias estudiadas, todos los residuos de NM’1 se
encuentran sustituidos por péptidos (Schleiffer y Kandler. /977; Ghuysen, 1977), aunque en
algunas especies como Micrococcus flsade/ltticus alrededor del 30-40% de los residuos ile
murán,/co no están s.jstit’jídas.
Las unidades peptíd/cas pueden a sta vez unirse entre si med/ante puentes interpeptidicos,
cuya proporción garfa según la especie (Ghuysen, /968). Así, el microorganismo en el que se ha
encontrado mayor proporción (90%) de unidades peptidicas formando parte de enlaces cruzados
es Swpá%ylocaccus aureus. mientras que en el otro extremo se encuentran los peptidoglicanos de
Escheichio co~ y de la mayoría de las bacterias Grans-negasivas, donde este índice es de alrededor
de un 25% <Nauman y ools., /982>. Dependiendo de 1. composición y localización de estos
puentes. ci peptidoglicano ha sido dividido en cuatro tipos principales (Cl~uysen, 977): En los
peptidoglicanos de tipo 1, II y III. el resto de 0-alarma terminal forma una unión, directa o
mediante otras cadenas polipeptíd/cas, con el grupo e-am/no del aminoác/do básica R3; esta
unión se forma con el grupo a-carbaxllo del residuo de ác/do O-isOg/utám/cO en los
pepridoglkanos del tipo IV.
A- ¿>OH
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Ca,-e-a
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L- Lys
C-Calc
a
-.3-
Figura 1. Estructura de una cadena de peptidoglicano.Panel A. Estructura primaria de la cadena de peptidoglicano <cadena glicán/ca y cadena peptídica).Las abreviaturas utilizadas son : NAC, N.acet/lg/ucosamina; NAI’1, N-acetiln,urámico. Losansínoacidos de la cadena peptdica se indican en código de tres letras. D-Clx, indica que ci grupoo-carboxilo del ácido D-glueárnico se encuentra am/dado (isogluramina). r - significa que el enlacepepeidico tiene lugar con el grupo z-carboxilo de la isogluramina.Eáp,gt~- Conformación más probable para la unidad de disacárido-retrapéptido.Panel C. Representación esquemática de una cadena de peptidogí/cano compuesta de diezunidades repetidas de disacárido-tetrapépeido. La cadena gí/cánica se representa con círculosblancos. La cadena peptidica se representa con circules punteados. Los grupos que intervienen enlos enlaces interpeptidicos se indican con circulos negros A. grupo «-carboxilo de la D-akaninacerminal; L, grupo e-amino de la cadena nepal de la L-/isina; C, grupo o-carooxilo del ácido D-giutánlico.Los paneles /3 y C están tomados de Barnickel y cok. (/983).
e
Cadena glicánice
Cadeno peplidico
NflaOOtJcOOt.
El tipo más frecuente es el 1, en donde la o-alaruina terminal forma un enlace coya/ente
directo con -1 ác/do meso.diaminopíméiico. Este tipo se encuentra probablemente en todas la.s
bacterias Gram-regativas, tasi corro en los procariotas más evo/ucionados como mixobactenas y
cianobactersas (Júrgens y Wecknesser. 1985),
La estructura tridimensional del peptidoglicano aún se encuentra lejos de estar b/en
definida. El modelo propuesto por Weidel y Pelzer (1964). que considera al peptidoglicano corno
una macromolécula que envuelve completamente a la célula es esenc/almente válido, aunque hay
que desechar la idea de que el peptidog/icano se organice en enormes cadenas conectadas entre
sí. De hecho, las cadenas glicán/cas y las unidades peptíd/cas presentan muchos grupos terminales.
calculárdcase que la longitud rneda de las cadenas gí/cán/cas escila en torne a los 35 d/sacándos
(Tipper. /969: Severidge, 1981; Glauner y Sc/swarz, 1983) lo que teniendo en cuenta las
dimensiones de /os aminoazúcares en la configurac/ón más extend/da del peptidog//caro
(Formanek, 1983). supone una longitud med/a aproximada de 35 mr.
Las cadenas peptíd/cas un/das a los residuos de NAMpresentan, como hemos visto, una
alternancia de am/noác/dos en forma t y o- Esta característica, y el en/ace peptídico en Ccon e]
ácido isoglutámico, confieren al peptidog//cano resistencia a proteasas a la vez que le permiten
adqu/nr una conformación hel/co/dal, con la alanina terminal próx/ma a la in/cial (figura IB>
pud/endo interacc/onar mediante enlaces de hidrogeno con la cadena gí/cán/ca (Barnickel y col,,..
/983), 1. cual adquiere una conforrisación como la que se representa en la figura 1 C. Para que la
mureina pueda empaquetarse de modo continuo y con enlaces entrecruzados, las cadenas
glicánica~ deben disponerse empaquetadas en paralelo y ligeramente rotadas unas con respecto a
otras (figura 2k) (Lab/schinski y cols., /985), En las bacterias Cram-positivas las capas de mureina
se disponen formando un hngulo de 600 con las capas adyacentes, lo que permite un niáxirno de
conexiones interpeptidicas, y la aparición de oligórneros peptíd/cos (figura 28). Según Formanek
(/983), una celda de la ma/la tridimensional del peptidogl/cano tendría las dimensiones que se
detallan en la figura 2C.
Según los modelos que se acaban de exponer, el peptidoglicaro cumpliría los dos requ/sitos
básicos de rigidez (debida a la cadena glicánica> y flex/bilidad (por las cadenas peptídicas>, cualidad
A) ____ Codencglic en ¡ ce
Codenepeplidice
8)
c)
Figura 2. Modelo de la estructura trid/mensional del peptidoglicano.Panel A. Disposic/ón paralela de las cadenas tic peptidoglicano en una capa de n,urefna, Lasregiones en las que se producen los enlaces cnjudos se señalan con una zona sombreada.Panel B. Representación esquemática de dos capas adyacentes de mureina.Los paneles Ay /3 están tomados de Labischinski y cols. (/985).Panel C. Representación esquemática de la mal/a tridimensional del peptidoglicano. Se detallan lasdimensiones de cada célula, definida por a un/dad disacárido-tetrapéptido. It Ácido N-acetilmurámico; N, N-acetilglucosamina. Tornado de Formanek (1983>.
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IÑnoDiacooN
esta última q¡ e permite /ncrementos de más del 200% en la distancia que separa a dos cadenas
gí/cánicas adyacentes. Aunque durante mucho tiempo se creyó que el peptidoglicano tenía una
estructura cnscalina similar a la que presenta la qurana, estud/os posteriores /nd/caron que la
estructura del peptadoglicarío puede calificarse más b/en como paracristaliraa, con poros que
permiten la interacción de proteínas de [apared, como las enzimas autolíticas. El agua representa
el 9296 del peso de la pared bacteriana, confiriéndole una densidad aproximada de 1,1 g/cm3 y
desempeñando por canto un papel fundamental en su estructura.
1.2. Los ácidos teicoicos
Los ác/dos te/co/co, son polimeros de glicerol fosfato o ribitol fosfato en los que los
monómeros correspondientes se unen a través de enlaces fosfodéster (Arn.scrong y cois..
/958>. Son sejetancias muy ant/gén/cas, y sólo se han encontrado hasta ahora en bacterias Gran>
positivas. La disposición de los ácidos teicoicos es la causa de la estructura trilamelar que la pared
presenta al microscopio electrón/co. con las caras externa e interna más Opacas que la porción
central,
Inicialmente se pensó que los ácidos teico/cos se unían covalentemente al peptIdogí/cano
mediante un enlace directo entre ci grupo fosfato terminal del ácido y el carbono 6 del residuo
de NAZI. Sin embargo, ha podido comprobarse que, en muchas especies bacterianas, existe un
compuesto intermedio, cuya identidad varía de unas especies a otras (Koiinsa y cols., 1985). En
cuanto a las funciones de los ác/dos seico/cos hay que señalar que forman parte de los receptores
de bacteriófagos e intervienen como moduladores de las enzimas auto/it/cas. Son, además, los
polianiones más importantes de la pared celular por su abundanc/a en grupos fosfato y le
confieren carga negativa neta. Los ác/dos te/co/cos internos forman quelatos con el magnesio y
con el/o contribuyen a la rigidez del peptidoglicano (Beveridge. /98/). Cuando los Ácidos
re/co/co, se unen cova/enremente a un glcolíp/do de membrana, rec/ben el nombre de ácidos
lípote/coicos (LTA>. Estos se intercalan dentro de la matriz de la pared, cumpl/endo una función
muy importante en la regulación de las actividades auto/it/cas en varios sistemas (H6ltj. y
lomasa, 975a; Horne y Tomasa, /985; Físcher. /988). Cuando los ácidos lipoteico/cos
8,NtRooucooN
atraviesan todo el espesor de la pared celular y son accesibles desde el exterior se comportan
como importantes determ/nantes antigénicos.
¡.3. La pared celular de Streptococcus pneumenioe
El espesor de la pared de 5. pneumonioe (neumococo) o~i/a alrededor de los 1 S nm,
equivalente aunas8 capas de pepodoglicano de 2 nm de espesor cada una (Tomasz, /98/). La
estructura del componente peptidico del peptidoglicano de S. pneumoniae ha podido ser
estudiada recientemente por García-Bustos y cols. (1987. 1990). gracias al empleo de
cromatografía líquida de alta presión (figura 3A), De acuerdo con estos autores,
aproximadamente el 40% de los residuos de 1/sima forma parte de enlaces cruzados entre
unidades peptid/cas, El principal páptido monomérico es el tripéptido (t-Ala-o-iGln-c-Lys) en lugar
de un tetrapéptido. lo que puede indicar la presencia de o,o y o.L.carboxipeptidasas. Ex/sten
además dos tipos de puentes interpeptidicos: el más abundante es un puente cruzado L.Ala.t-Ser
entre la o-Ala en posición 4 de la un/dad peptíd/ca donadora y la c-Lys de la posición 3 de la
aceptora; el segundo tipo de puente es un enlace directo entre estos dos aminoácidos o-Ala(4) y
L-Lys<3) - Además de estos aminoácidos, tambien se han encontrado, aunque en proporción
minoritaria. Gly y Mp. los cuales se supone que lorman parte de ¡os puentes interpeptídícos
(Fischer y Tomasz. 1985),
En cuanto a los ác/dos te/coicos. también denom/nados en S. póeumon/ae polisacárido C,
representan el 40.S0% del peso seco de la pared. La disposición espacial de los ácidos teicoicos
no se conoce todavía, aunque hay evidencia de que un porcentaje de ellos se local/za en la cara
externa dei. pared celular, por experimentos de reacción con antisueros ariti-po/isacáñdo C. La
figura 3A representa esquemáticamente la estructura qumka de la pared celular de neumococo.
Se estima que debe existir, por término medio, una cadena de ácido te/co/co por cada un/dad de
tetradisacár/do tetrapéptido (García-Bustos y Tomasa. /987).
5. pneunton/oe posee un requenmiento nutricional absoluto por el aminoalcohol colina, de
tal manen que la elim/nación de este compuesto del medio de cultivo provoca la detención de la
multipl/cación celular (Toman. /961). Esta dependencia condujo al descubrimento de que los
AIsicoico 45 ow.a
Rl~tol.ittoico PCot 1 1¡6
O.socdrido— P—1GP), &.U-DATG—NAGM-4/ACN 1 -
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L Taitoico 45 porod
FIgura 3. Modelo de la estructura de la pared celular des. pnannon/oe.Panel A. Las cadenas ¡1/cAn/cas se representan con las letras G-M. que indican los res/duosa/terrantes de tJ-acetilglucosamina (G) y ácido N-acetilnnsrám/co (M). Los aminoácidos de lascadenas peptid/cas se representan en código de tres letras según se indica en la Figura 1 A. e.s/gnifica que e/enlace peptid/co se realiza con el grupo e-amino de la L-llsina. El ácido te/co/co depared se sinsbol/za con un rectángulo: las abreviaturas utilindas son 1’. grvpo fosfato; GP.¡1/cero/fosfato (ex/sten dos o tres moléculas por cada molécula de ácido te/co/co); GLU. glucosa;DATG. dlacetamldoeridesox/¡alaceosa; NAGM. N-aceeftalactosamlna; PCOL, fosforlícolina;MT-PO ribitolfosfato. Se estima que hay, por término medio, fi moléculas de PCOL en cadamolécula de ácido te/co/co. Los números 1 y 6 represenran las posiciones de los átomos decarbono que participan en los enlaces que se indican. Los enlaces sensibles a la acción de lasenz/mas que hidrolizan la pared celular de neumococo se muestran con triángulos negros(sensibles a las amldasas). con triángulos blancos (sensibles a las vnuram/dasas o lisozimas>, y conflechas en zig-zag (sensibles a las glucosamin/dasas>
eo)
AMIOASA flb)
o)
MuRAMiOASA ~R
(LiSOZiMA)
-NAG-NAM-NAG—NAM-NAG-
NAO -NAM
NAO HNAÑ
NAO- ÑAM—NAG- NAM
NAO—NAN4 NAG-NAM-Nt¿3-flAM
Figura 3. (continuación)Panel E. Productos de degradación de la pared celular de neumococo cuando ésta se digiere conuna am/dasa (flecha negra) o con una muramidasa (flecha blanca). Los simbolos se correspondencon los detallados en el panel A, Las cadenas peptidicas se representan con trazos verticales y losreae~re! ln,erneorídicos ce’n tratos o5
0,cutas Tornado de Torrasz <1981
NnooJcoo,.
ác/dos te/co os de la pared celular de neumococo contenían col/na en forma de fos<orilcoiina er¡
su compos/cón. Se ha propuesto <jenn/ngs y cois.. 980) que los ác/dos te/coicos de
pneumoniae están compuestos de un/dades repetidas de glucosa-tr/desoxdaminohexosa-tJ.-
acet/lgalactosam/na-galactosamina-ribitol fosfato. Los residuos de fosforilcol/na st encontrarían
situados en la posición 0(6) de los residuos no acedados de galactosamina y las unidades
repetidas se un/rían a través de un enlace <osfoéster entre el rib/tol y el ácido murámIco (figura
3A) - El 85% de la colina presente en la célula se encuentra formando parte del ác/do te/co/co
(Brundisb y Badd/ley. 1968; Moaser y Tomas.. 1970), estimándose que hay, por término medio,
8 un/dades repetidas de fosforUcolina por cada molécula de ác/do te/co/co (Garcia.Bustos -r
Tomas.. /987). LI 15% de la colina total se encuentra en el ácido 1/pote/co/co o antígeno de
Forssznan (Briles y Tornas.. /973).
El requerimiento nutricional de S. pneumonioe por la colina puede satisfacerse mediante el
empleo de análogos estructurales tales como la etano/amIr-sa (EA). la H.mnetiletanolamina y la
N.ti]-¿metiletanolam/na <Batiger, 1944; Tomas., 968>. S/n embargo, neumococo es incapaz de
llevar a cabo la medIación de la etanolan,ina en los ácidos te/co/co, cuando se cultiva en un medio
que contiene este compuesto en lugar de colina (Tomas.. 968>; la sustitución de la colina por
EA en la pared celular- origina profundas alteraciones fisiológicas, u/es como la no separación de
las células hi1as al f/nal de la dlv/s/.bn celular (prs~iiuc/éndose un encadenamiento aimitado). la
resistencia a la lisis por detergentes y la no Infección por fagos, etc- - -
Todas las anomalías fisiológicas menc/onadas anteriormente pueden revertir fácilmente con
la adición de colina al medio de cultivo en un momento en el que las células permitan la
/ncorporac/ón de este aminoalcohod a las un/dades niclentes de ácido te/co/co, tras lo cual la
pared celular vuelve a ser un sustraco reconoc/do por las autolis/nas y permite tamb/én el proceso
de adsorción <ática.
A la hora de explicar estas alteraciones es prec/so señalar que la incorporación de
etano/amina a los ácidos te/co/cos en lugar de col/na no produce cambio, significativos en la
forma y composición qulmica de la pared de neumococo, puesto que los productos de
degradación producidos tras la digestión de estas paredes con la murana/dasa del hongo Choloro
Iti-rrRooiJcoow
(= Cboiorops/s) son los m/smos tanto en el caso de que la pared contenga colina o etano/amina er’
su compos/ción (Hólt¡e y Tomasz, 1 97Sb). Sin embargo, las paredes que contienen EA son
resistentes a la degradac/ón por las enzimas autolítícas de neumococo; la sensib/l/dad a la
degradación puede ser restaurada tras metilación de los residuos de EA por yoduro de metilo,
que los transforma en res/duos de colina (HÓltje y Tomasa. 1975b>. Las células cuya pared
contiene EA poseen una enz/ma autolítica denominada LYTA. en una conformación que posee
una actividad muy reducida (forma E) pero que puede activar,e (convertirsC) a la forma
catalíticamente activa (forma q tras preIncubación de la misma a beta temperatura con paredes
que contienen colina (Tomasa y Westphal, /971>,
‘3INrsoDucooN
2. ENZIMAS QUE DEGRADAN EL PEPTIDOGLICANO
2.>. Autoilslna. bacterianas
Las enzimas autoliticas o autofis/nas son enzimas sintetizadas por la propia bacteria que son
capaces de hidrolizar el peptidogilcano de la pared y de produc/r eventualmente la lisis bacteriana
(de ahí que durante algún tiempo se les llamase tan,b/Én si~ic/dasas”). Estas enzimas están
presentes tanto en bacterias Gran,-positlvas tomo en Gram-negauvas, aunque también se han
descrito en hongos y levaduras.
Ex/sten cuatro tipos bioquirnicamente d/ferenc/ables de enzimas auto/it/cas, que pueden
clasificarse en:
i) Muramidasas (enzimas tipo lisozama). que hidr-oflzan el enlace 8-1.4 entre el ácido N-
acetilmurán-,ico y la Ñ.acetilgiucosamina. liberando grupos reductores de ácido N-acetilmurám/cc-
(figura 38).
(1 B-N-acetilglucosamin/dasas (glucosamin/dasas). que l/beran grupos reductores de N-
acetilglucOsamina.
iii> fl-acedlmuransll-t.alaMJ amidasas (am/dazas> que h/drolizan el sniace am/da entre la
cadena gilcánoca y el péptido (figura 38>.
iv) Peptidasas. que pueden hidrol/zar alguno de los péptidos principales y los puentes
/nterpeptidicos. siempre que éstos tengan lugar entre la D-alan/na terminal y el grupo amino de
una cadena pept¿d/ca contigua,
Un qu/nto grupo de actividad enzimática puede ser el representado por las transglicos/dasas.
las cuales liberan grupos no reductores de ácido N-acet/lmurámico.aunque no se conoce todavía
con certeza s’ funcionan como autol/sinas in viso (Goo-delI y Schwaru, 1985). Asimismo, las o-
alan/l-cartsoxipeptidasas, que rompen por el extremo C-terminal de los residuos O-alan//o del
14INT*ooucooN
peptidoglicano y que normalmente están presentes en varios organismos, no actúan como
autol/5/nas.
El hecho de que las autolisinas bacterianas se presenten en una gran variedad de especies
hace pensar que deben desempeñar funciones de gran importancia, aunque éstas son difíciles de
estudiar puesto que estas enzimas no se purif/can fácilmente, se s/ntetizan en muy pequeña
cantidad, y en la mayoría de las bacter/as existe más de una autol/sina, lo que dificulta la asignac/ón
de prop/edades específicas a cada una de e/las. Sin embargo, parece demostrada su importancia en
procesos cales como la separación de las células hi/as al final de la división celular y la l/beración
de la descendencia fág/ca jMcDonnell y cols.. /975).
2.2. Enzimas líticas de bacteriófagos
Tras la infección fáglca de una bacteria, y posterior repilcaclón de su DNA, se hace
necesaria la lisis de la pared bacteriana para la liberación de su descendencia. Con mucha
frecuenc/a este proceso se lleva a cabo por enzimas it/cas de pared codificadas por el propio
fago. Se han descrito muchas enzimas líticas asociadas a fagos. pero sólo algunas han sido
estudiadas en detalle.
2.2.1 - EnzImas líticas de facos que infectan a bacterias Gram-neeativas
Los fagos de la familia ide E. coli cod/fican, en su mayoría, enzimas líticas que han sido b/en
estudiadas. El bacteriófago 14 es el único caso conoc/do de fago que lleva asociadas a la partícula
fágíca dos lisozirnas (Sze-tvczyk y cols.. 986). El bacteriófago 12 produce una lisozima cuya
secuencia sólo se diferencia en 33 aminoác/dos de una de las de 14 (Inouye y Isugita. 1968>. La
enzima lítica del fago 17 es una amidasa </nouye y cols., ~ y las de los fagos 13 y 15 podrían
tener activ/dades lít/cas similares (De Mart/ni y cols., 1 ~ Algunas de estas enzimas, como la
am/dan de 17, no se requieren para la lisis de la célula huésped, por lo que sus func/ones reales se
encuentran todavía en estudio. Una de las lisozimas del fago 14 ha sido cristalizada y su
estructura determinada a partir de espectros de difracción de rayos X. como se verá más
adelante.
/5IN,-sooo.icooUS
Con respecto al fago lambda existen dos genes, S y R. /naplicados en la l/sis celular (Garret y
cok., 1990). El gen R cod/fica para una transgllcosilasa específ/ca del peptidoglácano de L. coe.
aunque a lis/s celular no tiene lugar en ausencia de la proteína 5. Esta últ/ma ha sido implicada en
procesos de interacción con la membrana plasmática (8/15/ y cols.. 1989),
En el caso de otros bacteriófagos como ~X 174 y MU. la liberación de la progen/e fág/ca al
final del ciclo lítico depende de las autol/sinas de E. coL Tras la infecc/ón del fago ~>(í74. la lisis
celular depende, además de la producción de la proteina del fago, de otros parámetros tales
como la composición lip¿dica de la pared, la fuerza protón-motriz y la actividad del sistema
auto/loco (W/tte y Lub/tz, 989). Un importante aspecto de la proteina codificada por ~Xl74 es
que no posee actividad enzimática propia.
Por último. el bacteriófago PRDI, qt.e infecta a una gran var/edad de bacterias Gram.
negativas como E. colí y So/mondo ty$Éímurium, posee una Ilsozima asoc/ada que parece Ser única
entre las enz/mas it/cas fágicas, puesto que su estructura primana no tiene simil/tud con n/nguna
oua (PakuLa y coIs . /989>. Por sao parte, el fago PU de Solrrionello posee dos genes esencia/es
para la lisis de la pared celular bacteriana (Bouteir y cols.. 1 972>; una de ellas posee una gran
sim/litud de secuencia con la proteína 5 del lago lambda, mientras qo. la otra, cori activ/dad dio
lisozima, Locro. cierto parecido con la lisozima de 1-4,
22.2, Enz/mas líticas de bacteriófaros que infectan a bacterias Gram-qositivas
Los bactenófagos SF6 y ~29 de Aoci/lus subo/ls codifican para sendas lisoain,as que han sido
donadas y secuenciadas @erma, /986; Cjarvey y cols., 1987). La lisozima de ~29 presenta cierta
sim/litud con la lisoz/ma de PU y algo menos con la de 14. pero sus características estructurales
la hacen única entre las 1/sor/mas ~ágicas(Saedi y cois. - 1 ~ En la 1/sozama LysA - codif/cada pc-r
el fago mvi de toctobocilius bu¡goncus (Bo/zet y col,.. /990), se reúnen dos func/ones llesadas a
cabo en otros sistemas por proteínas diferentes, Así (apartado 2.4>. el extremo N.terminal de
esta proteína presenta gran similitud con la muramidasa del hongo (ho/oro, la del bactersófago
Cp-l de neumococo y la aurolisina des. globisporsn (Uchenstein y cols., 1990>. sutinendo que
esta parte de la molécula es la responsable de la actividad nuramidásaca Era cambio, el e>tren’.c
leiÑnoovcOoN
carboxi.termina/ es similar a la proteína S de lambda, con lo que podría estar implicado en
procesos de interacción con la membrana plasmática (Boizet y cols.. 1990). AsimIsmo, se ha
donado y expresado un gen responsable de la lisis de la pared de Loctococcus lodis contenido en
el genoma de~ fago LL-H (Trautwecter col, - 1986>. Además, se han descrito enzimas liticas
asociadas a fagos en el caso de estreptococos del grupo A (A-PAL del fago A25> (Wheeler y
cols.. /980> y estreptococos del grupo C (C-PAL del fago Cl) (H/ll y Wannan,aker. 198/), Estas
enzimas comparten muchas propiedades físico-químicas, aunque se diferenc/an en que la A-PAL
sólo se ha detectado en forma libre y nunca asociada a las partículas fágicas como es el caso de la
C-PAL (Fox y Wittner. /965>.
2.3. Las enzimas líticas deS. reur,on/oe y sus bacter/ófagos
En 5. pneumonioe se han descrito hasta la fecha dos enzimas auto/it/cas, una
aceti/muramil-t-a/anil amídasa (am/dan LYTA) (Howard y Cooder, 1974), que fue la primera que
se descubrió y que resultó ser mayoritaria en la célula, y una endo.13-/ ,4-tJ.aceti/g/iscosaminidasa
(Slnchez.Puelles y co/a., /986; García y cols., 1999). En cuanto a los bacteriófagos de 5.
pnesamon/ae se han podido caracterizar corno amídasas las enzimas líticas de los fagos Dp- 1. E)- 1 y
HB-3. y como muram/dasas las de los fagos Cp- 1. Cp-7 y Cp-9.
2.3,1 - La Orincipal autolisína de neumococo
La am/dasa LYTA fue purificada a homogeneidad electroforética por HÓ/tje y Iomasz
(1 975b>. quienes calcularon una Mr de 36.000. En 1 985. García y cOis. lograron donar y
expresar en E. col/e/gen IytA. que codifica para dicha enzima. Este resultado constituyó, además
de la primera donación y secuenciación del gen de una autolisina bacteriana, el primer caso de
expresión de un gen de neumococo en E cali, demostrándose que e/gen !ytA codificaba para una
proteína de 3/8 aminoácidos con una Mr de 36.532. La característica más relevante de esta
proteína es que su actividad catalítica requiere la presencia de residuos de colina en los ác/dos
secoicos de la pared de neumococo. Los residuos de colina actuarían como ligandos alostéricos
que permitirían la adsorc/& de las molÉculas de auto//tina a un suttrno irísoksble como es la
pared, pudiendo sisuarse entonces correctamente para llevar a cabo la catÉ/isis (Giud/celíl y
17flOOUCOON
Tomasz. 1 984a). Cuando se sustituye la col/na de la pared por su análogo estructural
et.nolamina. la amidasa LYTA es /ncapaz de hidrolIzar la pared, produciéndose una serie de
camb/os drásticos en la morfología de 5. tineumon/oe (ver apartado 1.3). Una explicación a este
hecho es que a am/dan no puede adsorberse a la pared celular, La medIación de los residuos de
etanolarnina senslb/liza la pared ala acción de la amnidasa Qiólt¡e y Toman. /975b). Cuando las
paredes de neumococo se solubil/zan mediante la acción enzimática de la muramidasa Ml de 5.
globssporus. la amida» LYrA es capaz de actuar sobre los muropéptidos resultantes tanto si
contienen coána o etno¿amina en los ácidos te/co/ces (García-Bustos y loman, 1987>, lo que
refuerza la hipótesis sobre el papel de la co/ina en los procesos de adsorción citados.
El aislamiento del mutante M3 1 de neumococo (Sánchez-Puelles y cok.. 1 986a). que
contiene una deleción comp/eta del gen ~tA, permitió asignar funciones específicas a la amida»
LYTA. El mutante 1131 crece a 370C en cadenas corcas y no se lisa en la <ase estacionaria de
cultivo ni en presencia de detergentes, al igual que las células con etano/amina en sil pared celular.
Además, este mutante exh/be una respuesta tolerante frente a los antibióticos /3-lactániicos,
confirmando la inaplicación de la am/da» en este fenómeno, Todas estas características revierten
cuando se logra c/onar y expresar en este mutante ci gen ¡vtA (Ronda y cols., /987>.
Recientemente se ha sugerido la existenci, de un sitio de alta afinidad por colina en la
amidasa LYTA (Marltiewicz y Tomas.. 1990). La colina unida a este sito non/ibera mediante
diálisis, preciptac/ón con ICA o con sulfato amán/co. o en el paso por columnas de filtración.
Sin embargo, esta un/ón no parece tener lugar mediante enlaces coya/entes, puesto que la colina
puede líberarse mediante electroforesis en geles de pol/acrilamida-SOS o por almacenamiento de
la proteiria a 0~’C. Tampocc. hay que descartar la existenc/a de otros sitios de -nás ba~a af/nidad
por este ligando.
2.3./ 1. El proceso de activación <con,ers/ón~
Como ya se d//o anteriormente, la amidasa LYTA se sintetiza en neumococo en una forma
de bela actividad enzimática (forma E) que re.~uiere un proceso de activación (convesión) para
alcanzar el estado de máxima activ/dad (forma q (tomas, y Westphal. /97/). Este proceso
/8í,aooucooN
consiste en una interacción específica de la amida» con los residuos de col/na. En la célula, la
colina utilizada para la conven/do es la que se encuentra en los ácidos telco/cos y 1/pote/co/tos de
la pared (friese y Hakenbeck. 1985>, Po.- esta rajón, la forma O se aísla de neumococos
crecidos normalmente en presencia de colina (conversión in vivo), m/entras que la forma E pura
puede alslarse de extractos de 5, ~neumon/oeIncubado en presencia de etanolam/na en lugar de
colina, Asim/smo, es también la forma E la que se sintetiza a partir del gen donado en E. cali, La
convúsMn puede real/zane h, vivo incubando a baja temperatura la forma E con paredes celulares
que contengan colina quedando asoc/ada la proteína a a pared (Toman y Westphal. 1971). Es
posible real/nr tamb/én la convenido con ácido lipoteico/co que contenga colina, o este m/smo
ligando libre o fosforilado en concentrac/ones alrededor de 150 mM (friese y Hakenbeck.
1985>. El proceso de reversión de la forma C a la forma E <deconwn/ón> sólo puede alcanzarse
después de una d/álisis continuad. (más de 20 días). lo que estaría de acuerdo con la hipótesis deja
ex/stencia de un sitio de muy alta afinidad por colina (Mark/eMa y Tomasz. 1 990).
211,2. lnhib/cion de la actividad catalítica de la amidasa LYTA
Las moléculas de colina libre en concentraciones superiores a 7 mM pueden interferir en el
proceso de adsorción de la amidasa a la pared compitiendo con los residuos de col/na de los
ácidos teicoicos. e Impidiendo de este modo la actividad catalítica sobre paredes celulares, Otros
inhibidores de este tipo son el LíA que contiene colina y la fosforilcol/na, Los compuestos
análogos que contienen etanolamina no e¡ercen ningún efecto inhibitorio, Al resultar /nhibida la
actividad enzimática. la adición de estos compuestos a las concentraciones apropladas puede
originar in vivo los mismos efectos fisiológicos que resultan de sustituir a colIna del med/o de
cultivo por etanolarnina (Hóltie y Tomasz. 1975.; G/udlcelli y Tomas,, 1 984a. b; friese y
Halcenbeck. 1983>.
Br/ese y Hackenbeck fI 98S> han observado que la forma E de la enzima está presente sólo
en el citoplasma, mientras que el resto se encuentra asociado a la membrana como forma C. En
células que contienen etanolam/na en sus ác/dos teico/cos de pared, no se encuentra enzima
transportada a través de la membrana, La enzima unida a membrana, como forma C. puede ser
liberada completamente con colina, sugiriendo que la amidasa está un/da a la membrana a través
19w4w00Jc00”
del LíA en lugar de ser una proce//sa integral de membrana. Esto se ve apoyado por la ausencia
de actividad amldás/ca en fricciones membranosas derivadas de neumococos incubados en
presencia de etanolamina. El LíA podría actuar entonces como barrera topológica lo wh.
2.3.2 Caracteristicas de la ulucosam/nidau de neumococo
La ausencia total de am/dasa LYTA en el mutante M3 1 de neumococo, que contiene una
deledón absoluta del gen 4tA. permitIó detectar una segunda autol/uina (Sánctiez-Pue/les y cok..
1 986 b) con actividad de glucosamínidasa (García y cok.. /989) que se encuentra normalmente
enmascarada por la auto//sima LNTA en las cepas salvajes. Esta enzima, de alrededor de 6-4 ltDa.
ha sido purificada a homogeneidad electro<orétlca. requiere la presencia a resiá,os de colina en
la pared celular y se inhibe con 1.1>. y colina. si bien no es reconocida por el antisuero frente a la
amidas. LYTA (García y cols.. 1 989). Su actividad se cripí/ca cuando se ensaya in vivo a 300C en
lugardea3ltiC. ydehecho,cuandoelmueaneeM3l sea aa300Chayautolisisaifinaidela
fase estacionaria y desaparece el encadenam/ento celular (Sánchez-Puelles cola., 1 986b>.
Además, las cadenas formadas por el mutante M31 incubado a 370C no son tan largas como las
formadas por la cepa salvale incubada en presencia de etanolamina en lugar de colina. Estos
hechos /ndicarían que la glucosamin/dasa poseería una cierta activIdad lítica importante a esa
temperatura.
2.3 3 Enzimas líticas de bacteriófasos oue infectan a 5 OnetiitiOoioe
La pnmera enzima lítica fáglca capaz de hidrolizar la pared celular de neumococo que fue
a/slada y purificada a homogeneidad electroforécica fue 1, codificada por e/fago Dp 1. y recibió el
nombre de PAL (Ptiage-Associated Lysin> (García y cols.. 1 983a). Esta enzima tiene una M~ de
aproximadamente 31.000 y se ha caracterizado como una t4-aceúlmuramil-t-alanil am/dasa
(García y cols., 984). Al /gual que la am/das. LYTA. para llevar cabo su acc/ón catalítica
requiere la presenc/a de residuos de colina en la pared y se Inhibe en presenc/a de LíA. Sin
embargo, a diferencia de aquéfla, su actividad /n ~&voe /n vitro se escimula por agentes reductores
como eí Qn o el fl-mercaptoetanol (García y cols., 1 983á, b, c>. además de inhibirse
parcialmente por cardiol/pina y no dar reacción inmunológica crinada con la forma E de la
20iÑflooucooi~
am/dasa L’fTA, aunque sí con la forma C <García y cols.. 1 ~ Por último, se ha demostrado
que esta enzima interviene activamente en la liberación de la descendencia fág/ca en vnusantes de
neumococo que carecen de am/dan LYTA. por lo que ambas enzimas participan en la l/berac/ón
de la progen/e fág/ca (García y cols.. 1 983b, cM
La siguiente enzima fágica con actividad sobre paredes de neumococo que se logró
caracterizar fue la murar/das. codificada por el bacteriófago C-l <CPLI). (García y co/a.,
198fl. Su peso mo/ecular se estiró en 39 ltDa. comparte con la LYTA La dependencia de cojina
en la pared y su actividad se inhibe asimismo con colina libre y LTA. aunque no reqtáere el
proceso de conversión para alcanzar la máx/ma activ/dad cacalítica. El gen cpu. que codificaba para
esta lisozima, fue donado y expresado en E. cal y se deternilnó la secuencia de nucleótidos del
gen, con lo que pudo deduc/rse la secuencía de aminoácidos de la proteína. De este análisis se
comprobó que esta muramldasa tendría 339 aminoácidos (M~ .39.146). Un estudio comparativo
con la amidasa de la célula huéssped reveló la homología existente entre la región 3 de este gen y
la reglón 3 del gen I~A deS. fr~eumonioe (García y cols., 1
Util/zando como sonda el gen cpU se procedió a la donación y secuenciaclón de los genes
cpu y cpl9 de los fagos Cp-7 y Cp—9. respectivamente (García y cols.. /990). U llsozima CPL9
sólo se diferencia de la CFI] en lb aminoácidos, S/n embargo, las mayores diferencias surgen de
la comparación de la lisozima CPU con la CPL 1. La l/sozins. CPL7 tiene una M~ de 38.461(342
am/noácidos> y su actividad catalítica no depende de la presencIa de residuos de col/na en la pared.
Esta importante caracteristica posibilita que el fago Cp-? pueda lisar y liberar la descendencia en
células de neumococo que posean etano/arma o colina en los ácidos te/cocos de pared, sin la
cooperac/ón de las autol/sinas bacterianas (García y cols., 1
La metodología empleada para la donación de los genes de las enzimas líticas de los fagas
Cp se utilizó también para donar el gen liól que codufica para la enzima lítica de pared del
bacteriófago 118-3 (N814, un fago atemperado de S. pneumonioe (Romero y cok.. 1990a>. La
enz/ma HBL es una amidasa, tiene una Mr de 36.000 y sus propiedades inmunológicas y
bioquímicas son muy sim/lares a las de la am/dasa LYTA (Romero y cok., 1990a). La secuendla de
21wjnoaucoon
aminoácidos de la asnidasa HIL. deducida de la secuencia de nucteót/dos del gen, confirtnó la
existencia de homología con el gen LTTA (Romero y cola.. l$lOb).
La construcción de genotecas de la cepa de 5. pneumoo/oe 101/87 permitió el aislamiento y
donación del gen ejl~ que mostraba similitud con el gen 4tA (Din. 1991>. Este gen codifica para la
enzima £JL, de 316 amInoácidos, que es una amidas. coáa,wtle 9 a Ii veces menos activa que la
amidas. LYTA. La enzima 91 está codificada por el fago lisoén.co 9-1 aunque es Inacerva en la
cepa 101/87 durante el c/clo lisogén/co (Díaz. 1991>. Ls secuenciación del gen ej permit/ó
comprobar la sim/litud de las secuencias de amInoácidos de la enzima EJL y la am/das. IXIA. S/n
embargo, la característica más importante que las diferenc/a es el hecho de que el proceso de
reecuperación del estado de bala actividad catalítica (daconwsi6n) por diálisis es notablemente
más ráp/do en el caso de la proteína Ejí,
2.4. Emb-uctura modulrd. las enzimas Sidas de Ltrsa¶bonioe y sus baceenófagos
Como hemos visto antenormenee. todas las enzimas líticas de neumococo y sus
bacteriófagos, a excepción de la lisozima del fago Cp-7. requieren la presencia de col/na en los
ácidos te/co/cos de pared para Nevar a cabo su actividad enzimátict Asimismo, todas estas
enzimas son capaces de producir el efecto denom/nado como curac/ón fenotípica por el cual.
cuando se aPiaden de forma exógena a cultivos de mutantes de 5. pneumoníoe deficientes en
am/dan [VTA (Lyr->, se obtiene como resultado la auto/Isis de los cultivos en la fase estacionaria
de crec/miento y la lisis /nduc/da por detergentes, procesos que no ocurren en ausencia de estas
enzimas, ta afinidad por colina que presenta la mayor<a de estas proteinas se ha aprovechado para
su purificac,ón en un sólo paso mediante cromatografí. de afin/dad en columnas de Sepharosa.
col/na (Br/ese y Hacltenbeck, 985>. Además, su actividad enzimáe/ca se InhIbe en presencia de
colina libre, como se ha demostrado en ensayos ir vivo e in vivo.
La comparación de las secuencias de aminoácidos de las enzimas lít/cas de neumococo y sus
bacteriófagos ha puesto de manifiesto una serie de peculiandades estructurales que hacen de
esas enzimas un niodelo muy interesante para establecer relaciones evolutivas entre ellas, y
constituye un nuevo cíemplo a fa-#or de la teoría modular de la evolución de las proteínas (García
22i,nooucoon
y cols.. 988; García y cok.. 1990), Como puede verse en la figura 5. el anális/s de sus
estructuras primarias revelan la existenc/a de dos posibles módulos funcionales en todas estas
proteínas. El módulo N-terminal sería el responsable de la actividad catalítica de estas entirnás.
puesto que se conserva con ligeras variac/ones en todas aquellas enzimas con la misma
especificidad enzimática, como las lisozimas CPL1 CPL7 y CPL9 por un lado, y las amidasas
LYTA, HBL3, EJLy LTTAIOI (Din. 1991> por otro. Además, otras enzimas heterólogas como
las usar/mas de Chalote (Pouche y Hash. 978>, ClosÚ/dium ocete&~tyiicum ATCC 824 (Crousc y
García. 1 99 1), 5. giobísponir (Lichenstein y cols, - 1 990>. y la del fago mv 1 de L. bulgoricus (Boizet
y cok.. 1991> tienen semejanza en su secuencia N-terminal con las lisorimas de los lagos Cp
(figura 4). Los dos am/noác/dos impl/cados en el mecan,tmo catalítico de la lisozima de Chalare se
conservan en la misma posic/ón y a la misma d/stancia en todas estas Ilsozimas.
En cuanto a la región C-terminal, se conserva en las enzimas depend/entes de colina, es
decir, en todas excepto en la lisozima del fago Cp-7. De los 142 residuos del dom/n/o C.terminal
de la am/dan LYTA, 73 son /dénticos a los del domin/o C-terminal de la lisoz/ma CPLI - y de las
69 sustituciones, 55 son camb/os conservativos (García y cols., 1988). Estos datos refuerzan la
h/pótesis según la cual es la región C-terminal la encargada del reconoc/m/ento de los residuos de
colina de la pared celular.
Una evidencia de que los módulos N- y C-terminales podrían constituir dominios
estructurales Independientes dentro de las enzimas líticas la constituyen los resultados obtenidos
cras la obtenc/ón de enzimas hibridas en las que se han intercambiado los distintos módulos entre
si (figura 5) <Din y cols.. 1990; Diaz y cols. /99/>. Como resultado, las proteínas quiméricas
resultantes adquieren las propiedades características de los módulos que las componen.
Un estud/o más profundo a n/vel de secuencía revela que todos los dom/n/os C.termina/es
con funcional/dad de unión a col/na están constituidos por motivos de secuencias repetidas con
gran simil/tud entre si en composición de aminoácidos, que se pueden considerar como unidades
modulares surgidas por dupl/cación gén/ca de una secuencia original <García y cols., 1988>. En el
caso de las enzimas LYTA. LYTAIOI, I-IBL3. F]L, CPLI y CPL9 existen 6 motivos de,
aproximadamente, 20 aminoácidos cada uno. Por comparación con los motivos de la am/dan
23NnOOucOO$
CPL VKRNDLFVDYS SMGYDITGILEQM~TDN’flLKI~ESflXLNPCLSAQVECAC MR~I ~SOL DTSGV0SIDYSMWQOSD4WSSVKSAGMSEAYLKAZI~TNYKDDRPSARYTalA TV~FD¿SSYQPSYNPAGAYSAGARFVIIEArEGTSr1I4PSFSSQYNMV1 TRT~y~VnyAVYQP~¿DLkAYHRA0ASfl1JZLUGVDYVNRRGPSfl?TAL M5~-zPmLRIbE~LRtKIflflrZg-YY’tIGIGHLLTR
FIGURA4. Comparación de las secuencias N.term/nales de dversas enzimas lltkas.Las enzimas mostradas son: CPL. lisozarna CPU; CAC. hsotrna de C. acetobutil3cum ATCC 824:$GL. lísozima de S. giob/sparos; CHA. Isozima de Chofra MVI, lisozin~a del fago mv 5 de 1.bu¡goñcus; T41. horma del fago T4 de L col. En ciniva y subrayado se señalan los aminoácidosmás conservados en las secuencias de las proteínas. En negrita se muestran los aminoácidos quehan sido implicados en el centro activo de cada una de las enzimas.
íÑfloOucooN
Ser o Tipo de
ocliv idcd
omitiese
especie
lytA
cha/aroSp.
~~I-]
CDI -9
cpl 7
li~j
¡ca
cli
¡c7
c17
mu ram di,so
mu ram/daso
mu, amidasa
mufamidasa
omitiese
om¡dc sc
macni idoso
orn/doto
muramidasa
Dependencia decolina
para activ/dad
Si
lA/mero de anrio¿cidoMr 0 30 00 50 200 250 300 350
36,4 NI-i2
No 22,4
Si 39,1
Si 39,1
No 36,5
Si 36,4
Si 36)
Si 39,3
No 35,4
Si 39,3
-000$•1 Para,, PS
000$
NI-12 - ~ 000$Pr pip%P4p~p«
NH2 ~c..<-e-.’ 000$ 1PI P2P3P PS eS
N82 0008Mi M2 MS
-000$PI PZPSF4PSPS
Nh{1 -<i-... -,. 0008
NH¿ <- -~ -Ir- 000$Pi P~P3P4P3PS
NI-12 0008Mi M2 MS
NR¿ - - 0008Pi P2P3PPSPS
FIGURA 5. Comparación de las propiedades más relevantes y representación esquemática delas enzimas líticas de neumococo y sus bacteriófagos, además de la lisozima de Chalaco.Las zonas de igual sombreado /ndican un alto grado de similitud, Pl a P6. Pl’ a P6 y Ml a M3representan las secuencias repetidas (motivos) de los dominios C-,erm/na/es de las enzimas,
25
[VTA y la hibozima CPU se obtuvo la secuencia consenso GWWIGDGWYYFDNSGAtIATN
(García y cok. 1988). Sin embargo, el módulo C-terniinal de la lIsos/ma CPU está constituido
por 2.8 motivos de 48 aminoácidos cada uno, diferentes de los arrta descritos pero /dénticos
entre si (García y cok.. 5990). lo cual revelada, de acuerdo con Doolitde (1986) que, para este
caso concreto, el proceso de duplicación gén/ca habría tenIdo lugar rec/entemente en tériNnos
evolutivos. Sólo en alpinos casos ha poddo demostrarse experimentalmente la relación entre la
exntencia de motivos repetidos y la función que desempelia la proteina que los contiene, como
ocurre por ejemplo con las proteínas que se unen al DNA <Klug y Rhode., 1987). La razón po la
que los dominios C-ternnales de las enzimas líticas de la pared de neumococo se han originado
por repetición de motivos se desconoce, ataque se puede especular con la posibilIdad de que
estas repeticiones están en relación con el hecho de que las enzimas están actuando sobrs un
sustrato polin,érico constituido también por estnhcnns químicas repetidas (Say col... 1987).
En la actualidad se conocen otras proteínas que tambiÉn actúan sobre sustratos polirnéricos y que
contienen repeticiones en las regiones Implicadas en el reconocimiento del sustraco- Entre ellas
destacan: la lisonma del fago .29 que infecta a A. su/ni». (Caney y col... 986), la endoglucanasa
E de C thwmocdum (Hal y cok., 1988). un celoSas. (Avacelasa 1) de C swcoMrum «aun. y cois..
/990), las glucosiltraoslerasas deS. mt’Wns (Sh/rozs y cols., 1987; Ueda y cols.. 1987) y des.
downe/ (Ferred y col.., 1 987; Gilmore y col,., 1 990>, y una proteína de un/ón a glucanos de 5.
mueons <Ranas y cols.. 1990>. También se han descrito toxinas de C- difficile capaces de
reconocer pequeñas estiuctras polin~érlcas que presentan módulos repetidos en su molécula
(Dove y cok., 1990; Banoso y cols.. 1990>.
26iflnooticooN
3. LAS USOZIMAS
Las lIsos/mas (EC 3,2.1 - Ii) se definen como 1 .4-8-N.acetilmufam/dasas. es dec/r, enzimas
que son capaces de hidrol/zar el enlace entre el carbono 1 del ácido t4acetilmurám/co y el
carbono 4 de la N-acetilglucosani/na del peptidoglkano bacteriano. Las Ilsozimas son enzimas
presentes en muy tversas especies, e históricamente han presentado un interés especial: la
l/sozin~a de ciar, de huevo (I-ffWL> fue la primer. proteína que fue secuenciada y que tenía los
veinte aminoác/dos usuales, además de ser también la primera de la que se obtuvo un análisis
cristalográfico completo y de la que se propino un mecanisnio de reacción detallado. Puesto que
además se conocen las secuencias de aminoácidos de una gran variedad de estas enzimas, las
lisozimas constituyen un sistema modelo desde los puntos de vista estructural, funcional y
evolutivo.
3.1. Tipos de lisoainia,
De acuerdo con Jo/lés y Jollés </984). las lisozimas se pueden das/ficar en los siguientes
tipos:
1.. Lisozimos tipo c (cb/cken-typÉ). Aunque /as 1/sozimas más representativas de este tipo
se encuentran en la clara de huevo de ciertas aves <pollo, pato) aquí también se pueden englobar
las lisozimas de leche humana, de rata, etc-. - Todas ellas poseen alrededor de 130 aminoácIdos
(M~l4.000), con cuatro puentes disulfuro. Además, los dos aminoácidos ácidos supuestamente
impl/cados en ti mecanismo catalítico de la lisoz/ma HEWL (Glu-35 y Asp.52) se conservan en
todas las enzimas de esta clase en posiciones similaret Poseen una c/erta activ/dad de qultinasa, lo
que posibilita la h/drólisis de po/imeros compuestos ún/camente de NAC.
2.- Lisozirnos tipo g (goose-type9. Esta clase de lisos/mas tienen unos 185 am/noác/dos
(M>.~2l .000>. y no dan reacción inmunológica cruzada con las de tipo c. Tanib/én poseen cuatro
puentes disulfuro. y se ha postulado, en base a estudios de homología de secuencia apoyados en
datos cristalográficos, que los am/noácidos Giu-73 y Asp-86 podrían corresponder a los Glu-33 y
Asp-52 de la HEWL.
27
3.. Lkoñnms de bocwMfo go.. El ejemplo más representativo lo constituye la lisozima
codificada por el bacteriófago T4 (T41). Esa hozima tiene 164 aminoácidos (Mr 18.700) y SAS
seojencia no es homóloga con las a las enzimas de tipo e: Se ha descrito la posib/l/dad de que los
aminoácidos Glo-l 1 y Asp-20 podrían cumplfr las funciones de los correspondientes Glu-3S y
Asp-S2 de la HEWL. Existen otras lisos/mas de fagos que no entrarian dentro de esta
clas/f/cación.
4,- lJsozinaos de hoctwias y hongos. La enzima lítica producIda por el hongo Choloro
O/sos/ma Ch>. además de ser ‘ma mwamldasa. posee actividad de 6-1 .4-N.{6-O-
iáacetil)muramldasa. por lo que es capuz de hidrolizar las paredes de 5. aore,s. Su secuencia y
tamafio (A4=21400) difieren del resto de lisos/mas conocidas aunque, de mnodo s/n,Iar a éstas,
también se ha postulado la existencia de dos ané,oácidos ácidos en el centro acdvo (Asp-6 y Ch.-
33) (Fouche y Hasl~, 1978>. Las lisozimas deS. glob/sporus (Uchenstein y cols.. 1990) yde C.
acew&nykun (Croux y García. (fi). la entino Utica codificada por el bacteriófago mvi de L.
bulgoricus (So/att y cok., 1990) y las enzimas codificadas por los bactersófagos Cp- 1 (García y
ca.. 1987) y Cp-7 (<Sard, y cok.. 1990) de 5, poeomonioe. por homología de secuencla,
también pueden índu/rse en este apartado.
3.2 M.anlsnso de acdón de la. lIsos/ns..
La criscahsción de cocn$ejos de la Esos/ma HEWL con oligosacáridos análogos de
sustrato. especialmente con tr/-H-acetilgjucosanu/na <tsiklAG). posibélitó en los años 60 el primer
estudio exhaustivo de la estructura de una enzima mediante técn/cas de difracción de rayos X
(DE<), Dicho estudio sentó las bases para una elaboración posterior de un modelo de
rnecanas.no de reacción, propuesto por Blake y cok, en 1967, Según este estudio, la lisozima es
tina proeína estructurada en dos domin/os atravesada en su superf/c/e por una hendidura que
acomode a la cadena de peptidoglicano. Esta cavidad tendría seis sitios para la unión del sisstrato
<denominados de A a Fy. en cada uno de los cuales se s/tuaría una un/dad de azúcar. El trímero
anteriormente citado de N-acetiiglucosamina forma seguramente un compie1o enzima/stistrato
no productivo a las concentraciones utilizadas para la formación de cnstales. puesto que la
h/dról/sis de este compuesto tiene lugar muy lentamente en estas condiciones. Del análisis de este
28~owcoow
complejo se deduce que son ocupados los sitios A. 8 y C. donde los residuos de azúcar
establecen varIos enlaces de hidrógeno con los am/noácidos que componen la cavidad. Un teórico
cuarto res/duo de MAC sólo podría acomodarse en el sitio O admitiendo una distorsión de la
conformación “en silla’ habitual hacia una conformación en “media silla” en la cual el carbono 6
se encontraría en posic/ón ax/al. Los sitios E y E podrían acomodar residuos de MAC sin mayor
dificultad.
El estudio detallado de la geometría de los subsitos de un/ón del sustrato Indica corno ún/ca
posibilidad el acoplamiento de los residuos de NA$ en los sitios 8, 0 y F. en donde no ttistitia
impedimento estérico a la hora de acomodar las cadenas relativamente voluminosas de ácido
láctico. Puesto que la lisozima es una muransidasa. la hidrólisis debe proceder entre los sitios 8 y
C. o bien entre D y E. Esta hipótesis se vio reforzada por los experimentos de Rupley y cola.
<1967) en los que se mostraba que la lisozima hidrolizaba hexámeros de NAC rindiendo como
productos un tetrámero y un dímero, La hidrólisis entre O y E parece mucho más probable según
el análisis del entorno am/noacíd/co. mucho más reactivo que en el primer caso.
Una característica muy importante de la zona que circunda los sitios O y E. donde se
ubicaría el enlace glicosídico susceptible de hidrólisis, es la presencia de dos am/noácidos ácidos, el
Glu.35 y el Asp-52. La cadena lateral del Clu-IS se encuentra cts un entorno predom/nantemente
apolar. lo que favorecería su protonación /ncluso a pi”is superiores al pKa teórico del gnipo -
cart,ox/Io de este residuo. Por su parte, el Asp-52 permanece en un entoriso polar, tendiendo a
mantener su grupo carboxIlo /onizado. Los experimentos de titulacion realizados por Parsoris y
Raftery (/971). seguidos de otros realizados con técnicas más precisas, sugieren unos valores de
pKa de aprox/madamente 4,5 para el Asp-52 y de 6 para el Glu-35. lo que confirmaría la
h/pótesis sobre el estado de ionizac/ón de estos grupos al pH óptimo de actuac/ón de la enzima.
como se verá más adelante,
TenIendo en cuenta estos datos. Blake y col, (1 967) postularon el siguiente mecan/smo de
reacción <figura 6):
29
O
Asp 5= ~%eO RESIDUO O
n FIrt ‘~‘H
RESIDUO E x0.—.A Gb 35
o,
2
Asp5Z
--4
cv-e
Y’O O
e.
FIoo—liO, GIl> 35
oY’- -¿‘eY’-0
FI 0FI2014 ~
o
O FI
Glu 354’o
iNflOOiXOO~
3
C4sp52
FIGURA 6. Mecanismo de reacc/ón propuesto para la HEWL
30no~co-
1 Una vez unido el sustrato, el Gu’33 podria actuar como un catalizador ác/do-base
general, ced/endo el protón de su grupo carboxilo al oxígeno 4 del residuo de NAC situado en el
subsitio E. De este modo, se crearla una carga positiva sobre el carbono 1 del NAM situado en el
subsitio O,
2. Este carbocatión incermedlo podría escabilizarse en cierto modo por: a> deslocallzac/ón
de carga con el oxigeno 5 del anillo. fadiltada por la distorsión de éste creada tras la un/ón al
subsitio D. como ya se habla mencionado <de modo que la un/ón del sustrato. por si misma.
contribuye fundamentalmente al proceso catalítico) y b) cercania del Asp-52 cargado
negativamente que actuaría como contralón. De este modo, la energía de activac/ón par, la
forniación de este complejo intermedio quedaría rebajada sustancialmente.
3.- 6/ último paso de la reacción lo llevaría a cabo una molécula de agua, reaccionando con
el carbocatión y cediendo un protón que acabaría recuperando el Glu-35.
LI. Papel biológIco de las lisouimas
Las lisozimas son enzimas presentes en una gran variedad de organismos desde los
bacteriófagos hasta los man,iferos superiores. Sin embaro, el papel bÉoló0co de 1., Ilsozirnas aún
no se conoce b/en, a pesar de la multitud de estud/os que se han realizado de estas proteínas
Solamente parece clara la f’mcióó de defensa del organismo contra la infección bacteriana, las
lisos/mas en /nvertebrados pueden servir quizá como un sistema rudimentario de protecc/ón,
puesto que estos organismos no producen inmunoglobulinas (Schind/er y col,., 1977), Las
lisosimas de algunas plantas como la papaya actúan principalmente como qultinasas. posiblemente
deb/do a que estas planeas crecen en lugares propensos al crecimiento de hongos, muchos de los
cuales poseen quitina en sus paredes celulares (Schindler y cols.. 1977>.
Las lisos/mas ex/sten en altas concentraciones en la clan de huevo de varias aves (lisozimas
y g). Aunque estos organismos poseen sistemas /nmunológicos. el huevo y el embrión no
producen /nrnunoglobul/nas hasta 7 días antes de la eclosi6n. por lo que es posible que .1 papel de
31
estas lisozimas sea la protección contra la infecc/ón bacteriana hasta que el embrión pueda hacer
uso de su sistema inmunoló/co.
La función que pueden desempeñar las lisouimas en los vertebrados superiores no está
dan- La lisozima y las inmunogiobulinas muestran una atribución similar en varIos fl,Mos
corporales. El papel de la lisoz/ma como agente antibacteriano puede estar relacionado
dírectamente con su acción bacteriolítica. AsE, la fagocitosis llevada a cabo por los macrófagos
afreolares de rau sólo puede realizarse contra bacterias cuya pared ha sido previamente
degradada con lisozima <Bizgar y Sturgess, 1977). S/n embargo, parece ser que es necesarsa una
interrelac/ón con otros componentes para alcanzar la máxima efectividad en los mecanIsmos de
defensa <Adinolfi. 1981).
32
iNnooucoo.i
4. OBJETIVOS
El gen cpU. que codufica para la lisozima CPLI, fue donado y expresado en E. <oS gradas al
trabajo de García y cols. en 1987, Aunque algunos datos bioquímicos de la lisozima se obtuv/eron
en el trabalo original, las peculiares características de esta enzima y el hecho de que fuer, una
lisozima la convertían en un atractivo cand/dato para un estud/o estructural, funcional y evolutivo
más exhaustivo. Para ello se precisaba poner a punto un sistema que permitiera una alta
producción de proteína, así como un método de purificación rápido que no adolec/era de los
/nconvenientes del procedimiento que utiliza la Sepharosa”colina. como son su duficil
regenerabil/dad y su alto coste.
La Ilsozima CPU es una enzima que requiere la presencia de colina en la pared celular de
neumococo para llevar a cabo /a hidról/sis de ésta. Dada la importancia de la interacción con este
ligando nos propusimos obtener la mayor cantidad posible de datos para su caracterizac/ón.
La comparac/ón de las secuencias de aminoácidos de la lisozima CPL1 y de la amida» LYTA
sugiere la estructuración de estas enzimas líticas en dos domInios o módulos, el N-term/nal
responsable de la especificidad enzimáoca y el C.terminal encargado del proceso de
reconocimiento de los residuos de colina de la pared (García y cols., /988). El estudio de los
dominios por separado permitiría no sólo la asignac/ón de funciones a los dominios sino también
la aportación de pruebas de la conservación de d/chas funciones con independencia de la
existencia del otro domin/o,
La comparación de las secuencias de las regiones N.tern~/nales de las lisozimas CMI. CPU
y CPU con la región N’terminal de la lisoz/ma de Cholo,, (García y cols,. 1988; García y cols..
1990) mostró la conservación en posiciones sim/lares dedos aminoácidos, Asp-9 y Glu-36, que
se ha sugerido que están implicados en el centro activo de esta última enzima (Fouche y Has>.,
1978). Por ello nos propusimos estud/ar la implicación de estos residuos en el mecan/smo
catalítico de la lisozima CPL/ -
33iNTtOOtJCOON
La construcc/ón de proteínas de tusón constituye una de las técnicas más versátiles para la
inmovilización y/o purificac/ón de proteínas, la afinidad del dominio C-rern,inal de las murein
hidrolasas de neumococo por el aminoalcohol col/na le convierte en un candidato para su
util/zación en la construcción de proteínas de fusión de interés biotecnológico que pud/eran
punficarse aprovechando la /nteracción específica del dominio por su l/gando.
Por todo ello, los objetivos de esta Tesis son /os siguientes:
1) Puesta a punto de unmétodo de obtmndón de Ilsozinsa CPLI.
i) Construcción de un sistema que posibilite la alta producción de enzima.
I/) Puesta a punto de un nuevo proceso de orificación.
II> Caracterización de la interacción de la lisozíma CPLI con colina.
Estudos de la Interacción con anáiogos estructurales de co/ina
II> Estudio de los cambios conformac/onales inducidos por el ligando
III) Estudio de la ntruccur.cfM, endominios de la lísazíma CPU.
Obtención mediante Ingeniería Genérica de os dominios $1- y C-rermina/es.
u) Asignación de funciones a estos dom/n/os.
iii) Estudio de la conformación de los dominios en la lisozirna CPLI.
IV) Obtención de datos sobre el mecanismo de reacción enzimática.
Mutagénesís dirigida de /os residuos presumiblenaente implicados en el centro activo
Y) Aplicaciones bíotecnológícas de las morelia hidrolasas de neumococo y sus
bacteriófagos.
> Construcción de fusiones de prorcinas de interés biotecnológico con los dom/Ños ti
termina/es responsables de la interacción con colina.
u> Purificación en un solo paso de las proteínas de fusión.
34
II MATEftIALÉS Y MEraDOS
3SMAISÉJAteS Y MtTOOO5
1. ESTIRPES BACTERIANAS, BACrERIOFAGOS Y PLASMIDOS
Para el desarrollo del presente traba1o se utilizaron las estirpes bacterianas, /os
bacteriófagos y los plásmidos que se detallan en la Tabla 1.
L MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepas se conservaron congeladas a ~70OCen medo de cultivo .1 que se añad/ó ¡lícerol
al 10% (y/y). Eh el moinento de sembrarlas se descongelaron. incubándose en los medos
correspondientes a 370C, a menos que se /ndque lo contrario, con agitación para las cepas de E.
toS y sin ag/tación para las cepas de 5. pneumonioe
2.1. S. pnesimonioe
Para el cultivo de 5. ~oeu,nonioese utilizó el medio (7.-Y, que consiste en med/o CpHB
(Tomaszy Hotctsltiss. 196-4) suplementando con extracto de levadura 008% (ph> (Difco>. Las
cepas de 5 póei¿mnon.oe que contienen en sos ác/dos reico/cos residuos de etanolamina en lugar
de residuos de colina se obtuvieron prolongando el cultivo de la cepa correspond/ente durante
más de /0 generacIones en un medio definido (Cden> util/zando el aminoalcohol etanolamina tn
lugar de cOl/ria (medio Cden-!A) (Toman. l964~. El crecim/ento deS freuinon/oe se sigu/ó por
nefelometría con eí emp/eo de un Nefelórneu’o Coleman modelo 9, calibrado para contaje de
viables en neumococo [N¡ — 7,5 x 105 unidades formadoras de colonias (UFC>lmli.
2.2. EcoS
Para el cultivo de E. cofl se utilizó el medio UR descrito por Sambroolt y cols. (1989),
añad/endo agar al 1 % (p/v> para cultivos en med/o sólido. Las cepas de E. col R87<9 1 y 0+4/
portadoras del plásmido p*’JIII-(lppP-S>-A3 y derivados de éste se cultivaron en medio LE al que
se añadió lactosa al 2% (p/v) En esta, condicione, la lactosa actúa como un inductor de la
expresión génica regulada por el promotor-operador del gen lócZ.
36
,t&TPJAUS Y m’roOos
TABLA 1. Cepas bacterianas, plisnidos y bacteriófagos
Cepa. plásmido Genotipo o fenotipo Referenciao bactenófago relevante
Sud (r’. mfl, recA 5
locZcMlS (r. m>
oQocIPOZYAjX74,gol). goiK. st,Ar. hsdR”
oQocWOZYA)X74,
c(ato. leu>, recASó
P’ QocMIocZcMI5>
W31 lO Iocfl
r5”. nl3t recAl3
Low, 1968
Messing. 1983
Casadaban y cols,. 1983
Casadabanycols. 1983
Gibson, 1984
BrentyPtasline, 1981
Aoyer y Rouland-Dusso,x.1969
PUCIa
pUC4K
plNllI-(Ip$i”.S).A3
pMC93I
tIC 1871
pCE 17
pCIPSO
pC/PSI
pCIPS4
pTcOO8S
Ap’
Ap~, Kan’
Ap~
Ap. Kan’, IacZ’YA
Tc~. Loa’
Apa. c-frtA
Ap”. Tc’, cpU
Tc’. cpU
Tc’, <fil’209
Ap’, TcRM. ¡
Mess/ng. 1983
VieirayMessing, 1982
Inouye e lnouye. 1 985
Casadabanycols.. 1983
Casadabanycols., 1982
Sánchez.Puelles y cols,. 1990
García y cols.. 987
Sánchez.Puelles y cols., 1 990
Díazycols.. 990,
Sant/ago Rodríguez,com, personal
E. coSi
Dm
9183
MC1060
MCI 116
‘tG¡
RB791
HSIOI
37
~ATfl/éJJ5Y VT0005
TABLA 1. (continuación>
Cepa. r>lásm/do Genotipo o fenotipo Referenciao baczeíiófago relevante
cepa silvestre RockefellerUntversity
M3 1 Hex”, cJytA Sárchez-Puelles ycois,. 1986b
&ócaoidfogos
Ml3sgl3O Kienyycols., 1983
Ml3sgl3l Kienyycols., 1983
38i4AfliAU5 Y 470001
la concentración de ant/biótico al/ad/da al med/o LB para el cultivo de cepas resistentes fue
de lOO hg/ml para la amp.cAina. lo jq/mI para la tetraciclina. 25 hg/ml para la Itanamlcina y 20’
20 ~¿g/mlpara e> cloranfenico¿. El crecim/ento de las cepas de ¿, coSi se sigw¿ por turb/dimetria a
550 nm con un espectrofotómetro Sh/madzu UV-260.
3. CURACION FENOTIPICA DE NEUMOCOCO
Los experimentos de curación fenot/plca de las cepas de neumococo Lyr se realizaron
corno se desate en Toman y WaIts (1975>. La curación consiste en la adición de una enzima
hidrolítica de la pared celular de neumococo a un cAtivo de una cepa LyC en fase exponencial
temprana de crecimiento. Se dc. que dicfta cepa — ha c.wsdo cuando ésta sufre 1. aacofisk al
akanzar la fase estacionaria de crecim/ento, un comportamiento similar al que experimenta una
cepa Lyt de forma natural
En los experimentos de curación fenot/p/ca real/zados en esta Tesis se ha utilizado la cepa
de neumococo M31, un mutante que carece del gen 4tA (Sánchez’Puelies y cok., 1 986a),
cultivada a 37 OCen medio C+Y. A esta temperatura de incubación la autolisina m/noritaria de
neumococo, la glucosaminidasa. presenta una baja acúv/dad y el fenotipo de la cepa M31 es Lyr
(apartado 1.3.1 de la Introducción).
4. PROCEDIMIENTOSDETRANSFORMACIONGENETICA
Las cepas de E. coSi se transformaron con el método del RbCI (Kushner, 1 978).
5. OSTENCiON DEEXTRACTLnLKUU~J> Ut t,UL i íYSfl .ELS>LflflO
Para obtener extractos crudos de las cepas de E. <oil, en un experimento típ/co se
cultivaron éstas en lOO ml del medio ind/cado en cada caso a 370C durante 16 horas (fase
estacionaria de crecim/ento). A continuac/ón, los cultivos se enfriaron a 40C y se centrifugaron a
6000 xg durante lO minutos. resuspend/kndose las células en 6ml de tampón Tris-maleato SO
mM, pH 6,5 (tampón fbi) o fosfato sádico 2OmM pH 7,0 (tampón fosfato). Una vez
39rtiiflÉAto Y P4!0005
homogeneizada la suspensión, las células se romp/eron en un sonicadcr MSE modelo MK2
mediante cuatro psi/sos de 5 segundos cada uno, manteniendo siempre la muestra a 4OC.
PInalniente. la suspensión sonicada se centrifugó a 40C y 10000 x g diamante lO minutos para
el/minar os restos celulares. El sobrenadante de esta centrifugac/ón (extracto crudo) se conservó
a .200C La concentración de prote¡na en el extracto se determinó mediante el método de
Itradford (Bradford, 1916). utilizando la curva patrón de la seroalMmina bovina. Cuando se
cultivaron volúmenes mayores, las células se rompieron usando una ~F:rench.pres?(American
Insmámnenca Compmny) operando a una pres/ón de 7,6 atmósferas.
6. TECNICAS DE FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR EN E. <oil
6.1. Frcdonaml.nto subeelular mediante choqoe omódco
El choque osmótico de los cultivos de la cepa E. coSi HBIOI [pCIPSOjse realizó como se
describe en Nona> and Heppel (1966). Para eno, se cultivó dicha cepa en 25 ml de medo LB con
ampicilina hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nns de 0.5 (fase exponencial media). Las
células del culttvo se concentraron mediante centrifugación, se restispendieron en lO ml de la
solución de plasmolísis (Tris-liC! lOO mM, pH 8,0; EDTA 1 mM y sacarosa al 20% (p/v)j. y se
incubaron a temperatura ambiente durante lO n,¡nutos. Con este tratamiento se liberan parte de
las proteinas que se localizan en el periplasma de la bacteria, Posteriormente, las células se
centrifugaron 8.00<1 x g durante 20 minutos a 40C. El sotrenadance constituía la fracción de
sacarosa y el sedimento las células plasmolisadas. Estas se resuspendieron suavemente en lO mI
de agua a 40C y se mantuvieron a esa temperatura durante otros /0 m/nutos (choque
hipotónico). Con este tratamiento se liberan las proteínas perlplásmn/cas que no lo han hecho
previamente en la fracción de la sacarosa. Después de una centrifugación de lO minutos a 40C y
$000 x g. se separó el sobrenadan. (fracción H20) del sedimento (fracción celular). Este
último se resuspendió en tampón Rl y las células se rompieron mediante son/cación a 40C (con
dos tratamientos de /0 segundos cada uno>. La fracción soluble (c/toplasma) y la sedmentable
envolturas celulares) se separaron mediante ultracentnfugac/ón a /00000 x j durante 60
m/nutos
40MAS!MJAtfl Y 470005
6.2. Fraccionamiento subcelular mediante la formación de esferoplastos
Se siguió el proced/miento descrito por Koshland y Botateln (1980). Para ello, se cultivó la
cepa E. cok HB IGl [pC/PSO]en 25 ml de med/o LB con amp/cilina hasta a/canzar una densidad
óptica a 550 nm de 0.5 (fase exponencial med.a). Las células del cultivo se concentraron
mediante centrifugación y se resuspendieron en 2.4 ml de una solución ¡1’ris.HC1 IDO mM, pl-l
8.0: EDTA 0,5 mMy sacarosa al 20% (p/v)I que contenía 0,24 mg de lisozima. DespuÉs de una
/ncubación a 40C durante 15-20 minutos, los esferoplastos formados (visualizados al
microscopio) se estab/lizaron añadiendo 45 M1 de MgCI, lI’1. La centrifugación a 8.000 xg
durante 20 minutos a 4OC originó un sobrenadante que contenía proteínas periptásmicas
(fracción periplásm/ca). y un sedimento celular que se sometió a choque hipotónico mediante
resuspensión en lO mide agua a 40C y agitac/ón a esta temperatura durante lO minutos. En este
caso, y a diferencia de lo comentado en el apartado 6±, el d~oqoe hipótónica ibera las
proteínas c/top/ásin/cas. La fracción soluble (citoplasma) se separó de la fracción sedimentable
(envolturas celulares) mediante ultracentrifugación. La eficiencia en la formación de esferoplastos
fue mayor del 95 ¾,como se pudo comprobar por observación directa al microscopio de
contraste de fase, así como también por la reducida actividad enzimática detectada en el
sedimento de una centrifugac/ón a baja velocidad de los esferoplastos cuando éstos ya habían
sufrido el choque hipotón/co.
7. OSTENCION DE LAS PAREDES CELULARES DE NEUMOCOCO
7,1. MarcaJe radiactivo de las paredes celulares
El marcaje de las paredes celulares de 5. pnevmonioe con cloruro de (meiiPHJcoJ/na (60
Ci/mrnod; Amersham) o con monoh/drocloruro de L.j4,S-3HJllSlfla (40 C//mmok Amersham). se
llevó a cabo añadiendo el isótopo correspondiente a la cepa R6 cultivada en med/o Cpl-18 según
se describe en MosseryTomasz (/970).
Para el marcaje de las paredes ce/u/ares que contienen ecanolam/na en lugar de colina, se
añad/ó I2.lCletano>amina (4.4 C//mrnol. Arnersham) o monohldrocloruro de L-J4.S’Hjlisina
(40 Ci/mmo/) a la cepa RÓ cultivada en med/o Cden’EA según se describe en Hóltje y Tomasz
(/975 b).
4’
•~-Tsmuds5 Y ~1’OOOS
7.2. AIslamiento y purificación de las paredes celulares
Pan llevar a cabo el a/slamiento y purificación de la.s paredes celulares se siguió básicamente
el método desarrollado por Garcia.Bustosytomasz(198fl. En resumen, secisltivó la cepa tipo
R6 en medio CpHS. o en medio Cden.EA para la obtención de paredes que contienen
tcanolam/na, en presencia del isótopo co,-respoodente hasta que el cultivo alcanzó una
concentración celular de 3,7 x 108 UFC/ml. Las células se centrifugaron a 6.000 x g durante lO
minutos a 40C y el sedimento resultante se resuspendó en tampón fosfato-sal/no (tanipón
fosfato 20 mM, pi’1 6,9 más NaO 0,15 M). Posteriormente, la suspensión celular se calentó a
900C durante 30 minutos en presencia de SOS al 4% (piv) con el fin de inactivar la autol/sina de
neumococo. Después de varios lavados con aria destilada par. eliminar el SOS, la células se
rompieron mediante ‘Frencl,-press” (American lnstnjments Company). El restante tratamiento
hasta la obtención de las paredes celulares se realizó como se describe en Garda.Bustos y
Tomas: (1987). F/naln,ente. Lis paredes celulares se resuspendieron de forma hosnogénea en
tampón SPS¡4 (tampón fosfato sUlco 25 mM. pl-IB.O; 13-mercaptoetanol 20 mM y NaO 0,85%)
a una ccincentractón final de 1 mg/re> (700 cpn,/gg para paredes marcadas con colina. 500 cpm/Mg
para <ti marcaje con usina>.
8. ENSAYOS DE AaIVIDAD ENZIMATICA
LI. Determinación de la actividad de las enzimas que hidrolizan la pared
celular de neumococo
S.l 1 Ensayo enzimático de los extnctos obtenidos de E. cok
Los extractos crudos de cepas de E. cd transformantes que expresan una activ/dad
h/drolísica sobre la pared de neumococo se ensayaron siguiendo el procedimiento clásico para la
determinación de la actividad amidásica en neumococo (t’losser y Tomasz, 1970>, pero con
algunas modificaciones.
42,1AfltiAtKS Y ~COOO5
En el caso de la amidasa LYTA. para proceder a su conversión el extracto celular se
preincubó a 40C durante lO minutos en presencia de col/na o análogos estructurales a w,a
concentrac/ón final de 03 Pl o 0.5 M (Briese y Hakenbeck, /985). DespuÉs de esta
preIncubación, la mezcla se diluyó con tampón TM hasta una concentración final inferior a 0.1
mM, con lo que se evita el efecto inhibidor del 1/gando sobre la actividad hidroiltica de pared al
competir con los residuos de colina de las paredes celulares (apartado 2,3.3.2 de la
Introducción). En el caso de las Ilsozimas CM. 1 y CPt7 no es necesario el proceso previo de
conversión.
La mezcla de reacción contiene 200 ¿ti de tampón, a los que se afiaden ID ¿tI de paredes
celulares de neumococo niarcadas fad.ctivan’entt (susoatol y de 5 a 30 ¿tI de la dilución
adecuada del extracto celular convertido en su caso. La incubación se realiza a 370C durante lO
minutos, y la reacción se detiene mediante la adición de /0 Mide formaldehido al 35% y O ¿tI de
seroalbómina bovina al 4% - Las muestras se centrifugan en una rr,icrofuga Hettich a 10000 5< £
durante lO minutos. A /50 ¿tI del sobrenadante de cada muestra se les añade 3.5 mIde liquido de
centelleo (Coclttail-22 Normascint. Scharlau) y se determina la radiactividad en un contador de
centelleo líquido LKB Wal/ac (modelo 1219 Racheta). Una unidad de actividad enzímática se
define como la cantidad de enzima que cataliza la solub//izac/ón de 1 MIde pared en 0 m/nutos
(Hóltie y Tomasz. 1976).
8 1,2. Ensayo enzimácico de las oroteinas nurificadas
La amidasa CITA purificada en presencia de colina no requiere conversión para ensayar su
actividad. Para ésta y el resto de las enzimas hídroliticas de pared, la mezcla de reacción contiene
200 ¿tI del tampón apropiado, lO ¿ti de paredes celulares de neumococo marcadas
rad/activamente y lO ¿ti de de la dilución adecuada de la enzima purificada. La incubación se realiza
como se ha descrito en el apartado 8. 1 . 1 -
43nA-mmAtn Y >410005
1 3. Caracterización del doc de actividad Utica
Para determinar el tipo de act/vidad de las enzimas Itt/cas se sigu/ó el método descrito por
García y cole. <1937). Se digIrieron durante 16 horas 200 ¿ti de paredes de neumococo
marcadas con colina o Usina con la cantidad apropiada de enzima más 300 ¿t1 de tampón 1>1 o
fosfatosegúnlaenzirna. Lareaccióoseparóafiadieodo lOpIdeformMdehídoaI3S%y l0~iide
seroalbámina bovina al 4% y centrifugando la muestra en una microfuga Hettids durante ID
minutos a 10000 st 5 El sobrenatance se aplicó a una columna de Septiade: GiS <1,5 st 50 cm>
equSradaenO.lSMNaOyseeluyóconlamlssn&sclución.Se reco/eronfracciooesde 1,5
‘nl y se contó la radiactividad de 400 pl de cada fracción co—o se describe en el apartado 8.1.1.
8 2 Ensayo de actividad de 13-calactosidasa
El ensayo de actividad de 13-galactos/dasa se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento
descrito por Miller (1972) utilizando o-.nitrofenll.galactósido (ONPG) como sustrato. Una unidad
de actividad enzimática se define como la cajitidad de enzima qJ* produce un nmol de o-
nitrofenol por minuto a 280C.
9. PURIFICACION DE LAS ENZIMAS UTICAS DE PARED DE
NEUMOCOCO Y DE SUS BACTERIOFAGOS.
9.1. Purificación mediante oomawgnfla de afinidad en Sepharo.a-colina
Las enzimas de neumococo y de sus bacteriófagos que hitolizan la pared celular de esta
bacteria y cuy. actividad depende de la presencia de residuos de colina en los ácidos teicoicos del
sustrato. se purificaron en un solo paso mediante una cromatografía de afinidad utilizando
columnas de Sepharosa-cokna según se describe por friese y Hackenbeclt (1985).
Las enz/mas se purificaron a partir de los extractos celulares obtenidos de las cepas
transformantes de E. col cultivadas hasta la <ase estacionaria de crecimiento (16 horas) en el
medo de cultivo adecuado para cada caso. Los extractos crudos se obuMeroo, después de
4-4m4ATSÉALES Y MtlODOS
concentrar las células 30 veces en tampón fosfato. mediante la ruptura de las mismas en una
~French-press<American lnstrun,ents Conwany) a una presión de 7.6 atmósferas y ponenor
centrifugación a 40C y 10,000 st £ durante 30 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación se
apl/có a una columna de Sepharosa-col/na preparada según Briese y Hackenbeclt (1985).
equilibrada en tampón fosfato, y el restante proceso de purificación se realizó a 40C. Después de
lavar la columna con 3 volúmenes de tampón fosfato que contenía NaO 1,5 Pl. la enzima
reten/da por interacción específica con la colina se eluyó ccii tampón fosfato que contenía NaO
1.5 Pl y coflna 140 mii. las fracciones en las que se detectó actividad h/&olltlca de pared se
dializaron dirante Ii horas frente a 300 volúmenes de tampón fosfato. La concentración de la
proteína purificada se deteryninó mediante espectroscopia de absorción (apanado lO) , y su
pureza se analizó mediante electroforesis en geles de pollacrllamlda-SOS (apartado II). tas
enziinas se cooservawn a ~2O0C.
9.2. Purificación de la Ilsozima CPLI por aomnatorafla de penetrabilidad
Para evitar la interacción de la 1/sca/ma CflI con colina se diseñó un procedimiento de
purificación alternativo prescindiendo de las columnas de Sepharou.coiina. Los extractos crudos
que contenian esta proteína, una vez centrifugados, se precipitaron fraccionadamente con
(NH4)2S04 a 4
0C. El precipitado obten/do en el rango del 30.50% de saturación se disolvió en
un volumen mín/mo de tampón fosfato o Tti y se procedió a una cromatografía de filtración en
gel en una columna de Rio-Gel P.60 (lOO st 6cm). equihbrada y eluida con el mismo tampón de Li
muestra. Se recogieron las fracciones que presentaban la mayor actividad y pureza según eí
anál/sis en geles de poliacrilan’ida.SDS.
9.3. Purificación d. la lisoziina CPU
La lIsos/ma CPL7 no presenta afinidad por la cofra. por lo que su purificación no se puede
real/nr en un solo paso mediante una cromatografía en Sepharosa-collna. Los extractos crudos
de las cepas de E. cok que expresan estas proteínas se obtuvieron como se indica en el apartado 5
y se sometieron a una precipitación fracc/onada con sulfato amónico a 40C. La fracción
sedimentable después de la precipitación con sulfato amónico a] 30% de saturación se
4Si,a-qs~Ln Y 1410001
resaspendó en lO mide tampón fosfato 20 mii pl4 7,0 yse aplcóa una coáamna <IOOxGcm)
de comatografla por ffloación en gel <&o~GeI NO. &o-Ra<~. La eloción se realizó con el mesmo
tampón fosfato. y Lis fracciones en las que se detenó actividad h/&ofltica de pared se analizaron
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.SOS recogiéndose las que mostraban mayor
pureza -
t4. Purifiadon desd. geles de pollaallan~ida
La pwIficación de proteínas por electroelucián de geles de poldacrllam/da-’SDS se kvó a
cabo corno sigue: una vez reaiizada la electroforesis (apartado II) se recortó la zona del gel en
donde se encontraba la proteína y se introdujo en una bolsa de diálIsis C~flslt/ng 20132. Serva) con
tampón TEE (Tris-borato 89 mii, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 mM, pl4 8,0). La bolsa se
introdufo en una cubeta de electroforesis horizontal con tampón TSE y se aplicó una tensión de
lOO voltios durante 1 hora. Después se aplicó un pulso 30 segundos con la polaridad invertida
para separar la proteina del celofán, con lo que la proteína se recogía finalmente en el tampón
dentro de la bolsa.
<O. VALORACION DE CONCENTRACIONES CE PROTEíNA PURA
La concentración de las proeeh,as puras se vaioró por espectroscopia de absorcaón. El
conocimiento de lasecuencia delaam/dasa LYTAy las lisozinias CPtI y CPU pernilte calcular su
coeficiente de extinción molar en base a la composición de la proteína en amInoicidos
aromáticos seg<in los datosde 280 a pl4 7 publicados por Fasman (1976): 5559 M’ cm-1 para
los residuos de triptófano. 1.197W1 cm1 para la tirosinay 0.7 M4 cm1 para la fenilalan/na.
Esto conduce a un c~~o de 87.483 M~ cm1 para la amidasa LYTA. 113.322 M1 cm1 para la
lisozimna CPU y 61.986 M-~ cr1 para la lisozima CPU.
46mt&1tÑALS5Y >410005
II. ELEC1ROFORESIS DE PROTEíNAS EN GELES DE POUACRILAMIDA.
Sos
Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en todos los casos en condiciones
desnaturalizarites en presencia de SOS. La técnica empleada fue Li descrita por Laemmli <1910)
utilizando geles de pollacrilamida en placa (160x lOOx lmm) entre el7 yel 15%. Las rnuesuas
se hirvieron previamente durante 5 minutos en presencia del tampón de ruptura (fris.HCI 62.5
mM, pH 6,8: SOS al 2%; B.niercaptoetanol al 5%; glicerol al 10% y azul de bromofenol al
0,005%). Las electroforesis se realizaron a temperatura ambiente y corriente constante <50
ni>.). utilizando un tampón que contenia Tris-MCI 0,025 ti. tcina 0.191 Ny SDS al 0.1%. tas
prote~as de los geles se visualizaron con azul brillante de Coon’assie A-250 según se describe en
Swank y Munkress (1971) o mediante la técnica de tinción con plata (Mernl y col... 1981)
<Aniersham). Las proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular se adquirieron de
la casa comercial ~io-P,ad.
12. DETERMINACION DE SECUENCIAS N-TERMINALES DE PROTEíNAS
La secijencia de ani.nolcido, N.terrnioal de las distintas proteínas se detervriinó mediante el
método de degradación de Edman según se describe en López y cols. </982). Se utilizó un
secuenciador automático modelo -477A (Applied Biosystems).
II. PREPARACION DE PLASMIDOS
La preparac/ón de plásmidos a partir de cepas de E. cofl se realizó utilizando el método de
Eirnboim y Doly (1979> tal y como lo describen Sambrook y cok. <1989).
íd. MANIPULACION DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMUN EN
BIOLOGíA MOLECULAR
Las endonucleasas de restricción se obtuvieron de Boehringer Mannhein,, Amersham.
Pharmacia y New England 8/o/abs. La fosfatan alcalina de intestino de temen se obtuvo de
47F%&T!tD&E5 Y >410001
foehringer Mannbelni. AmerÉam sun,ñstró la DNA ligasa yla polmucle&do qiMi.asa del fago
14. as¡ como el fragmento Klenow de la DNA polimerasa 1 de E. cok. Todas las enzimas y sus
tampones correspondientes se uclizaron siguiendo las indicaciones recomendadas por Lis casas
suministradoras.
15. ELECTROFORESIS DEI. DNA EN GELES DE AGAROSA
Para realizar la electroforesis del DNA se utilizaron geles con 0.7% o 1% de agarosa <Ra0.
Ra~ en tampón TAS <TrIs-HO 40 mM. ác/do acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH SI>, empleando
el mismo tampón como electrolito. A las muestras se les alladió 1/5-1/10 de su volumen de una
solución compuesta por Ficol 400 al 30% <plv). azul de bromofenol al 0,2 % (p/v). xlkncranol a]
0.2% y EDTA 40 mM. pH 8,0. La electroforesis se realizó a 100.150V durante 60-90 minutos,
y una vez finalizada los geles se olieron con bromuro de etidio <3 pghnl> para su visualización con
radiación ultravioleta. Como marcador de tamaño se util/zó el DNA del fago lambda digerido con
las enzimas de restricción Ifindíl o 8,61 (Amersliaml
16. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE LOS FRAGMENTOS DE DNA
Los fragmentos resultantes de la digestión del DNA con las enzimas de restncción se
aislaron y purificaron de 3 formas distintas.
16.1. Goles de pollw-llamlda
Se utilIzaron geles de pollacrilamida no desnaturalizantes a una concentración del 4% en
tampón TBt Se empleó como electrolizo para la electroforesis el tampón TRE. A las nuestras
se les añadió l/S.I/l0 de su volumen de una soluc/ón compuestapor FicoI400 al 30% (ph), azul
de br-omofenol al 0,2% (ph>, xilencianol al 0.2% y EDTA 40 mM, pH 8,0. Una vez ten/nada la
electroforesis, los ¡eles se tltieron con azul de metileno (0.04%) y se recorté la banda de DNA
deseada en cada caso. El DNA se eluyó de la banda de acrilamida como se describe en Sambroolt
y cois. (1989).
4%MATtR¡ALK5 Y YETOOOS
16.2. TécnIca del Ceneclean
Los fragmentos t~ie se desean aislar se separan mediante una electroforesis en ge/es de
arosa. Posteriormente, se recortan Lis bandas de interés y el DNA se purifica de la agarosa
mediante su adsorción a dim/nutas paniculas de vidrio siguiendo la técnica del G,eckon. El kit de
Geneclea, se utilizó como recomiendan los fabricantes <Rio IGl Inc., La Jolla. CA).
16.3. Celar ~; .¡arosa de bajo punto de fusión
Para algunos aislamientos de fragmentos de DNA se utilizaron geles de agarosa de bajo
punto de fusión (Bio-Rad) al 1-14% en tampón TAS. Una vez retada la electroforesis. se
cortóencadacasolabandadeseadadelgelyseresuspendlóentampóntE<Tris-HCI lOmM.pl-4
8.0; EDTA 1 mM) con NaO 0.25 M. La agarosa se fund/ó manteniéndola a 65 OC dijrmnte 5
minutos, A continuación, la muestra se trató con fenol y posteriormente con éter (vlv),
incubándola después a £5 ~Ci..z 5 minutos con el fin de eliminar los posibles restos de
éste. El DNA se precipitó con dos volumenes y medio de etanol absoluto durante 45 minutos a
~70 OC. Tras una centrifugación a 10.000 st g durante lO minutos, el precipitado se lavé con
etanol al 70% y finalmente se disolvió en un volumen adecuado de tampón TE.
IT. SECUENCIACION DEL DNA
La secuenciación del DNAse realizó según el método de Sanger y cola. (1977). Para la
reacción de secuenciación se util/zó el Sequenase Kim (United Sotes Riochemicals) y como
nucleótido marcado radiactivamente. [o-35S)dATP(Amersham). sigu/endo las recomendaciones
de los fabricantes. & cok 1<31 fue la cepa util/zada como huésped para los bacteriófagos
Ml3tgl3OyMl3tgI3l <K/enyycols.. 1983).
IR. MUTAGENESIS DIRIGIDA
Los o//gonucleótidos utilizados para la mutagénesis dirigida. asi como los empleados como
cebadores para la secuenciación del DNA, se sintetizaron en un sintetizador de DNA LKB Gene
49NAWWALI5 Y ~TOOOS
Asseenuer Plus (Ptiarmacia). Para levar a cabo la ,wagfresls dirigida se empleó el sistema de
m.~tagénes¿s le. ñúo de Amersham <método de Sayers y col... <988). siguiendo el protocolo que
detallan los fabricantes.
It TÉCNICA DE “wESTERN-BLOr
Las proteínas purificadas y las proteínas de los extractos crudos, una vez separadas
mediante elecuoforesis en geles de poliacrilamida-SOS. se transfirieron a membranas de
iwocelulosa <Sd.leid.er and Schuell) según se desate en Sambrook y col.- (1989>. La
membrana se saturó con leche en polvo desnatada a] 5% (p/v> en tampón FRS (fosfato sód/co lo
mM, pH 7.4; NaO /40 mii) mediante incubación a 4OC durante 12 horas. Posteriormente, se
ir.cubó a temperatura antlente con agitación suave durante 4 horas en presenc/a del suero
correspondiente a cada prote/na (García y cok. 1981). Después de 3 lavados con FRS que
contenía Tween al 0,1% (vN). de lO m/nutos de duración cada uno, la membrana se hizo
reacc/onar durante 1 hora a temperatura ambiente y suave agitación con anticuerpos de cabra
anci-lgGs de conejo conjugados cori peroxidasa Oackson Immunoresearch). Finalmente, tras un
lavado con tampón FRS. las bandas de reacción con los anticuerpos se v/sualizaron con peróx/do
de hIdrógeno y 4-cloro- 1 naftol (Sigma)
28. MICROSCOPIA ELEaRONICA
Para la observación de células de E. cok al nÉroscopio electrónico sin proceder a corte
alguno, se centrifugó una alícuota del cultivo correspond/ente y el precipitado se lavó dos veces
con tampón acetato amónico 0,1 tI, pH 7, Después, el precip/tado celular se resuspendió en el
mismo tampón y se observó directamente en un microscopio electrónico Ptdlps EM 300.
2<. FREDICCION DE ES’TRuCTuRA SECUNDARIA
La prediccion de estnactura secundaría de la enzima CPt 1 se llevó a cabo por tres
procedintientos Ésckuos: EJ método de O,oo y Pasman <1978) se siguió con las modificaciones
de Gavilanes y cola. (1984>. La predicción de estructra según Garnier y col.. (1928> se realizó
so¶iCflRiAtLS Y MÉTOOOt
con el progcs¡r.. ~RC,7cI0É contenido en las utilidades flNAstar- Por <Mimo, se procedió a
realIzar la predicción según el método de Lim <1974>. Con el objeto de obtener una posible
estructura consenso se siguieron las sigu/entes reglas: a> los giros A pred/chos por Chou y Fasman
tienen la mayor prioridad; b) la estructura de un residuo predicha por dos o más métodos se
considera definitiva en la estructura consenso; c) cuando existe mayor discrepancia, las
estructuras ahélice y estructura <3 tienen mayor prioridad que la ordenación aperiódica; d) se
descartan las estructuras en ohélice y en estructura /3 que contengan menos de cinco o cuatro
residuos respectivamente.
22 DICROíSMO CIRCULAR
Los espectros de dicroismo circular se registraron en un dicrógrafo Roussell-jouan II. Para
espectros en la región del ultravioleta cercano <320-240 nm) se utilizaron cubetas de un paso
óptico de 1 cm, y el instrumento operó a una sensibil/dad de 1 0~ cA/mm. Para espectros en el
ultravioleta lejano (240-200 nm) las cubetas eran de 05-1 mm de paso óptico, y la sensb¡Ldad se
alustó a 2,106 cA/mm. La eliptícidad media por residuo. 1~1• se calculó con la relación
101= 3300 at (AL-ATO x c’>c d-1’ donde (At.A,) es la diferencia de absorción dicroica. cesla
concentrac/ón media de residuo <para espectros en la región del ultravioleta lejano) o de proteína
(para el ultravioleta cercano), y d corresponde al paso óptico de la cubeta, expresado en cm.
Lós cálculos de estructura secundaria a par~~r de los datos de dicro¡smo c/rcular se llevaron
a cabo de acuerdo con los parámetros de Chang y cols. <1978) o Bolotina y cols. <1980)
mediante eí programa CDPROT desarrollado por Menéndez-Añas y cols. </988). El peso medio
utilizado por residuo fue de /16.
23. VALORACION DE CISTEINAS LIBRES Y BLOQUEO CON AA
La valoración de grupos sulfidrilo libres se realizó siguiendo el método de ElIman (1959)
usando ácido 5.S~-ditio.bis-<2-nitrobenzo.co) (DTNB) y midiendo la absorbancia a 412 nm del
DTNB reducido (¿412=13.600 M1 cm1). La reacción de valoración se llevó a cabo en
tampón Tris 0,1 M pH 8.0 conteniendo EDTA OmM y SOS al 2% en su caso. La reacción de
síi~ATfllAtEs Y ftoooS
Noqueo de los grupos SM lIbres se llevó a cabo en tampón Iris 66 mM, pH SA . conteniendo
SOS al 1.5% y EDTA 7 mM durante 30 minutos en ausencIa de luz.
24. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Los experimentos de espectroscopia de fluorescencia se llevaron a cabo en un
espectrofluorímetro SJ,iniadzu RP-540 a una temperatura constante de 25OC. Se utilizaron
cubetas de 1 cm X 1 cm- Las concentraciones de proteína tenían una absorbancia menor de 0,05
para m/nimizar el efecto de filtro interno.
25. EXPERIMENTOS DE CALORIMETRíA
25.1. C.lorInntria diferencial de barrido
Las medidas de calorimetría diferencial de barrido se llevaron a cabo en un calorímetro
MicroCal MC-2 (MicroCal Inc., Northampton, MA), utilizando el programa DA-2 para la
adquisición y análisis de datos, La concentración de lisezirna CFI. 1 utilizada en los experimentos
fue de 1 mg/mí, y la velocidad de calentam/ento fue de 0.5 K/min mientras no se indiqiae lo
contrario El tampón fue fosfato 20 mM. a pH 7.0 mientras no se indique lo contrario. La
distorsión de la función de capacidad calorifica debida al tiempo de respuesta del aparato se
corrigió mediante el método descrito por López-Mayorga y Freire (1987), Las variac/ones en la
capacidad calorífica de las muestras se registraron desde 250C a BOoC a una presión de dos
atmósferas. Las lineas de base se realizaron, en todos los casos, con el tampón de diálisis y en las
mismas condic/ones experimentales.
25.2. Calorin-ietrta de reacción
Los estudios de calorimetría isoterma en flujo se realizaron en un microcalorlmetro de
flujo LKB 10700-1 a ZSOC. La señal calorimétrica fue amplificada por medio de un
microvoltímetro Keithley 1506 y el calorímetro se calibró eléctrica y quirnicamente siguiendo el
procedimiento descrito por Wadso <1968). Los experimentos de valoración se realIzaron en
SiMAlTflAtS5 Y rrooos
tampón fosfato 20 mM ~H 7.0 y la ve/oc/dad de flujo fue de 8 ml/hora. Los resultados
experimentales fueron analizados mediante el uso de la ecuación
1/oH a Kd/([L1oH,~x) + l/olt~<
donde [U es /a concentración de ligando, OH es la entalpia medida a esa concentración de
l/gando. ~ es la variación de entalpia medida a saturac/ón de l/gando y 1% es la constante de
disociación. La ecuac/ón menc/onada está desarrollada en base a un único t/po de sitios de unión
del ligando.
53
III WMLI&22¡
54~S4LtADOS
1. NUEVO METODO DE PURIFICACION DE LAS tft¿.írnj UTICAS DE
NEUMOCOCO Y SUS BACTERIOFAGOS DEPENDIENTES DE COUNA
1.1 - Estudio de la con~mián de la amidasa LYTA con análogos de colina
Como se ha comentado en la Introducción (apartado 2,3). tanto la Ilsozima CPU como la
autolisina mayoritaria de neumococo (am/dna LYTA) dependen de la presencia de colina en los
ácidos teicoicos de la pared para llevar a cabo su actividad enzimática. Las regiones C.terminales
de estas dos proteínas están presumiblemente implicadas en la interacción con los residuos de
colina (García y cols., 1988) y son muy similares en cuanto a su secuentia de aminoácidos, por lo
que es de suponer que las características de la interacción con colina sean muy parecidas en
ambas enzimas. Sin embargo, el estudio de la interacción de análogos estructurales de la molécula
de colina con la amidasa LYTA puede verse facilitado si, a tal fin, se ucilin el efecto de com-wsidn
(o activación) de la forma E de esta enzima por col/na (apartado 23.1 ~1de la Introducción).
puesto ono el ,r$i- ‘~. r~~tzt5n de estos compuestos con la amídasa se puede relacionar con
el mayor o menor grado de comersión de la enzima. De este modo, con un sencillo ensayo de
actividad enzimática ¡o vito pueden estudiarse simultáneamente un gran número de compuestos.
Como se ha expuesto más arriba, dada la s/militud existente entre las regiones C-terminales de la
amídasa y de la lisorrna CPU cabe suponer que los resultados obtenidos con la primera pueden
constituir una buena aproximación al estudio del efecto de los mismos compuestos sobre la
‘5orm~ (PL 1
La molécula de colina consiste en un átomo de nitrógeno sustituido por tres grupos niecilo
y un grupo etanol, por lo que el átomo de nitrógeno posee una carga positIva permanente.
Teniendo en cuenta estas características sc eligieron para este estudio los análogos estructurales
de colina que se muestran en la tabla 2, En e/los se ha variado el número y el volumen de los
s,usttuyentes del nitrógeno y se ha mantenido, sustituido o sopnnúdo el grupo OH de la
molécula.
El ensayo de conversidn se realizó como se describe en Materiales y Métodos con extractos
de E. col R8791 [pGLIOO](García y cols., 1987). La convvsidn se llevó a cabo preincubando a
55ifl4LlADO1
40C los extractos con concentraciones de 0.1 ó 0.5 M del análogo correspondiente y duyendo
después la mezcla con objeto de que el análogo no pudiera inhIbIr la actividad enzinsática de la
amidasa convmMo. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 2. La
cai-accerlstica más relevante es el hecho de que un grao número de análogos era capaz de conetr
a la anildasa LYTA entre ellos se encontraba la dietilesanolamlna (DE>.!> <compuesto 1),
componente del intercamblador aniónico DEAE.celulosa. Para comprobar si el DE>.! pudiera
tener un efecto inhibitorio sobre la actividad in vnd de la amida» UflA similar al provocado por
altas concentraciones de col/na en los medios de cultivo de 5. ~,eumoníoe(apartado 2,3-1,2> —
íncubo esta bacteria en presencia de 0,1 tI de DEAE. observándose una inhibición de la
separación de las células hijas y una consecuente formación de cadenas (figura 7) sin que se viera
que afectara a la velocidad de multiplicación del cultivo. Además, en estas condiciones, no se
observó l/sis ni en la fase estacionaria de crecimiento ni inducida por detergentes En definItiva, se
reprodu1eron las anomalías provocadas por un exceso de colina en los medios de cultivo de
neumococo<Hóltie y Tomasz. 1975a; Giudicelliy fomasz. 1984a. b: friese y Hakenbeck. /985),
1.2. Rurificadón en un solo paso de las enzimas dependientes de colín,
mediantecolumnas de DEAE-celulosa
1 Purificación de la andan LYTA a homogeneidad electroforética
Puesto que la detiletanolantina es capaz de interaccionar especifícaniente con la amida»
LYTA rabia la posibilidad de que la DEAE unida a la celulosa pudiera actuar como un ligando de
adsorción específico de esta proteína. De este modo se podefa conseguir la purificación de la
enzima mediante cromatografía de afinidad en columnas de DEAE-celulosa. evitando as¡ el uso de
las columnas de Sepharosa-colina <Briese y Hackeribeck, 1985) cuyas desventajas más acusadas
son su difícil regeneración y su alto coste- Para comprobar este punto, un extracto de /00 ml de
un cultivo de E. colí R379 1 jpGL lOO) inducido con lactosa (Garch y cols.. 1987) se cargó en una
columna de DEAE-celulosa previamente equilibrada en tampón Tris-maleato SOnti. pl4 6,5
(volumen del lecho: /0 mi). La columna se lavó exhaustivamente con Cl ifllii,O tampón
incrementándose la fuerza lónica hasta una concentración de 1,5 Men NaCI.
56ut-lt-ra-oos
TABLA 2. Análogos de colina coano activadores de It unidasa ¡STA de neumococo.
1~Esquema a
2—N —R3
ConversiónC
Compuesto R1 R3 R4 0,IM 0,21
<A> -CH2CI420H -CH3 -CH3 -CH3 + +
(E) -CH2CH2OH -CH3 -CH3 -H + +
<C) CH2CH2OH -CH3 -H -H - -
(D) -CH2CH2OH H -H -H - -
-CH2CH2OH ~CH2Phb -CH3 -CH3 + +
(F) -CH2CH2OCOPh -CH3 -CH3 -CH3 + +
(G) -CH2CH2SH -CH3 -CH3 -H + +
(1-4) -CH,CI-I2CH,OH -CH3 -CH3 -Id + +
<1) -CH2CH,OH -CH2CH3 -CH2CH3 -H + +
a) CH2CH2OH .CH2CH2OH CH2CH2OH -H - +
<K) -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 +
(U> -CH3 -CH3 -CH3 -H - -*
(M) -CH3 -CH3 -H -H - -
(N) -CH3CH3 -CH2CH3 -CH3CH3 -H + *
<O) -CH2CH3 .CH2CW -H -H . -
-CH2CH2CH3 -H -H -H - -
a Concentración del compuesto utilizada en el experimento de convenida.
b Ph: grupo fenilo.
57RIsuL Tecol
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~lGURA 7. Electo del DEAE sobre la morfologia celular de neun,ococoS pnetsmonioe fue cultivado en medio CpH 8 que contenia DEAE al 2% - En la mitad de la faselosarítmica de crecimiento se retiró una muestra y se fotografió <x 940).
SSMSJLTAOOS
No se detectó en el eluido activIdad lítica apreciable sobre paredes de neumococo, lo que
indicaba que la enzima seguía reten/da en la columna interaccionando específicamente con los
residuos de DE.>.!. Se nuria entonces de un caso similar a la purificación por Septiarosa-colina.
donde la proteína sólo puede eluirse tras la adición de codina libre al tampón de lavado. Cuando se
pasó por la columna tampón Tns-maleato que contenía NaCI 1,5 M y col/na al 2% se recuperó
en el eluido toda la actividad lítica del extracto inicial. El análisis de las fracciones del cIta/do
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.SDS mostró la presencia de una única banda
cuyo peso molecular corresponda al de la amIdasa LYTA <figura 8).
1.2 2 Pu,iflcaci&. de otras murein hidrolasas
Aprovechando la dependencia de colina que, de modo similar a la am/dan UflA, presenta
la Ilsozima CPLI para su actividad enzimitica. se procedió a comprobar la validez del método de
la DEAEcelulosa como soporte de afinidad en el proceso de purificación de esta proteína. Así,
un extracto de un cultivo de E. col! HE 101 [pCIPSO](García y cols., 1987) fue cargado en una
columna de DEAE.celulosa en las mismas condic/ones que en el apartado anterior, observándose
de nuevo que virtualmente toda la actividad enzimitica se retenía en la columna eluyéndose
específicamente con colina. De /gual modo el análisis en geles de po/lacrilamida-SDS indicó la
purificac/ón de la lisozima CPU a homogene/dad electroforética <figura 9).
Este nuevo método de purificac/ón en un solo paso se empleó tamb/én con éxito en el caso
de la am/dan HEL (Romero y cols.. 1 990a). la glucosamin/dasa de neumococo y las enzimas
líticas LYTAIOI, FJL. CL>., UCA y CL7 (Díaz. /99/>.
123. Oncimización de/as condiciones de punficarión
la interacción de las proteínas reten/das en la resma de DEA!-celulosa con los residuos de
dietiletanolamina no se ve afectada por el pH de la columna, puesto que cambios moderados en
el mismo <5- 11) no provocaron la eluctón de las proteínas.
59
BtSAJLTAOCS
A 8 Ckoa
e
*
u
— 92,0
— 66,2
— 45,0
— — 31,0
— 21,5
— /4,3-5$’
flGURA & Purificación de la amidasa LYTA en OfAEcelulosa.£ajkb, amidasa LYTA purificada por DEAEcelulosa; gjJj.fl, extracto total obtenido de E coilRE?9 1 IPGL 1001; gjj~L>atrones de peso molecular. El ge1 de electroforesis de pollacrilamida-SOS era del 15%.
60RELLTAOOS
ABOD
e——2*
WC
— 9t5— 66.2— 43.0
— 31.0
y~ 21.5
e 14.3
FIGURA 9. Purificación de la lisozima CPLI en DEAE-celulosa.~Mk.AiExtracto de un cultivo de E. cofl IpCIPI00I inducido con lactosa 2%; caiitL LisozimaCPU purificada por cromatografía de afinidad en DEAE-celulosa; ~¡flL.~ Usozima CPUpurif/cada por cromatografía de penetrabilidad en SioGel P-60; £¡ii¡..Qi Marcadores de pesomolecular, Los pasos moleculares se indican en kilodalton. El gel de electroforesis depoliacrilamida-SOS era del 15* -
6ICJLThOOS
St embargo. cuando se elevó el pH a mSs de Ii se consiguió la recuperación de las
proteínas, si bien desnaturalizadas. Este mismo resultado — obtuvo cuando la colunvia se lavó
con una disolución de SOS al 2%. Por cero lado, compuestos análogos de colina que no son
capaces de cooetk la antidasa UllA como la N.metiletanolamina resultaron /neficaces a la hora
de eluir la proteína de la columna.
~l tampón empleado en el procedimiento seflalado en el apartado anterior era Tris-
maleato S/n embargo la uollzación de este tampón presentaba ciertos problemas puesto que su
pH variaba con la temperatura y presentaba un espectro de absorción en la región del
ultravioleta, lo que provoca interferencias cuando se pretende estudiar una proteína mediante
técnicas de espectroscop/a de absorción o de dicroisnio circular. Por tanto se propuso utilizar
tampón fosfato 20 ñ,$1, pH 7 0 en todas las dsolgciones de equilIbrado y lavado de la columna
porque este tampón no presenta los problemas mencionados, observándose que la eficacia del
proceso con el nuevo tampón no variaba apreciablemente.
la presencia de alta fuerza ión/ca en los tampones de lavado y eluclón (1.5 M de NaO) no
provocó efecto alguno sobre la actividad enzimática de las proteínas que se purificaron por este
método. Sin embargo, con objeto de comprobar cómo funcionaría el procedim/ento de
purificac/ón en el caso de una proteína cuya estabilidad fuera sensible a alta fuerza ión/ca, se
procedió a purificar la lisozima CPU lavando la resma con el tampón fosfato conten/endo 0,5 M
de NaO lo que supone una condición menos drástica que la anterior y por tanto un mayos
tiempo de lavado, a la vez que un riesgo de menor ourlficación de la muestrt Una vez que la
columna estaba lavada, se pasó tampón fosfato sin NaO y más tarde la proteína se eluyó con
tampón fosfato más 2% de colina en ausencia de NaCí. De nuevo, la proteína se purificó a
homogeneidad electroforética. lo que demuestra que no es imprescind/ble la presencia de alta
fuerza jónica para consegur su elución de la columna, sino que tan sólo el ligando libre puede
competir con los residuos de OEAE de la resine. Puesto que se observó que existen ciertas
sustancias que absorten en la región del ultravioleta cuya elución de la columna a alta fuerza
tónica es muy lenta, el procedimiento de lavado con tampón de baja fuerza lónica tras el paso de
tampón de alta fuerza jón/ca (0,5 6 1,5 Mj presenta la ventaja añadida de Impedir la elución de
dichas sustancias con la proteína, las cuales quedarfan retenidas anal soporte.
62hS&&TAOO5
114 Usodeotrostioosderesina
Todos los datos que se han presentado hasta el momento se han obtenido utIlIzando la
resma fibrosa de DEAE.celulos., pero se ha podido comprobar que la DEAEcelulosa
m,crogranular es igual de efectiva. AsImismo, tanto el dextrano (DEAE-Sephadex) como la
acrilamida (DEAE-Blogel) dieron resultados similares en cuanto a la eficacia del procedimiento.
63MSJtTAOO5
2. CARACTERíSTICAS GENERALES DE LA USOZIMA CODIFICADA POR
EL RACTERIOPAGO Cp-l (USOZIMA CPLI>
2.1. Coiwtrucción de unvector que Iilperexpewa la 11025ma 01-1
Pr-a realizar un estudio estructural exhaustivo de una enzima se requlere un sistema de alta
producción de la proteína en cuestión, El plásmido pCIP5O. utilizado hasta el momento para la
obtención de l~otima CPtl, no era el Idóneo para la producción de la suficiente cantidad de
proteéia po.w.e el gen c~tt se expresa en este piásnwdo baf o el control de un promotor débil
(Garcia y cols., 1987) (figura lO). por lo que se propuso la donación del gen cpll en el vector
plNllI-<lppP.5)-A3, del qu. se ha descrito su capacidad para la producción de grandes cantidades
de proteína Qnooye e lnouye. /985). Este vector contiene dos promotores muy fuertes en
tándem, el de la 1/poproteina y el del operón de la lactosa, seguidos de un sitio de unión al
ribosoma y una secuencia de donación múltiple (figura lO) Por otra parte, este vector expresa
de forma constitutiva el gen lod que codifica para el represor del promotor lod.
La construcción de un pUsinido que hiperexpresara el gen cf! st llevó a cabo corno se
indica en la figura /0. lEí plísmido paPSO fue digerido parcialmente con la enzima Drol y
posteriormente religado para formar el plásmido pOM3. be este plásrnido se obtuvo, tras una
digestión con la enzima Sou3Al, un fragmento que contenía el gen cpll. que fue insertado
entonces en el sitio fiomi-ll del vector plNllI.«pp.S)-A3. La mezcla de ligación se usó para
transformar células competentes de E. cok R879 1~ Los clones recombinantes se seleccionaron en
base a su resistencia a arnpicilina ya ia actividad lítica mostrada por extractos de cultivos de estos
clones sobre paredes de neumococo. De uno de los clones que poseían mayor actIv/dad se a/sló
el plásmido pCIP lOO <figura Ib). FI sitio de donación múltiple del vector está situado en el /nicio
del gen de la 1/poprote/na. por lo que la donación de fragmentos en este lugar da origen a la
formación de secuencias de fusión con d/cho gen - Sin embargo la estrategia de donación del gen
cpu en el sitio lomNí está diseñada de tal modo que si bien se cre4 un mareo de lectnra abierta
originado por la fusión del fragmento Sou3Al con el gen de la lipoprotein.. este marco se c/erra
antes del inicio del gen cpi 1~ De todos modos, con el objeto de comprobar que no se estaba
expresando una proteína de fusión se determiné la secuencia amino-terminal de la lisozin,. CPI. 1
64flSJLTAOO5
“elAMAATrTAÁMI3AWaGAMnMG — Cpl
—
o
t’reI(.a
T4 me LIGASA
SaiSa OreE
GATCCTTTTAAAGGAGAAAMAMTAAfl—epllies —
OilB
PQRA$NO <5.30>O
soo SOeSA a001
e—II’
(Z41Cb)T4 Oft& UGASA
fltl Econ Meas ~4 treS‘—~ cm
ATcTAGAGGiSTArrAATAATGAAAGUSAATTCCAAGCTTGGATCCTTTTAAAGGA GAAA AGAAATAATGSS — Le y % u. >,. Se, La A.,e PSe Lii 6/y Gis Lys lqe st..
Res
FIGURA lO. Construcción del plásmldo pCIPIOO.Sitios de restricción: A, hosnI-II; O. Oral; E, EcoRl: II, HissdIll: 5, Sou3Al; X. Xbd. El asterisco <*)significa que existen más sitios de restricción de esa clase de los que se indican. Se muestra lasecuencla de fusión del fragmento Sao3Al-Eotll del plhstn/do pDM3 con el plásmido plNIll.A3y el marco de lectura abierto anterior al gen cpU. Otras abreviaturas: RAS, sitio de unión alribosoma; LMT. aislamiento de DNA en geles de agarosa de bajo ponto de fusión; 1p9-5,promotor rnodtfic.do de la lipoproceina; locPO. promotor del operón de la lactosa,
65.SSJCTAOOS
purificada a partir de extractos de E coá RB791 ¡pCIPIOOj, obteniéndose la secuencla Val-Lys-
Lys-Asn-Asp-Leu-Phe.VaI qu. coincide con la predicha en base a la secuencia de nucleteldos del
gen cpU con la excepción de la ,etionina in/cial (Garc<a y cols., 1988>
12. Condiciones óptimas de produedón de la lluozIma CPU
Como ya se ha dicho en el apartado anterior, la expresión del gen de la lisozirna CPU está
regulada en el plásmido pCJPIOO por el promotor del operáis de la lactosa. Dado que el gen lod
se expresa en este plises/do de forma constitutiva, se necesita la presencia de un /nductor como
la lactosa en el medio de cultivo para conseguir la producción de altas cantidades de lisozitisa Las
condiciones óptimas de producción de la lisotima CPU 1 se obtuvieron incubando E. col R879 1
[pCI?1001 en medio LB suplementado con 2% de lactosa durante 16 horas con agitación a 370C.
En la figura 9 se muestra un análisis en gel de pollacrilarnida-SOS de un extracto de un cultivo
inducido con lactosa incubado corno se ha indicado, pudiendo observarte la gran producción de
proteina. Con este procedimiento se consiguieron rendim/entos en torno a 35 mg de Ilsozima
CHi pura por litro de cultivo. Sin embargo, ciertos problemas de estabilidad con la cepa R8791
nos ndu1o a transformar la cepa OH> con el plásm¡do pClPIOO. El nuevo clon. capaz asimismo
de asimilar lactosa, permitió la obtención de cantidades de proteina similares a las obtenidas en la
cepa REiS 1 pero demostró set más estable en cuanto a la producción de proteína.
2.3. Algunos datos bioquímicos de la Ilsozima CPLI
En la figura II sc muestra el efecto del pH, la fuerza ¿nica y la presencia de colina sobr, la
actividad lít/ca de la lisozima CPU sobre paredes aisladas de neumococo, Pudo comprobarse que
el pH de nikxima actividad para la enzima estaba situado en 5,0 . en desacuerdo con el pH de 6.0
previamente publicado <García y cols.. /987) debido probablemente a que ci empleo de tampón
fosfato en este último trabalo a pH 5.0 no es correcto. Por su parte, una concentración de
NaCí de 250 mM en el ensayo provocaba una inh/bic/ón del 50% en la actividad enzimática. y ésta
resultab, completamente inhibida a 500 mM, Por ultimo pudo comprobar.. cómo la coba lIbre
era capaz de inhibir completamente la actividad en concentraciones de 0 mM o superiores.
Como se ha descrito previamente (García y cois.. 1987). esta Inhibición es de car&cter no
66
u4.4 4.5 5* Ú Ú LB 7* 7.5 8:0
PH
e a go le a<u~(s~
e e —a—
FIGURA II. Ca’acterhticas bloquimkas de la 1/sozima CPtI -
Varlación de la actividad enzimática con: A) PH; 8) fuerza /ónica; C) colina. Los datos de actividadse dan en porcentaje con respecto al máximo.
h5%&TAOO5
le -
U -.
A
¡ go.
a.
8.5
‘e
¡ua
B
u- -
1c
Ne-
a —
67MtltTAOO5
coirpetitivo y puede ser debida a que el igando Interfiere en la interacción de la hozirna CPU
con los residuos de collna de loe ácidos tesco/cos de la pared de neumococo
2.4. AnálisIs esflctunl de la Lisodma CPLI
2 4,1 Esnidios de dicroísmo circular
Los espectros de do-o¡smo circular de la lliozárla CFi. 1 se muestran en la figura II. El
espectro registrado en la región del ultravioleta lejano (240-200 nmj a pH 7,0 <figura 1 ZA>
muestra un mínimo a 230 nm y otro a 2/0 nm, con un hombro a 211 nm. Utilizando el programa
CDPROT desarrollado por Menéndez Atlas y cols. (1988) se dedujo que la estructura secundaria
de la proteína estaría compuesta de un 19% en a-hélice. 32% de láminaS, 28% de giros II y
21% de ordenación aperiódica según los parámetros de Chang y co/s (1978) suponiendo una
media de /0 residuos por hélice. O. acuerdo con los parámetros de Bolotina y cok (1980) se
obtuvo una composición similar con un 19% de o-hélice. 35% de lámina 13, 32% de giros By
14% de ordenación aperiódica. Los ajustes no so” todo lo buenos que cabria esperar (figura 3)
deb/do fundamentalmente a la forma inusual del espectro en la región de 220-235 nn,. la cual
podría explicar-se por la contribución de aminoácidos aromáticos en esta zona del espectro
<Brahms y Brahms, 1980). Por otro lado, el espectro registrado en la región del ultravioleta
cercano <320-240 nrsi> (figura 128) muestra una banda de elipticidad positiva a 260 nm y otra de
elipticidad negativa centrada a 295 nm.
2.4 1 1~ Efecto de diversos acentes sobre los esoectros de dicroísmo circular
El espectro de la lisozima CPI.l muestra cambios mínimos cuando se incrementa la fuerza
ión/ca hasta 1 M en NaO a pH 7.0 (figura 12). La adición de sal cambia las bandas de 210 y 217
nm por una centrada a 209 nm. Por lo tanto, la inhibición de la actividad enzimática que se
observa a alta fuerza iónica (figura 1 1) debe escpl/carse en base a la Interacción de los Iones con
residuos cargados que son importantes para la catálisis más que en función de posibles cambios en
la estructura secundada. Por otro lado, cuando se varió el pH se observaron mínimos cambios en
los espectros en la región del ultravioleta lejano ene1 rango comprendido entre 6 y lO (figura
68atsM,-Aoos
Longitud de onda (nm)
FIGURA II. Espectros de dicroísmo c/rcular de la lisos/ma CPLI.faniL& Región del ultravioleta lejano <0,125 mg/mí); hnsLt Región del ultravioleta próximo(1.5 <ng/mI). (.—), Espectro registrado en tampón fosfato 20 mM pH 7.0; e - - --4, entampón fosfato más 1 tI NaO; (----), en tampón fosfato más lO mM colina; (- -). entampón fosfato más lO mM colina más 0.5 tI NaO.
-7200 210 220 230 240 250 270 290 310
¿9RESuLtADOS
‘oa
O
E-a
Eo-ao5.-
nsi
Longitud de onda (nm)
FIGURA II. Cálculo de la estructura secundaria de la lisozima CMI por el programaCDPROT.Panel A- Espectro registrado a una concentración de 0,125 mg/ml en tampón fosfato 20 mM pH7.0: enníLt en tampón fosfato conteniendo (O mM colina. Los círculos indican las elipticidades.calculadas a cada longitud de onda por el programa de aluste según los parámetros de Bolotina ycols. (1980)
200 2>0 220 230 240 2>0 220 230 240
70
o
‘o
o
tia
c.JEoo5.-o’á
-2
-3
-4
220 230
Longitud de onda (nm)
FIGURA 14. Efecto del pH en el espectro de d/croísmo circular de la Ilsosima ChI en elultravioleta lejano.
). pH S.6;<—), pH 7.0; ( ), pH 8.0; (—-— -—), pil 10.9; (— —>. pH 12.0.
fliLtAOO5
240
71DOS
14). A pH II se observó La’ s%uemiso de la contwtjdón ‘le eswucun aperlódca hasta
alcanzar un 50%. lo que podría nácar una denw.afizacióc parcial de la proteína. Este hecho
estaría de acuerdo con una drástica dltnslnucl6, de las Intensidades de las bandas de 260 y 295 nn’
en los espectros en el ulcr¿vioteta próximo a este pH que indican una pérdida de estructura
terciaria. A pH menor de S.S. la proteína precipitó a las concentraciones empleadas y no se
pudieron obtener datos e.. estas Condiciones.
2 4 2 Predcc& de la escructtn secundarla de la litozima CMI
,
La predicción de estructura secundaria de la Ilsozima CPU se muestra en la figura 1S. Se
dgieron pan este fin lot un métodos más udados en la flterat.ra con-o son el de Chou y
Fasman (1978). Um (1974) y Garnier y cols. (1978). Aunque la combinación de métodos de
predicción no mejora necesariamente el grado de certidumbre de ésta (Nlsb&awa y Qol, 1986),
s obtuvo una estructura secundaria consemo a partIr de los ¡res métodos citados en favor de
una mayor sinspilcidad en la presentación de los resultados. usándose para ello una serie de reglas
sencillas y lógicas corno ~gdescribe en el apartado 21 dc Materiales y Métodos. La estructura
final, producto de la comniÉnación señalada, tiene una composición de un 15% de a-hél/ce, 31%
de lámina O, un 32% de giros a y un 22% de estructura aperiódica, io que se ajustaría al resultado
del anál/sis de los espectros de dcroísn.o circular en <a región del ultravioleta lelano (apartado
241>.
Fn cuanto al anáilsis de la estructura consenso, puede observarse que la región C-¡erminal
de la proteína tiene un alto porcenta1e de probab/es giros O y ordenación aperiódica, mientras
que la región N-terminal tendría un mayor contenido en conformación de a-hélice y estructura
0 Un purLC y.~. ej que consaderar es el hecho de que las seis subsecuencias repet/das Pl a P6
que componen la región C•-termlnai de la proteína <García y cols. /908) no mostrarían el mismo
patrón repetido ‘le estructura secundaria, sino que la estructura global de esta zona consistiría en
la presencia de dos módulos lámina-giro-hélice conectados por cinco estructuras u-o-lámina.
72mn.i.raDos
1 V~DLflbV8SUOnrtQflzQ.On,fltn5aanTLaPa.5&QV5WNP2G7flflflQQDVA
0.1.O.K.1.. cctoazflu . fltOt0o0cOOn5fl000cCO0VVllN~BEftB0. ccccCtnhuccC?TTtma.ulicc0cnntI~0cc~nnc-1rzTtgnn1cnnnx
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1 PS— Ps—.-— ¡2~3 >W050M0?OWV%YWmnT,CURGNXVSUVIKSGKCWYPIQWIGELADMPSFmPOGLITVA
0.1.O.K. Tn0~mU5CnTTnhXZL. acoccc~llncczsncocc0cC0ccsntccntm~ccocccccc00occanzc0.
FIGURA 15. PrediccIón de la esnctura secundarla de la lisorma CPU -CF., predicción de acuerdo con el método de Oso.. y Fuman <1978): GR.. predicción deacuerdo con el método de Garnler y cols. (1978); L. predicción según el método de Um (1974);C.. estructura consenso. Los diferentes tipos de estructura secundarla se abrevian como sigue:H. a-hélice; E. conformacIón 13 o extendida; T. giros 8: C. ordenacIón aperiódica.
73
2 4 3 Fxnerlmentos de anasamento de fluorescencia
El espectro de fluorescencia de la boa/ma CPU con excitación a 293 a,,, se muestra en la
figura /6. Puede obsenarse un máximo situado a 33S nm. lo que indica un desplazam/ento al azul
con respecto a los espectros del triptófano en disoluciones acuosas. Esto se explicaría
supon/endo que los residuos de triptófano se encontrara, resguardados en cierto grado del
disolvente. Con obleto de estudiar el entorno de los arrilnoácldos aromáticos de la proteína, y
más concretamente de los residuos de triptófano, se proced/ó a registrar los espectros de
fluorescencia obtenidos por excitación a 295 nas en presencia de agentes extintores de:
fluorescencia. rres de estos agentes, el lón r <cargado negativamente). el ¿o Cs <positivo> y la
acrllarn/da (neutro) fueron elegidos para llevar a cabo estos estudios. Se midió la disminución de
fluorescencia a 334 nm y se coosznsyeron los diagramas correspondientes de Stern-Volmer
<figura?).
El clagrama correspondiente a la acción de la acñlam/da se representa en la figura 1 lA. El
proceso de extinción se ajusta bien a la ley de SternVolmer, obteniéndose una constante de
extinción colisional K~= 12 M-t (tabla 3> que no resulta afectada por la adición de colina 20
mM <Ksv’ 1 [5 M~). El aluste no resulta tan bueno ene/análisis de extinción por lón yoduro
(figura 1713) puesto que la gráfica aparece algo cunada hacia abajo- Ajustando la parte in/cial de la
gráfica según la ley de Stern-Volmer, se obtendría una constante Ksv de 1,0 M-1 que indica una
baja ef/c/encia en el proceso de extinc/ón tal vez explicable por la posible presencia de cargas
negativas cercanas a los fluoróforos o por la diferente accesibilidad de éstos al agente extintor
¿Labrar, /97/; Eftink y Ghiron. /98/>. Los experimentos de extinción por lón cesio <figura lic)muestran una gráfica mucho más curvada, indicando tal vez un proceso de extinción preferencial
debido a la acumulación de Cs cero de los residuos de triptófano. aunque la baja eficiencIa de
este tón como agente extintor unido a la posible d/ferencia de accesibil/dad de los tr-iptófanos en
este caso pueden complicar la explicación de/a curva (Ef t/nlt y Chiron, 1981).
7/4SSJLTADOI
60
o><o
lii-
ow u
Oc~DS
~l eL. 2
40
20
o310
Longitud de ando (nm)
FIGURA 16. Espectro de fluorescencia intrínseca de la lisozinsa CPLI -
Una disoluc/ón de 20 Mgfn.l de 1/sca/ma CPU en tampón fosfato 20 mM pH 7.0 se sometió aexcitac/ón por radiación a una longitud de onda de 295 nm(—). en ausencia de colina;(—--——),en presencia de colina 20 mM.
330 350 .370
75
an.M,Aboa
F.
F
PLF
.1
4A
3e
ee
1
1
12
‘-2
e
so WC 150(~ (rs)
mc
B
II
ee
ce •1*
osO 50 100 150
(lo] (mM)200
1.3- -
PLr
1.2- -
5,’
1.0--ae
O 50 500(0.0] (mU)
150 200
FIGURA 17. Diagramas de Stern-Volrner de apagamiento de fluorescencia de la lisozima CPU -Extinción de fluorescencia a 334 nm por: ~. acrllamida; ¡, ¿o yoduro: ~, ión cesio-fluorescencia en ausenc/a de agente extintor; F. fluorescenc/a en presencia del agente extintor.
c
76
.aJtrAoos
TABLA 3. Cenote, de apagamiento de la fluo.escende Intrínseca de la Ihozima
CPU
a Constante de queiching dinámico de la ecuación de Scern.Volmer FÚF. 1 + KsvlQl donde [Ql
es la concentrac/ón de agente extintor.
b Calculada a partir de la parte Inicial de la curva.
Ageme extintor K~ (M1)
Att-SIam/da 12.0
YoÉwoQ) l.Ob
Cesio <Cs)
71RSSAIADOI
2,4 4 Valorac/ón de cisteinas tres en la lisotinsa CFI
]
La lisozima CPU posee tres cistefras en su secuencia de aminoácidos (García y cok.,
¡988) Para aver,guar si dos de ellas se encontraban formando un puente disulfuro se procedió a
la valoración de grupos SM tres siguiendo el procedimiento de Elman (1959) utilizando DTNB y
midiendo la absorbanda a 412 nm producida por el OTNS reducido- Pudo observarte que
mientras la proteina no estaba desnaturalizada se obtenía u., resultado de 1,7 cistelnas libres por
molécula de proteína, lo que era Incongruente pues se esperaba obtener un valor
correspondiente a 1 6 3, Sin embargo, la adición de SOS en el ensayo provoca el desplegamaento
de la proteina y u., aumento en la absorbancla a 412 nn’ hasta un valor final que índica la presenoa
de 3,0 grupos SN libres por molécula de proteína.
LS. LocalIzadón subcelular de 1* lisozIma CPLI en Esclwichio col
Cuando la am/ésa LTTA des. pneumonioe se sinteti» en E. coL la mayoría se localiza en la
penferia celular, b/en en forma soluble <15%) o asociada mediante Interacciones débiles a la cara
periplásmIca de la membrana interna de la célula (65%) (D[n y cok.. 1989), Para estudiar la
localización de la lisozirria CPU en el mismo sistema se procedió al fraccionamiento subcelular
por choque osmótico (Nossal Heppel. 1966) y por formación de esferop¿astc>s (Ieacham.
/979) de las células de E. cd HEIOI IpCIPSOI (García y cols., 1987). corno — describe en el
aoartado 6 de Materiales y Métodos. Los resultados de estos experimentos se muestran en la
tabla 4 El fraccionamiento por choque osmótico muestra que aproximadamente un 60% de la
1/sor/rna CPl~ se encuentra en la fracción periplismica (fracción de sacarosa más la fracción de
H20) aunque el marcador periplásmlco (8-lactamasa) se encuentra en esta fracc/ón en un 90%.
S~n embargo, la formación de euferoplastos sólo perm/tió la tención de la boa/ma CFI.! en <a
fracción periplásmica de un 10%, SiguIendo el m/smo razonamiento que en el caso de la
localización de la antdasa [VTA <Diaz y cola.. /989) podría cc.nclulrse que, aunque la lisozima
CPLI estuviera mayoritariamente asocIada a la envoltura celular de E. <oil 118101 <60%). sólo un
10% se localizaría en el periplasmna. encontrándose el resto asociado a la membrana por
interacciones débiles. Por último halada que resaltar el hecho de que una cierta fracción de la
/isozima CP[.l se encuentra en el medio extracelular.
78
RaJtrAoos
TALA 4. L.ocjlzad6n subcelulas’ de la Mmcd ma CPLI expresada en E. col.
A. Fraccionamiento por ctioqoe osmótico.
Fracción
Medio
Enzima extracelulr Sacaron H20 Citoplasma
CFI] 6 3 54 37
ICDH 2 4 6 88
B-lactamasa NO.b 52 39 9
3. Fraccionamiento por formación de esferoplastos.
Fracción
MedoEnzima exeracekir Fenplasn.a CItoplasma
CPU 13 9 78
ICDH NO. 22 78
8-lactan-iasa NO. lOO NO.
• Porcenta¡e de actividad enzimática con respecto a la actividad total.
b MD. No detectado.
79iESATAOOS
i. CARAaERIZACION DE LA INTERACCION DE LA USOZIMA CPU CON
COLINA
II. Tennodlnámnlca del, unión decolina a la Ilsozima CPU
La unión de la colina a la lisozima CPU fue estudiada por calonmetría de reacción a lS~C
según el procedimiento descrito en el apanado 25 de Materiales y Métodos En la figura IB se ha
representado la curva de valoración de la proteína por el ligando. [a baja afirndad de. la colina
hacia la enzima no permite deterinnar el número & sitios de unión po’ rio1 de 4,oa/ma CFI. a
partir del valor n,~n/mo de la relación ligando/procefria pan la que el electo térmico observado ci.
náx/rncr E a~uste de lo, datos expenn,enrales al ccimnportamlenco descrito (apartado 252. de
Materiales y Métodos) demuestra, con todo, la existencia de una sola clase de sitios de unión.
obteniéndose un valor de -/60,3 kJ mol< para c>t,. y una constante de disociación, Ká. de
lA <raM. Los valores de la energía libre de CitÉ.? de entropía calculados a partir de estos datos
fueron —/4.9 ltJ mot y —488) 1U4 mot’ respectivamente.
3.2, Cambios conforniadonales de la lisoxima CPLI lnduddos po. colina
3.2 1 Estudios de d/croísmo circular
El espectro de dicroísmo circular de la lisozima CPU correspondiente a la región del
ultravioleta lejano <140-200 nm> muestra, como se describe en el aparrado 24.1., dos n,Sn/mos
a líO y 230 nm y tan hombro a u? nrn, características que a pH neutro no resuitan /nfluidas por
la presencia de NaO i hl (figura l~1. Sin embargo, la presencia de colina </0 MM) provoca un
cambio conforrnacional en la enzima que se manifiesta en una dism/nución de la /ntensidad de las
bandas de 210 y 230 nrhí y la aparición de una banda con elipticidad positiva alrededor de 225 nr,’
(figura 1 lA>. Este cambio resoltó ser completamente reversible puesto que tras eliminar 1, colina
por diálisis se reprodujo exactamente el espectro inicial de dicroísmo circular.
Para con~crobar si la Isozima CFI] purificada por el procedimiento de la DEAE-celulosa
<apartado 1) perdía toda la colina un/da tras la diálisis de la proteína elulda de la columna, se
so
ft—&-rAoos
150
125
oE
100
75.
50
25
o
FIGURA IB. Entalpia de la unión de colina a la 1/souima CFI.!.Los experImentos de calorimetría de reacción se Nevaron a cabo con distintas concentracionesde coflna a 15
0C.
¡¿
O 5 10 15 20 25[couM&] <mM>
e,MSA-TAbOS
reaNzó tina purlfkadéc alternativa de la enuima medante la cal la coilna no estS presente en
ninguna etapa (figura 9) (apartado 9.2 de Materiales y Métodos), obteniéndose el m/smo
espeto-o qn el que estica de la pnxeina p.irlfcda por el método convencIonal de afriléd u-as
el proceso de diálisis.
Cuando se ajuste el espewo de dicroísmo circalar de la proteina en presencia de cofre a
los parámetros de Cbangy vals, <1978), se obtiene una conipcslcí&ide 19% en a-Sta. 19%
de confo.wacló., 6.43% de $os Ay ¡4% de ordenación aperiódica. Sin embargo la aparición de
una banda inusual a 225 nns podría tamb/én ser debida a una contribución de la absorción de
aminoácidos aromáticos en esa región como describen 9nhn,s y Brahms <1980)8 espectro de
Ecroismo circular de la hazima CPU en .1 ginviolega cercano muestra una banda a 260 y on
a 295 nm (figura liS) que se atribuyen a la disposición de los amn,ohcidos aromáticos en la
estructura terciaria de la proseé.. La interacción con colina provoca un aumento de la Intensidad
de la tanda de 29$ nni. que sólo puede expllcane por la contribución de tuiptófanos o de
reuiduos/onizados de tirosln(flpara 128). Elcarnb/ode insensídadde lasbandasde 225 y 295nr.,
tras la adición de colina mostró .i.~ correlación eno-e las variaciones de las dos bandas <figura 12),
lo que apoyaba la hipótesis de la cootrib.ac/ón de residuos aromáticos en la zona de 225 nm. La
adición de NeC> 0.5 Pl redujo la intensidad de las bandas, lo que sugiere que ewe una
componente electrostática ea la interacción de la cofu~a con la lísozima CPU que podría estar
apante/lada en presencia de alta fuerza ¡ónice. Por otro lado, dos análogos de coMa que son
capaces de provocar la conversión de la an.ldasa mA, la benzol/coMa y la N-bend-N,N-
dimevlerano¿amh,a <apartado Ii. 1.1>. pueden inducir en los espectros de dicroísmo circular de la
enzima CFI. 1 camblos similares a los producidos por colina. Sin embargo, no se observó ningún
cambio apreciable con etano/anta, compuesto Incapaz de convertir a la enzima LYTA.
Con ob~eto de comprobar si los camb/os en los espectros de dicroísmo cfrcular Inducidos
por colina po*fan correlacionaras con alguna variación de las prop.edades enz.wnásicas de la
Ilsozima CPU, se realizó una titulación con colina tanto de la actividad enzimática como de la
intensidad de la banda centrada en 295 nm.
82USM,TAOOS
Como se obsern en la figura 19. la actividad enzimática se rUte conforme aumenta la
concentrac/ón de colina en la misma medida1Je s incrementa la /ntensidad de la banda de 295
nn~. El 50% de inhibición enzimática y el 50% de camb/o de elipeicidad ocurren a la m/sma
concentración de colina, en corno a 2 ‘ o-ti - ½que sugiere que ambos acontecimientos están
relacionados.
3,22. Exoerímentos de fluorescencia
El espectro de em/sión de fluorescencia de la 1/sor/ma CPI. 1 obtenido por excitación a 295
nm se muestra en La figura /6. Esta lcng~cu4 de onda es la indicada para excitar los residuos de
triptófano y las posibles tirosinas ionizadas de la proteh-ia. Como se habla indicado anteriormente
(apanado 1-5.3), el espectro muestra un máx/mo a 335 nm. La adición de colina provoca un
ligero desplazamiento del máx/mo a 334 orn y un aumento apreciable de la intensidad de la
emisión <figura /6). Esto supone que, i.nces de a ad/ción de la colina, la fluorescencia de los
residuos aromát/cos podría hallarte parcialmente extinguida con la cons/guiente dismInución en el
rend/m/ento cuántico de estos residucs La 0nión de colina provocada entonces un cambio
conformacional que liberada a los am/noácidos aromáticos del agente extintor de fluorescencia.
El 50% del cambio de fluorescencia a 334 nrO se produce con concentrac/ones de colina en
torno a 2-3 mM <figura 20>. Aunque la colina podría un/rse a zonas de contenido hldrofóbico.
como se ha apuntado más arriba <apartado 3.2 1>, este ligando no es capaz en una concentración
de 20 mM de proteger a los aminoácidos aromáticos de la extinción de fluorescencia por
acrilamida (apartado 2.4.3.>.
85.—atTAoos
05a5<Ec
u-,o.>
o
osEuoo.e
,
FIGURA It. Efecto de la coima sobe la actividad enzimática y el espectro de dicroismo circvlardela «sozlmaCptl.(e—.). porcentaje de actividad enzimática con respecsoa OmM coima. (o—o), incremento dela eliptícidad medida a 295 nm con respecto a una nniesara en O mil colIna.
o023 0.5 í a 5 lO 20
[Colmna]<rrM)
S~.M&iLtAOO,
loo-
75-
AF~
(%) 50-
25-
o0.5 2.0
COUNA (mM>1-o 5.0 10.0 20.0
FIGURA 20. Variación de la intensidad de fluorescencia a 334 nm de la lisozima CPLI con laconcentración de colina con respecto a una muestra en ausencia de colina.
85SliTAW5
4. LA ESTRUCTURA MODULAR OB LAS USOZIMAS DE LOS
BACTERIOFAGOS Crí Y Cp-?
4.1. EstudIos sobre el domInio C.tennlnal de la Ilsoalena CPLI obtenido por
lngeoL.da genéda <C-CPLI>
4 1 1 CasacIón y exnresi&n da bresén 3~ dcl — cali
El proceso de donación de la reglón V del gen cpU se muestas en la fign II. La ulgesdón
del plásmido pCIPSI con las enzimas S~U y Psd produce un fragmento que codfsca para toda la
reglón C-terntal a la ilsozima CPLI <antnoldldos 184-338> conservando. por canco, los
motivos repetidos Pl a Pá <apartado 2.4. de la Introdueclón). El fragmento Sqd-Pst se Nertó en
la forma replicadva del DNA del bacteriófago MlIegI3I cortada con Smd y P~ y la mezcla aligación se utilizó para tranafectar células competentes de E. cal jM103. De ence los Lagos
recombinantes oue originaba’. ~IacasIncoloras en presencIa de X-GAI. se aislé el DNA de uno de
ellos <M13-CCIO> que contenta el inserto Ss>l-Pst según se pudo comprobar por anáJiuis de
restricción. Esta construcción permitió segu/damente la obtención del fragmento c-cpfl por
digestión del DNA del recombinanse M13-CCIO con las enzimas £aW y Igl. insertándose
poscerlorrnence en el plásmIdo hipeq,roductor plNlll-<lppP.5)-A3 <lnooye e lnouye. 1983>
previa¡nente cortado con EcoR> y Soe*ll. Con la mezcla de ligación se transformaron células
competentes de E. cok RaIl 1. lAs clones que conuÑn el plásmldo reconibinanee pCI 1 (figura
21» cuando se cultivaron en presencia de lactosa al 1%. hlperproducian ~maproteína de peso
molecular /0,000 <figura 22>. valor éste similar al que cafrta esperar para el dominio C-ter,ninal
<18.758 Da. 161 aminoácidos). La proteína coeficada por el gen c-cpIl se denominará C.CPtI a
partir de este momento.
4 1 2 Purificacióndelaarotefr.aC.CPLl
SI el dominio C.tern,inal fuera responsable de la interacción con la coMa y pudiera adquirir
una conformación correcta aun en ausencia de la reg/ón N-sem,/nal. la proteína C-CPI. 1 deberla
poder purificarse en un solo paso en columnas de DEAE.celulosa <apanado 1.1.2).
85Rfl4JL1ADOS
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y
FIGURA 21. Construcción del plásmnido pCMI.Se muestran las secuencias de nucleátidos en donde se hallan las dianas de restricc/ón de interés.así como la secuencia deducida dde aminoácidos. Las enzimas de restricción se abrevian comosigue: 8. Senil-iI: Bg. Agil; fi, £coRl; H, b-lindl/l: P, Pstl; S, 3g/; Sin. Smol: X. Xbol, Otrasabreviaturas: RES, sitio de unión al ribosomt
87
kOo
92,0 — —
66,2 — —
43,0 — e
31,0— —
21,5— at
A 6 C _ O
e
a
a a
/4,3 — e
FIGURA 22. Furificaciór, de la proteína C-CPLI por DEAE-celulosa.Ca/le A marcadores de peso molecular; calle 8, proteína C-CPLI purificada por OEAE-celulosa;~ extracto de un cultivo de £ mli RBJ9I pCMlfl inducido con lactosa al 2%; 21k.Dextracto de un cultivo de a misma cepa en ausenc/a de inductor El gel de electroforesis enpo½crílan,idz-SDSera del 5%.
RÉ$tJLTADO5
88fiWtTAOO5
Cu.ndosecargóunexo-aczoprocedentedeunculúvodef. co5R879l !pC>lllinducldo
con lactosa en una columna de DEAE-celulosa equilibrada en tampón fosfato 2OmM pH 70,
despois de lavar la resma con NaO 1.5 fI se obtuvo la proteína C.CPLl en una forma
electroforéticamente pura al añadir colina al 2% (f/gura 22). La proteína C-CPt1 así purificada
precipisa cuando se dial/za para eliminar la col/na y sólo puede disolverse de nuevo en presencia de
colina 70 mM.
La construcc/ón del plásn-s/do pCM 1 provoca la adición de 6 aminoácidos al dominio O
terminal. Para comprobar la precisión de esta construcción se llevó a cabo el análisis del enema
N-terminal de la proteina C.CPLI. obteniéndose la secuencia Met-Lys-Gly-Gly-lle-Pro-llt-VaI,
que co/ncide con la esperada,
4 1.3 Estudios de dicroísmo c/rcular
Los espectros de d/croísmo c/rcular de la proteh,a C.CPLI se muestran en la figura 23- Los
espectros presentan dos máximos a 225 y 265 mm y dos mínimos a 285 y 295 nm- La
característica más sobresal/ente de estos espectros es la presencia de una banda de elipticidad
positiva a 225 mm. un caso muy poco frecuente en los espectros de proteínas pero qu. ha sido
explicado en base a contribuciones de aminoácidos aromáticos (Srahms y Arahms. 980). La
peculiar forma del espectro de dicroísmo en la reglón del ultravioleta lejano hace muy duficil la
asagnación del contenido de estructura secundaria de la proteina C.CPLI utilizando los
parámetros habituales <Chang y cols, ¡978; Bolotina y cok.. 1980). Cuando se analizó el efecto
de la colina sobre los espectros de dicroísmo circular de la proteína C-CPt1 se obtuvieron
resultados similares a los obten/dos con la isozima CPLI (figura 23). La adición de colina
provoca, al /gual que en el caso de la proteína comp/eta, un aumento en las intensidades de las
bandas centradas alrededor de 225 y 295 non, con lo que se puede deducir que los cambios
observados en el espectro de dicroísmo circular de la 1/sozima CPL 1 inducidos por colina son
producto de la contribución del dominio C-termunal en el espectro total.
89
MSATAOO$
3
2‘ob5<
oE0
EoOe0’
o
-2
-5
-4
-5
—6=00
/5
‘olo
o5<
57.3E-vo -
04Eo
-5e5-ci
-/0 —
-IB
-20
Longitud de onda (nm)
FIGURA 23. Espectros de dicroísmo c/rcular de la proteína C.CPI. 1,PaulA. región del ultravioleta lejano; 2ansLB. reg/ón del ultrav/oleta cercano. En línea continuase muestra el espectro registrado en tampón fosfato 20 mM pH 7.0. mientras que en líneadiscontlnua se muestra el espectro registrado en el mismo tampón en presencia de col/na lO mM.La concentrac/ón de proteína utilizada fue de 0.3/ mg/ml.
2/0 220 230 240 260 =80 300
90RESATAOOI
41.4 InhIbición de la acÚndad lítica de las rriurein h*olasas de neumococo tor la ntefr,a
C~~l
Los experimentos realizados hasta ahora demostraban que el dom/nio C.serrn/nal de la
lisozima CPL 1 era capaz de interaccionar específicamente con colina libre o con un análogo
estructural como el DEAE. La proteina C-CPI. 1 resultó ser totalmente inactiva en cuanto a la
hidrólisis de la pared celular de neumococo; sin embargo parecía interesante comprobar s1 este
polipéptido podría adsorberse a los residuos de coMa presentes en los ácidos te/colcos de la
pared de neumococo. & esto fuera así, la actnddad laica de la am/dan LYTA o de la llsozlma
CPU. que son dependientes de la presencia de residuos de colina en la pared, deberían resultar
inhibidas por la proteína C-CPL 1 puesto que ésta contpe tiria por la unión a los residuos de colina
de la pared, En la tabla 5 se muestran estos resultados. comprobándose que la proteína C.CPLI
es capaz de /nhibir específicamente la acción de las enzimas líticas mencionadas.
4 1.5 Valoración de la cisteina libre de la oroceina C.CPtI
Cuando se realiza la va/oración de los grupos 2-1 l/bres de la 1/sozima CPLI en condiciones
no desnatural/zantes se obtiene un valor jímne de ¡.7 que aumenta brvscan,ente a 3,0 cuando se
aliade SOS ti ensayo <apartado 1 5.4). El nusn,o método aplicado a La valoración de la única
cisteina del dom/nio C-CPI.l (Cys-238 de la lisozima CPU~ indicó que ésta sólo puede Devane a
cabo en presencia de un agente desnaturalizance como el SDS lo que sugiere qu esta clstekia se
encuentra inaccesible a] DTNE tanto en el dominio C-CPLI como en la proteína entera. Un
hecho que apoya esta hipótesis es el experimento de bloqueo de esta osteína por ácido
yodoacético (IAA). Cuando el dom¡ni0 C-CPL 1 se incuba con AA en condic/ones no
desnaturalizantes el grupo 51-4 de la cisteina se vibra perfectamente previa desnaturall,ac,óui de la
proteína. Sin embargo, si la reacción con AA se lleva a cabo en presencia de SOS la cisteina no
puede valorarse con la misma eficac/a, o que indica que ha sido bloqueada por el AA
demostrando que la proteína necesita estar desplegada para que la cisteina pueda ser accesible a
moléculas como eí DTNB ocí IA,A.
9I
en.tAoos
TABLA 5. Inhlbidón de la actividad lítica sobre paredes celulares de neumocee por
la proteína C-LYTA.
• Cada mezcla de reacc/ón contenla inicialmence 0.1 nmoles del aditivo a~roplado más lO ‘~ de
suspensión de paredes de neumococo, preparadas como se describe en Materiales y Métodos, en
un volumen final de 250 i~ en tampón tris-maleaso SO mM pH 6.9. tras Incubación a 40C
durante 5 minutos u aAadló 0,1 pntol de lisorlmna CMI o de amidas LYTA. las muestras se
incubaron lO minutos y se procesaron como se ha descrIto. Cada valor es la media de tres
experimentos /ndependientes.
% de radactMded flbenda
Adición Amldasa LTTA IlsozÉna CPU
Ninguna lOO lOO
Adtúndna lOO lOO
HEWI lOO ¡00
C-CPLI 16 24
92MSJLTADO5
‘¿.2. Ctt~nción del dominio N-eerminal de la lisozima CPLI (N-CPLI> por
Ingeniería genética
El esquema de la donación de la secuencía que codifica para el dominio amino-terminal de la
lisozima CPLI se muestra en la figura 24. El plásm/do pCIPS4 <Din y cois.. /990) contiene
donado el gen cfa¿ 1 en el que se ha producido artificialmente una mutación en la misad del motivo
Pl creándose un sitio de restricción SnoSI. El plísnido citado se d/girió con las enzimas SnoBl y
AsM y se convirtió en romo el corte producido por ésta última. Después se religó el plásmido y
se transformaron células de E. col HSIOI.0e este modo la proteína resultante contendría los
209 primeros aminokidos de la lisouirna CPU más un residuo de t,rosir4 resultante de la fusión
del gen ócpll con la secuencia del plásmido pCIPS4. La selección de los dones que poseían el
pusnuido recombinante pCIPS6 (figura 24) se llevó a cabo por anál/sis de restricción. Dado el bajo
nivel de expresión del sistema no se procedió a la purificac/ón del dominio N-terminal de la
«sozima CPU (denominado N-CPLI>, pero la comprobación de que se estaba expresando una
proteína de las características esperadas lo constituyó el expenmento de Western.bloC
representado en la figura 25, en donde se puso de manifiesto que los clones de E. cali 148101
[pCIPSÓJexpresaban una proteína de alrededor de 24.000 Da (lo esperado era 24262 Da) que
era reconocida por antiuueros aruti-CPLI.
4 2.1 - Actividad de la proteína N-CPLI
Para comprobar su el dominio N-term¿nal de la lisozirna CPLI retenía la actividad catalítica
de la enzima comp/eta se ensayaron extractos muy concentrados de E. cok 1-18101 [pCIPS6J
sobre paredes de neumococo que contenían colina o etanolamina en so composición. Los
resultados presentados en la tabla 6 muestran que la proteína N-CPL 1 es capaz de hidrolizar
paredes de neumococo que contiene, colina, aunque con una eficiencia cas, 20000 veces menor
que la enzima CPU entera, demostrando así la /mportancia de la adquisición del dominio C-
terminal para mejorar la eficiencia catalítica. U pérdida de actividad registrada sobre paredes con
colina no se corre/adiona con una pérdida de activ/dad sim/lar sobre paredes de eranojamina,
puesto que la proteína N-CPI. 1 es capaz de h/drolizadas con la misma eficiencia que la lisozima
CPLI entera. Además, la enzima N-CPLI digiere los dos tipos de pared con una eficiencia
93
E
flJLTAOO5
pA
I l)SnoS¡ .Asol2)Polrk
E
AcpII
pCI P~6<6.~tcb)0R
FIGURA 24. Construcción del plástrúdo pCIPS6.Enzimas de restricclónt A, AstiL; E. ¿coRi; 14. Hli’idu<; 5. SnoB(; P. Psis.
9,.SULTA 005
AB
92.0—
66.0—
430—
3/0—-
c
—eaa-a
2/ 5—-—
43—
FIGURA 25. wescern-bloc” del dominio N-terminal de la lísozima CPL 1. El anál/sis se realizóen un gel de poliacrilamida-SOS al 15%. Las proteínas se hibridaron con ancisuero anti-CPLICa/le A- Fragmento FI; Calle B 1/sor/ma CPLI ; Cait=extracco de E. <oh HB ¡0/ [pClPSEj.que produce la proteina N-CPLI - Se indican los pesos mo/ecu/ares de los marcadores enk/iodalton. La doble banda que se observa en a calle E se debe a la degradación de la lisozirnaCPL 1 puesta de manifiesto en las condiciones de revelado del “Western.bloC,
95nKn.-l-Aoos
TABLA 4. Acelvldad enzhnáelc. comparada de 1.. domInios N-eannln.le. de las
enzimas LYTA, CPLI y CPLI expresados en E. col
Aminoalcol~ol en parerRelación
Plásnildo Enzimab Colina Etanolamlna colinajeeanolamina
pCIPS4 CPLI 5947 0.33 :8020
N-CPtI 0.17 0.29 0.58
pCP7O CPL7 347 157 2.2
pCIP72 N-CPL7 0,40 0.76 0.52
pGLlOO LYTA O,8x106 66 11791
N-LYTA 3.1 35 0.10
La mezcla de reacción coraenia 200 Ml del exuacto correspondiente unto con tampón fosfato
20 mM. pH 6,0 y paredes de neumococo que contenían colina o etanolamina. las activ/dades se
dan en cpm liberadas en 6 horas por microgramo de extracto ensayado.
b Enzima codificada por el plásnildo representado en la columna anterior.
96AS&JLTAOOS
sim/lar, lo que sugiere que ha perdido cualquier dependencia con respecto al aminoalcol~ol
presente en los ác/dos ceicoicos de la pared.
4.3. Experimentos de proteolisis conuolada
Con objeto de estudiar la estructura en dos domin/os de las enzimas locas de neumococo y
nus bacteriófagos se procedió a determinar su sensibilidad frente a la digestión controlada con
diferentes proteasas para comprobar la posible existencia de un núcleo de resistenc/a frente a la
hidrólisis proteolítica.
4.3 1. Obtención de los dominios N-termina/es de las lisozímas CPLI y CM~7 <frnmentos
FI y Ffl oor dicestión controlada con snpsina
En primer lugar se procedió a analizar la sensibilidad de las enzimas líticas de neumococo y
sus bacteriófagos frente a la acción de la tripsina en las cond/ciones detalladas en Materiales y
Métodos. Se pudo observar que mientras la arnidasa LYTA era completamente digerida por
tripsina a una relación proceasa/enzima de 1:60 (p¡p) tras 60 minutos de incubac/ón a 370C, la
hidrólisis de las lisozimas CPL 1 y CPLZ en las mismas condiciones originaba como producto final
unos fragmentos resistentes denominados FI (24000 Da) ‘ F7 (23.000 Da) respectivamente
(figura 26). Los polipéptidos FI y F7 eran capaces de resistir d/gestiones más prolongadas o con
mayor concentración de tripsina.
La cinética de degradación de las dos lisozimas por tnpsina resultó ser muy distinta (figura
26). Mientras la d/gestión de la lisozirna CPLI originó el fragmento FI sin productos intermedios
incluso a tiempos muy cortos de digestión, la aparición del fragmento F7 fue simultánea a la
aparición de otras dos especies intermedias Esto (iLmo sugiere que la tripsina empieza a digerir a
la lisozima CPL7 por tres puntos igualmente accesibles. Es importante señalar que la adición de
colIna 120 mM al ensayo de digestión de a enzima CPLI es capaz de retrasar la aparición del
fragmento FI <figura 16), mientras que una concentración sim/lar de NaO no produjo un efecto
apreciable en la digestión,
97
AB CD EF G H 1
ABC DE FGH 1 J
FIGURA 26. Digestión controlada de las lisozirnas CPLI y CPL7 con tripsina.Las digestiones se llevaron a cabo en tampón fosfato 0,1 M pI4 7,0 a 37
0C y se tomaronalicuotas a diferentes t/empos. Panel A- Digestión de la lisozima CPLI a d/ferentes tiempos<relac/ón proteasa/lisozima: 1:/Qe). £¡iitAi. patrones de peso molecular; s¡llnLt. curso de ladigestión aO, 5.10.20 y40 m/nutos. ~. fragmento FI purificado; gjiaflj4, digestión a/os/ay40 minutos en presencia de IZO mM colina.EngL~ Digestión de la lisozima CPL7 <re/ac/ón proteasa/llsozlma: 1 :25)...~, marcadores de petomolecular; safl¡tti. curso de la digestión a 0, 2, 5, lO, 30, 60, 90 y 20 minutos; gjjj 1~fragmento Fi purificado, tos geles de electroforesis en poliacrilamidaSOS fueron del 1396.
R*SULTAOOS
A92,0——
43,0— --
31,5——
21,5 — —.
14,3— —
692,0 —
66,2—
45,0— t--;
31,5— —
21,5-- a
/4,3— —
98MSATAOOS
Las proteinas fl y FI fueron purificadas a homogeneidad electroforética segur’ se detalla
en Materiales y Métodos. La mezcla de digestión se purificó por columnas de DeAE.celulosa para
evitar una posible contaminac/ón con la enzima CPt 1 en la preparación final, ya que la enzima
entera se retiene en la resma en las condiciones de eluclón utilizadas (apartado 2 1 2) Sm
embargo esta afirmación no es necesariamente válida para la lisozima CPL7 por lo que, para
garantizar completamente la pureza del fragmento FI, se estableció un segunda etapa de
purificac/ón mediante cromatografía de filtración en gel en Sephadex 6.75. Cuando las proteínas
FI y Fi ni purificadas se analizaron en geles de pollacrilamida.SDS. se observó una única banda
incluso cuando los ge/es se revelaron con el método de tinción por plata <datos no mostrados).
4 3 1 1. Análisis estructural de los ool/oéotidos FI y Fi
Para determinar qué reg/ón de las Ilsorimas CPU y CI’t7 se conserva en/os fragmentos FI
y Fi se procedió en primer lugar a la determinación de so secuencla amino-terminal de
aminoácidos, obteniéndose para los dos casos la secuentia Val.Lys-Lys-Aso-Asp-Leu-Phe-VaI. que
coincide con la secuencia amino-terminal de las proteínas enteras, indicando que los fragmentos
FI y Fi constituyen la región N.terminal de las lísozimas CPU y CFI.? respectivamente. Con
objeto de establecer el punto exacto de corte de la proteasa, se intentó determinar la secuencla
C.cerminal de las proteínas FI y Fi mediante digestión con carboatipeptidasa Y. pero los
fragmentos fueron resistentes a la degradación por esta proteasa incluso en presencia de urea 6
M. Por tanto, para poder determinar el sitio de digestión lim/te hubo que recurrir a métodos
indirectos.
En la figura 25 se rni,esrra el resultado del experimento de Wenern-No? del fragmento
FI, la lisozima CPU yun exu-actode E. colil-IBIOI IpC1PS6I. que produce el dominio N-CPI./.
revelado con antisueros anti.lisotrn CPL/. Puede observarse que las tres proteínas son
reconoc/das por el antisuero y que la banda correspondiente al fragmento FI tiene la misma
movilIdad electroforética que la de la banda de la proteina N.CPLI, lo que sugiere que ambas
denen un peso molecular muy similar, Ten.endo en cuenta la construcción del plásmido pCJPS6
(figura 24), se puede conclu/r que el extremo C-terminal del fragmento FI debe de encontrarse
próximo a la mitad del motivo Pl. como ocurre con la proteína N-CPtI. Un resultado similar se
99UflAOOl
obtuvo con el fragmento Fi y el dosfrí/o N.termliial de la lisoalma CPU (NOIi) cvya
secuencia — encuentra donada en el pusrido pCIP72 <Di». 1991). Sm embargo, a pesar de la
similtud existente entre los dominios N-tern,inales de las lisozimas CPI. 1 y CPU. el antisuero
anti-CPL 1 no reconoc/ó con suficiente eficacia a las proteínas derivadas de la Ilsozima CPU y las
bandas de hibridación fueron apenas v/sibles en las membranas de nitrocelulosa.
Otro método indirecto para determinar el extremo Ctermlnal del framento FI consistió
en el anáfisis de las clsukias Ubres de la proteina. Como se ha visto anteriormente (apartado
1.5.4) la Ilsozima CPLI tiene — tres ciuceinas Ubres. Una de estas clstek,as (Cys-238) podría
estar próxima al posible punto de corte por srlpslna. El análisis de cisteinas libres en presencia de
SOS del fragmento FI mostró un valor de 1,7 osteínas por molécula asumiendo pan ésta el peso
molecular obtenido a partir de la electroforesis en ¿eles de pollacrilamida-SOS (aproximadamente
24.000 Da) (figura 26). por lo que el punto de corte debería de enconnrse antes de la cisteina
mencIonada. Aprovechando el alto contenido en aminoácidos aromáticos en la zona prevista de
corte (alrededor de la m.tad del motivo Pl), se calculó el coeficiente de extinción molar de cada
uno de los polipéptidos que podrían resultar de la acción de la tripuina (tabla 7). Usando estos
datos se calcularon los grupos 51-1 por molécula de proteína. Los valores más cercanos a dos se
obtuvieron para los fragmentos cuyo extremo se encontrada entre la usina 203 y la litina 222,10
que estarsa de acuerdo con el peso molecular aparente calculado en geles de pollacrllamida.SDS.
La ausencia de amdnoácidos aromáticos en la zona prevista de corte par. la lisozima CPU
imoidíeron determinar por este método la posición del extremo del fragmento Fi. puesto que
apenas varía el coeficiente de extinción molar de cada uno de los posibles fragmentos.
4.3.1 2 Análisis funcional de las proteínas FI vFl
Teniendo en cuenta que los dominios N.tern,/na/es de las dos l/sozlmas producidos por
ingen/ería genésica son activos, cabria esperar que las proteínas FI y Fi correspondientes
tamb/én a los módulos N-serminales de las lisozimas CPU y CPL7 pudieran poseer asimismo
actividad catalítica a pesar de carecer del dominio C-sern,inal. Para comprobar esta hipótesis se
ensayó su activ/dad catalítica sobre paredes de neumococo que contenían colina o etanolamina
(tabla 8>. Los dos polipéptidos FI y Fi conservan actividad hidrolítica sobre paredes de
looRail. tAOOS
TABLA?. Extremos C-eerniinales probables del fragmento FI
Coc/enter Punto de corte’ 44.rb ¿280c Cys/moléculad
¡ Lys-182 20654 32.246 1,5
Lys.194 22/24 32.146 1.5
Lys-196 22367 32246 1.5
Lys-202 23.029 37.805 1,7
Lys—206 23,505 37.805 1.7
Arg-21 1 24255 46.923 2,2
Arg-212 24.429 48.923 2,2
Lys-221 25.468 50.120
Lys-224 25.929 55.619
Lys-235 27.162 63.632 2.9
Lys-245 28.46~ 70.388 3,2
Lys.249 28.964 70388 3,2
Lys-254 29.807 78.341 36
a Posición del punto de corte de la tripsina referido a la lisozima CFI..
b Peso molecular correspondiente al fragmento resultante.
Coeficiente de extinción molar teórico calculado en base a la composición en aminoác/dos
aromáticos utilizando os parámetros de Fasrnan i /976’>.
d Se realizó una valoración de grupos SI-> libres sobre una muestra del fragmento Pl purificado
cuya absorbancia a 280 nm era de 082. obten/éndose un valor de A412=0,68.
correspondiente a (SHhSxlO5 M. Después se div/dió este valor por la concentración mo/arde
proteina calculada en base al valor de absoitancia y a su coef/ciente de extinción molar teórico,
obteniéndose una estimación del contenido en císteinas libres de los polipéptidos.
102.
M,JL,Aoos
TABLA 8. ActIvidad enzhviádca conipnda da lo. fragrn.ntos PI yF7 ruhtwtta a
la protn¡lis porezipina
• Los tns.yo~ so rflMnron en tanipán fosfato 20 niEl, pH 6.0 sobre paredes de neumococo qu.
contenían co4ina o eunolamnína en su composición. La actMdad enzimhvca ~enedad. en ~n,
liberadas tras 6horas de ensayo por tnicrognrno de proteína en el ensayo.
An*,o*ohc¡ en —.Ración
Enzima Coma Ew,oI.nuna cdMaletanol.mÉna
CPtI 12~lO’ 697 17210
FI lOS 233 0.45
CEla I,1x106 0,2do6 1,3
Fi 132 444 6.36
102ftts&rAoOs
neumococo Igual que en el caso de las prozefrías t4-CPU y N-CFU. vu actividad rntb ser
relatIvamente independiente del tipo de amínoalcohol presente en los ácidos teicoicos de la
pared, lo que en el caso de la proteína FI descaro una posible contaminación de este fragmento
con la enzima CPLI completa. El fragmento FI es unas 0,000 veces menos activo que la enzima
enter> CPU en los ensayos con paredes que contienen colina, pero consena un grado
comprable de actividad sobre paredes que contienen etanolarnin.. El fragmento Fi presenta una
actividad dtásticamente disminuida con respecto a la lisozima CPU sobre los dos tipos de
paredes. sI bien ésta result6 ser de la misma magnitud que la presentada por el fragmento FI.
Eno. resultados confir’nan la hipótesis sobre la funciorojidad del dominio N-tern,ir.al de estas
proteínas y sobre la in,po.-tancia del dominio C-tern,inal en la adquisición de una mayor
especificidad y eficacia caulftica.
Algunas de las caracteÑsticas bioquímicas de los fragmentos FI y FI se muestran en la
figura 27. Pese a la baja actividad que muestran estas proteínas con respecto a las ennmas
completas, eí método altamente sensible del que se dispone para analizar tales actividades puso de
manifiesto, como era previsible, que las dos proteínas seguían comportándose como
muramidasas. según puso de manifiesto el análisis de os productos de degradación de paredes de
neumococo (figura 27>) (García y cok.. 1987). El pH óptimo para la actividad del fragmento FI
se situó en 5,0 <figura 27B). el mismo que el de la proteína ente~, or ~arce.el fragmento Fi
tiene su pH óptimo de actuación a pH 4,75 (figura 278). al igual que el de la enzima CPL7. U
actividad entmgtica de los polipéptidos FI y Fi se inhibí, a bajas concentraciones de tuerza jónica
al igual que la lisozima CPL7, pero no la isozima CPLI (figura 27C). Como se puede observar en
la figura 28. el efecto de la fuerza úrica sobre a estructura secundaría del fragmento FI es
mínimo, pues no se aprecia ningún cambio conformacional detectado en el espectro de dicroismo
circular. U actividad de los dos <ragrre~zcs s~sulz¿ nliibida cspecmcarnente por colina sino
tan sólo por el efecto salino inespecíficci debido a la concentración de esta molécula en el ensayo.
103
75.
50
23
7
o 25 50-a <u~
75
B
1 •
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.3
4
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lOOi
50’
23’
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II 4it•1
‘-y“a -‘a-— — —
— -a — —.—,—. —.
150 SO 250
e£
50 lOO~I <sO
FIGURA 27. Caracceristscas bioquímicas comparadas de las lisozintas CPU y CPU? y losfragmentos FI yF7.fmaLh. .náfl de los productos de degradación de la digestión de paredes celulares deneumococo marcadas con colina radiactiva por medio del fragmento El - las paredes digeridas secrornnografm.ron en una columna de Sephadex G-75 y se contó la radiactividad de 400 ,,l de cadafraectón recogida. que constaba de 1,44 ml. y
0. volumen de eatclusión de la columna. ‘4.volumen total.PaLI. actividad enzimárica con respecto al pH. (.—.). FI: <o’ ‘‘o). Fi.faiC. lítl6cióndelaacgMtdesszlmátkaconlafuemióoka.(.—4CPtI;(o.o).CFLI;3’--8J, FI; <¿-—-a), Fi. Los ensayos se reafiza,~, en tampón fosfato 20 mM pH 6A. y laactividad se refiere al dato obtenido a O mM Nao.
nmJLTbOs
a..
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104
3
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2
0”- —
—1
—2-
—3-.
—4190
Longitud de onda (nm)
FIGURA 28. Espectro de dcroismo circular del fragmento FI en la región del ultravioletalejano.Se usó una concentración de 0.26 mg/ml de proteina FI, y se regisvó el espectro: (—‘——). entampón fosfato 20 mM pH 7,0: e>. en tampón fosfato conteniendo lOO mM NaCÍ
LiADOS
T 1
200 210 220 230 240
loseflATADOS
4.1 2 OfrestIde, conaún enzimas oroceoikicas
La sensibilidad de las enzimas líticas de neumococo y sus bacteriófagos Cp-1 y 4>-? frente a
la acción de otras proteasas también fue estudiad.. U digestión de la lisozima CPU con o-
quimosripsina jI :30 plp) durante 60 minutos a 37~C originó la aparición de un fragmento
resistente de sanito ligeramente superior al del polipéptido FI (Mr -26.000) (figura 29). Este
ft-agn~enco demosut — también nvqrettence a la acción de 1. qulmotripaina puesto que una
incubación más prolongada o el uso de mayores cantidades de proteasa generaron resultados
similares. Sin embargo, la amidas. LYTA y la lisozima CFI) fueron más sensibles a la digestión en
estas condiciones, no pudiendo aislarse un fragmento resistente. Igual que en la digestión con
tripsina, la hidrólisis de la lisozima CPU por quimotuips.na se retrasa osando se afiade al medio
colina; este comportamiento se explicada en base a que el cambio conforniacional producido en
el dominio C-sermunal subsiguiente a la adición del ligando le confiere a esta región una mayor
resistencia a la acción proceolftica. Por último. los ensayos de digestión con proteinasa K
mostraron que todas las enzimas estudiadas resultaron ser mliv susceotibles a esta proteasa
puesto que, a una concentración de 1:30 (plp). las enzimas fueron completamente hidrolizadas en
¡20 minutos de incubación, Usando concentraciones más bajas de proteicas. K (1:100 p/p) en a
digestión de la lisozima CPU se pudo observar, tras 60 minutos de incubación, la aparición de un
fragmento de un peso molecular similar al del fragmento FI. pero que desapareció cuando la
incubación se prolongó dos horas más, por lo que no cabe calificado de resistente a la proteinas.
K.
4.4. Estudios calorfrnéfricos de la eseab¡lidad térmica de la lisozima CPLI
4 4 1 Estudios de DSC sobre la oroteina con,oleta
La estabilidad térmica de la lisozima DV se estudió por calodmetifa diferencial de barrido
(DSC). En la figura 30 se ha representado la curva experimental obtenida para la proteína a pH
7,0. utilizando una velocidad de barrido de 3OCihora, tras corrección de la línea base. El perfil
de la curva muestra una transición centrada a 430C y un hombro a una temperatura de
aproximadamente SOOC. La reversibilidad de la u’amición térmica se estudió analizando la señal
106
~5ULTA DOS
koo A E C D E F G H U
92,0 —
66,2 — -—
43,0 —
3í,0 —
- .-‘
21,5 —
t4,3 —
FIGURA 29. Digestión controlada de la lisozima CPLI con a.quimotripsina.La digestión se llevó a cabo en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 a 3?
0C con una relaciónproteasallisozéma de 1,30, y se tomaron alícuotas a diferentes tiempos. ~¡jjs..A1Marcadores depeso molecular; calles B-F. curso de la digestión a 0. 5, 15. 30 y 60 minutos; ~ digestióna 5. 15, 30 y 60 minutos en presencia dc 25 mM colina. El gel de electroforesis en
107
R[SJJI,TAOOS
oo
u
x<Jox ‘4
o.
o
‘o
FIGURA 30. Reversibilidad de la desnaturalización térmica de la lisozima CPU analizada porDSC.La proteína se sometió a calentamiento hasta una determinada temperatura, de
1ándose enfriar ycalentando una segunda vez. A. curva de capacidades caloríficas de la lisozima CPLI; fi, despuésde detener el primer calentamiento a 46
0C; ~. después de detener el primer calentamiento a560C
30 40 50 801 <sO
108M5011A005
obtenida en un segundo bamdo tras detener el primero a distIntas temperaturas (figura ~
Cuando el pnmer calentamiento se detuvo a 460C solamente se reprodujo después la señal
correspondiente al segundo plco. Cuando se llegó a los SI0C se observó que esta transición
toda,4a era reversible en un 90%. Sin embargo, ya el calentamiento hasta 560C reducía la
reversibilidad hasta el 54%. Por último, cuando el primer barrido llegaba a temperaua
superiores a las de la transición no se obtuvo ninguna señal al proceder al segundo calentamiento.
t,as curvas de capacidad calorífica obtenidas utilizando diferentes velocidades de bando <30,
60 y 90~C/hora) no presentaban variaciones significativas ni en la forma ni en la entalpía de
transición, por lo que puede descartarse una influencia significativa de la etapa irreversible en la
función oCp, lo que permite analizar las curvas aplicando las ecuaciones obtenidas en condiciones
de equilibrio. Así, la deconvolución de la curva de capacidades caloríficas mediante el algoritirio de
Freire y Biltonen (1978a. b, c) muestra la existencia de dos transiciones entre dos estados cuyas
son de 43.50C y 5l,4~C respectrnmente (figura 31). En la tabla 9 se encuentran recogidos
los parámetros termodinárnicos v’a~enwus para cada una de las transiciones, la existencia de las
mismas podría indicar la presencia de dos dominios estructurales que funden independientemente
a dichas temperaturas.
4.4.1.1. EfeczodeloH
Las curvas obtenidas a diferentes pl-ls se representan en la figura 32. y los parámetros que
de ellas se derivan se muestran en la tabla lO. La entalpia tota] no varía significativamente con el
pH. La deconvolución de las curvas indica que el aumento del pH provoca un fuerte aumento en
la entalpía de la primen transición: por otra parte, la segunda transición contribuye casI con el
50% a la enralpía total de desnaturalización de la lisozima CPLI a pH 6,0. mientras que
desaparece casi totalmente a pl-l 8,0. No pudieron obtenerse datos por debajo de pH 6.0 debido
a que la proteína precipitaba a la concentración utilizada.
109
RLSJLTADO$
2
ose es
FIGURA II. Deconvolución de la curva de desnaturalización térmica de la lisozíma CPU1.). curva experimental; (— —), perfil de las transiciones que resultan de la
deconvolución de a curva experimental; ( ). envolvente teórica de las dos transiciones.
7 Cc,
‘lo
TABLA 9. Cmcterfsticas termodinámicas de las proteínas CPLI, C-CPLI y FI a pH
7.0.
a Transiciones determinadas a partir de la deconvolución de la curva.
b Datos de la media de tres experimentos
‘N.D.: No determinado.
Especie Colina (mM> T,(OC) oH0Qcj mok’> OHv,dkJ mol’’) óH0/o%~
CPU 0 43,3 694 41$ ti
-Transición l 0 43,5 364 61$ 0,9
-Transición 2 0 51,4 309 359 0,9
C-CPLI 0 42.9 435 969 0.5
Flb 0 52,1 723 504 1.4
CPLI lO 5l,S 994 1479 0.7
.Transidón 1 lO 51.3 949 lS~ 0.6
-Transición 2 lO N.D.C N.D. NO. NO.
C.CPLI lO 51,9 614 212 0.3
FI lO 52,4 893 445 2,0
lii.
MSJLTADOS
30 15 40 ‘5 50 55 80 85
T <00
FIGURA 32. Influencia del pH sobre La desnaturalización térmica de la lisozima CPLI.Curvas de DSC registradas: (~ — ‘ —) a pI-4 6,0; ( >. pH 7,0; (— —). a pH 8,0,
112RSSJtTAOOS
TABLA lO. Parámet.-os eern,odlnámicos de la lísozima CPLI ydel fragmento FI a
diferentes pHs
CPU Transición 1 • Transición ~ FI
pH ,~ Y~ :H,, T~ jI-<0 7,, oH0
6.0 41,9 1011 41,8 468 50,7 535 61,0 1483
1.0 43,5 894 43,5 564 51,4 309 53.9 873
8.0 41,8 957 41,8 870 47.6 04 49,2 777
a Transiciones determinadas a partir de la deconvolución de la curva.
b Grados centigrados.
Entalpia calorimétrica, en kJ moW
1.
II>kan.¶.oos
4 4 2 Estudios sobre el dominio C.sernainal
Con objeto de comprobar s. las dos transiciones de la lísozama CPU 1 poáhn asignan. a
cada uno de los dos dominios funcIonales de la proteása (ti- yC.rermlnales), se realizó en primer
lugar el estudio por DSC de la proteína C-CPUI. correspondiente al dominio C-cerminal (flgtn
33>. Del termograma se dedulo una única transición con una entalpia de desnaturalización de 455
kJ n,or4 y cuya T era de 42,90C. (tabla 9>. Por unto, la primera de las dos transiciones de la
lísoalma CPU (Te- 43,SOC) po&fa corresponder al dominio C-termlnal de la proteína. La
asipadón del primer pico a la desnasurahacián térmica del doatio C-termlnal se confrnsó en
base a los .-esulrados obtenidos en presencia de colina, tal y como se mes rarA en el aparrado
4.4,4. mIs adelante.
44.3 Estudios sobre el donÉ-do ti-terminal
Para proseg* con el estudio del dominio ti-terminal de la lisozirsia CPL 1 habría que
realizar el mismo tipo de estudios del apanado antenor con la proteína ti-CPU (apartado 42).
Sin embargo ésta se obtiene con muy bajo rendimiento. lo que constituye un obstáculo para la
realización de estos experimentos. No obstante, ciertas características del dominio N.terminal
pueden estudarse utilIzando el fragmento FI (apartado 4.3.1.) puesto que esta proteína se
corresponde con dicha región, a pesar de la indefinicló., de su extremo C-rermlnal.
FI perfil de las curvas de capacidades calorlficas obtenidas en la desnaturalización térmica del
fragmento Fi vanaba en cierta medida de unas preparaciones a otras, a pesar de que no existía
hetereogeneidad en las muestras según mostraban los resultados de electroforesis en geles de
poliacrilarnida-SOS. Asimismo, la forma de los termogramas no indicaba una única transición entre
do. estados (fIgura 34>. Ceo todo. del análisis de las curvas se pueden obtener datos de interés
(tabla 9). So T~ calculad, a pI-I 7,0 se sitúa en torno a los 520C. valor muy parecido al calculado
para la segunda transición de la lisozima CPtI com9lesa (Sí ,4
0C). siendo además independiente
de la presencia de colina. Puesto que los parámetros de la segunda transición de la lisozima CPLI
son dependientes del pH (figura 32 .tabla lO>. se procedió a estudiar el electo del mismo sobre la
desnaturalización térmica del fragmento FI, obteniendose los resultados que se muestran en la
114RESuLTADOS
e —
c
FIGURA 33. Perfil de desnaturalización térmica del domir,io C-terminai de la lisozinn CPU porDSC.
curva de a lisozima CPLI completo; (— —), curva de la proteina C.CPLI,correspondiente al dominio C-terminal(—) significa en ausencia de colina, y U~) significa enpresencia de lO mM colina.
50 95 49 45 55 80 U
¶ <‘O
/
115
ftESuLTADoS
oo,
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¡o
,/1
~1
50 ‘0
‘y
FIGURA 34. Influencia del pI-l en la desnaturalización térmica del fragmento FI.Se representa la curva de DSC del fragmento FI: (—- — —>, a pH 6,0; ( ). a pH 7,0;
—). a pH 8,0,
r
,—‘ \
40 00
116B5SJ4.1AOOS
flgsn 34 y en la tabla lO. Mientras que a pH 7,0 y 8,0 la 7, de la proteína FI es bastante simtar a
la 7 de la primera transición de la Ilsozima completa, las mayores diferencias se observan a pH
6,0. EJ valor de la T,, a este pH (óloq es considerablemente mayor que el calculado para este
dominio dentro de la lisotma CPU (S0.7~q (tabla 5), debido posiblemente a la existencia de
alguna interacción desestabilizadora con el dominio C-terminal que se pone de manifiesto a este
pH -
4.4 4. Efecto de la colina sobre la desnaturalización térmica de la lisozima CPLI
En la figura 35 se representan las curvas de absorción de calor obtenidas en presencia de
concentraciones crecientes de colina. Como puede observarse. la unión del ligando Induce un
aumento de la variación de la entalpía de desnaturalización y un desplazamiento en a To, del
primer pico hacia temperaturas más altas. Hay que señalar también la existencia de una
disminución en la intensidad del pico correspondiente a la segunda transición, particularmente
visible a bajas concentraciones de colina. Cuando la concentración de colina es de 20 mM sólo se
observa un pico cuya lo, es de SI ,5~C. La adición de NaO 0.2 M en lugar de colina no produjo
ningún cambio apreciable en el perfil de la curva referente a la lisozima. de lo que se deduce que
el cambio observado en presencia de colina es debido a una interacción específica de este ligando
con la lisozima CPL 1. Por otra parte, el termograma de la proteína purificada por cromatogralia
de penetrabilidad en lugar de DEAE-celulosa resultó ser idéntico al de la proteína purificada por
este último procedimiento, lo que prueba que tras la diálisis de la proteína no permanece unida
ninguna molécula de colina.
Es muy importante señalar que la adición de colina a la proteína C-CPLI provocó en el
perfil de desnaturalización térmica de ésta unos cambios similares a los de la primera de las
transiciones de la lisozima CPLI (figura ~ lo que apoya la hipótesis de que esta transición
corresponde al dominio C-tenninal de la proteína.
La desnaturalización térmica de la lisozima CPLI en presencia de colina resultó ser
parcialmente irreversible cuando el primer calentamiento se detuvo en temperaturas a las que no
había concluido la transición, y cuando se completaba ésta en el primer barrido no se observaba
117
eflLJL¶AOOS
uN
‘3
Go
FIGURA 35. Variación del perfil de DSC de la lisozima Cftl con colina.Las curvas se obtuvieron en presencia de distintas concentraciones de colina: (—>. O mM:( Y 2 mM; ½— —). 5 mM; — —). lO mM; (— —— —>. 20 mii.
35 40 45 50 55
.T (~O
lISA5SA¶A005
ninguna señal al proceder al segundo calentamiento. Sin embargo tampoco se observó ninguna
influencia apreciable de la velocidad de barrido en el perfil de desnatsraiización térmica de la
proteína en estas condiciones, es decir, no existe control cinético de la transición, por lo que
cabe suponer que el proceso irreversible no cíerce influencia sobre el equilibrio de interacción
con el ligando, lo cual posíbdit. analizar la unión de colina a la proceina seg<,n el método de Fuluda
y cols. <1983). Por tanto, se construyó ci diagrama de vant NoII que se muestra en la figura 36.
Los datos experimentales se ajustan a una recta con bastante precisión; de la pendiente de esta
recta se puede calcular un número de 3,8 sidos de unión de colina en la lisozima CPLI -
119
tau LIADOS
—4
5
6
-4
oo
7
a.3.04
1/Tm (x103)
FIGURA 36. Diagrama de vant Hoff para la unión de colina a la lisozima CPLI.Los datos de DSC se ajustaron a la ecuación óI4,,~/RTo, + nln(LJ constante, donde n es elnúmero de sitios de unión del ligando y L
0es la concentración de ligando libre. El valor de cH~es de 994 kj mork
3.08 3.12 3.16
120S>LTAOOS
5. MECANISMO DE REACCION DE LA LISOZIMA CPU
S.l. Mutagénesis dIrigida del gen cpl 1
Los resultados que se presentan en este apartado tratan de poner de manifiesto la
implicación directa de los aminoácidos Asp-9 y Glu.36 de la lisozjrra CPU en el mecanismo
catalítico. Un problema que suele aparecer con cierta frecuencia cuando se realiza un
experimento de mutagénesis dirigida es la apanción de artefactos en el proceso de manipulación
genétic. que pueden conducir a la aparición de mutaciones indeseadas en otras partes del gen
Por ello, nos propusimos secuenciar el fragmento sobre el que se llevarla a cabo la mutagénesis
con objeto de eliminar por completo la posibilidad de aparición de dichas mutaciones indeseadas,
Por esta razón, se procedió a la donación de un fragmento del gen cpU que, conteniendo la
región de interés (la correspondiente a os aminoácidos 9 y 36), fuera lo suficientemente corco
como para poder secuencíario sin grandes dificultades, La existencia de un sitio SpN en la pc.sición
321 del gen posibilita la obtención de un fragmento que cumple estas condiciones.
El proceso de mutagénesis dirigida de la región 5 dei gen cpu se muestra esquematizado en
la figura 37. Para ello se utilizó el método descrito por Sayers y cois. (1988). Tanto el plásmido
pOPí 00 (apanado 2.1.> como la forma replicativa del DNA del fago Ml 3tgl 30 fueron digeridos
con Xbol y S~N. y con la mezcla de ligación se procedió a transfectar células competentes de E.
cofl TG 1. Las placas incoloras indicaron la presencia de fagos Ml 3 recombinances de los que se
alsió su DNA. Tras un análisis por enzimas de restricción y posterior secuenciación del fragmento
insertado, se eligió el clon número 9 (MI 3-XC9). sobre el que se llevó a cabo la mutagénesis.
S.l .1 - Introducción de aminoácidos nolares
Con objeto de sustituir los aminoácidos Asp~9 y Glu-36 por distintos aminoácidos, se
sintetizaron los oligonucicótidos degenerados que se muestran en la tabla 1 1. De este n,odo. en
cada una de las posiciones 9 y 36 se incluirían los am¡noácidos Mp, kan, Glu, (Sin, His y Lys
Estos aminoácidos poseen una serie de propiedades de carga, polaridad y cama,~o lo
121
Mutogdnesusdirigido
HEXE
aM 13- ZMKK
~ <7>7 kb)
yE6
E\Mc’
a
T4 DNA ii~oso
*4XE E
/09-5FPCIPXxXI
tyy a
FIGURA 37. Mutagénesis dirigida del gen cpU.Enzimas de restricción indicadas: 5. AomHl; E, EcoRI; H, HindIlí: 5. SpH; X, XbaI. El asterisco (‘>índica el lugar de la mutación. Los símbolos II/ denotan la presencia de plásmidos con la mismaconstrucción pero diferentes mutaciones, cuya identificación se encuentra en el texto.
ZSuL1AOO$
E ‘AB
12.2
Rh5JL,TAOOS
TABLA II. Olígonudeótidos diseñados para la nwtagénes¿s dirigida del gen cpU
OLIGONUCLEOTIDO MtflYACION
5, -GAfl’TAT’fl’CTA HA H GrrrCAAGTCAC-3’
5t.CAT>rAAAArTTCTHAHAGTACGAC&.flt
5 ‘-TAWflGTA GCT GVrrCAAG-J
Asp-9- Mp. Ass,, (Síu.(Sin, l-4is, t.ys
Glu-36-. Mp. AsIR, (Síu,(Sin His, Iqs
Asp-9-. Ala
5’ -AAATTTCr GCA AGTACGAC-3’ Glu-36-. Ala
123aflATaDos
suficientemente heterogéneas como para poder obtener algunas conclusiones sobre el centro
activo de la leonina CPU.
1.. obtención de las enzimas mutantes en grandes cantidades es un rqaislzo Indispensable
cuando se quieren estudiar caracter~cicas estnicturales de estas proteínas. Por ello se pensó en la
construcción de un plásmido similar al pO?lOO en el que el gen salvaje fuer. sustituido por el
mutante. U donación directa del fragmento Xbd-Spid en el p¡ásmido pCIP lOO presenta la
dificultad de Ssttg’& el gel~ muante del gen salvaje. Por ello se procedió a la construcción de un
sistema que permitiera la selección directa e Inequfroca de plásmidos con una construcción similar
al pCIPIOO. Así, se extrajo el gen de resIstencIa a Itanamicina del plásmido pUC4K mediante
digestión con Ectt. y se hertó en el pUsm4do pCIPIOO cortado con la misma enzima,
obteniéndose el plásn’ido recombinante pKAN2 (figura 37). Las células de E. cd HBIOI que
contenlan este plásmido eran resistentes a ampicilina y Icanamicina. Como se puede ver en la
«gura 37, la donación del fragmento fld-S$dd rmnante en el mismo sitio del pKAN2 conduce a
la desapa,ición de la resistencia a kanarnidna, por lo que la selección de recombinantes es sencilla.
De este modo. se obtu,ieron los plásmidos pO?lOl, pON II, pORl 13. pCWi3O. pOP2OS.
pOPí13 y pCIP2 17, los cuales permiten la hiperproducción de las proteínas mutantes Asp-9—Clu
(09E). Asp-9-4ys <09K). Asp-9-.Asn (D9N). Asp-9—His (D9H). Glu-36-.Asp (E360). (Síu.
36-.Gln (E360>y GIu-36—tys (E36K). respectivamente. las mutacionesAsp-9-Gln. Glu-36-Asn
y Giu-36--His no pudieron obtenerse a pesar de la secuenciación de una gran cantidad de clones.
S.l 2. Actividad nzln,Atica de los ,nucante
¡
El sistema de expresión del vector p~Nlll.QppP.S>A3 posibIlite, corno se ha visto en el
apartado 2.1. la producción de gandes cantidades de lisozima CPu. Todas las proteínas
mutantes pudieron obtenerse con similares rendimientos a la enzima nativa a partir de extractos
de culovos de E. colí OH 1 inducidos con lactosa. Asimisn,o, todas ellas pudieron purificarse en un
sólo paso utilizando cromatografia en DEAE-celulosa (apartado 1.2.).
La actividad de las enzimas se dtern,inó sobre paredes de neumococo marcadas con [44-
metiq.col¡na. Dada la distinta eficiencia catalítica de las diversas proteínas se fijó el tiempo de
124MESJIJTAOOs
reacción en 30 minutos y el pH e., 5.0 y se vanó la cantidad de enzima ensayada de modo que se
obtuviera, aproximadamente, la nTnt cantidad de radiactividad tetada en el ensayo. Las
enzimas menos activas se ensayaron a pH 6.0 ya que se precisaban en estos casos grandes
cantidades de proteína, la cual precipita a pHs más bajos. Por otro lado, la gran heterogeneidad
existente entre las diversas preparaciones de paredes de neumococo hace que el cálculo de
parimesros como la constante de Michaeh, carezca de sentido, puesto que su valor varIaba de
una preparación a otra.
Los resultados obtenidos de la actividad enzímática de las distintas proteínas se muestran en
la tabla Ii. Sólo en el caso del rnutante E36K no se detectó actividad. Los mutanses D$Ky D9H
mostraron una actividad muy baja. aunque detectable. Las enzimas 0% y D9N conservan una
actividad de aproximadamente el 2% con respecto a u enzima salvaje. Sorprendentemente, las
enzimas mutantes EJ6D y E36Q mostraron una actividad dei 37 y 67%. respectivamente.
actividad anormalmente alta si, corno se supon<a. el residuo de giuúsito esté Implicado en la
catálisis.
5.1.3 Introducción de un aminoácido aoolar
Los resultados presentados en el anterior apartado fueron obtenidos al sustituir los
residuos Mp-9 y Glu-36 por aminoácidos polares, algunos de ellos cargados. Pan comprobar el
comportamiento de un aminoácido apolar en estas posiciones nos propusimos la sustitución de
los aminoácidos Asp-9 y Glu-36 por un aminoácido apolar c’sya inserción no supusiera, en
principio, un desajuste grande en la estructura ternaria de la proteína en esta zona. El aminoácido
que se eligió para este experimento fue la alanina. Al mismo tiempo, se pensó en la construcción
de un doble n’utante fAla-9. Ala.361 en el cual se habría eliminado por completo la posible
,tnplicac.ón de los des residisos ácidos en el mecanismo.
Los oligonucleátidos diseñados para la obtención de los mutantes Asp.9-.Ala (D9A). Glu~
36—Ala (E36A) y el doble mutante <09A, E36A) se muestran en la tabla II. E~ el experimento
de mutagénesis dirigida se hibridó el DNA de cadena simple de M13 que consenla el inserto Xbd-
Sphl con los dos oligonucícótldos al mismo tiempo, lo que permitió el aislamiento simultáneo de
125
SE&Jt¶AOOS
TABLA 12. AdMdad enalmátjca h~ vivo de las pntMnas mutadas en los amlnoéddos
9y Udc la llsoulnm CPLI
1ftadiactMdad liberada en el ensayo Las condiciones fueron: Tampón acetato 23 mM, pH 5,0.
30 minutos. 370C
2 Actividad con respecto a la proteína nativa.
N.D.: No se detectó actividad en ningún caso.
‘Ensayo realizado en tampón fosfato 20 mM, pH 6,0 durante 24 horas.
Mutante 9 36 cpm1 EnzIma (ng) Actividad (%)2
Nativo Mp Glu 751 0.5 lOO
101(096) Glu Ql.. 1266 50 1.7
111(09K> Lys Su NO~ - <0.00001
1 I3(09N> As. Ql.. 921 27 2.2
130(0914) 1-lis (Síu 3180 5400 0,0008’
31409A> Ma Ql.. 1051 $70 0.1
203<63W) Mp Asp 275 0.5 37
213<6314> Mp (SIn 440 0.45 67
211(E3éK> Mp Lys 3063 3600 0.0013’
304<EIAA) Asp Ala 369 5 5,0
30* Ala Ala 324 5000 0,00014’(09A,E36A~
26TAnO!
los tres tipos de nsutantes en un solo experimento. Se s¡guió ci mismo procedimiento descrito en
ci apartado antenor para la obtención de las proteínas mutadas. que se purificaron del modo
usual. Los resultados de la actividad envs,á~ca se muestran en la sabia 1 2. ~i resultado más
Importante fue el hecho de que ci mutanro 1536A poseía un S% de actividad con respecto a la
enzima nativa. Asimismo, el mutante OSA tiene un 0,1% de actividad. El doble musante Ala-9,
Ala.36 posee una actividad extremadamente bala aunque detecrable,
5.2. Análisi, estructural y funcional de las proteínas mucanees
La pérdida de actividad enzimácica de zs proteínas rnucantes puede acribuirse a diversos
factores, como pueden ser la variación de las condiciones óptimas del ensayo o la aparición de
cambios conformacioriales que dificulten el proceso catalítico Para comprobar la primera
hipótesis, se estudió a dependencia de la actividad con respecto al pH. Al realzar estos
experimentos se podo comprobar qie, al igual que la enzima salvaje, todas las enzimas tenían el
máximo de actividad a pH S.Q
Pan determinar en qué mediÉ las mutaciones introducidas en la lisozima CPL 1 podrían
h.ber originaco un cambio eonforrnacional ea la proteína que fuera responsable de a pérdida de
actividad enzirnátaca se realizaron es~ecwcs de dicroísmo circular de todas las proteínas
mutantes. Tao sólo las enzimas 09% , E361( pcarecen tenel una essn,aora sigo diferente a la
proteina nativa (figura 3S), mientras que el resto de las proteína! mutantes no presentaba
variaciones significativas.
5.3. Actividad de las proteínas n,uuntes ir, sívo
Aunque os ensayos u vito demostraban que la mayoría de las proteínas murances
conservaban cierto grado de activdad sobre paredes aisladas de neumococo, una prueba
concluyente sobre la actividad real de estas proteínas sería sc ensayo ir, vive. Los experimentos de
este tipo que se realizan en el sistema de £ fiseumonioe se denominan curación fenotípicC
(toman y Waks, 197S), y consisten en la adición exógena de enzima lítica a cultivos de cepas de
neumococo con el fenotipo Lyt’. es decir, incapaces de autolisarse al final de la fase exponencial
127
USJttAOO!
o
—1
o—2
,~ —3E
E —~<3
o —5Ql
~ —6
.7200 210 220 230 240
Longitud de onda (nm)
FIGURA 38. Espectros de dicroísmo circular en la región del ultravioleta lejano de la proteínaCPLI nativa ( ). el mutante D9K ( ) yel mutante E36K (
liSRISJLTAOOS
de crecimiento, y posteriormente determinar la posible autolisis provocada por a adición de
enzima. En la figura 39 se muestra el experimento de curación de la cepa M31 de neumococo
por la enzima nativa y los mutantes E36Q 8360 (los mía activos vis Mro). La cantidad de enzima
necesaria para provocar la autolisis fue mucbo mayor en el caso de las proteínas mutantes que en
el de la proteína nativa. Se puede concluir de estos experimentos que los mutantes E3ÓQ y E360
mantienen un 13% y un 5%, respectivamente, de capacidad cuwti.o con respecto a a lisozima
nativa. Con este experimento se demostré que, aunque con una eficiencia mucho mis baja, estos
rnutantes poseen actividad in vivo sobr, neumococo.
SA. Requerimiento del componente peptidíco del peptidoglicano para la
actividad lítica de la lisozima CPU
Con obíeto de determinar la importancia de la presencia de los péptidos que componen el
peptidoglicano de neumococo para la actividad enánática de la lisózima CFI), se procedió en
primer lugar a la digestión de paredes de 5. pneumonioe marcadas con colina radiactiva con a
amidasa LYTA, con lo que se separa el componente peptídico del componente glicánico (figura
36>. Los productos de degradación se cromacografiaron en una columna de Sephacsex GIS
como describen García y cols. (1 987> y se recuperó la fracción radiactiva que aparecía en el
volumen de exclusión (figura 40) correspondiente a la cadena glicánica sin el páptido. La posterior
digestión de esta fracción con lisozima CPU no produjo can,bios significativos en el patrón de
elución en Sephadex <3.75 (figura 40). Como la arnidasa LYTA, después de a primera digestión.
podría encontrarse todavía unida a bs residuos de colina do lcs Indos teicoicos de la pared,
dificultando de este modo la interacción de ls lísozima con el aminoalcohol. el producto de la
digestión con la amídasa se trató con colina libre o bien se sometió a una desnaturlízación
ctrmka (7 SC> con ob1eto de disociar la posible enzima unida a la cadena gkánka. Sin embaqo,
ninguno de estos tratamientos permitió la digestión por la lisozima CFI., por lo que habría que
concluir que la presencia del péptido ea necesaria para que a lisozima pueda lle~ar a cabo su
acción hidrolítica.
129
UW1TA005
zo1—2:
Li
ciLi
o
1200
1000
800
600
400
200
o0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
FIGURA 39. Experimento de curación fenodplca de neunlococo con Ilsozimas Cftl mutantes.La cepa tUl de neumococo se cidiróa 3PCyse regiscrólanefelomeerla delculrlvo: ¡—4),control de M31 sin adición exógena de enzima Utica; (o’o>, adición de CRí nativa a unaconcentración final de 39 ng/ml (IS unidades/niq; (e-——.) • adición del imitante E360 (300ng/mI, 75 unidades/mI); (A--A), adición del mutante E360 (800 ng/ml. 200 unidades/mI).Todas las enzimas se añadieron al cultivo a los 40 minutos.
130RSSi ITA005
6000
£5000ca-‘—- 4-000o~3000ÍZ~ 2000o
& 1000
oo
FIGURA 40. Degradación secuencial de la pared de neumococo por la amidasa LYTA y lalisozirna CPL 1.Paredes aisladas de neumococo marcadas con colina radiactiva fueron digeridas totalmente conamidasa LYTA como se describe en el apartado 8 1.3. de Materiales y Métodos. Tras detener lareacción, los productos de la digestión fueron posteriormente cromatograflados en una columnade Sephadex G.75 (.—.>. recogiéndose fracciones de 1,44 ml y contando la radiactividad de0.4 ml de cada fracción, tas fracciones recogidas entre los 9-25 mIde eluido (correspondientesal volumen de exclusión) se dializaron y liofilizaron, volviéndose a disolver en 300 ial d~ tampónSPSH más 200 ¡sí de tampón fosfato 20 mM pH 6,0 y añadiendo una cantidad en exceso delisozima CFI.. La digestión se llevó a cabo durante 16 horas y se procesó como se ha descritoanteriormente (o—--o>. yo, volumen de exclusión;½,volumen total.
25 50 75VOLUMEN (mi)
131áKaLTAOOS
6. APLICACIONES BIOrECNOLOGICAS DE LOS DOMINIOS
TERMINALESDELAS PEPTIDOGLICAN-lIIDROLASAS DE5 PNEUMCY4IAE
6.1. Fusione del dominio C-terrnínal d. la lísezínia CPLI con la B-galactosfdasa
La importancia de la e-galactosidasa en distintos procesos industriales, y su empleo en
técnicas de ingeniería genética como marcador genético fl’oong y Davls, 1983) o coqno
elemento estabilizador en fusiones con otras proteínas (ltakura y cols., 1977: Goeddel y cola.,
1979> ha significado el desarrollo de vectores que contienen el gen IocZ en una variedad de
construcciones que facilitan la obtención de protelilas híbridas con la <3-galactosidasa (Casadaban y
cola.. 1983). Debido a la importancia de esta proteína y a la facilidad de manipulación genética del
gen >ocZ, se eligió este sistema para comprobar si las proteínas hhidas que contienen el dominio
de reconocimiento de colina pudieran ser purif’icables en un solo paso en columnas de DEAE.
celulosa (apartado II.).
6 1 1. Obtención de la oroteána hibrida C-CPL 1 -13-calaetosidasa con el dominio de
reconócimiento de colina como región N.terminal
Uno de los vectores desarrollados para producir fusiones con la 13-galactosldasa. el
plásmido pMC lSTí • contiene el gen freZ excepto los nucicótidos que codifIcan para los primeros
1 aminoácidos de la proteína (que no son esenciales para su actividad~ Casadaban. 1983). El gen
¡ocz se encuentra precedido en este plásmido de una secuencia de donación múltiple (figura 41) y
carece de promotor, por lo que sólo las colonias que lleven el plásmido que contenga una fusión
con un promotor adecuado tendifan color azul cuando se cultivaran en placas conteniendo X-
GAL. La construcción del plásrnido pCMI 6. que contiene una fusión del dominio de unión a
colina de la lisozirna CPU (C.CPti) con la B.galactosidasa se llevó a cabo como se muestra en la
figura 41.81 plásniido pCI1, que codifla panel dominio C.CPI.l (apartado 3.1.1.) (Sánchez-
Puches y cols., 1990). se digirió con asti-II y sus extremos se hicieron romos con el fragmento
lClenovt de la DNA polimerasa 1 de E. ccli. De este modo se obtiene la secuencia del rn que
codifica para ci dominio C-CPLI junto con los promotores l»Ioc (lnotiy. y lnoijye, 1985>. Por
otro lado, el plásmido ptICISTI se digirió con Sant, en donde se insertó el fragmento 84*41 del
1.132
Y F M NSIAl ITt AIG AM 5~
84oN1
1 P GOSt., ATT CCC 650 GAT~. 3’
SA,.’
EJAn?p
{pMOBflt£1760 3-.p\~jE
8.
C-CPLt—— ~—4-6dY F M:G O
S...TAT nc ATG~G6GSAr. .3
’
IPP’-5 pCNt6E 8.3kb Eja
FIGURA 41. Construcción del plásmidopCMl6.Enzimas de restricción mostradas: Bs, 54*41: E, £coRl; P, Pstl; X, Xbill. Se muestran lassecuencIas de nucleósidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de las reglones deinterés. En trazo grueso se representa el gen c’cp¿¡ y en trazo rayado el gen IocZ.
RESA,tA005
•S,’aI
T4 DNA ligas.
133•~jttaoot
pU,mido pali. creándose de este modo una fusión en fase con el gen IocZ. Aa¡, la región W-
terminal de la proteína hbrida coaespor¡derfa al dontnio de unión a colina C-CPI. 1. mIentras que
la región C-tenránal la cor,sótniri. la 8-galactosidasa. La mezcla de ligación se usó para
transformar células competentes de E. coM TG 1. Las colonias con el plásmido recombinante
pCtl 16 mostraron, color azul cuando fueron incubadas en placas con X-GAL La precisión de la
constnjccióu’ se poso de manifiesto mediante análisis de restricción
Uno de los clones recombiniantas E. coá ‘IGl [pCM16> se cultivó a 310C hasta que la
densidad óptica del cultivo medida a 550 nnh llegó a 0.2. El inductor IPTG se aIladió entonces en
una concentración de 1 mM y se prosiguió la incubación durante 16 horas. Los extractos
bacterianos fuero., analizados mediante electroforesis en geles de poliacnilanilda en presencia de
SOS <figura 42>. observándose la Ñpe’pro~ccióo de una doble banda de Mrs 120.000. Estos
extractos se purificaron en DEAE.celulosa mediante elución específica de la proteína con un
tampón conteniendo colina al 2%, ~usJque se habla descrito previamente para la purificación de
las enzimas líticas dependientes de colina y tus dominios C.terminales (apartado 2.1.1). Se
observó que, de igual manera que la proteína C-CPLI. la proteína de fusión C.CPtI 4
¡alactosidasa precipitó tras la diálisis llevada a cabo para eliminar el NaCí y a colina del tampón
de elución, si bien pudo redisolverse en un tampón conteniendo colina 70 mM. (a proteína
purificada se obtuvo con un rendimiento de 25 mgflitro de cultivo, y poseía una actividad de B-
galactosidasa en un orden de magnitud comparable a la descrita para la B-galactosidasa nativa
<aproximadamente 300.000 unidades/miligramo de proteína) (Miller, 1972).
6.1.2, Inmovilización de la oroseina hbida en columna
Para comprobar si la proteína hfrida podía ser inmovilizada en OEAEcelulosa sin perder
actividad, se cargó en columna un extracto de E. col iGl IpCMI6I cultivado en las mismas
condiciones que en el apartado anterior. Después de lavar exhaustivamente la columna con 1,5 M
de NaCí. se ensayó la actividad B-galactosidasa retenida en la columna, y por último se eiuyó la
proteína de fusión con colina. Aproximadamente S,Sxl 0”’ mg de proteína pudieron
inmovílizarse por miligramo de DEAE.celulosa. si bien las condiciones de inmovilización son
susceptibles de ser meíoradas con toda seguridad. Dado que se pudieron valorar íí,S
134
MSuLTAOO5
ABC
e,e
1 a
a
D
k Da
— 200,0
16,2
— 97,4
— 66,2
— 45,0
FIGURA 42. Producción de la enzin’a h~rida C.CPLI.13-galactosidasa.~¡kA~,.extracto de E. coli 10 1 [pCM1 6J cultivado en ausencia de IPTG; gjk.,L extracto de uncultivo inducido con PtO 1 mM; ~ proteína hil,rida C.CPI.l-13-galactosidasa purificada porDEAF-celuiosa;calle 0, marcadores de peso molecular. El gel de electroforesis era del 7%.
135ftKtM,1’AOOS
un.dades/nilligramo de DEAE.celulosa. esto implicaba que la enzima inmovilizada retenía un 63%
de actividad con respecto a la proteína pura.
6.13. Construcción de la oroteina isfrda B.ralaccosidasa-C.CPLI IC-CPLI como re,ión
C.terminafl
En la construcción del plásmido pCfrl 16 hay que sel¶alar que el dominio C-CPL 1 conserva
sus propiedades funcionales de afinidad por colina y sus análogos aunque se encuentra en la región
N.termlnal de la proteína quimérica. Como resultaba interesante comprobar el papel del dominio
CCPL 1 en la posición C-t*rnsinul de una proteína de fusión, se procedió a la construcción del
plásmido pCI II. que permitiría la producción de una proteína ¡trida 13-galactosidas.-C-CPL 1.
que pose. los elementos funcionales Invertidos en su posición con respecto a la construcción
anterior.
El plíamnido ~Q1 1 fue cortado en el sitio (mico EcoPJ que se encuentra en el inicio del gen
que codifica pan el dominio C-CPt. 1 (fIgura 43). haciendo romos los extremos cohesivos
resultantes. Asimismo, el plásmido pMC93 1 (Casadabán y cols., 1 983) fue cortado con las
enzimas &amd-ll y £coRl, haciendo también romos sus extremos. De este modo se obtuvo el gen
locZ. Puesto que se ha descrito previamente que las inserciones en el sitio LcoRI del gen locZ
generan una proteína inactiva (Young y Davis. 1983), era de esperar que la proteina de fusión
también lo fuera. Con la mezcla de ligación se transformaron células competentes de la cepa
JM83 de E. con, Las colonias con el plásnildo recombinante pCMII presentaban color azul en
placas con X-CAL debido a un proceso de o.complementación con la 13-galactosidasa delecionada
de la propia cepa. Cuando se transformó la cepa MCI 116 con el plásmido pCMI 1 todas las
colonias con el plásniido eran blancas, puesto que esta cepa posee una deleción total del gen locZ
y no exBte, por santo, posibilidad de a-comnplemencación.
El cultvo de la cepa recombinante y la inducción de la expresión del gen de la fusión fueron
exactamente las mismas que las que se utilizaron con ia proteína de fusión C-CPL 1
galactosidasa (apanado 6.1). Cuando los extractos deL. colíJM83 con el plásmido pCMl l se
analizan en SOS-PACE (figura 44), se observa una apreciable producción de proteína Itrida. Sin
136
O <3 1 PCGO OCA An ccc
Feo RlATT...
3
a
‘oc
Y- Eco Rl
ROl 1k
74 DNA ligose
C-CPL3—-— ¡2-GolO <3 1.0 P
GGA ATT GAT ccc.
FIGURA43. Construcción del plásmido pCI II.Las enzimas de restricción sel¶aladas son: B, &omHl; E, EcoRl: P, Psd; X. Xbci. En trazo oscurose representa el gen c-cpi! y en trazo rayado el operón de la lactosa. Se muestran además lassecuencias de nucícótidos y las correspondientes de aminoácidos en donde se lleva a Cabo lafusión.
RESuLTADOS
¿-Eco Rl
.3
/ppPj ~
¿4-Gol —,——. C-CPuí
A E Li 1 P 1————eco OAA TTA ATT ccc ATT...3.
157
RtSOLTAOOS
ABC
—n
n —
— e
k Do
— 200,0
116,2
— 97,4
66,2
45,0
FIGURA 4.4. Producción de la enzima hibrida B-galactosidasa.C-CPUI.Calle A, eluido con 505 al 2% de la columna de DEAE.celulosa donde previamente se habíaaplicado un extracto de E. cok JMSJ [pCMIII: calle 8 extracto de le misma cepa culsÑada enpresencia de lactosa 2%; =~ikg.extracto de la misma cepa cultivada en ausencia de inductor.
138fiSSJtTAOOl
embargo, cuando se intentó punticar la proteína de fusión en DEAE-celulosa, se pudo comprobar
que se retenía en la columna de tal modo que no podía ser eluida ni siquiera con altas
concentraciones de colina. Tan sólo se pudo eluir de la columna con SOS. Las razones de este
hecho son desconocidas, aunque una posible explicación es que esta proteína en concreto
adquiera, cuando está unida a la resma, una conformación tal que impida el acceso de las
moléculas de colina al dominio de unión a colina y por tanto la competición con los residuos de
DEfl.
6.1. Conhwucdón de una proesina de fusión C-LTTA-TcRfl. 1
La cadena O de la línea Jur*au del receptor de células T ~Nilsony cols.. 1 98fi> consta de
una región variable, otra constante y dos zonas que las separan {D y fl. Con ob}eto de obtener
anticuerpos que reconociesen las zonas vanable. DyJ del receptor (proteína TcRLI8.l) se ideó la
construcción de una fusión entre esta proteína y el dominio C.terni¡nal de la autolisana LYTA de
S. pneumotioe (C’LYTA). La proteína Cl.YTA posee caracterist¡cas estructurales y funcionales
similares a las de la proteína C-CPt 1, lo qu. le convierte en otro candidato válido a la hora de
construir proteínas hibridas punficables por DEAS-celulosa. La especial distribución de sitios de
restricción del plásmido pal? (Sáischez.Puelles y cois., 1990) le hacía especialmente atractivo
para construir la proteína de fusión C.LYTA.TcRI3S. 1. Este plásmido expresa el gen c-frtA ba¡o el
control de los promotores !p~.4oc (lnouye e lnouye. 9851,
A partir de un. genoteca de diNA de linfocitos 1 humanos se obtuvo el pLmido
pIcl3&,S (figura 45) (Santiago Rodríguez, comunicación personal). Este plásmido contiene el gen
que codifica para la proteína IcRBS. 1 con la secuencia del péptido señal de 19 aminoácidos. El
plásmido se digirió con Ncol y Nindilí, las mismas enzimas con las que se digirió el plásmido pCE?
(figura 45). Con la mezcla de ligación se transformaron células competentes de E. toS Dl-II, y se
seleccionaron por análisis de restricción las colonias que poselan el plásmido recombinante
pCE39IO. Los clones positivos producían una proteína de fusión (M~~~4J.OOO) como se pudo
comprobar mediante el procedimiento de ‘Wessern.blot por hibridación con anticuerpos anti
C.LYTA (datos no mostrados). A pesar de contar con los promotores lpPP-5 y locPO e inducir la
expresión con lactosa ninguna de las colonias analizadas hipercxpresaba ci gen de fusión.
139RESuLTADOS
cDNA-tc R~cDNA/x0río
FIGURA 45. Construcción del plásrnido pCES39I.Las enzimas de restricción se5aladas son las siguientes: 6,N. Neol; S, Smol; X, Xbol. Se muestran las secuencias deamiro~ridos en 1,” re ~ion~ de fusi~v.
BoU; 6a, !oa*4l; E, EcoFil; 1-4, Hindulí;nucícótidos y las correspondientes de
• Bo/ 1Smol O A U y
~ T4 ONA ligoso 5’ Gé~ 6TA .~ 3
IISo
So
So
40RESiJTADOS
Suponiendo que la posible toxicidad de la proteína quimérica hubiera inducido la selección de los
clones menos productores, se procedió a la subclonación del fragmento Xboi.Bon+41 del plásmido
pCE39l0 en el mismo lugar del plásmído plNlll.(Ipp~.S).A3 (lnouye e lnouye. 1985>.
construyéndose de este modo el plásmido pCES39I (figura 45) y transformando células
competentes DH 1. En este nuevo intento se obtuvieron recombinantes hiperproductores por
inducción del cultivo con lactosa, aunque sólo en un 25% de los recombinantes analizados (figura
46). lo que parece indicar que su toxicidad selecciona los clones no productores.
6.2 1 Purificación de la nroteíoa hibrida C-LYTA.TcRJ3B. 1
Cuando los extractos de cultivos de E. cok 04-41 [pCES39II inducidos con lactosa se
centrifugaron con el objeto de eliminar los restos celulares del proceso de sonicado o en el
tratamiento con French.press, se observó que en el precipitado permanecía la mayor parte de la
proteína de fusión. La proteína podía precípitarse con el mismo rendimiento por centrifugación
del extracto a baía velocidad (lOOxg), y sólo podía disolverse por medio de agentes
desnaturalizantes como el SOS o el cloruro de guanídinio. Todos estos datos nos llevaron a
pensar que la proteína quin’érica formaba cuerpos de inclusión, extensamente descritos en la
literatura (Marsron, 1986). Para confirmar esta hipótesis, se procedió al análisis al microscopio
electrónico de las células productoras de la proteína. Como se puede apreciar en las fotografías
(figura 47), se forman cuerpos refringentes que ¡niclaimente se ubican por toda la célula pero que
finalmente se acumulan en uno de los poios de ésta.
FI tratamiento de los cuerpos de inclusión para solubilizar y recuperar en forma nativa la
proteína de interés se hace habitualmente con agenteS desnaturalizantes seguido de un
procedimiento de renaturalisaciór.. Sin embargo, los ‘nécodc’s de solubilrzación utilizados como el
tratamiento con sosa, urea, cloruro de guanidinio y detergentes (Tritón X-lOO, DOC> no
produieron resultados satisfactorios, La incubación del cultivo bacteriano a temperaturas de
300C o menores así como la eliminación, del inductor en el cultivo evitó a formación de cuerpos
de inclusión, pero la producción de proteína era nuy escasa. Por todo ello, se abandonó la idea
de ponficación en la resma de DEAE.celulosa y se procedió a la electroelución de la proteína de
geles de po¿iacrllamida.SOS. Como lo que se pretendía era la obtención de anticuerpos que
1>~1
etsu11A005
A BC DE F 1< Do
—92,0
— 66,2
— 43,0
31,0
21,5
— 4,3
FIGURA 46. Producción de la proteína híbrida C.LYTA.lcRBS, 1.C~lle A extracto de E. coL DH 1 ~pCFS39l1 cultivado en ausencia de lactosa; ~jfl~~.,..e~ctractodea misma cepa cultivada en presencia de lactosa 2%; gikX,, sobrenadante procedente de lacentrifugación del extracto a lOO x ~ cab..,Q..,precipitado de la sedimentación anterior disueltoen SDS 2%; c¡ll~f~...proteína C.LYTA.TcRI3B,l purificada por electroelución de geles depcliacrilamidaSOS; calle F marcadores de peso molecular. El gel de electroforesis era del
1
00$
FIGURA 47. Acumulación de la proteína híbrida C-LYTA.fcRllS 1 en E. <oíl.En la fotografía se muestran c~lvlas de E cotí DHI IPCES391 1 cultivadas en presencia de lactosa2% y recogidas al final de la fase exponencial de crecimiento. No se procedió a corte ni tíntióiialguno.
43NJLTADO5
reaccionaran con la proteína TcRM. 1, carecía de importancia el que se obtuviera la proteina en
for,na desnaturalizada. Tras la recuperación de la proteína mediante electroelución de geles de
poliacnlamida.SDS ~figura46) se obtuvieron anticuerpos que reaccionaban con ella, iniciÁndose
una serie de estudios que todavía se están llevando a cabo.
44
lv 21KU1!2~A
143
1. UNNUEVOMETODODE PURIPICACION DE LAS PEPTIDOCLICAN-
HIDROLASAS DE NEUMOCOCO DEPENDIENTES DE COLINA
El requerimiento que muestra la mayoría de las peptidogficán-hidro¿asas de S. pneuinonioe
y sus bacteriófagos por la presenca de colina en la pared celular de neumococo para poder
llevar a cabo su actividad consiwyó la base del sistema de purificación ideado por Briese y
Hacltenbecit (1985) en soportes de Sepharosa.colina. Aunque el método permitía la
purificación de estas proteínas a honiogeneidad electroforética en un solo paso, el sistema no
estaba exento de inconvenientes, como lo es su alto coste. Por lo tanto, uno de los primeros
objetivos de estaTesis fue la bósqueda de un nuevo sistema de purificación de la lisozima
CPLI. y por extensión, de todas las peptidoglkán4sldrolasas de neumococo dependientes de
co¡lna que manttMera las ventajas del empleo de la Sepharosa-colina pero que no tuviera los
ínconven¡entes citados.
Dado que una de las posibles alternativas era La bósqueda de soportes crornato¡rificos
pu. connMeran análogos de colina. se procedió al anáiisis de la interacción de estas nweín
hidrolasas con distintos análogos de colina. Los experimentos de conretón de la antidasa
LYTA constituyen un sistema rápido y eficaz de comproóación del grado de interacción de
diversos compuestos análogos de la colina con esta proteína. Los resultados que se muestran
en la tabla 2 indican que existe un gran número de compuestos capaces de producir la
conversión de la amidasa a una concentración de 0,1 M, La proteína es capaz de tolerar la unión
de análogos con distintos sustituyences del átomo de nitrógeno y del grupo OH. algunos muy
voluminosos como los grupos bencilo y benzoilo (compuestos E y F) aunque la ex:stencia de
grupos polares como sustituyentes del nitrógeno parece interferir en el proceso de conversión
(compuesto fl. El único requerimiento estructural que parece existir es la presencia de al
menos tres sustituyentes en el átomo de nitrógeno, es decir, la estructura mínima necesaria
para inducir la conresión es la de una amina terciaria alifática. El compuesto límite que cumple
esta condición es la N,H.N.trimetilamina. la cual es capaz de inducir la conversión de la amidasa
aunque a concentraciones superiores a las habituales ~0,3 M>. Las aminas secundanas y
primarias, como la etanolansina. no son capaces de interaccionar específicamente con la
ansidasa LYTA, lo que está de acuerdo con el hecho de lije, cuando la colina de la pared
46
celular de neumococo se sustituye por etanolarnina o N-mesilet.nolamina. la amidasa LYTA es
Incapaz de degradar el nuevo sustrato florrasa, 1 96fi). Estos resultados sugieren que en el
centro o centros de unión de colina de a amidasa, además de una carga negativa que
interaccione con la carga positiva del átomo de nitrógeno del ligando, debe de existir un
entorno hidrofóhico que interaccione con los cres grupos n’.etílo de la molÉcula de colin, y
que a su vez sea lo suficientemente flexible como para poder acon,odar otros grupos más
voluminosos. Por otra parte, los sustítuyentes del grupo OH de la molécula, 0.1 propio grupo
hidroxilo no parecen ser relevantes en el proceso de interacción, lo cual parece lógico si se
tiene en cuent, que el susticuyente de este grupo funcional en la pared celular de neumococo
es ci voluminoso polímero de nbitol fosfato que constituye el ácido teicoico (figura 3>.
Uno ti. los anliogos de colina que pueden converti, la amidas. IrlA es la N.N-
dietiletanolamina (DEAE), componente de laí resinas de DEAE.celulosa. La especificidad de la
interacción se demostró no sólo con el expenn~ento de conven,dn sino con la observación de
que la DEAE es capaz de actuar sobre la autolisína LYTA cuando se aliade de forma exógena a
los cultivos de 5. pneumonioe provocando. al igual que la colina, la inhibición de la amidasa
LYTA e induciendo por tanto los mismos cambios en la morfología de esta bacteria (figura 7).
Todos estos datos sugerían que la resma de D~AE-celulosa podía ser un candidato idóneo
como soporte de afinidad para la punficación de la amidasa LYTA. En la figura 8 se puede
comprobar cómo la cromatografía en DEAE-celulosa posib¿lica la purificación de la amidasa
LYTA a homogeneidad electroforética en un solo paso. La proteína I,YTA procedente del
extracto celular quedó adsorbida tan fuertemente a la resma que ni siquiera un lavado con 1.5
M de NaCí fue capaz de desprenderia de la resma. Sin embargo, el lavado con una
concentración relativamente baja de crílira ~C,íSfi> permitió la recuperación de toda la
proteína LYTA. lo que constituye una medida de la especificidad de la interacción de la arnídasa
con el DEAE. Dada la similitud existente entre los dominios C.terminales de la amidas. UY TA
y de la lisozima CPLI , supuestamente implicados en el proceso de reconocimiento de la colina
de la pared celular, se procedió a ia punficación de esta óltirna enzima por el mismo
procedimiento, obteniéndose el resultado que se muestra en la figura 9. La glucosaminidasa de
neumococo, la enzima lítica codificada por el bactenófago HB-3 de neumococo (Romero y
col,., 1990a> y ovas proteínas que se eswdían en esta Tesis han sido también purificadas por
.47oisoJso,.,
este método coí os mismos resultados Las resinas que contienen DEAE poseen un gran
número de vental s sobre la Sepharosa-colina~ están disponibles comercialmente, no necesitan
preparación previ. , son fácilmente regenerables y existen en una gran variedad de soportes
además de la celulosa, como el dextrano fDEAESephadex) ola acrilamida (DEAE-Biogel).
48Ol$OflON
2. CARACTERíSTICAS CENERALESDE LA LISOZIMA CPLI Y DE SU
INTERACCIONCONCOLINA
Para obtener grandes cantidades de lisozirna CPU se necesitaba construir un sistema de
expresión del gen cpu más eficaz. U construcción del plásmido pCIPIOO (figura lO) posibilitó
la obtención de la enzima con un rendimiento cercano a 35 mg de proteína por litro de cultivo
(figura 9). Ene1 plásmido pCIPIOO ci gen cpU se encuentra regulado por los promotores de la
ipoproteina y del operón de a lactosa del vector plNlll-<lppP.S).A3 <lnouye e lnouye, 1985).
Esta combinación ya habla demostrado ser muy efectiva en cuanto a la hiperexpresión de
genes aunque la producción de lisozima CPU parece ser excepcionalmente alta. Una posible
explicación a este hecho puede provenir de la misma construcción del plásmido pCIPl 00. en
donde se origina la formación de un marco de lectura abierto entre los promotores y el gen
cpU. U existencia de estos pequeños marcos de lectura previos a la secuencia del gen de
interés ya ha sido descrita en sistemas de alta expresión dc genes (Schoner y cols.. 981)
Gracias a la obtención de una elevada cantidad de proteína se pudo proceder a so análisis
por dicroísmo circular (CD). El análisis de los espectros de CD de la lisorima CPLI (figura 13)
permite can cálculo de la estructura secundari de la proteína, con un 19% de a.hél.ce, 3 S% de
lámina B, 32% de giros 5 y 14% de estructura aperiódica, según los parámetros de Bolotina y
col’. (ISEO). La peculiar forma del espectro en la región de 235-220 nm impide un ajuste
preciso en esta zona (figura 1 3A). El mínimo que se encuentra centrado a 230 nm es una
característica que se encuentra en dos serin-proteasas, la quimotripsina (Hunt y Jingersons.
1913) y la elastasa (Gorbunoff y rimashefí, 1972). La aparición de esta banda ha sido
explicada en base a la contribución, en el primer caso, de un criptófano, y en el segundo de
una tirosina, en lugar de una contribución peptidica. Brahms y Brahms (1980) han analizado los
espectros de varios dipéptidos que cons,encn un aminoácido aromático, determinando que la
tirosina y el triptófano muestran una contnbuci.Sn positiva a 225 nm. Por lo tanto, la banda a
230 nm podría explicarse por la presencia de otra centrada a 225 nm debida a la contribución
de los aminoácidos aromáticos de la proteína. Cuando la lísozima CPU 1 interacciona con
colina, la banda a 225 nm aumenta de intensidad llegando incluso a mostrar valores de
eliptacidad positivos (figura 12). El cambio sufrido por esta banda es concomitante con el
49D~OJSON
aumento de intenstíd observado en la bands centrada en los 295 mr del espectro registrado
en la región del ultravioleta cercano (figura l 21 donde sólo pueden medirse las contribuciones
de triptófanos o de residuos ionizados de tirosina. La presencia de una banda positiva centrada
a 225 nm es una característica inusual observada en algunas proteínas como la fib-onectina
(Khan y cols., 1988). la globulina insoluble en frío <Alexander y cois.. 1979) y la ONasa ácida
(Timasheff y Sernardi, 1970). donde este hecho también se ha explicado de acuerdo con la
contribución de aminoácidos aromáticos al espectro. De todos modos, el espectro de CO
registrado en presencia de colina puede explicarse en tÉrminos de composición de estructura
secundaria sin tener en cuenca la interferencia de aminoácidos aromáticos, aunque para ello
habría que admitir que un .43% de la estructura secundaria de fa proceiha la constituyen giros 8
(figura 138).
La hipótesis de la existencia de residuos aromáticos en el sitio o sitios de
reconocimiento de océna en la fisozima CPI, 1 se sustenca en otras observaciones. En primer
lugar. 1 2 de los 1 5 triptófanos de la molécula se encuentran en la región C.terminal de la
proteína, dominio que se supone implicado en el reconocimiento del igando (García y cok.,
1188). La mitad de ellos forman parte del núcleo central aromático que se encuentra en los
seis motivos repetidos que componen esta región (García y cok., 1988), Además, la
importancia de la componente hidrofóbica descrita para la interacción entre la amidasa UnA
y la colina (apartado anterior) parece mantenerse en el caso de la lisozirna CPU 1 puesto que un
compuesto como la N-bencil-N.H4metiletanolamina es capaz de inducir los mismos cambios
en el espectro de dicroísmo circular que la colina mientras que la adición de etanolamina no
produce ningún efecto apreciable en la conformación de la proteína, dato que está de acuerdo
con el hecho de que la lisoajena CPU1 es incapaz de degradar eficazmente paredes que
contengan este amirioalcohol en lugar de colina (García y cols., 1987). Por otra parte, la
emisión de fluorescencia de los residuos de triptófano (dejando aparte una posible
i,ontribución de residuos ionizados de tirosina. de la que no se disponen datos suficientes en la
literatura) se ve afectada por la interacción con colina, la cual provoca un aumento en la
fluorescencia (figura 16). Una explicación a este hecho puede residir en la posibilidad de que la
fluorescencia de los residuos de triptófano se encuentre extinguida en cierto grado por la
accesibilidad a las moléculas de disolvente o por la cercanl~ de grupos amIno o carboxilo
1 50D4SCJSJOÑ
protonados (Beechem y Brand. 985). La unión de la colina provocaría un cambe
conformacional que liberaría a los triptófanos de la proximidad del agente extintor. De todos
modos la accesibilidad de los residuos de criptófano al exterior no debe de variar
excesivamente tras la unión de la colina puesto que no hay cambios significativos en la longitud
de onda del máximo de emisión, indicando que la polaridad del entorno de los triptófanos es
muy similar en los dos casos. Además. a acción extintora de la acrilamida no se afecta
apreciablemente (apartado 2.4.3.).
Los espectros de CD no sufren una variación significativa al incrementar la fuerza lónica
hasta 1 li en NaCí (figura 12), ni ene1 intervalo de pH comprendido entre E> y lO (figura lA).
Por tanto, el descenso en actividad lítica que presenta la lisozima CPU cuando se ensaya en
presencia de NaCí 500 mM o a pH 8.0 (figura II) no debe atribuirse a la existencia de
cambios conformacionales en a enzima en estas condiciones, sino más bien al efecto de estos
agentes sobre el estado de ionización de ciertos residuos importantes para la catálisis o sobre
la componente electrostática de la interacción con el suscrato. La fuerza iónica interfiere en la
unión de colina a la lisozima CPL 1. ya que los cambios conformacionales producidos por el
ligando revierten, en parte, en presencia de 0,5 M de NaCí (figura 12). sugiriendo cierto grado
de interacción electrostática entre la proteína y la carga positiva de la molécula de colina. La
unión de la colina a la lisozima CPL 1 es completamente reversible, puesto que tanto los
espectros de CD de la proteína purificada por DEAS-celulosa y dializada para la eliminación de
la colina como los de la misma lisozima purificada por cromatografía de penetrabilidad, donde
no se precisa la presencia de colina, resultaron ser idénticos.
Como se ha puesto de manifiesto a partir del análisis de los resultados obtenidos por la
valoración calorimétrica de la lisozima CPLI con colina a 250C (figura 18). la enzima posee un
único tipo de sitios, con una entalpia de interacción 0H258 = -160.3k) mot
t y una constante
de disociación de 2.4 mM. Este valor está de acuerdo con los datos obtenidos a partir del
efecto de la concentración de colina sobre la actividad enzimática <figura 19), el espectro de
dicroísmo circular (figura 19) y la fluorescencia de los residuos de triptófano (figura 20). En
todos estos casos la mitad del cambio observado se produjo a una concentración de 2-3 mM.
A pesar de tratarse de una alta constante de disociación, la lisozima CPLI mantiene una
151OllOflON
extraordinaria afinidad por los residuos de dietilaminoetanol en las resinas de DEAE.celulosa
El hecho de que la concentración efectiva de D!AE en la columna llega a ser del orden de 1 $0
mM, unido a la posible existencia de varios sitios de unión (apartado ~ aseguraría la
saturación de la proteína con ligando aunque el equilibrio de interacción no estuviera
favorecido.
Uos valores obtenidos para los parámetros terniodinámicos asociados a la formación del
complejo ljsoz,ma-cofina muestran que el proceso de unión del ligando está desfavorecido
enta~ópicamente. siendo la contribución de la entalp¿. el factor determinante del valor negativo
de la energía libre.
La valoración de las cisteinas litres de la lisozinia CPU sigue una cinética peculiar. Dos
de las tres cisteinas de la molécula reaccionan con el DTNS en condiciones nativas mientras
que la detección de la tercera sólo se consigue cuando se demnawrahza la proteína. Al analizar
el contenido en cisleinas libres del dominio C.tern,inal de la proteína (apanado 4.2. de
Resultados) se observa que la valoración de su única cisteina se consigue únicamente
desnaturalizando la proteína, lo que sugiere que esta cisteina (Cys.238) se encuentra oculta en
el interior de la lisozima CPUI y que moléculas como el DTNB sólo pueden acceder a ella
cuando la proteína está desplegada.
En cuanto a la localización subcelular de la lisozima Cal en E. col, los resultados de la
tabla 4 parecen indicar que la proteína se ubica en la célula de un modo parecido al descrito
para la arnidasa UYTA (Din y cok., 1 989), es decir, débilmente asociada a la cara periplásiníca
de la membrana celular de E. col!. Al igual que la amidasa. la lisozima CPUI carece de Una
secuencie dpica dc un péptido señal Ñ.terminal que pudiera dar cuenta del proceso de
transiocación a travÉs de la membrana. Tampoco se observa ninguna secuencie sdlal interna
corno se ha descrito para la ovoalbúmina (Pugsley y Schwarsz, ‘985). los mecanismos de
secreción proteica en procariotas que no involucran un péptido señal requieren proteínas
adicionales especificas para cada caso (Holland y cols., 1986; de Graaf y Oudega, 1986). por
lo que es probable que éste no sea el caso de la lisozima CFI. 1 en E. cok. Se trataría por tanto
de un caso peculiar de secreción sin péptido señal.
O~OJSON
3. LA ESTRUCTURA MODULAR DE LAS LISOZIMAS CPLI Y CPU
La teoría modular de la evolución de las proteínas establece que, con respecto a algunos
procesos evolutivos, ciertas proteínas se encontrarían estructuradas en unidades más
pequeñas llamadas módulos que poseen una determinada funcionalidad que se mantiene con
independencia del resto de la proteína en donde están incluidos, permitiendo de este modo a
la proteína adaptarse a un nuevo entorno <Blake, 1978) adquiriendo una nueva funcionalidad
mediante la captación o intercambio de las secuencias correspondientes a dichos módulos por
recombinación genésica (Gilbert. 1978). La especial distribución del genoma de los organismos
cucarióticos podría facilitar el reordenamienro de secuencias de DNA posibilitando así la
aparición de proteínas h~ridas construidas en base al intercambio de estos módulos (Altierts y
cols,, 1983). El concepto de módulo varia según los autores: mientras que para 8otstein
(1980) un módulo es un conjunto de genes que cumplen una función biológica específica, para
Doolittie (1985) los módulos son secuencias de un gen que codifican para un dominio
proteico. Por último, también se ha propuesto que los pequeños péptidos de conformación
definida son los módulos primordiales que constituyen las protemnas (DuBose y Mart], 19891
La comparación de las secuencias de aminoácidos de las enzimas líticas UllA, E)U.
UllAIOI. CFI]. CFI.? y CPL9, (García y col>.. 986.1990; Díaz, 1991) había conducido a
la hipótesis de que el sistema de las enzimas líticas de neumococo y sus bacteriófagos podría
incluirse dentro de la teoría modular de evolución de las proteínas. Según eso hipótesis, estas
enzimas estarían estructuradas en dos módulos o dominios: el INI-terminal, donde se ubicaría el
centro activo, y el C.cermínal, responsable de la interacción con los residuos de colina del
sustrato (apartado 2.4. de la Introducción>. La construcción de enzimas quiméricas por
intercambio de los dominios INI y C.terminales <Díaz y col,.. 1990, 1991> significó un gran
avance en la confirmación de esta hipóteos
Un primer dato que estaría de acuerdo con la estructuración modular de la lisoznna
CPUI lo constituyó la donación y expresión del dominio C.terminal de la lisozinsa CPLI
(proteína C.CPLI) (figura 21). El dominio CCPLi se purificó en un solo paso mediante
cromatografía de afinidad en columnas de DEAE..celulo,a (figura 12) al igual que la lisozima
52DISOiSiON
.2L1 corriplera. los .e indic=baque su capacidad para el reconocimiento de colina se mantenía
intacta aun en aurencia del dominio ti-terminal. Otros experimentos confirniaron la
funcionalidad del dominio C.terminal de la lisozima CPUI en cuanto al reconocimiento de la
colina. Por una parte, la colina induce específicamente cambios conformacionales en el
espectro de CD de la proteína C.CPLI de la misma naturaleza que en la estructura de la
lisozima (figura 23). de modo que, en los dos catos, se produce el incremento de intensidad de
las bandas centradas a 295 y 225 nm. Por otro lado, la proteína C.CPLI puede reconocer la
colina de los ácidos teicoicos de la pared de neumococo y de este modo bloquear la acción
catalítica de las enzimas UNTA y CPUI (tabla 5) ya que dificulta la accesibilidad de estas
proteínas al aminoalcohol. Un resultado similar se ha conseguido con el dominio Ctern,inal de
la amidasa LYTA (Sánchez-Puches y cols., 1990).
De igual modo que se hizo con el dominio C.ternsinal. se realizó el estudio estructural y
funcional de la región N-terminal de la lisozima CM. 1 (proteína N.CPL 1). Este dominio se
expresó en E. cok como se describe en la figura 24. La proteína N-CPUI posee un cierto
grado de actividad lítica de tipo lisozima sobre paredes de neumococo, aunque &ásticamente
disminuida con respecto a la hisozima entera (tabla 6). Sin embargo, la enzima N-CPLI degrada
con la misma eficiencia paredes que contienen colina o etanolamina en su composición, lo cual
es lógico si tenemos en cuenta que no está presente la región de la proteína capaz de
reconocer el aminoalcohol de la pared. Por otro lado, los experimentos de proteolisis
controlada de la lisozima CPUI con tripsina permitieron la obtención de la región N-termin.l
intacta de la enzima (proteína FI) (figura 26). La digestión tríptica de la lisozirna CPU? origina
asimismo a apanción de un fragmento resistente (F7) (figura 26) que también coincide con la
región N-terrninal de la proteína. Las proteínas FI y FI son también activas aunque en mucha
menor medida que las lisozimas enteras (tabla 8). U contervacón en estas proteínas de una
especificidad enauirnática muramidásica. como se pone de manifiesto en la figura VA, concede
una gran importancia a la actividad enzimática de los fragmentos a pesar de su baja eficiencia.
De nuevo, la actividad mostrada era indiferente con respecto a la presencia de colina o
etanolaniina en los kidos seicoicos de la pared. Todos estos resultados, junto con la
producción por ingeniería genética de los dominios N-ternslnales de la amidasa UYTA <proteína
N-LYTA) y de 1 lisozima CPL7 <N-CPLZ) (DIn, 1991) permiten afirmar con toda seguridad
54DiSOJSON
que las regiones N-terminales de las enzimas incas de neumococo y sus bacteriófagos sfln
efectivamente las responsables de la actividad enzimatica, y que pueden adquirir una
conformación activa en ausencia de los dominios C terminales rospectivos.
Puesto que los dominios Si y C.terntnales conservan su funcionalidad en ausencia del
otro dominio, cabe considerados como módulos, según la clasificación de Doolíttle (1985). La
baja actividad catalítica mostrada por los módulos N terminales con respecto a las proteínas
enteras permite suponer que dichos módulos pudieron ser en un tiempo enzimas funcionales a
las que la adquisición del módulo C-terminal aportó un aumento considerable en la eficacia
catalítica debido a que significó una melora del sistema de reconocimiento del sustrato
insoluble, añadiendo al mismo tiempo una mayor especificidad en este proceso.
La digestión de las lisozimnas CPLI y CPL7 por diferentes enzimas proteoliticas como la
tripsina conduce en ciertos casos a la aparición de fragmentos resistentes (figuras 26 y 29) lo
que consituye una prueba adicional en favor de a existencia de dominios en la proteína. En el
caso de las digestiones llevadas a cabo con cripsina puede obseniarse que las cinéticas de
degradación de las enzimas CPLI y CPL7 que llevan a la aparición de los fragmentos FI y F7
respectivamente, es muy diferente (figura 26>. Mientras que a tiempos de digestión cortos el
fragmento F 1 aparece libre de productos intermedios de mayor peso molecular, la aparición
del fragmento Fi es simultánea a la aparición de otros dos productos de pesos moleculares
intermedios entre este fragmento y la liscaima CPU?. Dado que las proteínas FI y Fi
constituyen los dominios N.termínales de las lisozámas, la cinética de degradación debe de
relacionarse con la estructura del dominio C.cern,inal, que es el que resulta digendo. La
comparación del tamaño del fragmento FI con el de la proteína N-CPL 1 (figura 25) unido a
pruebas indirectas como la valoración de los grupos SH libres <tabla 7) induce a pensar que la
zona límite de proteolisis de la lisozima GPI. l por trípsina se encontraría aproximadamente
situada en la mitad del primero de tos seis motivos repetidos que forman la reg.ón Cterminal
de la proteína <motivo Pl) (figura 5). Estos resultados estarían de acuerdo con la predicción de
estructura secundaria que se muestra en la figura 1 5. según la cual la región C-terminal sería
rica en estructuras de tipo giro 13 y ordenación aperiódica que favorecerían teóricamente la
accesibilidad de las proceasas a los enlaces susceptibles de hidrólisis, mientras que e1 dominio
155tisa,SoN
iNi-terminal mostraría una estructura más compacta. Cabría resaltar ~u: ~ y motivo k se
predice un alto contenido de giros 13, de los cuales se tonote su tendercía situarse en :5
superficie de las proteínas, lo que sugiere que este motivo constituye una especie de finke,
entre los dominios Si y C-terminales y que debe de tratarse de una zona de fácil acceso para la
tripsina
Por otro lado, la adición de colina al medio de reacción origina un retraso en la digestión
de la lisozima CPUI tanto por tripsina como por quimotuipsina (figuras 26 y 29). lo que
indicaría que la colina induce un cambio conformacional en el dominio C.terminal que le haría
más resistente a la acción de la proteasa.
El estudio de la degradación de la lisorima CFI.? por trlpslna permite obtener otra serie
de conclusiones. La aparición simultánea de tres fragmentos a tiempos cortos significa la
existencia de otros tantos sitios de proteolisis Igualmente accesibles a la proteasa. Puesto que
el dominio C-terminal de la lisozin,a CPU? está formado de tres motivos exactamente iguales
en secuencia (M 1, Ml y M3) (figura 5) abría esperar que la trlpsina actuara con igual
probabilidad sobre cada uno de ellos. Cada motivo posee cuatro aminoácidos básicos situados
en las secuencias Glu-Arg.Tyr, Asn-Arg.Gly. Asp-Uys-Vai y Ala-Arg-Clu. En tres de estas
regiones existen aminoácidos ácidos contiguos en secuencia a los aminoácidos básicos; este
hecho es conocido como un factor negativo en cuanto a la acción proteolítica de la tripsina
lMihalyí, 1972). Por tanto se puede especular con la posibilidad de que el dominio C-terminal
de la lisozima CPL7 tenga un estructura trilobular a causa de la disposición de los tres motivos
tI 1 a M3, con las secuencias AsnArg-Gly de cada motivo situadas en la superficie de la
rnotéctala e igualmente accesibles a la trípsina.
La curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC) obtenida para la lisozima CPU 1
puede descomponerse en la suma de dos transiciones <figura 3 1>. La deconvolución de una
í:urva de DSC en varias generalmente es indicio de la existencia de dominios en la proteína.
izada uno de ellos con unas caracrensticas termodinámicas diferenciadas del resto (Privalov.
1989; Mevdev Y cols.. 989). La comparación de las dos transiciones mencionadas con los
dominios sintetizados individualmente permite asignar la primera de las transiciones de la curva
56OI5OJSON
de DSC de la lisozima CPLI al dominio C~cerminaI puesto :ue además tese esúa
presumiblemente implicado en el reconocimiento de colina y la adición dei ligando provoca c>s
cambios más destacables en la primera transición (figura 33). De igual modo, la segunda de las
transiciones correspondería al dominio 54-terminal.
El perfil de absorción de calor de la lisozima CPU sufre variaciones significativas en ci
rango de pH comprendido entre 6,0 y 8.0 (figura 32.1. La deconvolución de las curvas posibilica
ci seguimiento de los dos dominios. Así, mientras los parámetros del dominio C-terminal no
muestran cambios importantes, el dominio 54-terminal parece desestabihízarse conlorme
aumenta el pH (tabla íd). pues la entalpía de la transición disminuye drásticamente mientras
que la 7~ baja. El fragmento FI parece seguir el mismo comportamiento (figura 34),
poniendose más en evidencia a pH 8,0 la asimecna de la transición, Es interesante comprobar
que mientras la7m del fragmento FI a pH 6,0 es de 61 0C, a T~ de a segunda transición de la
lisozima CPLI completa a ese pH es de 50,7<, considerablemente inferior. Este resultado
indicaría que la interacción entre el dominio C-terminal y el N-terminal provoca una cierta
desestabilización de éste último cuando se encuentra formando parte de la lisozima.
La adición de colina provoca una estabilización del dominio C.termínal, que se traduce
en un aumento de la T,, y de la entalpLa de desnaturalización (tabla 9). Este dato estaría de
acuerdo con el hecho de que la presencia de colina aumenta la resistencia del dominio C
terminal a su digestión con proteasas (figuras 26 y 29). La saturación con el ligando da lugar a
una curva con una sola transición (figura 33~, aunque no se puede distinguir entre la posibilidad
de que la proteína se esté desplegando cooperasivamente o que las dos transiciones ocurran a
temperaturas muy parecidas. El hecho de que a baias concentraciones de colina se observe una
disminución en la entalpía de la transición asignada al dominio Ncerminal parece corroborar la
primera de las hipótesis, puesto que la adición de colina al fragmento FI no induce cambios en
éste. Un caso parecido a éste es el de la hexoquinasa (Takahashi y cols., 1981). Esta es una
proteína con dos dominios entre los que existe una hendidura que es donde se une Su
sustrato, la glucosa. La unión de esta molécula provoca un acercamiento entre los dos
dominios que termina por cerrar la hendidura en donde se encuentra la glucosa. de modo que
la proteína funde cooperativamerNte con una sola transición.
4. MECANI 140 DEREACCIONDE LA LISOZIMA CPU
Los experim ntos llevados a cabo por Fouche y Hash en 978 sobre la lisozinna del
hongo Choloro convujeron a la formulación de la hipótesis de que dos aminoácidos ácidos. el
Asp-6 y & Glu-33 estarían implicados en el mecanismo de acción catalítica. La comparación de
secuencias entre la l,sozlma de Choloro y la lisozima CPtI reveló una gran similitud en la región
amino-terminal de las moléculas, destacándose la conservación en la secuencia de la lisozima
CM. 1 de los dos aminoácidos ácidos presumiblernente implicados en la catálisis (Asp-9 y Glu-
36) (figura 4) (García y coIs. 1988). Es necesario recordar que el mecanismo propuesto por
Blake y cois (1 ‘Sl) para la acción catalítica de la lisozima de clara de huevo de gallina <HEWU)
supone la participación de un residuo de ácido aspártico (Mp-Sl) y otro de glutámico (Glu-
35).
La mutación de los residuos Asp-9 y Glsa.36 de la lisozima CPUI conduce a una sene de
resultados diversos, pero cabe desucar el hecho de que la sustitución de los aminoácidos
ác:idos no elimina completamente la actividad lítica de la lisozima sobre paredes de neumococo
<tabla 12). La sustitución del Asp-9 por Asti origina una proteína mutanee con un 2% de
aí:tividad comparado con la enzima nativa, mientras que el cambio de Glu-36 por <Sin sólo
provoca un 33% de pérdida de eficiencia catalítica. Si el papel de estos dos residuos fuera tan
esencial como suponen Blake y cols. (1967) o Fouche y Hasln (1978) dichas mutaciones
tentirlan que haber conducido a una proteína completamente inactiva.
Desde la formulación de la hipótesis de Slalce r cols. <1967> <capitulo 3 de la
Introducción) (figura 6), se han realizado muchos experimentos que estarían de acuerdo con el
mecanismo propuesto, aunque otros no se ajustan al modelo. Ciertos autores (Sinnott, 1987)
no creen que el oxocartocatión intermedio del residuo de ácido murámico sea lo
suficientemente estable como Flara poder esperar a la difusión del grupo saliente y la entrada
de una molecula de agua, sobre todo cuando existe un aminoácido como ci Asp-Sl, cargado y
-elativamente cercano. Por unto, según este modelo, el catión reaccionaría con eí Asp-S2
originando un intermedio covalente. Aunque no hay datos suficiences que permitan dilucidar
entre los dos mecanismos, según Sinnou el intermedio covalente es completamente necesano
1 58oiscuaoN
para explicar el mecanismo de otras gi:cosidasas que, corno la HEWL, actúan con retención de
configuración. FI papel del Asp-52 en ~:acatálisis es también discutible teniendo en cuenta el
trabajo experimental realizado por Mslcolm <ida. 198%. en el cual se sustituyó dicho
residuo por su amida (Asn-52) mediante mucagenesís dirigida, con lo que se obtenía una
proteína mutante que todavía conservaba un 5% de actividad con respecto a la enzima nativa
sobre paredes de M. fuseus. Asimismo, el trabalo teórico de Dao-pin y cols <1989) sobre el
campo electrostático calculado en la zona alrededor del sitio activo de la lisozima induce a
pensar que la carga neta del Asp52 no sería esencial para la actividad catalítica, puesto que las
interacciones electrostáticas en el centro activo, consideradas como muy importantes en e
mecanismo catalitico. no dependerían del estado de protonación del ácido aspártico. Por
último, aunque ha sido postulado Gollés y Jollés, £984) que en la lisozima de clara de huevo de
ganso (GEWL), los residuos Glu-73 y Asp~86 podrían corresponder al Glu-35 y Asp-52 de la
HEWU. una comparación de las estructuras tridimensionales de las enzimas HEWL, GEWL y
NL (Weaver y cok.. 985> mostró que ninguno de los dos residuos Asp-86 y Asp-97 de la
GEWL se encontrarían en posiciones comparables a los correspondientes Asp-52 de la HEWL
o Asp.20 de la NL. sino a distancias considerablemente grandes y, por tanto, más lejos del
enlace a hidrolizar.
Tamblén existen puntos de controversia en cuanto al proceso de protonación del grupo
saliente (sobre el 04 del residuo E del sustraco, según la nomenclatura de Blake y col,..
967), atribuido al residuo Clu-35. Por ejeniplo. una parte de la secuencia de la lisozirna de A.
subtilis YT-25 es similar a la secuencia de la HEWL que contiene a los aminoácidos ácidos
presentes en el centro activo (Kamei y cols., 1988). El examen de estas secuencias similares
revela la existencia de un residuo de ácido aspartíco de la lisozima de A. sufreilis situado en una
posición análoga a la del Asp.52 de la HEWL, pero no existe ningún aminoácido ácido que
pudiera corresponder al Glu-35. Del mismo modo, no hay acuerdo sobre la función real del
aminoácido <Síu. II de la lisozima del bacteriófago T4 (T4L). el cual según algunos autores
corresponderla al Glu.35 de la HEWL, afirmación que no resulta tan evidente para otros
(Anderton y col,., 1981; Sinnott, 19871. puesto que en laNLelGIsal 1 se encuentrasituado
consparatiramente más lejos del 04 del residuo O, además de escar muy cera de un residuo
de arginina (Arg-145), interaccionando con él por medio de un puente salino que supondría la
159O<satsdON
deslírotonaclón de; grupo ácido. Los mismos autores han sugerido 1; posibilícad de que la
proconación del grupo saliente puede llerarse a cabo por una molécula de agua, puesto que
hay espacio para ella entre el Glu-i fi y el residuo O de la cadena glicánica. moto y cols. (1972)
resaltan el hecho oc que la lisozima es capaz de catalizar la hidrólisis de la pared celular a pH 9,
donde el GIu-35 se encontraría presumiblen’ente desproronado, lo que sugeriría que el papel
de este residuo como catalizador ácido no es esencial. mientras que su carga negativa a esa pl-i
podria contribuir a la estabilización ti4! lón carbonio. De todos modos, cabria la posibilidad de
que el pl(8 del Giu-35 pueda alcanzar valores más altos que los calculados tras la unión del
sustrato. Por último, es necesario señalar el hecho de que las glicosidasas en general pueden
catalizar la hidrólisis de compuestos de glicosil-piridinio en procesos en los que la protonación
del grupo saliente es imposible, adquiriendo por tanto gran importancia en esta clase de
enzimas otro tipo de interacciones no covalentes además de las propuestas. Todos estos
datos llevan a la conclusión de que aún permanecen puntos oscuros en el mecanismo descrito
por Blake y col, (1 967), a pesar de consdtuir uno de los mas estudiados.
Al analizar las secuencias amino-terminales de las lisozimas de los fagos Cp- 1, mvi y 74,
así como las lisozirnas de C. ocetobutifcum 5. globisporus y Cholora (figura 4). se observa que en
todas, excepto en la TAL, se conservan los residuos Asp-9 y Glu-36 de la lisozima CPLI
E:itisten otros aminoácidos que también se conservan en la misma posición, como son Gly-26,
Lys-33 y Tyr-40. Otras posiciones se encuentran muy conservadas. Mt el an,ii’oácido lO es
valina o isoleucína; el residuo lA es en casi codos los casos una glucamína, aunque en la lisozmma
CPU 1 es una asparagina el aminoácido 31 es isoleucina o tirosina; el 32 es isoleucina en casi
todos los casos; el residuo 35 es treonina excepto en la CPU 1 • en donde se encuentra una
serna; por último, eí aminoácido 37 es mayoritariamente una glicina. Induso puede
encontrarse una cierta similitud entre una pequeña región de la T4U y el resto en la posición
16, correspondiente al glutámico presumiblemente implicado en el centro activo de la lisozmma
de Choloio y de la lisozama CPU 1, si bien este aminoácido no ha sido descrito como esencial en
el mecanismo catalítico de la lisozima del fago T4 (Anderson y cols., 1981).
Por otra parte, parece que los experimentos de Fouche y Has>, <1978) sobre el centro
activo de la lísozima de Choicto llevaron a los autores del «abajo a obtener una serie de
l 50D45OJ5iON
conclusiones demasiado aventuradas a partir los resultados preserítadot. La modificación
química de los residuos ácidos de la proteína conduce a la pérdida toral de actividad, mientras
que la misma modificación en presencia de un inhibidor competitivo permite la recuperación
de un 40% de actividad. Los análisis demuestran que los dos aminoácidos Asp.6 y Glu-33 se
protegen de la modificación química en presencia del inhibidor, pero no demuestran que los
dos sean esenciales en la catálisis, sino que al menos uno de ellos loes,
En cuanto a la lisozima CPLI, los experimentos de mucagénesis dirigida parecen
demostrar que el Asp-9 es un residuo muy importante en el proceso catalítico. En el mejor de
los casos sta sustitución se corresponde con un 2% de actividad con respecto a la proteina
nativa. La inclusión de un aminoácido cargado positivamente (Lys) o apolar (Ala) provoca la
inactivación total o casi total de la proteina. Sin embargo el residuo Glu-36 parece tener
mucha menos importancia en la catálisis (tabla 12). El componente estérico parece tener más
importancia en este caso que el componente de carga, pues el mutanre E360 es dos veces
más activo que el munante E360. Los mutantes E36Q y E360 son capaces de actuar in vivo
sobre la pared celular de neumococo como se desprende de los experimentos de curación
fenotipica (figura 39), aunque con una eficacia de un 10% con respecto a la proteína nativa. La
extraordinaria sensibilidad del método de valoración enzimática sobre paredes marcadas
radiactivamente permite cuantificar muy bajas actividades catalisicas (como la del doble
mutante Ala-9, Ala-36). las cuales habrían podido pasar desapercibidas si se hubieran seguido
otros métodos de valoración mucho menos sensibles.
Es necesario señalar que, aparentemente. el componente peptidico del peptidoglicano
de la pared celular de S. pneumon’oe parece ser esencial en ci mecanismo de reconocimiento
del sustrato por parte de la lisozima CPLI (figura 40). Los diferentes tipos de lisozimas
también presentan distintos requerimientos de sustrato <Schindler y cols.. 1977> Así, las
lisozimas de tipo c y g son capaces de hidrolizar los polimeros de NAC-NAM tanto si los
residuos de ácido niurárnico están sustituidos con ci péptido corno si no lo están, si bien las
lisozimas de tipo c son también capaces de hidrolizar polimeros de NAO (actividad qualtinasa),
al contrario que las de tipo g. Las lisozimas de plantas, sin embargo, poseen una esrncta
especificidad sobre oligosacáridos de quitina <poli-NAG), presentando una baja actividad sobre
It.OlsaiSiON
las cadenas de N.A S-NAM sustituidas con péptidos o nc.9or mci, las l~sc~.rr: :.. agos
como el YA sólo s.>n capaces de hidrolizar la cadena glicánica aiK donde los residuos de ácido
mulámico se encu.¿ntran sustituidos con ci componente peptidico. Este hechc=indicada una
adaptación de la enzima al sustrato, t~ue en este caso es el peptidoglicano de E. coli donde la
mayoría de los residuos de murámico están sustituidos. El requerimiento del pkptido por parte
de la lisozima CPLI puede estar indicando asimismo este tipo adaptación a la pared celular de
neumococo.
Oi$00510N
5. APLICAcIONES SIOTECHOLOGICAS DE LOS DOMINIOS C-
TERMINALESDELAS PEPTIDOGLICAN-MIDROLASASDES. PNEUMONIAE
La extraordinaria afinidad de los dominios C.terminales de las enzimas líticas de la pared
de neumococo por OFAEcelulosa llevó a pensar en s.s posible aplkación biotecnológica como
dominios que, una vez fusionados a una proteína de interés, permitieran la purificación de ésta.
Las ventajas de la utilización de resinas del tipo de DEAE.celulosa en procesos de purificación
por afinidad y de inmovilización de enzinsas son evidentes: existen muchos soportes
comerciales que contienen DEAE, es factible su utilización en procesos a gran escala y son
fácilmente regenerables, por lo que su empleo a nivel industrial es muy adecuado.
El plásmido pCM 1 6 <figura 4 1) contiene una secuencia de fusión entre el dominio C-
terminal de la lisozima CPU 1 (C-CPL1) y la del gen locZ que codifica para la 8-galactosidasa de
E, cok la expresión del gen de fusión está controlada por los promotores de la Ilpoproteina y
del operón de la lactosa, lo que posibilita una alta producción de proteína (figura .42> (lnouye e
lnouye. 985). La proteína de fusión fue purificada en un solo paso en una columna de OEAE-
celulosa a partir de extractos de cultivos de E, cok TG 1 [pCMlA] inducidos con IPTG Además
de la importancia de la purificación de la 13-galactosidasa en sí misma, el valor real del
experimento reside en la validez de la utilización del dominio C-CPLI para este método de
purificación. La presencia de una doble banda cuando la prote¡na hitrida se analizó por
electroforesis en geles de poliacrilamida-SOS podría ser debido a una degradación de la misma.
Sin embargo, ci hecho de que la banda nferior migrara en la misma posición que la banda
correspondiente a la l3~galacsosidasa podría indicar la producción en cierta proporción de esta
proteína no fusionada al dominio C-CPLI Esta hipótesis parece bastante probable, puesto
que, como se observa en la figura 41. en la región de fusión existe una secuencia que podría
corresponder a un sitio de unión al ribosoma seguida de un codón AIG que podría actuar
corno nidador de la traducción. Para comprobar esta hipótesis se intentó realizar el análisis de
la secuencia N.terminal de la proteína de fusión, si bien la proteina se mostró resistente al
tratamiento, debido probablemente al bloqueo del extremo amino-terminal, La proteína ti.
CPLI4-galactosidasa mantenía una actividad especiflca comparable a la descrita para la enzima
nativa (Miller. 1972>. Puesto que la inmovilización de enzimas es un procedimiento muy
;63
importani er )rt. sos bmocecrioiógicor íi-lercmeie. 988) parecía nteresante comprobar si
la ~rose>~ dc fus mantenía la actividad cuando se inmovilizaba en la tesina de DEAE-
celulosa. Se obser’ i que un 63% de actividad enrimática se mantenía en estas condiciones, lo
que sugiere que la <za afinidad del dominio C-CPLI por ci DFAE podría emplearse con éxito
par:a la inrnovilizaci¿ de otras enzimas de interés.
Aunque en la oroceina de fusión producida por el plásmido pCMI6 el dominio C.CPLI
ocupa una posición N-ternsinal. éste mantiene sus propiedades funcionales intactas. Este
resultado demuestra que la consecución de la estructura funcionalmente óptima del dominio
C-CPLI es independiente del o de los polipéptidos a los que se encuentra unido, lo cual
constituye una prueba más a favor de la calificación de este dominio como módulo (apartado
anterior>. No obstante, resultaba de gran interés comprobar el comportamiento del módulo
C-CPt. 1 fusionado en la posición C.terminal de la 3-galactosidasa. Para ello se construyó el
plásmido pCMI 1 ~figura43). si bien esta construcción genera una proteína inactiva <Young y
Dais, 1983). La proteína de fusión se hiperprodujo y se retuvo en la resma de DEAE-celulosa
incluso lavando con 1,5 M en NaO, demostrándose así que a funcionalidad del dominio C-
CPU no se había perdido. Sin embargo, en este caso, la interacción con el DEAE debe
provocar en la proteína un cambio conformacional tal que impida la accesibilidad de las
moléculas de colina libre al dominio CCPLI. no pudiéndose lograr por este motivo la elución
de la proteína sino cor, agentes desnaturalizantes como el 5125. Este experinsento. aun siendo
negativo en lo que a la purificación se refiere, aporta un interesante resultado sobre eí uso de
tís dominios C.terminales dependientes de colina para procesos de inmovilización de enzimas
en columna.
Otra de las ventajas de los dominios C-terininales de las peptídoglicán.hidrolasas de
ricunsococo en la producción de proteínas de fusión reside en su utilización como sonda de
seguimiento en los pasos de purificación de dichas proteínas de fusión cuando éstas no tienen
ninguna funcionalidad medibie ni se poseen anticuerpos contra ellas, ya que sí se pueden utilizar
anticuerpos que reaccionan con el dominio C.terminal. Este es el caso de la fusión del módulo
Cterminal de la amidasa LYTA (C.LYTA> con la región de la cadena 8 del receptor de células
1 de la línea celular )urlcats que contiene las regiones V6A. 1. 0 y) <proteína TcPJ3S, 1) (figura
O5CJSJON
45) (V.’ilson y cols., 1988). El ob1erivo era la ~yr ¿rición de esta prorc.i$a nana la obtención de
anticuerpos que la reconocieran. El inonvo por <e’ que la purificación no pudo llevarse a cabo
por el procedimiento deseado <OEAE-celuloso> te el hecho de que la proteína de fusión
formaba cuerpos de inclusión (figura 471. Loa aerpos de inclusión son agregados insolubles
que precipitan dentro de la propia bacteria y que toistienen. además de la protefra producida
por el plásmido en cuestión, otras proteínas r:orno las cuatro subunidades de la RNA
polimerasa, e incluso DNA y RNA (Hartley y Kane, 988). Es muy frecuente encontrarlos
cuando se desea la expresión de proteínas cucar-rotas en sistemas procariotas corno E. cok
(Marston. 1986) y pueden constituir una ventaja en procesos biotecnológicos puesto que la
proteína de interés se encuentra en estos agregados en un alto grado de pureza, y
frecuentemente puede recuperarse de éstos en forma nativa <Kant y Hartley. 1988). La
formación de cuerpos de inclusión no depende necesariamente de la mayor o menor cantidad
de proteína producida en la célula (Marscon, 1986). Realmente intervienen muchos y muy
diversos factores, cada uno con una mayor o menor incidencia dependiendo de las
características de cada proteína en concreto. Entre los factores que pueden conducir a la
formación de cuerpos de indusión hay que destacar la presencia de grupos sulfidrilo libres o
temperaturas de cultivo que imposibilitan que a proteína adquiera su conformación correcta
desde que se biosinteoza la cadena polipeptídica. Otro motivo podría ser que la proteína se
biosintetice con tanta rapidez que los sistemas de degradación de la célula se saturen y la
proteína termine por acumularse. En último término, la precipitación de la proteína en forma
de cuerpos de inclusión va a vent determinada por la facilidad que tenga en conseguir su
conformación nativa por lo que para evitar la formación de los cuerpos es necesario actuar
sobre los parámetros que determinan el plegamiento de las proteínas. Así, una menor
temperatura de cultivo o una menor inducción de la expresión génica provocan una menor
velocidad de biosíntesis de la proteína y por santo ésta tiene más posibilidades de adquirir la
conformación correcta. tn el caso de la lusión C-IXTA.TcRl3a.l sólo una incubación a
pudo evitar la formación de agregados aunque la producción de proteína fue mínima.
Una vez obtenidos los cuerpos de inclusión, la recuperación de la proteína de fusión en
forma nativa pasa por la solubihitación de los agregados, la cual se realiza frecuentemente
mediante agentes desnaturalizantes. procediéndose después a la renaturalitación de la proteína
oisctaso,.
(lMarston, 1 98~). En embargo, eí empleo de compuestos como la urea, cloruro
y diversos deterge ces no permitieron la renaturalización de la prote.na de fusión, nor .,. flue
se deseché la idea e purificación por DEAE-celulosa, obteniéndose la proteína en lcr-ore aura
por electroelcaciór. ce geles de poliacrilamida-SOS. Ya que el objetivo era la obtención de
anticuerpos que reaccionaran con la proteína, no revestía mayor importancia que ésta se
encontrar-a desnaturalizada. A pesar del contratiempo que supuso la formación de cuernos de
inclusión el dominio C-LYTA se mostró de gran utilidad puesto que permitió seguir los pasos
de purificación de la proteína de fusión mediante técnicas de western-bloC utilizando los
anticuerpos que reconocen el módulo C-terminal.
1 66
Y CaNCLUSIONES
i 67cONctusc AS
Las conclusio es que se derivan de los resultaocs presentados en este watclc de
investigación son lat siguientes:
1.- Existe una variedad de compuestos análogos de colina capaces de interaccionar
específicamente con las peptidoglícán-hidrolasas dependientes de colina de 5. pneumcnioe y sus
bacteriófagos. La estructura química requerida es la de una amina terciaria, La hidrofobicidad de
los suscictzyentes del átomo de nitrógeno favorece la interacción.
2.- Las peptidoglicán-hidrolasas dependientes de colina de 5. pneurnonioe y sus bacteriófagos
pueden purificarse en un solo paso mediante cromatografía de afinidad en DEAE-celulosa.
3.- Según los datos de dicroísmo circular, la estructura secundaria de la lisozima CPLI estada
compuesta de un 19% de o-hélice, 35% de lámina 8, 32% de giros B y 14% de ordenación
apenódica. La probable contribución de los aminoácidos aromáticos en la región del ultravioleta
le1ano duficulta el análisis de cus espectros en base a contribuciones de escn,cosra secundaria.
4.- La unión de colina a la lisozima CPLI provoca un cambio conformacional en la proteína que
afecta a a disposición espacial de los residuos de triptófano.
5.- La lisozima CPU posee un único tipo de sitios para la unión de colina. La constante de
disociación del ligando es de 2,4 mM.
6.- Las tres cisceinas de la lisozima CPU contienen sus grupos 514 libres. La cisteina 23$ se
encuentra inaccesible al disolvente cuando la proteín, está en se, conformación nativa.
7.~ El dominio hl-terminal de la lisozima CPLI mantiene su capacidad catalítica cuando se sinretiza
en ausencia del dominio C-tern,inal, si bien pierde la especificidad por paredes que contienen
colina en el ácido teicoico y sc eficiencia catalítica es mucho menor.
168cONcLu2oN~S
t- Los dominios N.terminales de las lisozirnas CPU y CPLI poseen una estructura más
compacta que los respectivos dominios C-tern,iroles. de modo que resultan más resistentes a la
degradación por proteasas.
9.- El dominio C-terminal de la lisozima CPLI mantiene su capacidad de unión de colina cuando se
sintetiza en ausencia del dominio hl-terminal.
10,- Las características termodinámicas del dominio C-terminal permanecen prácticamente
inalteradas tanto en presencia como en ausencia del dominio hl-terminal.
II.- La colina induce un cambio conformacional en el dominio C-terminal de modo que éste se
estabihiza térmicamente y se hace más resistente al ataque por proteasas.
12.-U desnaturalización térmica del dominio C-terminal de la lisozima CPLI es irreversible, en
tanto que la correspondiente al dominio N.terminal es parcialmente reversible, dependiendo de la
temperatura a la que se detenga el proceso de desnaturalización.
13.- El aminoácido Asp-9 de la lisozirna CPL 1 es muy importante para la actividad catalítica de la
enzima, si bien su sustitución por su correspondiente amida no ocasiona la pérdida total de
actividad.
14.— El aminoácido Glu36 de la lisozima CPLI desempeña sólo un papel de relativa importancia
en la catálisis, ya que la sustitución de este residuo por glutamina tan solo origina la pérdida de un
30% de actividad.
lS.~ El dominio C.ternsinal de la lisozima CPLI mantiene su afinidad por colina cuando se fusiona
a la B-galactosidasa. La proteína de fusión se purificó en un solo paso mediante cromatografía de
afinidad en DEAE-celulosa.
169co.aauuo.s
La fwt.s de la B-galacwsidasa con el dominio C-rerminal permitió la lnnnovlzaóón de la
proteína hibrida en columnas de 12CM-celulosa. La enzama inmovilizada posee u~ 63% de
actividad con respecto a la proteína en disolución.
IL- Los resolsados presentados en esta memoria demuestran que los dominios N- y C-
terminajes que forman parte de la lisozin,a CM. 1 conservan se, funcionalidad por separado, lo que
constituye una prueba más en favor de la teoria modular aplicada a la evolución de las
peptidoglicln-ñidroiasas de S. pneumon?ee >-sus bacteriófagos.
VI BIBLIOGRAFíA
171tauoowt.
Adinolfi, M, en: ¡o anologico/aspectso(in(ectbocinthefrWsondnen~orn. <H.P. LantertyC.S,5.Woodeds.) Academic Press, London l98l,pp 19-47
.&lberts, 8.. Bray, 12.. Lewis. J.. Rafí, M.. Robers. K. y Watson, J. D. 1983. ~nMoleculor Eoiogyof tSe Col, Garland Publishing Inc. NY.
Alexander, S.S.Jr.. Colonna, <<,‘ Edelhoch, H. 979). Siol, Che»,. 254: 1501-1505.
Andersen, W.F.. Grotcer, MG.. Reiningwn. S.J.. Weaver, L.H. yMatdsews, S.W. 1981 j.MM.Biol. 147: 523-543
Armstrong.J.J., %addley,J.. Euchananj. a. Ca.-ss. E-y Grenber. GR. 1958.). Che»,. Sac.4344-4354.
Badger. E., 1944.). SiM. Che»,. 153: 183-191.
Sanas,). A.. Russell, R. R. 8. y Fe,reñ, J), 1990. Jafea. Innun. St- 667-673.
Barnicitel, C., Nauman, O., Bndaaek. H., t.ablschinsltl. II. y Giestreche. P. 1983, En me Tórgetof PeniciIlln Q-4áenbeck. R - HeJee. J. V. y Lablschlnsltl, H., eds.) Pp. 61-66. W. deGruyter, Berlin
Barroso. U A.. Wang, 5. Z.. Ptselps. Cj., Johnson, j. L y Wilklns. T. O. 1990. Nucleic AcidsRes. It 4004-4005.
Beacham, 1. R. 1979. lnej, Akchem. lO: 877-883.
BeechemJ.M.y Brand.t. 1985 Annu, Re,. Blochws,54:43-71,
Bevendge,T.J. 1981.lritRev. Cito¡72:229-317,
Blggar. W.D. y Sturgess. j.M.. Infect lmmiano¡. I6~ 974-982
Sirnboim, H. C. yDoly,j. 1979, NucJeic. Acids Res. 7:1513-1323.
Blake, C.C. E. 1978. Notare 273: 261’.
Blake. C,C.F,, Johnson, L.N.. Mair. CA.. Nortin, A.C.T.. Phillips. D.C. y Serma, VR. 1967Prec. Ro>t Soc. London 1:167. 378-388
Blasi, LJ..Nam. K.. Harta. 12, GoId, Uy Yoe,ng.R. 1989, £MAOJ. 1:3501.3510.
Boizet. 1.. Lahbib-Mansais, Y., Dupont, L. Ritzenthaler. P. yMata,M. Ge»e94: 61-67
Bolotina, lA., Chekhov, yo., Lugauskas, V.Yu. y Ptitsyn, 0.6. 1980 MM. SiM. (Moscú). 14:
902-908. <Traducción al inglés. pág 709 (1981)).Botstein. 12., Chan,R. K. y Waddel.C H. 1972, Y¡rology 49:268-282,
Boyer. H. W. ykouiland-Dussoix. D. ¡969. J.Moi. Sial. 41:459474.
Bradford. rl. rl. 1976. Anal, Abchan. 72: 248-256.
Brahms. 5. y Brahms,J. 1980 J. Mal, Sial. I3S~ 149-178.
Brent, R. y Ptashr,e. rl. 1981, Proc. NoeI. Atad. Sc). USA 7& 4204,
Breser. yHakenbeck,R. 1985. Esa.). rnochem. 146:417-427,
Briles, E. Br Tomas,, A. 1970.). Cd tI. 47: 766-790.
[72•uOdP.W
Boaodish, O E. y Baddiley, J. 1968. tel,.,,.) líO: 573-582.
Candaban. M. 3.. Martínez-Arias. A.. Shapdmlra. 3. 1<, y Chau,). 1983. Memada EnzymM. lOOt213-308.
Candaban. M. ).. Marúnz-Arias. A. Shapira. S. 1<. y Chau, 3. 1983. Methods Enzymol. lOO: 293-308.
Chang, C.T.. WuC-s.C. yYangJ.T. 1978. Anal. &odiem9l:l3-31.
0504’. P. y Pasman. C.D. 1978, Annu. Re». Aiochem. 47:253-256.
Croox,C. y García, jI. 1990. Gvie(wpnnsa>
Dao-pin, 3.. Liao, 12-1. yftemingtoc.SJ. 1989. Proc, NoeI. AcotScl. LISA 86: 3361-5365
de Qaaf, E. 1<. y Oudega. 8. 1986. Cian. Top. MicrobioS. ¡inmuneS. 123:183:205.
DeMarainí. M,. Halegooa. S. ylno<sye.M. i915.J. ÑoS. 16:439-461.
D~z. E. [99<. Tesis doctoro), Universidad Cornstutense. Madrid.
Din, E.. Gar& E.. Asaso. C.. Méndez, E.. López, R. y Garó. 3.1. 1989.). SiM. Chan,, 264:1238-1244,
Din. E.. López, R. yGarcía,J.L. 1990. Proc. NoeI. Ae,d,Sci. USA 87:8123-8129.
Din. E., López. R. yGarcia.J.L. 1991.J. Sial. Chw.t 26t 5464-5471
Doo&tle, R. E. 2986. University Scionce fiócás. Mill YaRey, CA.
Doolitde, RE. 3983. T¡’ends bioclen, 5<1. 30: 233-237.
Don. 3. Z.. Price, 3. 8.. Phelps, C.J.. tyerly. 12. M.. Wifltins. T, O. y Johnson,). L. 1990.lnfect. Imnaun, 5*: 480-488.
Dutose. RS. y H.rtl. 0.1. [989. Proc. NoeI. Acod, Sci. USA ALt 9966-9970.
Dunn,B.M. y AnkeT.C. [973. Ada. Eiuymol. 37: ¡-60.
Edge. Y., AJlev,ell, HM. y Seurtevant. J.M. 1985. Bioch.nisfry 24: 3899-3906.
Eftink,M.R.yGhiron. C.A. ¡981, AnoS, 8¿ocha,,. 114:199-227.
Elinsan. LiS. 1959 Arel,. Sioche»,. &iophy. 82:70-77.
Fasrnan, C. ¡976. en ¡-Ionéook of biochemistry and molecular biology. 3 edición vol. III, CRCPien. Cleveland. OH.
FerrettJ.J.. Cilpin. M, 1. yftussell. fi. R. E. 1987.). Bocwiol, 169:4211-4278.
Fiacher, H. yTomasz, A. 1985.). fiocteriol. 363: 46-34.
Fiacher, W. 1988. Ada, Mícrob. PhysiM. 29: 233-302.
Forn,anek, H, 3983. En The Torpe of Pe’,icíllin (1-lakenbeck. fi.,. Háltje 3. y. y Labischinski. H..ede.) Pp. 55-60. W. de Gruyter, Ber*n,
Fovche. PB. y Hask,. JIl. 1978.). Sial. Chan. 253: 6787-6793
Fox, E. N. y Wiener, ti. 1<. 1965.1 SaciadoS. *9: 496-502.
‘73ka—
Freire. E. y Biltonen, KL. 1978a. &opo~’mm [7: 463-479.
Freire, E. yBiltonen. RL. 197t. AiopoIymrs 17:481-496.
Freire, E. y Biltonen. RL. ¡97k. &opolymers 17: 497-510.
Freire. E.. Osdol. W.W,. Mayarga. aL, y Sánchez-Ruiz. J.M, [990. Aonia. Rey. &ophys. BiophysChes,,. l9~ 159-188,
hitada. 1-4.. Sturtevaot.j.M. yQuioct.o, F,A. 1983.J. fiSol, Che.,,. hL 13193-l3198.
García, E., Rojo, j. M.. García. P.. Ronda, C., López. R. y Toman. A. ¡982. FEMS MicrobioS.Lete. 14:133-136.
García, P.. García, E., Ronda. C.. López. R, y Tomas,, A. 1983a. J, Gen. Microbiot ¡29: 489-497.
García. P. - García. E. - Ronda, C.. Tomas,, A. y López. R. 1 983b. Curr, MIUObSOI. & 137-140.
García. P.. López, R., Ronda. C.. García. E. y Toman. A. 198k.). Gen. Microbio!. 129:479-487.
García, P.. Méndez. E.. García. E., Ronda, C. y López. R. ¡984.). fiocteriol. 159: 793-796.
García. E., García,]. L.. Ronda. C., García. P. y López. R, 1985. MM. Gen. Genee. 201:225-230.
García, J. L., García. E., Ararás. A., García. P.. Ronda. C. y López. R, 1987.). ViroL 61: 2573-2580.
García. E., García. J. L.. García. P., Arrarás. A.. Sánchez-Puelles. J. M. y López. R. 1988. Proc.
NoeI. Acad. 5<1. USA. 85: 914-918,García. P.. García. J. L., García. E. y López, R. 1989. Saches,,. Biophys. Res. Commun. ¡58: 251-
256.
García. P.. García. 3. L.. García. E. y López. R. 1990. GeneA6: Sl-SS.
García-Bustos. J. It yTomasz.A. 1987.J. fiocteriol. ¡69:447—453.
Garcfa-Bustos,j. F.,Chait.B.T.yThmasz.A. 1987.J.fiiol. Chan. háL 15400-15405.
Garcla.Bussos.J.F. ytomasz, A. 990. Proc. NoeI. Acod.Sci. LISA 87: 5415-5419.
Ganiier.J.. Osguthorpe, D.J. y Robson. A. 1978.J.MI. Sol. 120:97-120.
Garres,]., Bruno,C. y Young. R. 990.). Bocteriol. 172: 7275-7277.
Garvey. K.J.. Saed. M. Se taJ. 986, Nuc¡eícAcids Res. 14: lO00l-10008.
Gavilanes, J.C.. Menéndez-Arias, L. y Rodríguez. A. 1984. Comp. Sache»,. PhysioL 77B: 83-SS.
Ghuysen. 3M. 1977. En me Synthais. Asseanblyand Turnoeer of CellSiarfoce Componenta (Poste,G. y Nicolson, G. L.. eds.) pp. 463.595. Elsevíer! North Holland Publishing Co.,Amsterdam.
Ghuysen,J. M.. 965. Socwiol. Rey. 32: 425-464.
Gibson. T. J. 1984. Tesis DoctoraL Universidad de Cambridge. Inglaterra.
Gílbert,W. 1978. Nowre 271: SOl.
Gilmore, K. 5.. Russell. R, R. A, y Ferreti, 1~ 1. 1990. lnj’ect Imanan. SS: 2452-2458.
‘74
Giudc.lliS. yTomasz.A. 1984a.J. Bocwfri. 1S8:1188-1190.
Giudicelli. 5. y Toman. A. 1 984b. En Microbio) Cd Wd Srflhais ond Auto4-sia (Nombela. C.,ed.)pp. 207-212. Eisevi.rScience Publishers.Amsterdan,.
Clauner, 8. y Schwan. U. 1983. En Tite Torgd of Peniclin (Makenbeck. R., Háltje, J. y. yLabischinskl, 1-4., eds.) pp. 29-34. W. de Gruyter. Berlin.
Goeddel. DV., Kleid. D.C.. Salivar. F., Heynelter. HL.. Yansura, C.C., Crea, R.. Mb-ose. T.,Kraszewslti. A., ltakura. K. y Ris. AD. 1979. Proc. NoeI. Acod. Sci, USA. 76:106-lío.
Goodell. E. W. ySchwan. u, ísss,j. Soctriol. IáL 391-397.
Gorbunoff,Mf y Timasheff, SN. 1972. Art).. &iochem, Sophys. 152: 413-422.
Hall. j,, l-lazlewood, GP.. Barker, P.J.yGabert. H.J. 1988. Gn 69: 29-38.
Hanley.D.L.yiCane.J.F. 1988. Sache»,, Soc. Tren.. 16:101-102.
Hartn,eier. W. 1988. ImmobWízed 5¿ocow~ns, Springer Verlag. Berlin.
HilI.J., yWann.maker. L. 1981.). fiocteriol. 145:696-703.
Hofiand, IB.. Mackn,an, N. y Nicaud.J.-M. 1986. So/Technology4: 427-431,
HOltje. 3. V, y Tomas.. A. 1 975a, Proc. NoeI. Acod. SC. LISA 72: 1690-1694.
Hált¡e J. y. y Tomas.. A. 1 975b.). Sol. Chean, 230: 6072-6076.
Halt¡e, J. V. y Toman. A. 1976.). Sol. Che»i. 251:4199-4207.
1-torne, O. y Tomasa, A, 1985.1 Boctriol. 161:18-24.
Howard, LV. yGooder,H. 1974.). Socwiol. 117:796-804.
Hunt, AH, yJingersons, 8. 1973 &iochemisea-y 12: 4435-444L
moco, 11, johnson, L.M.. Non)., A.C.T.. Philips, D.C. y Rupley. JA. en Ti.. Enzyma (P.C.Boyer ed) vol 7, Pp 665-868, Academic Press. New York 1972
lnouy., rl.. An,heinr, $4. ySternglanz. R. 19734 BIOS, Che»,. 24:7247-7252.
lnouye, M.. y Ts.agita, A. 1968.). MM. Sol, 37: 213-219.
Inouye, 5. y lnouye, M. 985. Nucl~c. ACM. Ra. 13: 3101.3110.
lulcura, 1<.. Miro,., T., Crea, R., Rius. AD., Hynelcen HL.. Salivar, F. y BOyer, MW. 1977.Science 19&1056-1063.
Jauris, 3., Rocknagel, 1<. P., Schwarz, W. 1-4.. Kraosch. P.. Bronnenmeler. 1<. y Staudenbauer,W. L. 990. Mal. Gen, Canee. 223:258-167.
)enninr. ¡-4.)., Lugowski, C, y Youn¿. $4, rl. 1980. &ochemisvy IP: 4712-4719,
Johnson. L,N.. Cheecham. J.. McLaughling. P.J., Acharya. K.R., Barford. D. y Phillips. D.C. [988Curr. Top. Microbiol. Immunol, 139:81-134
Joflás, P. yjollés.J. 1984. Mal, Cali. Sache»,. 63: 165-189
Jorgens, V.J, y Weclcnesser,J. [985. Ann. Inst Postetar 136: 41-44,
liS~4Mfl
Kamei. K.. Hara, S.. lkenalta,r yrluraoS. 1988.f Sodem. (04, 832436
Kane4t’. yI-Urdey. DL (988. Traa*Aiotach. L95401.
Khan, M.Y.. Jailtana. NS., Frena. DA,, Villanueva. G.y Newman, SA. 1988). A>o>. Che,». 263:¡ 1314—11318,
Kieny. MP.. Ladie. R.y Lecocq,J. P. [983, Genelfi: 91-99,
Klug, A. y fihodes, 12. 1987, Trenda Sache»,. Sri. IL 464-469.
Kojinia. $4.. Arakl. Y, alto, E. [985.). Bocwio¡. (lIs 299-306.
Koshland. D. y Bocssein, 0. (980. Ce¡ 20: 749-760.
K.ashner. 5. R, <978, En Genetic aqgjnwk,g (Boyer. ¡-4. 8. y N’cos.a. 5. cd.> pp IiElsevier/Norsh-Holland. Amsterdam.
Labischinski, H., Barniltel. G.. Nauman. O. y KelIer, P. 1985. A..», (rase. Posteta, 136:45-50.
Laemrnli. U. K. 1979. Notiare 227: 680-685.
Lehrer. S.S. 1971. Socheniiseay lO: 3254-3263,
Uchenstein, H.S., Hastings. A.E.. Langley. IC., Mendaz, EA., Rohde, MF., Elrnore. R. yZukowsj¿l. MM. CencAS: 81-86.
Lim, VI. <974.). Mo>. SoL 88:873-894.
López, C., Gritó. A. y Méndez, E. 1982. FEAS Lete. [44: 349-353.
López-t-layorga, O. y Freire, E, ¡987, Biophys. Chem. 87: 87.
Low,B. 968. Proc. NoII. Acod. Sc). USA 60: 160.
Malcolm. SA., Rosenberg 5., Corey, Mf, Alíen, J.S.. De Baetseiier, A. y Kirsch, j.F. 989
Proc, flor), .4cod, Sc]. USA 86: 133-137.Manly,.P.. Matthews. 1<3, ySturnvanr).M. 1985. Aiachemistryl4:3842.3846.
Markiewicz, Z. yTomasz, A. 1990.). Boctrioj. 172:2241-2244.
Marston. FAO. 1986. Biochem.). 240:1-12.
ticOannelí. ti., Ronda. C. yTornasa, A, 1975. Vfrology 63: 577.582,
Menéndez Arias. L., Gómez Gutiérrez. J., García Fernández, rl., García Teledor, A. y Morán. F.1988. CABIOS4:479-482.
Meo-ii, C. A.. Goidman, D..Sedman,5.A.yFberz.MH. l981.Sóence2li: 1437-lOS.
Messing.j. 1983. MethodsEnzymol. 101: 20-78,
Mevdev, L V., Busby, IP.. e lngtaan~. K.C. 1989. Sochernistry 28: 5408-5414.
Mihalyi, E. 1972. App¿icotion of proteol>-eic enzymes w proteja, structare stndies, CRC Press,Cleveland (OH).
Miller. >41. 1912. £xperimens in Molecu/ar Genetjcs. Caíd Spring Harbor Laboratory. CoId SpringHarbor, N.Y.
Mosser, J. L. y Tonaasz. A, 970,). Sol, Cha»,, 245: 287-298.
176
Naun,.an. 12., Barnlckel, G.. Bradaaek, ¡-4., Labiscf-uinslti, ¡-4. y Glesfrecht, P. 1932. Lar.).
¡jachan, [25: 505-515.
Nlkaido, H. y Vaara, H. 1985. MicrabiaL Rey, 49: ¡-32.
NÓ¡kawa. K. y Oc.. T. 1986 ¡iochim. Sophys. Acto 871. 45-54.
NossaI,N. E. yHeppel, LA. 1966). SiaL Chan. 241:3055-3062.
Pakula.T.M.,SavilahetH.y Ban,lord. O. H. 1989. bar.) ¡jachen, 180 [49-152.
Parson:. SM, y Raftery. MA. 1972. Sochem,ttry 11:1623-1629
Prlvalov, PL 1989. Anno. Rey. A¿ophys. Siophys. Chan. It 47-69,
Pugsley.A. P.ySchwartz,M. 1985. FEMS MicrobioS. Att’. 3L3-38.
Romero, A., López. A. yGarc(z,P. 1990a.j. Virol. 64: [37-142.
Romero, A,. López. A, y García, P, 1 990b. j. Soceeriol. 1 7L 5064-5070.
Ronda, C.. García, J, L., García, E.. Sánchez-Puelles, J. rl. y López, R. (987. Lar,). Biochen,.164: 621-624.
Rupley. JA., Butier, L., Gerring. rl., Hartdegen. F.j. y Pacoraro. R. 1967, Proc. Nazi. Atad. SetUSA 37±¡088-1095.
Saedi. $1. - Caney. K.3. y Ito, J. 1987. Proc. NoeI. Acad. Sc). USAN: 955-958.
Sambrook. J.. Fritad,, EF. y Marúatis, 1. ¡981. Molecular cloning: o boboroto’y anonuol (2edición). CoId Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Sánchez-Puellesj. rl., Ronda. C,. García,j. L.. García, P.. López. R. y García. E. 1986a. bar.).Alache»,. ¡33: 2.89-293,
Sánchez-Puelles,3, M., Ronda. C., García, E., Méndez, E.. Carcía,J. L. y López, R. 1986b, FEMSMícrobioi, Len, 35: 163-166.
Sánchez-Puelles. 3M., Sanz, J.M.. García. J.L. y García. E. 1990. Gene 39: 69-75,
Sanger, F.. Nicklen, 5.7 Caulson, A. R. 1977. Proc. NoeI. Acod, SO, USA 74~ 5463-5467.
Sayers. J. A.. Schmidt, W. y Ectitein, F, 1988. Nucleic Acid. R~. [6, 791-802.
Schindler, rl., Mirelman, O. y Sl,aron, N. 977. Aiochim. S¡ophys. Acto 482: 386-392.
Schleiffer, K. H. y Kandler. 0. 1972. fiocteriol. Rey. 36: 407-477,
Schoner, BE., Belagale, R.M. ySchoner, RiS. 987 Methods £nzymoL 153±401-416
Shiroza. T., Ueda,S, yKuramitsu, H. K, 1987.). Boaerio(. 169:4263-4270.
SJ,ockman, C.D. y Barret.J. F. 1983. Ann. Rey, Mcrobia(. 37: 501-521.
Sinnott. ML. en EnzymeMechonisms (Ml. Page y A. Williams eds.) PP 259-297. Royal Society of0~emistry. London 1987.
Swank, R. T. y Munkres, K. 0. 1971. Anal. Sioche,n. 39: 462477.
Szewczyk. 3,, Bienkowska-Szewczyk. K. y Kozloff, L.M. ¡986. Mal. Gen, Genee. 202: 363-367.
[77MSJOOWIA
Takaha.Mi. 1<., Casey, 3.L. ySturtevanc. ¡rl. (98(. AMchattqZt469B-4697.
Tmn,ashefl, SN. y Bernard, Ci. 1970. Art).. &acheo~. ~ry’~ 141: 33-58.
Tipper. 124. y Su-oniinger.3. L. 1965. Proc. Nat>. Acod. Sc). USA 54: 1133.1141.
Tipper,D.3.. 1969,Sacbemistry&2¡92-22[2
Tornan, A. 1964. Bocuriol. Proc. 29
Toman, A. 1967. Science II?: 694-697,
Ton,asz, A. [960. Proc, fiat). Atad. Sc). USA 59±86-93.
Tornan. A, 1981. Rey. [nfect Di,. 3±[90-211.
Tomas.. A. y Hochtkéss, R. 12. 1964. Proc. fiat). Atad. SC. USA 51±480-487.
Tontas., A. yWaks,S. 197S. Sachen,. Siophys. Res. Commun. 65: 1311-1319.
Tomas.. A. y Westpha(, rl. 197(. P~ac. NoiI. Acad. Sc]. LiSA 64±2627-2630.
Trautwetcer, A.. Riczenchaler, P.. Alatossava. 7. y Maca-Gllsinger. rl. 1986. J. Virol. 19: 55,-555.
Ueda, 3.. Shiroza, T. y Kuramitsu. H. K. 987. Gene 69:101-109.
Verma. rl.. 986. Cur,. Microbio(, 13: 299-301.
Vieira, J. yrlessing.j. 1982. Ge-te 19, 259.
Wadso. J. 968. Acta Chan. Stand. 22: 927.
Weave,, L.H., Grotter, MG., Rernington. S.J.. Gray. T.M., lsaacs. N.W. y Matthews, 8W.
1985 1 Mal. Et’oL2lA7-lll
Weidel, W. y Pelzer, H. 1964. Mt’. Enzymo(. 26±93-232.
Wheeler, j.. HolIax,dJ. Terry,J. y Blaineyj. 1980.). Gen. Microbio>. 110:27-33.
Wilson, R.K., Lal. E. Cancannon, P., Bard~, R.K. y Hood, UE. 988, !mmunoL Rey. 101:149-172
Wicre, A., yLubi La, W. 1989. &‘rf Sache,», (U: 393-398.
Young. RA. y Davis, R,W. 1983. Proc. Notl. Atad. Sc). (iSA 80:1 94-1198,