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Aislamiento de plásmidos
FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
EQUIPO 2DÍAZ DE LEÓN SÁNCHEZ PAMELA
LÓPEZ ORDUÑA ERIK
LUNA TORRES KEVIN
MARTÍNEZ LÓPEZ GUSTAVO
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Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico, bicatenario, superenrrollado, que se replica de forma independiente del genoma y que puede ser propagado en una población.
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• Son pequeños 5,000 -40,000 pb.• Replicación independiente y
rastreabilidad.• Tienen un único origen de replicación. • Suelen llevar sólo uno o pocos genes. • Molécula de DNA circular.• Pueden conferir ventajas selectivas al
organismo que lo posee.• Son transmisibles. Resistencia a
antibióticos.
Características de los plásmidos
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Técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos Permiten obtener preparaciones de
cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular.
La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño de ambos.
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Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS).
o Puentes de hidrógeno de cadenas complementarias de DNA se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí.
o Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente.
o Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas.
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o La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas.
o Las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación.
o El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.
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Aislamiento de Plásmidos Se han desarrollado un gran número de
métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos:
1. Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo
2. Recogida y lisis de las bacterias3. Purificación del DNA plasmídico
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Objetivos
oRealizar el aislamiento de DNA plasmídico.oConocer los fundamentos para la
purificación del DNA plasmídico y su separación de DNA genómico.
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Reactivos• 5mL de medio Luria-Kanamicina
(30μg/mL)• Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM
Tris/HCl pH=8.0 y EDTA 10mM pH=8.0• Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS
p/v• 3M Acetato de potasio pH=4.8• 70% Etanol, Isopropanol• 10 N NaOH• 10% SDS
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Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se
obtuvieron en la práctica anterior.
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Lisis celular con SDS/ NaOH
1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)Disuelve la membrana
Se une a las proteínas y las desnaturaliza
2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los puentes de hidrógeno entre ambas cadenas)
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Neutralización
2.- Acetato de potasio/ ácido acéticoA) Neutraliza el NaOH (renaturalización de
DNA plasmídico, se restablecen los puentes de hidrógeno).
B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Dodecil Sulfato de Potasio (PDS) (H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)
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DNA plásmidico separado de los contaminantes por centrifugación El sobrenadante contiene: - El DNA del plásmido - Los componentes celulares solubles Pellet contiene: - PDS - Lípidos - proteínas - El DNA cromosómico
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ReferenciasSánchez Nieto, Sobeida. Manual de Prácticas
de Bioquímica Experimental. Facultad de Química, Departamento de Bioquímica Básica. Semestre 2012-2
Mendoza DF Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular: Su Aplicación en Genética Básica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62
Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU