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Trucos y consejos en el desarrollo de metodos multicomponentes por GCMSMS
José Juan Rivero Marabé
Especialista de producto GC y GCMS
Agilent Technologies, Spain
6 de marzo de 2013
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Situación actual
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Reto analítico
Niveles:
0,001-10
mg/Kg
Residuos:
>1000 Pesticidas
>300 Drogas veterinarias
Contaminantes naturales:
>500 Micotoxinas
>500 Toxinas de plantas
>100 Biotoxinas marinas
>1000 Contaminanates: Medioambientales:
Dioxinas, PCBs, HPAs, Retardantes de llama, PFCs, Biocidas, Disruptores endocrinos, Metales pesados
>>Cientos de contaminantes de procesos y adulterantes:
Acrilamida, Aminas heterocíclicas, Furanos, desinfectantes, Melamina…
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Documento SANCODirectrices de la comision Europea
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Establecer un sistema armonizado y “cost-effective” de
aseguramiento de la calidad en la UE
Asegurar la calidad y comparabilidad de los resultados
analíticos
Asegurar una aceptable exactitud de los resultados
analíticos
Asegurar la ausencia de falsos positivos/negativos en los
reports
Servir de apoyo para la acreditación ISO 17025
Documento SANCO/12571/2013
El documento es integral y complementario a los
requisitos de 17025Inicialmente está dirigido a los laboratorios de control oficial pero se ha popularizado a todos
laboratorios de analisis de residuos
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Tendencias en las estrategias del análisis de trazas de residuos en alimentación
• Desarrollo de estrategias eficaces mediante análisis conjunto por GC/MS/MS y LC/MS/MS y que
superen las limitaciones actuales de muchas normativas(FDA/EPA/EU)
• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas
• Aumentar el número de residuos analizados
• Acortar los tiempos de analisis
• Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES
• Desarrollo de estrategias eficaces para determinacion de residuos no target o desconocidos
mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF
• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas
• Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos.
• Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente
• Revisión rápida y atomática de resultados e informes: Más datos con menos recursos
• Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales
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¿ Por qué MS/MS ?
Hoy día, MS/MS es una técnica de rutina y representa una poderosa herramienta
analítica para la determinación de ultratrazas en matrices incluso complejas.
Gran
selectividad
eliminación
del fondo de
la matriz.
Inigualable
sensibilidad
Buena
calidad
espectral
confirmación
más fiable
Preparación
de muestra
más sencilla
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¿Cuándo usar MS/MS?
Cuando la Matriz es compleja se pueden producir
Interferencias por coincidencia de los iones de
cuantificación del analito con los de la matriz
Permite la cuantificación selectiva de compuestos
CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo
químico
Mejor S/N en matrices complejas que el que puede
obtenerse por tecnologías que
trabajan en Scan o SIM.
Las exigencias de las normativas más actuales resultan
más fáciles de cumplir gracias al
poder de la confirmación
MS/MS
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El MS/MS es la solución donde el MS no llega
GC/MS Triple Quad SRM
GC/MS Single Quad SIM
El sueño de todo
cromatografista:
Un pico con linea base
limpia
Interf de matriz = Ruido Químico
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Preparacion de la muestra
•Extracción L-L (Disolv inmiscible)
•Extracción fase sólida (SPE, Luke, Quechers, etc…)
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El método QuEChERS
•Consiste en una microextracción líquido-líquido
•El MgSO4 ayuda a la partición de los pesticidas en la capa orgánica, gracias a queretiene el agua
•El solvente preferido es acetonitrilo
•El Acetonitrilo proporciona la extracción del más amplio rango de compuestosorgánicos sin la co-extracción de grandes cantidades de material lipofílico y escompatible con la mayoría de aplicaciones de GC/MS y LC/MS mostrando muy pocasinteracciones.
•Seguida de un clean-up de muestra por una SPE dispersiva para eliminar lamatriz no deseada con PSA
•Procedimiento rápido y económico en comparación con los métodostradicionales de preparación de muestra en plaguicidas. Proceso terminadoen menos de 20 minutos
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Quechers. Historia y modificaciones
Metodo original
Anastassiades 2002
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Quechers. Historia y modificaciones
Problemas de estabilidad:
Sensibilidad al pH (incluso de matriz)
Inestabilidad en el propio disolvente.
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Quechers. Historia y modificaciones
Metodo tamponado
AOAC oficial 2007
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Quechers. Historia y modificaciones
Metodo tamponado con citrato
EU Estándar method EN 15662/2008
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Proceso de Clean up
MgSO4 • Secado (reducir la cantidad de agua en el acetonitrilo)
PSA • Sorbente (reduce la cantidad de grasa, acidos orgánicos y azúcares)
C18 • Reduce la cantidad de compuestos lipofílicos (esteroles, ceras)
GCB• Absorbe compuestos con estructura planar (pigmentos,
carotenoides)
Ej.- Muestras de frutas y vegetales
150mg MgSO4 anh + 50 mg PSA + 50 mg C18
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Consideraciones especiales
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Uso de patrones internos
1. Buena practica para mejorar la precisión y la exactitud.
2. Normaliza errores volumétricos o de inyección, procesos de
evaporación de extractos.
3. Se suele añadir al final del proceso de extracción inicial.
El buen patrón interno debe:
o Buena estabilidad y recuperación independiente de la
matriz.
o No presente en la muestra
o Disponible puro y económico
o Represente a la mayoría de los analitos presentes
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Uso de patrones internos: QC
Uso de patrones QC (controles de calidad)
ISTD añadidos al principio del proceso de extracción
Control de las recuperaciones de todos los pasos del proceso de extracción de
compuestos problemáticos.
Ojo no usar patrones planares si se usa GCB en el proceso de cleanup (TPP)
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Uso de patrones internos: Selección
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Selección de la columna
- Convencionalmente HP5 (5% phenyl)
- Cyanopropyl, cyanopropylphenyl, phenyl…..50%
- 30m x 0,25mm x 0,25um
- 20 m (i.d.<0,2mm) 20 min análisis y pérdida de
robustez
Coelucciones de componentes de la matriz
Afectan a todos los etapas de la cromatografía
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Efecto matriz
• Aumento de la señal (GC)
• Supresion de señal o mejora de señal (LC/MS)
Efecto principal: Coelucción
• Puntos activos en el sistema GC
• Estructura química de los compuestos
• Concentracion del analito
• Tipo de muestra y concentración
• Tiempo de residencia
• Temperatura de inyección.
Factores que afectan
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Tecnicas de inyección (S/SL)
•Inyeccion splitless en caliente
•Inyeccion splitless pulsado (mejora compuestos lábiles, discriminacion)
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Split abierto
Tecnicas de inyección (MMI)
•Cold splitless o solvent vent
oMayores volúmenes de inyección, sin dañar columna por exceso
de disolvente
oIntroduccion de los analitos en columna a la temperatura
adecuada.
Temp
Split cerrado Split abierto
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Optimizacion del solvent vent
Excesiva cantidad de acetonitrilo
Condiciones correctas de venteo
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Backflush. Optimizacion.
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MS-TeeQQQ
EPCMMIPres Alta
1.0 ml/min
Flujo Constante
Pres = 0 Presión RESIDUALPresión ALTA
Backflush y análisis simultáneos: Funcionamiento
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Run se para a 42 min y el
retroflujo se realiza a 280oC
durante 7 min
Necesita 33 min adicionales y
poner a 320oC la columna
para eliminar estos picos.
Blanco run despues de limpieza
min
Una vez instalado, el tiempo de retroflujo
trabajará para TODOS los compuestos
pesados.
- Los compuestos de menor peso eluyen primero
Backflush. Ventajas
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Uso de analitos protectores (AP): Sin Backflush
Mezclas de compuestos añadidos a los extractos para desactivacion en
cada inyeccion del Sistema cromatográfico
Fuerte Interaccion con puntos activos (grupos silanoles libres o depósitos
de compuestos no volátiles de la matriz) en la columna y en el inyector
Protege analitos susceptibles de adsorberse sobre puntos activos
Mezclas de AP selecionadas para cubrir amplio rango de volatilidad,
minimizer el efecto matriz, y mejorar la robustez
Compuestos como acido L-gulonico, γ-lactona, D-sorbitol
Analitos baratos, no tóxicos, y seguros para uso en sistemas de GC/MS
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March 10, 2014
34
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March 10, 2014
35
Uso de los protectans: Sin Backflush
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Optimizacion de las condiciones del MS
-Temperatura de la fuente de ionización
280ºC compromiso entre buena respuesta de los últimos
compuestos eluidos
-Factor de ganancia vs EMV (+200v)
Ganancia 10-20
-Optimizacion condiciones MS/MS
Condiciones seleccionando 2-4 iones precursores del Full Scan
con multiples energías de colision (0-60v) y seleccionando 2-3
transiciones de las mas abundantes.
-Programa de segmentos de tiempo
Siempre > 10 puntos por pico
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Bases de datos publicadas
Agilent: 7 transiciones; clasificaciones; 3 RTs y RIs
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Optimizacion MSMS
March 10, 2014
40
1. Realizar un Full Scan para elegir el mejor ion
2. Realizar un scan de iones producto a diferentes voltajes
3. Elegir las mejores condiciones de voltaje y abundancia
4. Comprobar numero de puntos por pico
5. Comprobar transiciones con matriz: Interferencias
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Optimizacion MSMS
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Ciclos por segundo
3,5 ciclos/seg generan 15 puntos por pico
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Evaluación de 6 MRMs para Atrazine en diferentes matrices
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Metodo MRM: Segmentos de tiempo
Trabajar en RTL
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Metodo MRM: Condiciones MRM segmento
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Indice
Introducción
Preparación de la muestra
Uso de patrones internos
Consideraciones cromatografía
Consideraciones detección
Optimizacion y desarrollo método GCMSMS
Rutina y mantenimiento
Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes
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Rutina de mantenimiento diario (Bacth 50 muestras)
-Cambio de liner.
-Cambio de septum.
-Realizar tune evaluation.
-Revisar estado de los filtros de gases.
-Revisar nivel de presión de gases.
-Comprobar del primer pinchazo la resolución de picos
isomèricos (-HCH vs -HCH y/o p,p’-DDD vs o,p’-DDT)
-Comprobar perdida de sensibilidad o forma de pico.
-Comprobar el RTL
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Requerimientos de controles de calidad
Durante proceso de validación
Recuperaciones, precisión al LOQ (5
replicas)
recuperaciones del 70-120%
repetibilidad 20% al LOQ
En rutina
Recuperaciones ± 2 veces RSD (SANCO 60-
140%)
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Consideraciones respecto a la Calibracion
Sobre Matriz
Factores de correlación R2 > 0.990
% RSD ≤ 20%
Residuales < 20% (dif calc vs conc real) (80-120%)
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Resumen
• Conocer bien la muestra y los compuestos a analizar
• Condiciones de extracción óptimas
Preparacion de muestra
• Buena introdución de la muestra
• Selección del uso de ISTD
• Selección correcta de las condiciones cromatografícas y de detección
Condiciones instrumentales y metodológicas
• Controles de calidad adecuados
• Planificacion de los mantenimientos diarios, semanales y mensuales
Mantenimiento en rutina
March 10, 2014
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Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes