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Transformación
Ingreso a la célula de DNA presente en el medio
Bacterias
Levaduras
Células de animales (mamíferos)
Células vegetales
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Bacterias (Escherichia coli)
Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma
Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento
►Origen de replicación
►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación)
►Sitio de clonamiento (“polylinker”)
Transformación (transfección) llevada a cabo por:
1. Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura
2. Electroporación
Utilidad
►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa
►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón
lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)
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H
HO
X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
-galactosidasa
galactosa
Colonias azules : fragmento clonadoColonias blancas : sin fragmento
Productoazúl
- IPTG → expresión bloqueada+ IPTG → expresión
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Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”)► Origen de replicación en E. coli► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli)► Origen de replicación en levadura
● 2 ● ARS (secuencia de replicación autónoma)
► Marcador de selección metabólico
YACs → Cromosomas artificiales de levadura► Secuencias teloméricas► Secuencias centroméricas► Marcador de selección metabólico► ARS (secuencia de replicación autónoma)
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(YAC)
Vectores y marcadores de selección en levaduras
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Transformación llevada a cabo por:
1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura
2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura
Utilidad
► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli
► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos
(YACs)
► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores
Levadura útil como modelo para probar función de genes de
otros organismos
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Manipulación de genes por recombinación homóloga
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Eliminación (KO) de genes cromosómicos
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“Plasmid shuffle”
Estudio de función de genesmutantes o genes foráneos
KO TPK1, TPK2, TPK3
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Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido
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Animales
Genes en:
► Fragmentos de DNA
► Vectores tipo plásmido con elementos virales
► Virus
Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración)
Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientesPartículas virales
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Transformación llevada a cabo por:
Microinyección
DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis)
Electroporación
Liposomas
Infección viral
Utilidad
► Expresión de proteínas recombinantes
► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero)
► Estudio de la función de los genes en entorno natural● Expresión● Silenciamiento (antisentido)
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Marcadores de selección
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Ejemplo 1: Transformación con
fragmentos de DNA
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Ejemplo 2: Transformación con
vectores
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Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7
Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006)
Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP
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Ejemplo 3: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus
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Ejemplo 4: Transformación combinada
fragmentos de DNA y virus
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Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)