Download - Transferencia de genes mediada por espermatozoides para la producción de embriones transgénicos
TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES PARA LA
PRODUCCIÓN DE EMBRIONES TRANSGÉNICOS
M.C. Graciela Calderón Mendoza
Centro Multidisciplinario de Estudios en BiotecnologíaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
Animales transgénicos
Microinyección pronuclear
Transferencia nuclear
Integración genética ratones 30-50%
animales de granja 3%
Eficiencia
Transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT)
FIV
Cultivo de embriones transgénicos
PASO 4
IncubaciónEspermatozoides/ADN
PASO 1
PASO 2
ADN EXÓGENO
IncubaciónEspermatozoides transfectados con ovocitos
ICSI
Implantación de embriones
transgénicos viables
Descendencia transgénicaIntegración genética
PASO 3
•liposomas•electroporación•REMI•vectores retrovirales•anticuerpos monoclonales•detergentes•crioprotectores•congelación•RecA Tn5
Métodos Transfecciónespermatozoides
* Brackett et al. (1971)
* Lavitrano et al. (1989)
*Perry A. (1999) 94% expresión genética
Inseminación artificial
Ratones, Conejos, Peces, Aves, Monkey Rhesus, macaques, Cabras, Ovinos, Cerdos, Bovinos, Felinos y Equinos
Interacción e integración de ADN exógeno en el espermatozoide
SMGT
Interacción de moléculas de ADN exógenas en el núcleo espermático
Spadafora, 1998
MP
Núcleo
MN
Protaminas
ADN cromosomal
IF-1
DP
B CD4
ADN exógeno
MHC II
DPB: binding proteinsIF-1: Factor inhibidor
Integración
ADN exógeno
Protaminas
ADN cromosomal
Integración del ADN exógeno en el ADN cromosómico del espermatozoide
Topoisomerasa II
Elementos nucleares tipo I
Spadafora, 2008
Transferencia de genes “inversa” mediada por espermatozoides (SMRGT)
SMGT94% EXPRESION GENETICA
R A T O N
Animales granja baja eficiencia: B O V I N O S
Incubación ADN/espermatozoides
LiposomasElectroporación
I.A FIV
SMGT EN BOVINOS
Castro et al., 1990: incubación ADN 0.3% espermatozoides (EGFP)
Gagné et al., 1991: electroporación 12% embriones FIV (pRGH527)
Rieth et al., 2000: electroporación 27% espermatozoides (Pst1 -actin GFP)
Francolini et al.,1993: incubación de ADN 15-22% espermatozoides (GFP)
Schellander et al. 1995: incubación ADN 2.4% embriones I.A (pSV2-cat)
Sperandio et al., 1996: incubación ADN 0.4% embriones FIV (PALu)
Shemesh et al., 2000: REMI 13% espermatozoides (pEGFP)
Alderson et al.,2006: incubación ADN 10.2% embriones (pCX-EGFP- protaminas) FIV
Hoelker et al., 2007: liposomas 3.6% embriones (CMV-INF-t-IRES-EGFP) FIV
Pereyra et al., 2008: incubación ADN 24% embriones (pCX-EGFP) FIV
Crioprotectores en congelación y/o detergentes - Transfección espermatozoides (pCMV-GFP) (UPII-GFP) – Embriones transgénicos ICSI
Lavitrano et al. (1992)Incubación ADN exógeno
autorradiografía 80% periferia del núcleo entre MP y MN
20% internaba núcleo ratón
Francolini et al. (1993)Incubación ADN exógeno
autorradiografía 6-30% internado núcleo ratón
Sperandio et al. (1996) Incubación ADN exógeno
autorradiografía 50-80% región postacrosomal , toro y
cerdo
Huguet and Esponda (1998) Incubación ADN exógeno
microscopia electrónica 34% núcleo y 7.5% MP y acrosoma ratón
Lavitrano et al. (1997)Incubación ADN exógeno
inmunofluorescencia segmento posacrosomal cerdos
Anzar and Buhr (2006)Incubación ADN exógeno
microscopia fluorescencia región acrosomal 49% bovinos
Localización de ADN exógeno en espermatozoides
Estado funcional del espermatozoideEspermatozoide no capacitado
Espermatozoide exocitósis acrosomal
Espermatozoide reacción acrosomalNo Capacitado Capacitado Reacción acrosomal
ADN exógeno
Anzar and Buhr (2006)
Harrison, 1997: capacitation like
Perry, 1999: transfección de espermatozoides congelados de ratón
• Disuleve proteínas
• Elimina la MP
•Elimina membrana acrosomal
• Elimina acrosoma
•Ingresa ADN exógeno
• Acrosoma interfiere en descondensación de la cromatina espermática
• Expuesto núcleo espermático
núcleo
acrosoma
membrana plasmática
núcleo
ADN exógeno
cabeza
parte intermedia
flagelo
membranaacrosomal
Desestabilización de la MP del espermatozoide con detergentes
núcleo
núcleo
• Crioprotectores
• Protege al espermatozoide en congelamiento
• Almacenamiento • Daños en membrana plasmática
• Formación de cristales de agua en espacio extracelular e intracelular
• Muerte celular
Espermatozoide con crioprotector
Espermatozoide sin crioprotector
Desestabilización de la MP del espermatozoide con crioprotectores
• Bajas concentraciones crioprotectores
• Ingresa ADN exógeno
Espermatozoides de bovino transfectados
crioprotector
ADN exógeno
espermatozoides
Congelación -80°C
Espermatozoides transgénicos
APLICACION DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINO TRANSFECTADOS
Espermatozoides MP desestabilizada con
detergentes y crioprotectores permiten la transfección
Producción de animales
transgénicos“BIORREACTOR
ES”
Producción de
embriones bovinos
transgénicos
Transferencia de embriones
Producción de proteínas terapéuticas
(UROPLAQUINA) en orina
ICSI Aumenta la captura ADN exógeno
ANIMALES BIORRECTORES DE UROPLAQUINA EN ORINA
Kerry et al. (1998)
ratones UPII
Espermatozoide Gen UPII
Promotor para tejido específico (urotelio)
Transferenciaembriones
Cultivo embrionario
ICSI
Vaca transgénicaBiorreactor Orina
Vaca adulta 30 litros/día
Aislamiento y purificación de
UPII
Urotelio-Vejiga expresando la UPII
Producto finalUPII
Marcador de cáncer urotelial en
humanos