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Técnicas enBioquímica
• Univ. Ismar Romero.• Univ. José Rojas.• Univ. Kelvin Rojas.• Univ. Victor Rojas.
Grupo #03
Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”Campus La Morita
Profa. Fabiola Sarco Lira.
Abril, 2013
ElectroforesisEs una técnica para la separación de moléculas que se basa en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, también afecta a la función de la misma.
Separación, visualización y cuantificación del numero de proteínas de una solución.
Ventajas
Desventajas
Movimiento iónico en un campo eléctrico
Durante el proceso de migración de una partícula cargada en un campo eléctrico, dependiendo de la carga neta ocurrirá lo siguiente:a. Si la partícula posee carga + se moverá hacia el cátodo.b. Si la partícula posee carga – se moverá hacia el ánodo.c. Si la partícula no posee carga no se moverá
Electroquímica moderna, Volumen 1. John O'Mara Bockris
En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolécula es el potencial eléctrico, E, expresada en voltios/cm.
Principios de Bioquímica Lehninger
La movilidad electroforética de la molécula, μ, es el cociente entre la velocidad de la partícula, V, expresada en cm/seg, y el potencial eléctrico.
La movilidad electroforética esta expresada en cm2 /(V)(s)
La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre.
Proceso Electroforético
Electroforesis libre:Electrodos
Proteínas disueltas en
el buffer
Buffer
Una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación en forma de U.
http://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpg
Electroforesis de zona :
La disolución a tratar se aplica como una mancha , o como una banda, y las partículas migran a través del disolvente, utilizando además un medio de soporte inerte y homogéneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles.
Bioquímica Christopher K.
Mathews
Cámaras Electroforéticas
Cámaras horizontales
En la electroforesis de tipo horizontal generalmente, se trabaja con ADN o ARN.
Cámaras verticalesEn la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas.
Medios de Soporte
Papel
Método sencillo y rápido
Separación de:
•Proteínas•Oligonucleótidos•Carbohidratos•Lípidos
Desventajas
•Se desgarra fácilmente•Distorsiona las bandas•Se produce interacción entre las proteínas y los grupos hidroxilo de la celulosa, por lo tanto la migración se frena
Acetato de Celulosa
Se usa en el análisis de fluidos biológicos
Tiempo de análisis corto
Sencillez de la técnica
Desventaja: Su débil resolución
Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilación, por lo que no hay interacción con las proteínas.
Gel
Almidón Técnica barata, fácil y rápida
Poliacrilamida
Agarosa
Soporte mas usado en electroforesisDe alta resoluciónSus componentes son tóxicos
Buena resoluciónSeparación de moléculas grandes con radio mayor a 5-10nm (virus, ácidos nucleicos)
Factores que afectan la Electroforesis
Carga neta Tamaño Intensidad del campo eléctrica Temperatura Medio de soporte Buffer
Electroforesis en gel de
poliacrilamida
¿Qué es la poliacrilamida?
Polímero generado a partir de acrilamida y bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa para realizar electroforesis de macromoléculas, en especial proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.
http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html
¿Como se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida?
• Primeramente se necesita el gel de poliacrilamida, quien funciona como filtro gracias a su estructura porosa.
http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/943905 http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspx
¿Como se realiza la electroforesis en gel de
poliacrilamida?• Colocar las muestras en los
pocillos.
• Se aplican cargas eléctricashttp://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html
http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electroforesis-monografia.html
¿Como se realiza la electroforesis en gel de
poliacrilamida?
• Aplicar un colorante tal como el azul de Coomassie.
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm
Electroforesis en gel de poliacrilamida en SDSEs otra técnica electroforética también aplicada en
proteínas en la que las mismas sufren desnaturalización.
¿SDS?¿De que habla?
El SDS (Dodecilsulfato sódico) es un compuesto desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.
¿Como se realiza la electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS?• Primero deben
desnaturalizarse las proteínas.
• En presencia de SDS la proteína:
http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mito-realidad.html
http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012/11/proteinas.html
http://cvclavoz.com/blog/paralelo/page/6/
http://bioquimica6ce.wikispaces.com/Proteinas
¿Como se realiza la electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS?• Se colocan las
muestras en los pocillos y se aplican las cargas eléctricas.
• Se visualizan añadiendo un colorante como el azul de Coomassie
http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/electroforesis-en-gel.html
http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biologia/tecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html
Electroforesis bidimensional
¿Qué es?
Es una técnica para la separación de mezclas complejas de proteínas, ya que la misma permite la separación y visualización de hasta 1.000 proteínas diferentes en un solo gel.
Lehninger 5ta edición
Se incorpora una mezcla de
anfolitos.
¿Cuál es el procedimiento para la
electroforesis bidimensional?• Punto Isoelectrico• Se establece un gradiente de pH.
¿Cuál es el procedimiento para la electroforesis bidimensional?
Primera dimensión . pI decreciente
El gel se coloca sobre un gel de
poliacrilamida SDS
Segunda dimensión
Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS
Peso molecular decreciente
pI decrecient
e
Lehninger 5ta edición
Electroforesis en gel de agarosa
o Es una técnica utilizada para fragmentos grandesde ADN.
¿Agarosa?La agarosa es un polímero de galactosa
http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196
¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de
agarosa?• Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con
un buffer.
http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.html
¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de
agarosa?
http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-nucleicos.html
¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de
agarosa?
http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis/
La Espectrofotometría Es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoleculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas)
Principios de la Espectrofotometría
• Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.
• La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, lo que da lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior.
• Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. La frecuencia de la radiación absorbida es proporcional a la diferencia de energía entre ambos niveles.
• El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.
• La espectrofotometría se basa en dos leyes que relacionan la absorción de luz a una determinada longitud de onda con la concentración del material absorbente y la longitud del camino que debe atravesar. Estas dos leyes, que combinadas resultan en la ley de Lambert-Beer
Espectro de absorción• Representación gráfica de la absorbancia de un
analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación, l, (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada).
Ley de Lambert BeerASPECTOS TEÓRICOS
La fotometría
La colorimetría
La espectrofotometría
Medición de luz
Leyes de Lambert y
Beer
Luz monocromáti
ca
Lambert y Beer
relacionan
observando
La medida de la absorción
El espesor de la sustancia absorbente
La cantidad de sustancia que absorbe
crecimiento exponencial de la absorción de radiación
espesor de la región absorbente
En Función de
la cantidad de esa especie
Ley de Lambert:
Medio absorbente
Intensidad transm.
Ley de Lambert Beer«la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución»
1. Agua con azúcar disuelta.2. Agua con mayor cantidad de azúcar.
Ley de Beer:
Sustancia absorbente
Intensidad trans.
Ley de Lambert Beer«La cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz»
1. Agua con azúcar disuelta.
2. Agua con azúcar disuelta en un vaso con mayor diámetro.
Ley de Lambert BeerEstas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:
«Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado, relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción»
http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-radiacion_11.html
Ley de Lambert Beer
• Transmitancia (T)Es la fracción de radiación incidente transmitida por la solución
Si T se expresa en %,T % = 100 I/I0
T: I/I0
• Absorbancia (A)Es la fracción de radiación incidente absorbida por la solución, expresada como
A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T
Si T se expresa en % A = log100/T% = 2 -logT%
La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra
Ley de Lambert Beer
A = C . ξ . L
• ξ: Absortividad molarEs una propiedad de la materia relacionada únicamente con la naturaleza de la misma.
a cuando la concentración está en mg/Lξ cuando la concentración está en mol/L
• L: Trayectoria de la radiación a través de la muestra (cm)
• C: Concentración (mg/L ó mol/L)
expbasquimica-g1-zb-09-10.wikispaces.com
Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la luz. MacGraw Hill: México.
Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la luz. MacGraw Hill: México.
Ley de Lambert Beer1) Una disolución 100 µM de un determinado cromóforo tuvo una
transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una celda 1.5 cm de longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolución; b) la absorptividad molar del cromóforo.
a) A = -log T = - log 0.5 = 0.301
b) A = C . ξ . L Reordenando la ecuación obtendremos: ξ = A/(C . L) = 0.301 /(10-4 M x 1.5 cm) = 2 x 103 M-1 cm-1
0,5
0,01% Concentración
% T
ran
smit
an
cia
Nadie puede volver atrás y comenzar de nuevo. Pero cualquiera puede comenzar hoy mismo y hacer un nuevo final, no te rindas.
Anónimo