BIBLIOGRAFÍA
• Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a
ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad deArchaea y Bacteria)
• Reviews• Roselló-Mora R & Amann R. (2001). The species concept for prokaryotes.
FEMS Microb Rev 25, 39-67.
• Vandamme P. et al (1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approachto bacterial systematics. Microbiol Rev 60, 407-438.
TEMARIO
Taxonomía y concepto de especie en procariotas
Taxonomía clásica, numérica y polifásica
Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos
Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting)
Filogenética: clasificación y relación evolutiva
gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos
Relación entre taxonomía clásica y filogenética.
Diversidad bacteriana.
Identificacion de una cepa
Clasificaciónestructura los organismos en grupos (taxones) en base a susimilitud
Nomenclaturaasigna nombres a los taxones
Identificacióndetermina a que taxones pertenece un organismo que seaisla
TAXONOMÍA
• Taxonomía– Caracterización exhaustiva– Aplicación de teoría y método de clasificación– Formación de grupos taxonómicos (taxones)– Nomenclatura
• Identificación– Caracterización por número limitado de tests
adecuados al problema– Comparación con spp conocidas– Asignación a una sp– No identificado: estudio taxonómico
• unidad taxonómica básica• grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud
en sus propiedades y que difieren en formasignificativa de otros grupos de cepas
• Cepa: población de organismos que desciende de unúnico organismo
ESPECIE
• Concepto en revisión continua
ESPECIE BACTERIANA
• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinaciónde características fenotípicas y genómicas)
• Definición metodológica estándar:- % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%
- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
Longitud de onda (nm)
ADN simple hebra
ADN doble hebra
Abs
orba
ncia
220 260 300
Abs
. rel
ativ
a 26
0 nm
80 90 100temperatura (ºC)
Tm = 86ºC
ADN doble hebra
ADN simple hebra
desnaturalización
Tm: punto mediodel perfil dedesnaturalizacióntérmica de ADN-ADN o de ADN-ARN
Aumento deabsorbancia delADN a 260nm pordesnaturalizacion
Taxones: Dominio
Phylum
Clase
Orden
Familia
Género
Especie
Sub-especie
importancia en estudiosclínicos y ecológicos
RANGOS TAXONOMICOS ENCLASIFICACION BACTERIANA
Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie
Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coliEscherichia coli
• serovariedad o serotipo (antígenos distintos)
• fagovariedad (tipificación por fagos)
• biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)
• patovariedad (patogenicidad)
• morfovariedad (diferencias morfológicas)
• genomovariedad (grupos con ADN similares)
Categorías de clasificacion a nivel de sub-especie (tipificación)
Variedades o tipos
Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology
1923 (1ed)-1994 (9ed)
Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed1984(vol 1)-1989(vol 4)
Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed2001(vol 1)
The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)
PUBLICACIONES
International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology (antes IJSB).Publicado por la Sociedad General de Microbiología
Otros: Applied and Environmental Microbiology,Systematic Applied Microbiology
COLECCIONES (cepas tipo y otras)ATCC (American Type Culture Collection)
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZelkulturen, Colección alemana)
CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)
Taxonomía bacteriana
CLÁSICA
• caracteres fenotípicos (morfología, nutrición,etc.)
• algunos genotípicos: % G+C, hibridación ADN-ADN
• ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)
Características fenotípicas clásicasde valor taxonómico
Morfología: forma, tamaño y tinción
Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo,aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos,fuentes alternativas de C, N y S
Movilidad: tipo y disposición de flagelos
Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidada antibióticos, patogenicidad
• Contenido G+C
% G+C = G + C x 100 G + C + A + T
determinación por gradiente de CsCl, desnaturalizacióntérmica o cromatografía
Amplio rango en procariotas: 20 al 80%Poca información para la caracterización taxonómica
criterio de exclusión: %GC > 3, probablemente especies diferentes %GC > 10, probablemente géneros diferentes
Características genotípicas clásicas
• Hibridación ADN-ADN
- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados
- determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido
- es el criterio actual de definición de especie
NUMÉRICA• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones
por métodos numéricos• Se basa en un gran número de caracteres• Cada carácter tiene igual peso• La similitud es función de la proporción de
caracteres comunes
NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60)
- coeficiente de semejanza = a + d .
a + b + c + d
a: número de caracteres positivos en ambas cepasb: número de caracteres positivos sólo en cepa 1c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2d: número de caracteres negativos en ambas cepas
Desventajas de una clasificación artificial
• No permite inferir propiedades• No permite comprender microorganismos
que no se han cultivado en el laboratorio• No permite estudiar el origen y evolución
de funciones celulares (resistencia aantibióticos, aerobiosis, fotosintesis)
Clasificación natural
Estructura los organismos en taxonescuyos miembros reflejan tanto como seaposible su naturaleza biológica.
Es ventajosa si además establecerelaciones evolutivas
POLIFÁSICA
Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc)- marcadores quimiotaxonómicos- perfil de proteínas totales y enzimas
Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S
Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA
nuevos: fingerprinting (ej. perfiles molecularespor restricción o amplificación de ADN)
Es la tendencia moderna. Consenso en laintegración de distintos tipos de caracteres:
Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en lataxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).
Marcadores quimiotaxonómicos
Características
- análisis químico con equipamiento especializado
- no son universales, muy útiles dentro de algunosgrupos
- alto grado de discriminación
- presentes en distintas estructuras celulares
CARACTERES FENOTIPICOS
• Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo enPlanctomyces y Mycoplamas
• Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos
• Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty AcidMethyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacteriasGram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoidesen bacterias fotótrofas anoxigénicas.
• Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.
• Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.
• Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gramnegativas
• Plantean hipótesis de evolución (determinarelaciones de parentesco entre las especies)
• Compara la secuencia de moléculas (cronómetrosevolutivos) y establece la relación entre ellas
• Las secuencias de las moléculas son el registrohistórico de la evolución
CARACTERES FILOGENETICOSCARACTERES FILOGENETICOS
PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO
– distribución universal (presente en todos losorganismos)
- función homóloga en todos los organismos- secuencias con zonas altamente conservada para
distancias evolutivas grandes (alineamiento) yalgunas zonas variables
- ausencia de transferencia horizontal- cantidad de informacion suficiente
•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)•Factor de Elongación Tu•Subunidad beta de ATPasa•RecA•Genes funcionales
Moléculas usadas para la determinaciónde relaciones filogenéticas deorganismos
ARNr en Procariotas
Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos)
5S 120 Subunidad mayor del ribosoma
16S 1500 Subunidad menor
23S 2900 Subunidad mayor
Arboles filogenéticos
• Uso de programas para alinear secuencias yconstruir árboles filogenéticos
• Longitud de la línea entre organismos esproporcional a la distancia evolutiva
• Similitud de secuencias implica similitud enlos genes
Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S. La barraindica la sustitución de 10 nucleótidos cada 100
• Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación,
con cambios de secuencia, pero conservación deestructura secundaria
• Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de
proteínas: función ancestral
Secuencia del ARNr 16S
Estructurasecundaria delARNr 16S de E. coliLíneas gruesas: dominiosde conservación universal
Líneas normales:dominios de conservaciónintermedia
Líneas punteadas:regiones hipervariables
Bacteria Archaea Eucarya
Peptidoglicano Sí No No
Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester
Ribosomas 70S 70S 80S
tRNA iniciador Formilme-
tionina
Metionina Metionina
Intrones en tRNA No Sí Sí
RNA polimerasa Una
(4 subun)
Varias
(8-12 subun)
Tres
(12-14 subun)
Ribosoma sensible a:
Toxina diftérica No Sensible Sensible
Cloranfenicol
Kanamicina
Estreptomicina
Sensible No No
Características diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya
Secuencias signaturas o firma en ARNr
Oligonucleótidos o bases presentes endeterminadas posiciones en ciertos gruposde organismosEjemplos:
AAACUCAAA (posición 910) en BacteriaCACACACCG (posición 1400) en Archaea
C (posición 47) en gamma-Protebacteria,Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos
Arbol del ARNr 16S
• Termofilia representada en los gruposmas profundos de Archaea y Bacteria
• Muchos de los linajes profundos sonanerobios o microaerofílicos
• Fotosíntesis basada en clorofilas:distribuida en varios linajes de Bacteria
Propiedades definidas genéticamente quehan cambiado poco
• Estructura de la pared celular:– peptidoglicano solo presente en Bacteria– Gram +: linaje filogenéticamente coherente
• Lípidos de membrana (ésteres o éteres)• Metanogénicos: todos pertenecen a uno de
los 4 linajes dentro de Archaea
Caracteres que confirman el árbol universalconstruido a partir del ARNr 16S
• Principales diferencias entre dominios Bacteria,Archaea y Eukarya
• Procariotas actuales mas cercanos al ancestrorelacionadas con las condiciones fisicoquímicas en elorigen de la vida: Aquifex y Methanopyrus(termofilia, anaerobiosis)
• Características de los Eukarya mas cercanos a losprocariotas: Giardia y Microsporidia
• Secuencias de otras moléculas, especialmente lasligadas a la replicacion, transcripción y traducción
Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados,tienen genoma un poco mayor que los procariotas.
Caracteres similares en taxonesfilogenéticamente distantes
Chloroflexus y Chlorobium
ambos poseen clorosomas con similar función yestructura, pero diferentes centros de reacción
posibles explicaciones:
transferencia lateral
evolución independiente
el gen del ARNr 16S aportaría información limitada
DOMINIO BACTERIA
Actualmente con mas de 40 divisiones (phylum),algunas sin organismos cultivados (secuenciasambientales)
Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria(α,β,γ,δ,ε), Gram positivos (LowGC y HighGC)
Origen de mitocondrias (phylum Proteobacteria) ycloroplastos (phylum Cyanobacteria)
Relación entre la definición de especiebacteriana y el análisis del gen ARNr 16S
En general se cumple:secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3%con el resto de las secuencias conocidas de bacteriasentonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%
especies diferentes
Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%
COMPLETAR IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS PUROS
ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO
Secuencia del gen ARNr 16S
Se emplea frecuentemente para:
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA
> 3% < 3%
Diferencia de secuencia con la cepa mas similar
Alineamiento y corrección de la secuencia
Comparación con bases de secuencias(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
NUEVA CEPA DE LAMISMA ESPECIE
< 70%
Hibridación ADN-ADN
pruebas fenotípicas
similaresdiferentes
> 70%
Confirmación conpruebas fenotípicas ygenotípicas diferentes
NUEVA ESPECIE
¿Por qué hay tanta diversidad entre losProcariotas (Archaea y Bacteria)?
• son ancestrales
• son ubicuos: ambientes extremos, parásitos osimbiontes de Eukarya
• representan la mayor diversidad de seres vivos,mucha de la cual esta aún inexplorada
Ejemplos de diversidad: estructura y función
• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)
• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)
• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter),formacion de hifas (Streptomyces)
• Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)
• Diferenciacion celular: microcistos de Cyanobacterias,comportamiento social (Myxobacterias)
• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)
• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones(fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación,ej.decarboxilasas en Oxalobacter formigenes
• Origen de la tierra 4600 millones de años
• Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS yH2S
• Temperatura > 100°C
• Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva(microfósiles: estromatolitos)
• Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)
• Célula moderna: ADN ARN Proteína
• Origen de eucariotas: teoría endosimbiótica
ORIGEN DE LA VIDA