Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı
Dr. Zümrüt Uysal
19 Kasım 2011
Anemik Çocuğa Yaklaşım
• Öykü
• Fizik muayene
• Laboratuar
1.Tam Kan Sayımı Hb,Hkt, KK, OEV, OEH, OEHK, BK, Trombosit 2. RDW 3.Retikülosit 4.Periferik Yayma • Demir rezervi - Serum demiri, UDBK, TS - Ferritin -Serum eritrosit protoporfini • Coombs test Eksiklik testleri - Folik asit, B12 düzeyi • Hemoglobin elektroforezi • Kemik iliği • Osmotik frajilite • Eritrosit enzimleri • Radioizotopik araştırmalar
LABORATUVAR
Yaşlara Göre Eritrosit İndekslerinin Değişimi
YAŞ MCV (fl)
Mean -2SD
MCH (pg)
Mean -2SD
MCHC (g/dL)
Mean -2SD
1-3 gün 108 95 34 31 33 29
2 hafta 105 86 34 28 33 28
1 ay 104 85 34 28 33 29
2 ay 96 77 30 26 33 29
3-6 ay 91 74 30 25 33 30
0.5-2 yaş 78 70 27 23 33 30
2-4 yaş 80 72 27 24 34 31
4-10 yaş 83 77 28 25 34 31
10-15 yaş 86 78 29 25 34 31
Hb (g/dl) MCV (µ3)
Yaş(yıl) Ortalama
Alt sınır Ortalama
Alt sınır
YD 16.8 13 110 100
0.5-1.9 12.5 11.0 77 70
2-4 12.5 11.0 79 73
5-7 13.0 11.5 81 75
8-11 13.5 12.0 83 76
12-14 13.5
14.0
12.0
12.5
85
84
78
77
15-17 14.0
15.0
12.0
13.0
87
86
79
79
NORMAL Hb ve MCV Değerleri
Hb alt sınır
g / dl
MCV alt sınır
3
YD
13 110
3 ay
9.5 70
6ay - 6yaş
10.5 70-74
7-12 yaş 11
76-80
Erişkin 12-14 80
Anemi ve Mikrositoz
Tam Kan İncelemesi
MCV
ANEMİ
Mikrositer Normositer Makrositer
-Demir eksikliği anemisi
-Kronik enflamasyon anemileri
(normositik te)
-α ve β talasemi sendromları
-Kurşun zehirlenmesi
-Sideroblastik anemiler
-Bakır, pridoksin ve Zn eksikliği
Megaloblastosis olmaksızın makrositoz -yenidoğan dönemi -retikülostoz -karaciğer hastalıkları -hipotroidi -aplastik anemiler -Pure red cell anemi -MDS
Megaloblastosisle makrositoz -B12 eksikliği -folik asit eksikliği -konjenital ve akkiz pürin ve pirimidin metabo. bozuklukları
Beta talasemi taşıyıcılarında ayırıcı tanı
Demir eksikliği RBC↓, RDW ↑
Mikrositoz + eritrositoz RDW normal
MCV / RBC olan Mentzer İndeks <13
MCV<61fl MCHC<28g/dl MCV/MCHC> 1
Enflamasyon anemisi Sed, CRP, Ferritin
Alfa talasemi : mikrositoz, hipokromi, eritrositoz DE değil, Hb A2 Hb F artmamış ise düşünülür Alfa ve beta talasemi birlikte ise beta talasemideki değişiklikler (A2 artışı) görülmeyebilir. Aile çalışmaları, moleküler çalışmalar gerekir Kurşun entoksikasyonu (FEP↑)
Demir eksikliği
Talasemi minör
Normal erişkin insan hemoglobinleri
• Hb A : α2β2 %96- 98
• Hb F : α2 γ2 %0.5- 2
• HbA2 : α2 δ2 %1.5- 3.5
• Αlfa talasemi
• Beta talasemi
Periferik yayma
Metilen mavisi ile retikülosit boyama
1/1 metil viole ile karıştırıp, 370C ½ sa
parafinle kapatıp
Hemoglobin Elektroforezi
Metot:
Bir tüpün içine 50l venöz kan ve 300l hemolizat solüsyonu konur ve karıştırılır. En az beş dakika
bekletilir. Selüloz asetat plağı dikkatlice ve hava kabarcığı olmaksızın alkali (Ph 8.2-8.6) Supre
Heme tampon içine yavaşça daldırılır. Beş dakika sonra plak tampondan çıkarılıp, kurutma kâğıtları
arasında tek bir hareketle kurutulduktan sonra örnekler aplikatör ile plağa basılır. Örnekler selüloz
plak üzerinde katot ile anot arasındaki bir başlama noktasına yüklenir. Plak elektroforez tankına
örnek tatbik edilen ucu katot kutba gelecek şekilde yerleştirilir. Elektroforez cihazı 3,1amper ve 20
dakika olacak şekilde çalıştırılır. Bu süre sonrası plaklar çıkarılarak sırayla aşağıdaki çözeltilerde ve
sürelerde tutulur.
•Poncuez boyası 5 dakika
•%5’lik Asetik Asit 5 dakika
•%5’lik Asetik Asit 5 dakika
•%5’lik Asetik Asit 5 dakika
•Metanol 5 dakika
•% 80 Metanol + % 20 Asetik Asit 5 dakika
Bu işlemlerden sonra plak tankın içinde kurutulup, tam şeffaflaştıktan sonra dansitometrede 520 nm
dalga boyunda okunur. Hemoglobin varyantlarının yüzdeleri tespit edilir. Hemoglobinler kırmızı
bantlar halinde görülür.
Ap
lik
asy
on
n
ok
tası
Pro
tein
ler
HbA
2 -
H
b E
, H
b,C
, O
Ara
p(
>%
10
)
Hb
S v
ey
a H
b D
Hb
Lep
ore
Hb
F
Hb
A1
Hb
A1C
Hb
J İ
ran
Hb
Ba
rts
Hb
H
Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket
ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük
taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her
birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır.
Ör: Hb A1’in toplam negatif yükü HbA2’den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya
yürümüştür.
Talasemide Sınıflandırma
1. Sessiz taşıyıcı Hematolojik olarak normal
2. Talasemi minör (taşıyıcı, heterozigot ) Hafif hipokrom mikrositer anemi
3. Talasemi intermedia (hasta, homozigot) orta derecede anemi, transfüzyon ihtiyacı az
4. Talasemi major (hasta, homozigot) Ağır anemi, transfüzyona bağımlı
Sessiz Taşıyıcı
Sessiz taşıyıcılık - Farklı klinik ve biyokimyasal bir durum - Hb A2 düzeyleri ve periferik yaymaları normal - Taşıyıcılar klinik olarak tamamen normal, mikrositoz - Globin sentezinde orta derecede azalma (-101 promotor mut ve + 1 cap
site ınr mut) Hastalar -Sessiz taşıyıcı talasemi geni için homozigot olanlar -Orta derecede bir anemi (Hb 6-7g/dl) nadiren transf gereksinimi -Önemli derecede hepatosplenomegali olabilir. -Hemoglobin elektroforezinde HbF %10-15 , HbA2 ise klasik talasemi
taşıyıcılarında olduğu gibi (% 3,5 ).
Beta talasemi minor (beta talasemi trait, beta talasemi taşıyıcılığı)
Beta tal majörlü hastaların anne ve babaları, taşıyıcılığın farkında değiller Bir geni tamamen normal, diğer geninde mutasyon HbA2: Mutant geni ve karşı taraftaki kromozomdaki sağlam genine bitişik
geninden yapılan globin zincirlerinin, eksik geni yüzünden zincirleri ile birleşmesi nedeniyle 2 2 A2 düzeyi artar
HbA2, HbF veya her ikisi de, nadiren normal , globülinin %2,5’u Eğer globulin ekspresyonunu etkileyen bir mutasyon varsa
daha da az HbA2 Demir eksikliğinde A2 düzeyi azalır. Bu nedenle beta talasemi taşıyıcılarının tanısı
maskelenebilir. Demir tedavisinden sonra HbA2 de
Hipokrom mikrositik hafif bir anemileri olabilir
Demir, folik asit eksikliği, gebelik, enfeksiyonlar gibi stres durumları anemilerini artırabilir.
Beta talasemi minor
۞ Yüksek A2 ile olan talasemi taşıyıcılığı En fazla görülen tip, tek baz mutasyonu sonucu HbA2: %3,5-8, HbF %1-5 + veya o mutasyonlarla olan heterozigotlar farklıdır. Klinik fenotipi mutasyonun tabiatı belirler. + taşıyıcılarda MCV ve MCH daha yüksektir. Homozigot çocuklarında
transfüzyona bağımlı anemi, fakat bazen de talasemia intermedia fenotipi olur. ۞ Yüksek A2, yüksek F ile olan talasemi taşıyıcılığı Farklı bir varyant. Hem A2 hem %5-20 gibi Hb F yüksektir. geni delesyonu
ve genleri sağlam. ۞ Normal A2 ile olan talasemi taşıyıcılığı Sessiz taşıyıcılardan ayrılmalıdır. Farkı hipokrom mikrositer anemi oluşu Hem hem geni azalmış (aynı kromozom veya karşı sağlam kromozomda) Ebeveynlerden biri bu tip, diğeri klasik taşıyıcı ise ağır klinik tablo
Talasemi İntermedia
Homozigot talasemi fakat klinik olarak ağır değil transfüzyon ihtiyacı yok veya çok az
Enfeksiyon, cerrahi ve bazı özel stres durumları dışında Hb’leri 6-10g/dl düzeyinde
İlerleyen yaşla kemik iliği genişlemesine bağlı kemik değişiklikleri
Ekstramedüller hematopoez kitleleri
Artmış demir emilimi sonucu demir birikim bulguları
Talasemide hastalığın ağırlığı α ve non α globin sentezi arasındaki dengesizliğin derecesine bağlıdır
β mutasyonunun tipi β+ β0
α globinin artması veya azalması
genetik olarak Hb F yapma kapasitesi)
Talasemik hastada veya aile taramalarında
klasik olmayan elektroforez sonuçları varsa
• α veya γ genlerinin eksikliği veya fazlalığı düşünülmelidir
• α talasemi de varsa talasemi kliniği hafifler, Hb daha yüksektir, Hb F düzeyi düşüktür
• α gen fazlalığında klinik daha ağırdır, Hb F artar.
• β gen delesyonlarında taşıyıcılarda A2 belirgin yüksek, klinik ağırdır. Promotor delesyonlarda Hb F belirgin yüksektir
• δβ talasemide taşıyıcılarda HbA2 yükselmez, Hb F %5-15 gibidir
• Homozigot β tal gibi olan hastanın anne veya babasının veya her ikisinin Hb A2 leri normal ise o taşıyıcılarda:
- Beraberinde demir eksikliği
– δβ talasemi taşıyıcılığı
– β taşıyıcılığı + δ talasemi varlığı
– -101 mutasyonu gibi sessiz taşıyıcılık
– Başka anormal Hb varlığı
• Dominant talasemi : globin genleri kodlama bölgesi mutasyonu, β sentezi çok az, inkülizyon cisimcikleri, Hb elektroforezinde bant görmek çok zor
• Yakınma: Kulak ağrısı
• Öykü : Beslenme: İnek sütü : 400 ml/gün
Jeofaji : Yok
• Soygeçmiş: Anne: 36 yaş, sağlıklı
Baba: 36 yaş, DM
• Fizik Muayene:
VA: 21.5 kg (%50-75) Boy: 116 cm (%25-50)
Cilt soluk Hb: 10.3 g/dl
Diğer sistem bulguları doğal
B.Ö., 5 yaş, Ankara
Tam kan sayımı: Hb : 10.6 g/dl Htc : % 32.3 MCV : 62.3 fl MCH : 20.5 pg MCHC: 32.8 g/dl RDW : %13 BK : 7600/mm3
Plt : 326000/mm3
PY : Hipokromi, target hücreleri
Demir profili:
SD: 90 mcg/ml
TDBK: 290 mcg/dl
TS : % 31
Ferritin: 28.83 ng/ml
Hb elektroforezi:
HbA2 : % 4.8
Hb F : 4 Anormal Hb: Yok
Anne: Normal bulgular
Baba:
Hb: 14.0 g/dl
MCV: 64.8 µ3 MCH: 21.0 pg
HbA2: % 6.7 HbF: %2
Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı
Dr. Zümrüt Uysal
• ÖYKÜ:
2 ve 3 aylık Halsizlik , kusma, sarılık
Anemi Eritrosit transfüzyonu (2 kere)
6 aylık Hastaneye başvuru
Tam kan sayımı:
Hb : 5.3 g/dl
MCV : 66.9 fl
BK : 9400/mm3
Plt : 245000/mm3
O.K., 4 yaş, Gaziantep
Ferritin: 42.4 ng/ml (N)
Mikrositer
anemi
4 yaş kız KLİNİĞİMİZE BAŞVURU
• Solukluk dışında yakınması yok
• Soygeçmiş: Anne: 26 yaş Sağlıklı, teyze çocukları
Baba: 33 yaş
• Fizik Muayene:
VA: 16 kg (%25-50) Boy: 95 cm (%3)
Cilt ve mukozalar soluk
Karaciğer kot altı MKH’ da 4 cm, dalak 6 cm ele geliyor
Diğer sistem bulguları doğal
O.K., 4 yaş, Gaziantep
Hb : 5.3 g/dl
MCV: 66.9 fl
RDW: 26
6/100 normoblast
Ferritin: 3556 ng/ml
Hemoglobin Elektroforezi Hb A2 : %2.1 Hb F : %13.7
Anormal Hb: YOK
Talasemi majorde laboratuar
• Hipokromik mikrositik anemi (5g/dl↓), RDW↑
• Normoblastlar (stoplazmaları bozuk)
• Eritrosit içi inkülüzyonlar
• Retikülosit artmamış
• SD ↑, UDBK ↓(0), Transferrin satüre (%100)
• İndirek bilirübin artmış ama fazla değil, idrar rengi koyu
• Hb F yüksek
• Anne ve babalarında HbA2 >3.5
O.K., LABORATUVAR İNCELEMELERİ
HASTA BABA ANNE
Hb : 5.3 g/dl
MCV : 66.9 fl
RDW: 20
Hb : 11.5 g/dl
Htc : %36.8
MCV : 62.5 fl
RDW: 13.8
Hb : 12.1 g/dl
Htc : %40.5
MCV: 71.8 fl
RDW: %14.5
Hipokromi,
anizopoikilositoz
Normoblast 2/100
Hipokromi Hipokromi
Ferritin: 3556 ng/ml Ferritin: 48.6 ng/ml Ferritin: 89.2 ng/ml
Hb A2: %2.1
Hb F : %13.7
Anormal Hb: YOK
Hb A2: %6.6
Hb F : %2
Anormal Hb: YOK
Hb A2: %6.2
Hb F : %2
Anormal Hb: YOK
Beta Talasemi Majör
Talasemide Patofizyoloji
1. İnefektif eritropoez
2. Hemoliz : İntrasellüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu
3. Membran hasarı: Membranda rijidite artışı, stabilite azalması
4. Hücre dehidratasyonu
5. Eritrositlerin RES’ te yıkılışı
6. Demir birikimi ve oksidatif stres
Talasemi majorde hemoliz
• Talasemik kemik iliğinde
Eritrosit öncü hücreler sağlıklı kontrollere göre 5-6 kat fazla, ondan sonraki eritroid gelişim basamaklarında da apopitotik hücreler 15 kat fazla
• 1- İntrameduller hemoliz kemik iliğinde hemoliz ve bunun neden olduğu inefektif eritropoez
• 2- Ekstrameduller hemoliz RES ve başlıca dalakta olan hemoliz
Ekstrameduller hemoliz fizyopatolojisi:
– Membran hasarı sonucunda membran rijiditesinde artış ve stabilitesinde azalma
– İntraselüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu
– Hücre dehidratasyonu
– Demir birikimi ve oksidatif stres
ß globulinde azalma, fazla α globulinzincirleri
Kemik iliğinde eritroid maturasyon boyunca intrameduller yıkım sürer.
Eritroid oncülerin yaşam süresi kısalır. Apopitosis, posfotidil serinin membrana hareketi - makrofaja sinyal - fagositoz
apopitosis
ß Talassemide İnefektif eritropoez
A B 15y E
L4 L5 Kontüzyon/ Beyin cerrahiden konsültasyon
• Hb : 8.9 g/dl
• KK : 2.87 mil/mm3
• MCV : 89 fl
• MCH :30.9pg
• MCHC : 34.6g/dl
• BK : 13 500/ mm3
• Tr : 590 000/ mm3
• Ret : %8.6
• CRP 20
• İnd Bil :2.35
• LDH :783
Hb S :%98.5
AB
BK ve Tr. Normal Pure red cell anemi İlaçlar Enfeksiyonlar Geçici eritroblastopeni
BK ve Tr. Anormal Lösemi, Kİ İnfiltrasyonu Hipersplenizm
Düşük Yüksek
RETİKÜLOSİT SAYIMI
Coombs
Normositik Anemi
NEGATİF
POZİTİF
Coombs
Korpüsküler
•Membran defektleri Morfoloji,osmotik frajilite
•Hemoglobinopatiler Hemoglobin elektroforezi
•Enzim eksiklikleri
Ekstrakorpüsküler •İdiopatik •Sekonder: İlaçlar Enfeksiyon Mikroanjiopatik HA
(DİC, HÜS, mekanik)
Otoimmün hemolitik anemi Primer Sekonder (konnektif doku hast., ilaçlar, vb)
İzoimmün hemolitik anemi Rh ABO subgrup uygunsuz kan trans.
Ap
lik
asy
on
n
ok
tası
Pro
tein
ler
HbA
2 -
H
b E
, H
b,C
, O
Ara
p(
>%
10
)
Hb
S v
eya
Hb
D
Hb
Lep
ore
Hb
F
Hb
A1
Hb
A1C
Hb
J İ
ran
Hb
Ba
rts
Hb
H
HbA2 < % 3,5
Hb F < % 2
HbA2 bandı % 3,5 ise
HbA2 bandı % 3,5 – 8 talasemi taşıyıcılığı
HbA2 bandı % 10 ise Hb E, Hb C ve O
Arap ?
Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket
ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük
taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her
birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır.
Ör: Hb A1’in toplam negatif yükü HbA2’den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya
yürümüştür.
Hb S HbD ayırımı
Solubilite Testi
• 4,5 ml’lik EDTA’lı kan serum fizyolojik ile iki kez
yıkanır.
• 1 ml yıkanmış eritrosit + 1,5 ml distile su + 0,4 ml
CCI4 karıştırılıp(vortex), 15 dakika 3000 rpm’de
santrifüj edilir.
• Hemolizat (üstteki kısım) başka bir tüpe alınır. +40
C’ de uzun süre saklanabilir.
• Başka bir tüp içinde 5 mgr Na2S2O4 (Sodyum
hiposülfit), 0,9 ml solubilite solüsyonu (pH 6,8,
KH2PO4) ile karıştırılır. Bu karışıma 0,1ml hemolizat
ilave edilir.
• Birkaç dakika beklenir. Bulanıklık varsa HbS, yoksa
Hb D, vb diyoruz. Mutlaka negatif ve pozitif kontrol
kullanılmalı. HbS olduğunu ikinci kez ispatlamak için
Sickling Testi yapılır.
Hb D, vb‘lerinin tayini için moleküler inceleme
yapılır.
Sickling Testi
A Solüsyonu (0,114 M Na2 S2 O4, pH 6,8) : 0,2
ml
B Solüsyonu (0,114 M Na2H PO4, pH 6,8) : 0,3
ml
Venöz kan (EDTA’lı)
: 0,1 ml karıştırılır. Bu karışımdan bir damla
lam üzerine alınır, lamel ile kapatılır. Kenarları
vazelinle kaplanır. Hava girmesi önlenir. Düşük
oksijenli ortamda hemoglobinin polimerazyonu
nedeni ile uzar ve bükülür. Bir saat 37 0C ‘de en
az bir saat bekletilir. Bu süre sonunda
mikroskopta oraklaşmaya bakılır.
Hb S :%98.5
Hb S :% 20.3
AB