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start
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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicosMétodos de análisis
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• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2)• Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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Absorción de luz ultravioleta (UV)
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desnaturalización y reasociación
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Viscosidad del DNA en solución
disminuye al -fragmentarse: agitación mecánica, sonicación (ultrasonido)
-desnaturalizarse: calor, baja fuerza iónica, pH alcalino, urea, …
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• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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efecto hipercrómico
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efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA
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efecto hipercrómico
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• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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desnaturalización y reasociación
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cinética de reasociación
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Curvas Cot
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X = a Cot 1/2
1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2
Cot1/2 = 1/k
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X R = f NX = a Cot 1/2
1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2
Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla
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genoma nuclear humano
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no todo el DNA codifica proteínas
Britten y Kohne, 60’s
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• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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rotores y centrífugas
centrifugación
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centrifugación diferencial
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separación por tamaño
centrifugación zonalgradiente de sacarosa
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centrifugación isopícnica
gradiente de CsCl
separación por densidad
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0
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SeparaciónDNA2c y DNAss
1. centrifugación isopícnica2. tratamiento con nucleasas específicas de DNA2c o DNAss 3. columnas de hidroxiapatito: retienen DNA2c y pasa el DNAss (el DNA2c puede ser eluido aumentando la temperatura o la concentración salina)
4: filtros de nitrocelulosa: unen DNAss y no DNA2c
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electroforesis
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electroforesis
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• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
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marcaje radiactivo
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isótopos pesados
- isótopos más usados en biología: N14 y N15; C12 y C13; H y D
- uso en centrifugación isopícnica
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desnaturalización y reasociación
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hibridaciónmolecular
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hibridación DNA/RNA
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hibridación en filtro
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hibridación en colonia
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FISH
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telómeros
centrómeros
FISH
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cariotipo espectral humano
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chips de DNA
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microarrays
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Southern
pocillos con DNA
electroforesis
esponja
solución salina
gel filtro
gel
la solución sube a través del gelal filtro y a la pila de papeles absorbentes
DNA enel filtro
la sonda hibridacon las secuenciascomplementarias
hibridacióncon una sonda
el filtro se expone auna película o una placa sensibles
transferencia
electroforesis +transferencia +hibridación =Southern
Southern
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electroforesis hibridación
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Southern (DNA)
Northern (RNA)
Western (proteínas)
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1 h de clase: 6-noviembre-2009
capítulo 1
2ª ed.: 14-24 (el 23 no)3ª ed.: 14-23
problemas
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http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
Laboratorio virtual en http://learn.genetics.utah.edu/Aislar DNA, PCR, chip DNA y electroforesis y mas….
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papelera
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satéliteminisatélitemicrosatélite
SINEsLINEstransposones
genoma humano
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Estudios con DNA
Análisis
Detección
Aislamiento
hipercromicidadreasociación
hibridaciónPCR
centrifugaciónelectroforesis
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PCR
cebadordirecto
cebadorinverso
PCR
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Southern
electroforesis +transferencia +hibridación
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Southern
electroforesis +transferencia +hibridación
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Southern
Northern
Western