Facultad de Ciencias
Licenciatura en Ciencias Biológicas
Profundización Microbiología
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.)
a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
Bach. Martín Beracochea
Orientador: Dra. Margarita Sicardi
Co-Orientador: Dra. Adriana Montañez
Laboratorio de Microbiología de Suelos – Facultad de Ciencias
Tribunal: Dr. Federico Battistoni
Dra. Alicia Arias
Montevideo
Noviembre 2011
Agradecimientos.
A Margarita que fue mi mentora en este proceso, a lo largo del mismo siempre estuvopresente para responder mis “mil y una” dudas. Que “rico es comer” frase que siemprellevare conmigo.
A Claudia, compañera de muchas horas y muchos mates. Siempre es un placer trabajar asu lado.
Adriana, tus aportes siempre sumaron.
A los “gurises” del laboratorio Hugo, Lucia y Diana con quienes compartimos por unratito la mesada.
A Federico Battistoni y Alicia Arias cuyas rápidas correcciones mejoraronsustancialmente este trabajo.
A mis padres y mi hermano que nunca aflojaron y donde siempre encontré valiososconsejos.
A Mary y José que me brindaron un segundo hogar.
A Cintia con quien compartimos tantos viajes en la vida, sin su cariñosa compañía esto nohubiera sido posible.
Dedicada a todos aquellos que me preguntaron “¿Para cuándo la tesis?”.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
Índice general
RESUMEN 1
1 - INTRODUCCIÓN 2
1.1 - NITRÓGENO COMO NUTRIENTE VEGETAL 2
1.2 - CICLO DEL NITRÓGENO 3
1.3 – FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO 4
1.4 - LOS CEREALES: MAÍZ (ZEA MAYS, L.) 5
1.5 - MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL 6
1.5.1 - BACTERIAS ENDÓFITAS 6
1.6 - MECANISMOS DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN GRAMÍNEAS 9
1.6.1 - FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO 9
1.6.2 - SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATO 11
1.6.3 - PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOL-ACÉTICO (AIA) 11
1.7 - INOCULACIÓN DE GRAMÍNEAS CON MPCV 12
1.8 - ESTUDIOS DE FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN MAÍZ EN URUGUAY. 12
2 - OBJETIVOS 14
2.1 - OBJETIVO GENERAL 14
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14
3 - MATERIALES Y MÉTODOS 15
3.1 - CEPAS BACTERIANAS 15
3.2 - SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATO INORGÁNICO IN VITRO 16
3.3 - BACTERIZACIÓN DE SEMILLAS DE MAÍZ Y CRECIMIENTO DE LA RADÍCULA 17
3.4 - TOLERANCIA AL HERBICIDA GLIFOSATO 18
3.5 - RESPUESTA DE MAÍZ A LA INOCULACIÓN CON BACTERIAS ENDÓFITAS-DIAZÓTROFAS 18
3.5.1 - ENSAYO EN CONDICIONES GNOTOBIÓTICAS 18
3.5.2 - ENSAYO EN INVERNÁCULO 19
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4 - RESULTADOS Y DISCUSIÓN 21
4.1 - CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FOSFATO INORGÁNICO IN VITRO 21
4.2 - EFECTO DE LA BACTERIZACIÓN DE SEMILLAS EN EL CRECIMIENTO DE LA RADÍCULA 24
4.3 - TOLERANCIA AL GLIFOSATO 27
4.4 - RESPUESTA DE MAÍZ A LA INOCULACIÓN BACTERIANA 29
4.4.1 - ENSAYO EN CONDICIONES GNOTOBIÓTICAS 29
4.4.2 - ENSAYO EN INVERNÁCULO 32
5 - CONCLUSIONES 37
6 - PERSPECTIVAS 38
7 – ANEXO 1 39
MEDIOS DE CULTIVO 39
8 - BIBLIOGRAFÍA 41
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Índice de Figuras
Figura 1 - Ciclo biogeoquímico del nitrógeno. 3
Figura 2 - Complejo enzimático nitrogenasa. 4
Figura 3 - Microscopia confocal de tallos y raíz de cortes de maíz infectados con
Klebsiella pneumoniae. 9
Figura 4 - Placa de NBRIP sembrada con las cepas EMA-35 y EMA-38. 21
Figura 5 - Placa de agar-agua con semillas de maíz germinando. 24
Figura 6 - Sistema de crecimiento de plántulas de maíz in vitro. 29
Figura 7 - Peso seco parte aérea y peso seco radical de las variedades NK940, PAU871 y
Maizón 33
Índice de Tablas
Tabla 1- Subconjunto de bacterias endófitas descritas para distintas plantas 7
Tabla 2 - Cepas bacterianas asociadas a maíz (Zea mays L.) 16
Tabla 3 - Capacidad de solubilización de P in vitro 22
Tabla 4 - Longitud media de radícula de semillas de maíz bacterizadas 25
Tabla 5 - Tolerancia de cepas endófitas-diazótrofas al glifosato 28
Tabla 6 - Valores medios de peso seco parte aérea y peso seco radical de plantas de
maíz 30
Tabla 7 - Valores de índice relativo de peso seco de la parte aérea. 31
Tabla 8 - Valores medios de peso seco parte aérea y raíz, % de átomos en exceso
de 15N, concentración de N y acumulación de N en ensayo de invernáculo. 34
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
1
Resumen
El maíz (Zea mays L.) es uno de los cereales de mayor importancia en el mundo,
tanto para la alimentación humana como animal. Recientemente, su cultivo se ha
incentivado en los países para utilizarlo en la producción de etanol y biodiésel, productos
de gran importancia energética, económica y social. En Uruguay, el área de siembra de
maíz se incrementó significativamente en los últimos años.
En nuestro país y en general en muchos otros países, los altos rendimientos en el
cultivo de maíz están asociados a altas dosis de fertilización nitrogenada. Este concepto
erróneo, trajo y trae un excesivo empleo de fertilizantes en los cultivos y graves
problemas ambientales asociados. Un alto porcentaje del fertilizante añadido a un
cultivo se volatiliza y/o es lixiviado del suelo (50%) y se acumula como nitrato en las
aguas de arroyos y ríos. Esto trae el problema de efectos perjudiciales en la salud
humana y daño ecológico. En Brasil, la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en
gramíneas por bacterias que viven en la rizósfera o en el interior de las plantas
(endófitas) ha revolucionado la agricultura nacional y regional, en las últimas décadas,
por los resultados promisorios de numerosas investigaciones. Si el objetivo es minimizar
los problemas ambientales y económicos que trae la fertilización nitrogenada la FBN es
una alternativa biológica con alto potencial de aplicación y que justifica los esfuerzos
que se hagan en su estudio. En Uruguay, el tema de la FBN en gramíneas no es nuevo.
Existen antecedentes sobre la presencia en variedades comerciales de maíz, de varios
géneros de bacterias nativas fijadoras de nitrógeno atmosférico (diazótrofas).
El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas endófitas-diazótrofas nativas con
características de promoción del crecimiento vegetal y evaluar la respuesta de su
inoculación de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) utilizadas en Uruguay.
Los resultados muestran que las bacterias endófitas asociadas a maíz utilizadas en
este trabajo tienen la capacidad de solubilizar fosfato y son tolerantes al herbicida
glifosato. La respuesta de variedades comerciales de maíz demostró que existe
especificidad en la interacción cepa-variedad. Mediante la técnica de dilución isotópica
de 15N se detectaron combinaciones cepa-variedad que tienen la capacidad de contribuir
con la nutrición nitrogenada de maíz en las condiciones experimentales utilizadas.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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1 - Introducción
1.1 - Nitrógeno como nutriente vegetal
El nitrógeno (N) es un nutriente fundamental para la vida, formando parte de
ácidos nucleicos, proteínas, aminoácidos, coenzimas entre otras biomoléculas. Este
compuesto es esencial para el crecimiento vegetativo vigoroso de las plantas y para el
contenido de proteína en grano (Urzúa, 2000). En el suelo este se encuentra en un 98%
en formas orgánicas no asimilables por vegetales. El balance de N en los suelos agrícolas
suele ser negativo, se retira en mayores proporciones del que ingresa naturalmente, y
por su baja biodisponibilidad es un elemento limitante del crecimiento vegetal. Es por
los motivos expuestos que se emplean fertilizantes nitrogenados para suplir su falta y
lograr buenos rendimientos en los cultivos. Los fertilizantes utilizados derivan del
proceso químico industrial de Haber-Bosch (Galloway et al., 2004). Este proceso tiene un
costo energético elevado y se basa en la quema de combustibles fósiles. La creciente
escasez de combustibles a nivel mundial ha causado, como consecuencia, un aumento en
el precio de los fertilizantes nitrogenados; en nuestro país se importan y representan el
insumo agrícola de mayor costo. Otro problema a tener en cuenta en este contexto es la
baja eficiencia de estos fertilizantes, solo el 50% es absorbido el resto se pierde por
causas biológicas y factores ambientales. Parte se pierde por el proceso biológico de
desnitrificación, sobre todo en ambientes anegados. Otra fracción se volatiliza como
amonio, mientras que el resto de la pérdida de N está representado por el lixiviado de
nitratos y nitritos. A su vez, los nitritos (muy tóxicos) y los nitratos van a los cauces de
agua potable provocando su eutrofización. Esta problemática ha llevado a intensificar,
en los últimos años, la investigación de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) como
alternativa para lograr una agricultura sustentable (Bhattacharjee et al., 2008;
Adesemoye y Kloepper 2009).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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1.2 - Ciclo del Nitrógeno
La transferencia de nitrógeno inorgánico desde el ambiente a la biomasa, y el
proceso inverso conforma lo que se conoce como el ciclo del nitrógeno.
El ciclo del N comprende los distintos estados de oxidación y reducción de este
elemento, así como sus interacciones juegan un rol fundamental los microorganismos
del suelo. Las plantas absorben el N en forma de amonio (NH4+) y nitrato (NO3
-). El
amonio es producido a partir de restos animales, vegetales y microbianos. Esta
conversión de materia orgánica en amonio forma parte de la mineralización, proceso que
llevan a cabo microorganismos muy variados. Es posible que el amonio sea oxidado a
NO2-, y este a NO3
-, este proceso es llamado nitrificación. El nitrato es la principal fuente
de N para las plantas en el suelo. En condiciones de baja concentración de O2, el nitrato
es empleado como aceptor final de electrones por bacterias produciendo formas
gaseosas (desnitrificación) como NO y N2O, ocasionando pérdidas para el sistema suelo-
planta. Las entradas de N al sistema suelo-planta están representadas por la actividad
Figura 1. Ciclo biogeoquímico del nitrógeno. Fuente Cumming (2009) con modificaciones.
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humana (fertilización), por la fijación por fenómenos atmosféricos y la fijación biológica
de nitrógeno (FBN) (Frioni, 2011).
1.3 – Fijación biológica de nitrógeno
El aire está compuesto en un 80% de N2, molécula compuesta por 2 átomos de N
unidos por un triple enlace de alta energía lo que la hace una molécula prácticamente
inerte. Solamente algunos organismos procariotas son capaces de llevar a cabo la
reducción catalítica de N2 a NH3, proceso denominado FBN (Buchanan et al., 2000). La
ecuación general del proceso es:
N2 + 8e- + 8H+ + 16MgATP -> 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi
La conversión enzimática de nitrógeno molecular a amonio es catalizada por la
nitrogenasa (Figura 2). Este complejo enzimático está compuesto por 2 metaloenzimas.
El componente 1 también designado proteína MoFe o dinitrogenasa es un
heterotetrámero de 220.000 Da formado por 2 subunidades diferentes (α2β2). Esta
proteína contiene 2 copias de 2 centros metálicos: el cofactor FeMo-co (MoFe7S8:
homocitrato) y grupos P (cluster-P). Es a nivel de estos centros que ocurre la reducción
del N2. Por otro lado el componente 2 denominado proteína Fe o dinitrogenasa
reductasa es un homodimero, de 68.000 Da, que coordinan un único cluster 4Fe:4S. Esta
enzima se desactiva irreversiblemente frente al O2 por lo cual existen diversos
mecanismos de protección frente al mismo (Rees y Howard, 2000).
Figura 2. Complejo enzimático nitrogenasa. Fuente Taiz y Zeiger (2006) con
modificaciones.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
5
El flujo de electrones en la nitrogenasa es: donador de e- -> dinitrogenasa
reducatasa -> dinitrogenasa -> N2. El mecanismo básico de acción involucra 4 pasos:
formación de un complejo entre la proteína Fe (con 2 moléculas de ATP) y la proteína
Mo-Fe, transferencia de e- entre las proteínas acoplada a la reducción de ATP,
disociación de la proteína Fe volviendo a reducirse y cambio de ATP por ADP. Finalmente
cuando un número suficiente de e- se acumula se reduce el N2. Si bien son necesarios 6 e-
para reducir una molécula de N2 a NH3 se consumen 8 e-, 2 de los cuales se pierden como
H2 por motivos que se desconocen (Rees y Howard 2000; Seefeldt et al., 2009).
Solamente un subgrupo de microorganismos procariotas puede llevar a cabo la FBN.
Aquellos capaces de realizar la FBN se los denomina diazótrofos (di, 2; azo, nitrógeno).
Existe una gran diversidad metabólica y ecológica dentro de los diazótrofos existiendo
microorganismos aerobios, anaerobios, quimiorganotrofos, quimiolitotrofos y
fototrofos (Madigan et al., 2003). Algunos solo son capaces de fijar nitrógeno cuando
forman simbiosis con ciertas plantas constituyendo un grupo de gran importancia
agrícola. Anualmente la FBN es responsable del 60% del total de nitrógeno incorporado
al suelo, la fijación industrial del 30% y el 10% restante se debe a motivos no biológicos
atmosféricos (Frioni, 2011).
1.4 - Los cereales: maíz (Zea mays, L.)
La familia Poaceae incluye cultivos de gran importancia como el trigo, sorgo, maíz,
arroz y caña de azúcar. Dichos cereales son fundamentales en la alimentación animal y
humana. El maíz (Zea mays L.) es uno de los principales cereales del mundo. Es un cultivo
multipropósito, sus principales usos son alimentación humana y animal; pero en los
últimos años se emplea para la producción de biocombustibles. En Uruguay el área de
siembra asciende a 96 mil hectáreas sembradas en la zafra 2010 (DIEA/MGAP, 2010). A
nivel internacional es uno de los cultivos de mayor importancia en área sembrada luego
del trigo y el arroz (FAO, 2009). Sus usos no se limitan a la alimentación humana, animal y
biocombustibles, la industria utiliza muchos subproductos derivados del maíz. Uno de los
más importantes es el almidón, el cual es utilizado por ejemplo en la industria alimenticia
y en la industria del papel.
Una de las dificultades de este cultivo es que necesita grandes aportes de
fertilizante nitrogenado para obtener altos rendimientos. Este alto requerimiento en N
de los cereales en general, condujo a que en las últimas décadas, el estudio de los
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
6
microorganismos promotores del crecimiento vegetal (MPCV) en maíz y arroz, haya sido
y es un área de activa investigación en busca de tecnologías que suministren ese y otros
nutrientes en forma biológica, de manera de promover los sistemas agrícolas
sustentables (Avis et al., 2008; Franche et al., 2009).
1.5 - Microorganismos promotores del crecimiento vegetal
El estudio de microorganismos benéficos en cereales comprende a los
microorganismos promotores del crecimiento vegetal (MPCV). Los mecanismos por los
cuales los MPCV promueven el crecimiento vegetal se dividen en directos e indirectos.
Los mecanismos directos son: FBN, producción de fitohormonas y solubilización de
minerales; los mecanismos indirectos son : control biológico de patógenos e inducción
del sistema inmune vegetal (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).
1.5.1 - Bacterias endófitas
Tomado literalmente endófito significa “dentro de la planta” (endo: “dentro”;
phyton: “planta”). El término endófito fue definido por Wilson (1995) en referencia a
hongos o bacterias que cumplen parte o todo su ciclo de vida dentro de las plantas vivas
sin causar síntomas de enfermedad. Esta definición incluye huéspedes que pueden
tener estrategias de vida muy diferentes como saprofitas, parásitos y simbiontes.
Posteriormente Reinhold-Hurek y Hurek (1998) plantearon el criterio de endófitos
“verdaderos” para aquellas bacterias que fueran aisladas de tejidos desinfectados
superficialmente y que exista evidencia microscópica de su presencia en los tejidos
vegetales. Existen varias definiciones para endófitos una de ellas y la que definición de
Bacon y Hinton (2006) : bacterias capaces de colonizar tejidos vegetales sanos sin causar
síntomas evidentes de enfermedad.
En la Tabla 1 se muestra un subconjunto de especies bacterianas endófitas
descritas distintos cultivos (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
7
Tabla 1, subconjunto de bacterias endófitas descritas para distintas plantas. FuenteRosenblueth y Martínez-Romero(2006) con modificaciones
Endófito Especie vegetalα-Proteobacteria
Azorhizobium caulinodans ArrozAzospirillum brasilense Banana
Azospirillum amazonense Banana y AnanáBradyrhizobium japonicum Arroz
Gluconacetobacter diazotrophicus Caña de azúcar y caféMethylobacterium mesophilicuma Cítricos
Methylobacterium extorquens Pino y CítricosRhizobium leguminosarum Arroz
Rhizobium (Agrobacterium) radiobacter Zanahoria, arrozSinorhizobium meliloti Boniato
Sphingomonas paucimobilisa Arrozß-Proteobacteria
Azoarcus sp. Pasto de Kallar y ArrozBurkholderia pickettiia MaízBurkholderia cepacia Altramuz amarillo y Cítricos
Burkholderia sp. Banana, Ananá y ArrozChromobacterium violaceuma Arroz
Herbaspirillum seropedicae Caña de azúcar, Arroz, Maíz, Sorgo y BananaHerbaspirillum rubrisulbalbicans Caña de azúcar
γ-ProteobacteriaCitrobacter sp. Banana
Enterobacter spp. MaízEnterobacter sakazakiia SojaEnterobacter cloacaea Cítricos y Maíz
Enterobacter agglomeransa SojaEnterobacter asburiae Boniato
Erwinia sp. SojaEscherichia coli LechugaKlebsiella sp. Trigo, Boniato y Arroz
Klebsiella pneumoniae SojaKlebsiella variicola Banana, Arroz, Maíz y Caña de azúcarKlebsiella terrigena ZanahoriaKlebsiella oxytoca Soja
Pantoea sp. Arroz y SojaPantoea agglomerans Cítricos y Boniato
Pseudomonas chlororaphis Zanahoria y caléndulaPseudomonas putida Zanahoria
Pseudomonas fluorescens ZanahoriaPseudomonas citronellolis SojaPseudomonas synxantha Pino
Salmonella enterica Alfalfa, Zanahoria, Rábano y TomateSerratia sp. Arroz
Serratia marcescensa ArrozStenotrophomonas Pasto de las dunas
FirmicutesBacillus spp. Cítricos
Bacillus megaterium Maíz, Zanahoria y CítricosClostridium Pasto Miscanthus sinesis
Paenibacillus odorifer BoniatoStaphylococcus saprophyticus Zanahoria
BacteroidetesSphingobacterium sp. Arroz
ActinobacteriaArthrobacter globiformis Maíz
Curtobacterium flaccumfaciens CítricosKocuria varians Caléndula
Microbacterium esteraromaticum CaléndulaMicrobacterium testaceum Maíz
Mycobacterium sp. Trigo, PinoNocardia sp. Cítricos
Streptomyces Trigo
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Los endófitos habitan principalmente los espacios intercelulares de la planta, que
son ambientes ricos en azucares, ácidos orgánicos, aminoácidos e iones inorgánicos,
suficientes para sustentar el crecimiento microbiano. A su vez, estos se encuentran
protegidos del estrés ambiental y se encuentran en un lugar óptimo para el intercambio
metabólico (Bacon y Hinton, 2006).
Las bacterias endófitas pueden clasificarse en obligadas o facultativas, los
obligados con bacterias que dependen del huésped para su crecimiento, sobrevivencia y
dispersión. Mientras que las facultativas cumplen una etapa de su ciclo fuera del
hospedero, generalmente en el suelo (Hardoim et al., 2008). En este ambiente es donde
se encuentra la mayor fuente de bacterias endófitas y generalmente es donde comienza
el proceso de colonización (Sturz et al., 2000). Es posible que la colonización sea pasiva
como por ejemplo que los endófitos se encuentren naturalmente en las semillas
utilizando las mismas como medio de dispersión (Coombs y Franco, 2003). En las plantas
que se propagan vegetativamente los endófitos pasan de un lugar a otro con las yemas
(Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006). Por otro lado la colonización activa involucra 3
pasos. El primer paso es el acercamiento espacial de la bacteria a la superficie de la raíz a
través del movimiento motivado por quimiotaxis. Los principales quimioatrayentes son
ácidos orgánicos, carbohidratos y aminoácidos excretados por la raíz. Luego que la
bacteria entra en contacto con la raíz esta se adhiere a la misma y finalmente se ancla a
la superficie. En estos sitios comienza a multiplicarse la bacteria y se generan
microcolonias comenzando el siguiente paso que es la colonización de la superficie, es
desde estos lugares donde comienza la invasión de los tejidos internos (Hardoim et al.,
2008). La penetración al interior puede ser mediante la liberación de enzimas hidrolíticas
en bajos niveles o espontáneamente por aberturas naturales. En cuanto las células de
endófitos se encuentran dentro de la planta comienzan a multiplicarse colonizando los
principalmente los espacios intercelulares. Los endófitos pueden permanecer en un
tejido específico o lograr una colonización sistémica disparándose por el sistema
vascular o el apoplasto (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).
La planta muestra una leve respuesta defensiva permitiendo la infección pero a su
vez regulando la misma. La presencia de endófitos está descrita para todos los órganos
vegetales, pero se puede decir que existe un número mayor en raíz, disminuyendo a
medida que ascienden por el tallo hasta llegar a las hojas y por ultimo frutos e
inflorescencias (Bacon y Hinton, 2006).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
9
En la Figura 3 se observa la colonización de tallo y raíz de maíz por la bacteria
Klebsiella pneumoniae. Las bacterias fueron transformadas con un plásmido que codifica
para la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) (Chelius y Triplett, 2000).
1.6 - Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal en gramíneas
Como se hizo mención anteriormente los MPCV poseen mecanismos directos e
indirectos de promoción del crecimiento vegetal. A continuación se detallaran 3
mecanismos directos:
1.6.1 - Fijación biológica de nitrógeno
A finales de la década del 60, la Dra. Döbereiner y su grupo en Brasil comenzaron la
investigación de las bacterias diazótrofas asociadas a gramíneas. Sus primeros estudios
se centraron en bacterias diazótrofas rizosféricas, posteriormente junto a otros
Figura 3. Microscopia confocal de tallos (a) y raíz (b – d) de maíz. a,
Corte longitudinal del tallo de maíz (rojizo) colonizado por K.
pneumoniae (verde amarillento) se señala un grupo de células
bacterianas. b a d, Raíces de maíz (verde oscuro) colonizadas por K.
pneumoniae (verde claro). Barras, 20 (a y b) o 10 (c y d) μm. Fuente
Chelius y Triplett (2000) con modificaciones.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
10
investigadores describieron los primeros endófitos diazótrofos al aislar bacterias del
interior de gramíneas capaces de crecer en medios semi-sólidos sin nitrógeno ( Baldani y
Baldani, 2005). Con el empleo de esta metodología se aislaron y describieron distintas
especies de bacterias endófitas diazótrofas como Azospirillum spp. (Tarrand et al., 1978),
Azoarcus sp. (Reinhold et al., 1986) y Herbaspirillim spp. (Baldani et al., 1986).
Los medios semi-sólidos sin N como el JNFb (Boddey et al., 1995), proveen un
ambiente con la presión de O2 necesaria para que se lleve a cabo la FBN. Uno de los
avances que impulsó el estudio de la FBN en gramíneas fue el desarrollo de la técnica de
reducción de acetileno (ARA). La misma se basa en la capacidad de la nitrogenasa de
reducir además del nitrógeno atmosférico, a otras moléculas con triple enlace como el
cianuro y el acetileno. Esta característica permite estimar la FBN inyectando en un
sistema cerrado acetileno y midiendo la producción de etileno en un cromatógrafo de
gases (Boddey y Knowles, 1987).
Existen otras técnicas que permiten medir la FBN con mayor exactitud que ARA.
Entre ellas se encuentra el método de dilución isotópica de 15N de aplicación en
invernáculo y campo. Esta metodología es sensible y permite obtener información útil
para cuantificar la FBN (Boddey y Knowles, 1987; Barraclough, 1995). El nitrógeno posee
2 isótopos estables 14N y 15N, mientras que el primero es el más abundante en la
naturaleza, representa el 99,634%, 0,366% corresponde al isotopo 15N. La técnica de
dilución isotópica de 15N se basa en que plantas creciendo en sustratos con
enriquecimiento homogéneo de 15N tendrán el mismo patrón de absorción de 15N/14N.
Existen 2 posibilidades para aplicar dilución isotópica de 15N: utilizar N2 o fertilizante
nitrogenado marcado como urea u otro compuesto. Debido a las dificultades para
trabajar bajo atmósferas controladas enriquecidas de 15N, generalmente se opta por
fertilizantes marcados. Cuando existe aporte de la FBN a la planta, ésta incorpora N
atmosférico el cual tiene una relación 15N/14N menor a la del sustrato fertilizado con 15N,
“diluyendo” la relación isotópica en la planta. Es posible medir la FBN conociendo la
relación 15N/14N y teniendo como referencia una planta “no fijadora” (Eldor, 2007).
Investigaciones recientes han aislado endófitos diazótrofos de distintas variedades
de maíz (Zinniel et al., 2002; Dermastia et al., 2007). De este cultivo se obtuvieron los
géneros: Herbaspirillum sp. (Palus et al., 1996), Klebsiella sp. (Chelius y Triplett, 2000) y
Burkholderia spp., Herbaspirillum spp., Pantoea spp., Rhanella spp. (Montañez et al.,
2009). Asimismo, Roesch y colaboradores, (2008) realizaron un estudio de biodiversidad
de bacterias endófitas-diazótrofas asociadas a maíz utilizando técnicas independientes
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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de cultivo encontrando que las proteobacterias son el grupo dominante capaces de
colonizar tanto la raíz, como el tallo y la hoja. En raíz las α-proteobacterias son el grupo
dominante mientras que en tallo no existe predominancia por parte de algún grupo. Los
géneros bacterianos más abundantes encontrados por los autores fueron Azospirillum,
Herbaspirillum, Ideonella, Klebsiella y Raoultella (Roesch et al., 2008).
1.6.2 - Solubilización de fosfato
El fósforo (P) es un nutriente necesario para el crecimiento vegetal vigoroso. Al
igual que el N, es un macronutriente de vital importancia en procesos bioquímicos y
fisiológicos. Si bien la concentración del mismo en el suelo puede ser alta, el P no se
encuentra en formas fácilmente disponibles para los vegetales. Esto se debe a que pasa
rápidamente a formas orgánicas (inmovilización) o inorgánicas formando complejos
insolubles con Al y Fe en suelos ácidos, Ca y Mg en suelos alcalinos (Calderón-Vázquez et
al., 2009).
Las bacterias solubilizadoras de fosfato mediante la liberación de fosfatasas
alcalinas, fitasas, producción de ácidos orgánicos, fosfonatasas entre otras, aumentan la
concentración de P biodisponible. Las plantas se benefician de las bacterias que habitan
las rizósfera mediante la solubilización de fosfato (Rodríguez et al., 2006). Por su lado se
postula que las bacterias endófitas mejoran la nutrición de P de las plantas durante los
primeras etapas de la colonización (Kuklinsky-Sobral et al., 2004).
En los últimos años los microoganismos del suelo se han venido estudiando en
muchos países, como una nueva tecnología sustentable y con posibilidades de aplicación
en el sector agrícola.
1.6.3 - Producción de ácido indol-acético (AIA)
Otra característica de PCV que se evalúa en bacterias es la producción de
fitohormonas por endófitos vegetales, por ejemplo, el ácido indol-acético (AIA). Esta
fitohormona está involucrada principalmente en la elongación y división celular. El AIA
promueve el crecimiento radical en bajas concentraciones, en concentraciones altas
inhibe el crecimiento principalmente activando la producción de etileno, hormona que
afecta el crecimiento radical (Taiz y Zeiger, 2006). Existen 2 vías principales de
producción de AIA en bacterias, la vía indol-3-piruvato (IpyA) y la vía indol-3-acetamida
(IAM), ambas dependientes de triptófano (Lambrecht et al., 2000). La producción de AIA
bacteriana se relaciona con un mayor crecimiento de la raíz y el desarrollo de un mayor
número de pelos radicales, favoreciendo la producción vegetal (Perrig et al., 2007).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
12
1.7 - Inoculación de gramíneas con MPCV
La inoculación con rizobios es una biotecnología ampliamente utilizada en
leguminosas de interés agrícola. Los rizobios forman una simbiosis con las leguminosas,
son bacterias gram-negativas que pertenecen a la división proteobacteria. Una de las
características únicas y más destacables es que ingresan a tejidos vegetales y forman
estructuras tipo saco llamadas nódulos. Dentro de estas estructuras establecen una
íntima relación con su hospedero, aportándole nitrógeno mediante la FBN y reciben
fotosintatos de la planta (Frioni, 2011). La biotecnología leguminosa-rizobio es utilizado
mundialmente, en nuestro país la inoculación de las semillas de leguminosas con rizobios
eficientes en FBN, es una tecnología utilizada rutinariamente debido a las ventajas
económicas y ambientales que presenta (Baraibar et al., 1999). Es así que desarrollar una
biotecnología similar al cultivo de maíz, tendría gran impacto en la alimentación humana
y animal así como en el medio ambiente. Sustituir parte del fertilizante químico con
bacterias diazótrofas eficientes es una alternativa a incentivar. Para lograr e incorporar
esta tecnología son necesarios estudios sobre nuevos microorganismos, variedades de
hospederos, condiciones ambientales y fundamentalmente profundizar más en el
conocimiento sobre la interacción bacteria-planta-suelo (Weyens et al., 2009).
Últimamente se ha observado en la literatura un gran esfuerzo en realizar evaluaciones
de la inoculación de gramíneas con bacterias PCV tratando de seleccionar aquellas más
promisorias en diferentes condiciones ambientales (Wu et al., 2005; Pedraza et al., 2009;
Mehnaz et al., 2010; Marques et al., 2010). Si bien se han realizado numerosas pruebas en
invernáculo con éxito, todavía existen inconsistencias en los resultados de ensayos en
campo (Bhattacharjee et al., 2008).
1.8 - Estudios de fijación biológica de nitrógeno en maíz en Uruguay.
En Uruguay, las investigaciones en fijación biológica de nitrógeno en maíz, se
iniciaron en el laboratorio de Microbiología del Suelo (LMS) de la Facultad de Ciencias. En
el mismo se realizaron 2 proyectos financiados por la Agencia Internacional de Energía
Atómica (IAEA). Los resultados de esos estudios, permitieron: a) identificar las
variedades comerciales de maíz más promisorias en FBN (metodología de 15N) y b)
obtener una colección de bacterias endófitas-diazótrofas nativas aisladas de ellas.
Posteriormente, se eligieron 15 cepas de esa colección las cuales fueron caracterizadas
bioquímicamente e identificadas, dicha aproximación permitió la identificación de varios
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
13
géneros de bacterias, entre ellos Brevundimonas, Pantoea, Pseudomonas, Rhanella,
Agrobacterium, Herbaspirillum y Azospirillum (Montañez et al., 2009).
El presente trabajo continua las investigaciones sobre FBN en el cultivo de maíz. La
hipótesis que nos planteamos es que las bacterias endófitas diazótrofas benefician a las
plantas de maíz, ya sea por fijación de nitrógeno o por otra característica promotora del
crecimiento vegetal.
Se pretende validar en ensayos de laboratorio e invernáculo, el efecto de la
inoculación de las raíces de plantas de maíz con cepas diazótrofas nativas seleccionadas.
Esta información será de utilidad para el avance en los conocimientos sobre la FBN en
maíz en nuestro país y conocer su contribución al crecimiento de las plantas.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
14
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo general
Seleccionar cepas endófitas-diazótrofas nativas con características de promoción
del crecimiento vegetal y evaluar la respuesta de su inoculación de variedades
comerciales de maíz (Zea mays L.) utilizadas en Uruguay.
2.2 - Objetivos específicos
a) Evaluar la capacidad de solubilizar fosfato y promover el crecimiento de la
radícula de plantas de maíz por cepas endófitas-diazótrofas nativas.
b) Determinar la tolerancia al herbicida glifosato de las cepas en estudio.
c) Determinar la respuesta de diferentes variedades de maíz a la inoculación con
cepas en condiciones de laboratorio e invernáculo, midiendo el posible aporte de
la FBN con la técnica de dilución isotópica de 15N.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
15
3 - Materiales y Métodos
3.1 - Cepas bacterianas
El laboratorio de Microbiología de Suelos (LMS) de la Facultad de Ciencias mantiene
una colección de 270 aislamientos de bacterias endófitas-diazótrofas de maíz (Zea mays
L.) identificada con la sigla EMA. La colección se formó durante la realización de 2
proyectos de investigación sobre la fijación biológica de N2 en maíz, iniciados en los años
2004 y 2006 (Barloco, 2008; Montañez et al., 2009). Los aislamientos bacterianos se
obtuvieron de hoja, raíz y tallo de 19 variedades de maíz comerciales. Veintidós de esos
aislamientos se caracterizaron como bacterias diazótrofas por crecer en medios de
cultivo sin nitrógeno (N), así como por presentar el gen estructural fundamental de la
nitrogenasa (nifH) y capacidad de reducir acetileno (ARA) (Barloco, 2008). Así mismo, se
las diferenció por ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) y GTG-PCR
(tipificación mediante repetidos GTG) (Montañez et al., 2009). De esa colección de cepas
se eligieron las utilizadas en este trabajo (Tabla 2). Las cepas se conservaron en medio
TY-glicerol al 50% (Beringer, 1974)(Anexo 1), con una subcolección a -20ºC y otra a -80ºC.
La primera actividad realizada con las cepas elegidas (conservadas a -20ºC) fue
repicar las mismas por agotamiento en placas con medio TY para reactivar su
crecimiento.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
16
Tabla 2. Características de las cepas bacterianas asociadas a maíz (Zea mays L.) utilizadas en este trabajo.
Cepabacteriana1 Variedad Origen ARA* Presencia de
nifH Identificación
EMA-15 DK688 Raiz + + Pantoea sp.
EMA-35 PAU785 Semilla - + Pantoea sp.
EMA-38 PAU786 Raíz - +Pseudomonas
fluorescens
EMA-46 PAU674 Hoja - + Ranhella sp.
EMA-68 Tendem Tallo + +Pseudomonas
fluorescens
EMA-82 Topacio Tallo + + Pantoea sp.
EMA-83 Topacio Tallo + + Ranhella sp.
EMA-117 NK940 Tallo + +Herbaspirillum
frisingense
EMA-130 Suco Raiz - +Pantoea
agglomerans
EMA-149 Maizon Raiz - + no identificada
EMA-169 Cheyenne Tallo basal + + Ranhella sp.
EMA-171 Cheyenne Raíz - + Burkholderia sp.
EMA-175 Cheyenne Tallo basal - + Ranhella aquatilis
EMA-176 PAU871 Raiz - + Rhizobium sp.
EMA-177 PAU871 Raiz + + Brevundimonas sp.
1 Colección del laboratorio de Microbiología del Suelo, Facultad Ciencias.* ensayo de reducción de acetileno.
3.2 - Solubilización de fosfato inorgánico in vitro
La capacidad de solubilizar fosfato (CSP) inorgánico in vitro se determinó en las
cepas en estudio (Tabla 2) así como la estabilidad o permanencia de esa característica en
sucesivos repiques. El medio de cultivo empleado fue el NBRIP (National Botanical
Research Institute Phosphate's growth medium) (Anexo 1) con Ca3PO4 como fuente de
fósforo (P) insoluble a pH 7 (Nautiyal, 1999).
En primera instancia, las cepas se sembraron en placas de Petri conteniendo medio
TY incubándose a 28ºC repicándose en tubos conteniendo medio líquido TY,
incubándolas a 28ºC en baño mecánico con agitación (100 rpm) durante 24 horas. Las
células bacterianas libres de medio TY se obtuvieron por centrifugación (MiniSpin -
Eppendorf) a 12100 g durante 4 min resuspendiendo el en 1ml de NaCl 0,85% (p/v). El
procedimiento se repitió 3 veces y de la última suspensión de cada cepa se utilizaron
10µl para inocular tubos con 10 ml de medio NBRIP (Anexo 1). Los cultivos se incubaron
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
17
a 28ºC por 3 días en agitación hasta la observación visual de crecimiento por turbidez.
Diez microlitros de cultivo de cada cepa se placas conteniendo 20 ml de medio NBRIP
por quintuplicado, y se incubaron a 28ºC durante 4 días.
La capacidad de solubilizar fosfato se determinó por formación de un halo
transparente visible alrededor y debajo de la colonia. Las colonias de las cepas
solubilizadoras se repicaron, con palillos de madera estériles, a otra placa con medio
NBRIP por cuadruplicado de manera de medir el diámetro del halo de solubilización y el
diámetro de la colonia en cm. La estabilidad o permanencia de esa característica se
determinó por repiques sucesivos de las cepas en placas con medio TY. Al final del ciclo
de repiques, se evaluó nuevamente su CSP siguiendo los pasos descritos, teniendo
cuidado de mantener las mismas condiciones de crecimiento de los cultivos. Los
resultados se expresan en cm de halo formado sobre cm de cada colonia (Nautiyal,
1999).
3.3 - Bacterización de semillas de maíz y crecimiento de la radícula
El objetivo fue determinar si la bacterización de las semillas de maíz con las cepas
en estudio tiene algún efecto sobre la germinación y el crecimiento de la radícula. La
hipótesis fue que las bacterias excretan metabolitos (por ejemplo, fitohormonas como
las auxinas) que promueven el crecimiento de la radícula una vez germinada la semilla.
Se utilizaron semillas de la variedad NK900 porque se destacó como uno de las
variedades promisorias en fijación biológica de nitrógeno (FBN) en condiciones
controladas en el ensayo realizado por Montañez y colaboradores (2009). Esta
variedades un híbrido utilizado en nuestro país en la alimentación animal. Los inóculos
de las cepas se prepararon individualmente, en 100 ml de medio TY, con incubación a
28ºC, 24 h en agitación (100 rpm). Por otra parte, las semillas de maíz se esterilizaron
superficialmente por inmersión en NaCLO4 4% (v/v) durante 5 min, seguido de 5
enjuagues con agua destilada estéril (Sauer y Burroughs, 1986). Se utilizaron inóculos de
cada cepa sin diluir y diluidos al medio para embeber las semillas por 1 h, manteniendo
en todos los casos condiciones asépticas. Como tratamientos controles se utilizaron
semillas esterilizadas superficialmente, embebidas en medio TY estéril. Las semillas se
colocaron asépticamente en placas con agar-agua 1,5% (p/v) con precaución de lograr
una distribución uniforme de ellas en todas las placas. Se las colocó en los vértices de un
hexágono, enfrentadas entre sí de tal manera que se minimizara el efecto de dispersión
del inóculo y el efecto que podría tener la germinación de una semilla sobre otra
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
18
adyacente. Las placas se incubaron en estufa a 28ºC en oscuridad, midiéndole la la
radícula de cada semilla a las 48 hs.
3.4 - Tolerancia al herbicida glifosato
Se determinó el efecto del herbicida glifosato sobre las cepas en estudio, bajo la
hipótesis de que este produce un efecto negativo sobre su crecimiento in vitro. La
evaluación se realizó en placas con medio TY y con el agregado de dos concentraciones
de glifosato en la formulación “Roundup®” (Glifotec® de Agritec), 250 mg.l-1 y 500 mg.l-1
respectivamente siguiendo los lineamientos de Zabaloy y Gómez (2005). El glifosato se
esterilizó por filtración, utilizando una jeringa de 10 ml con filtro de poro de 0.22 µm
(Zabaloy y Gómez, 2005). El glifosato estéril se agregó asépticamente al medio TY
fundido y termostatizado a 45ºC y luego se dispensó en placas de Petri. Las cepas en
estudio se crecieron en medio TY (agitador, 100 rpm) a 28ºC y se ajustó la densidad
óptica (D.O.) de cada una por lectura en espectrofotómetro (M302, CamSpec) a 620 nm,
en el rango 0,8-1,0 con NaCl 0,85 % (p/v) estéril. Con los inóculos calibrados, se
prepararon diluciones seriadas 10-4, 10-5 y 10-6 en NaCl 0,85% (p/v). De cada dilución se
transfirieron 3 alícuotas de 10 µl a las placas de TY con glifosato. El control se preparó
con las mismas diluciones de cada cepa sembradas en placas con TY sin glifosato. Todos
los tratamientos se realizaron por duplicado y las placas se incubaron durante 48 h a
28ºC. Los resultados se expresan como Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml
de suspensión bacteriana de cada cepa (Somasegaran y Hoden, 1994).
3.5 - Respuesta de maíz a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas
3.5.1 - Ensayo en condiciones gnotobióticas
Se determinó la respuesta en biomasa aérea y radical de plantas de maíz a la
inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas en sistemas estériles y en condiciones de
luz y temperatura controladas. Las semillas de las variedades NK900 y DK682,
seleccionadas por tamaño homogéneo, se esterilizaron superficialmente (Ítem 3.3) y se
hidrataron en agua destilada estéril durante 4 horas las mismas fueron pre-germinadas
en placas con agar-agua 1.5% (p/v) a 28 ºC por 24h hasta la observación visual de la
radícula. Cada semilla fue transferida asépticamente a tubos (20 cm de largo x 2,5 cm de
diámetro) con “zona estrecha” (reducción de diámetro) para sostener la misma (1 semilla
por tubo). Los tubos contenían 18 ml de medio con sales minerales sin nitrógeno
(Fahraeus, 1957)(Anexo 1). Los inóculos bacterianos se prepararon en 20 ml de medio TY
(Ítem 3.3). La inoculación de las semillas se realizó 24h después, con 1 ml de inóculo de
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
19
cada cepa por tubo. El recuento de células viables (UFC.ml-1) de cada inóculo para
conocer la densidad celular se realizó en medio TY (Ítem 3.3). Además de los
tratamientos inoculados con cada cepa, se incluyeron tratamientos controles, con
semillas esterilizadas superficialmente, pre-germinadas, sin inocular y con 0, 35 y 70 ppm
de N en forma de NH4NO3. El nitrógeno se agregó en forma de solución en dos
momentos del ensayo, en la siembra y a los 5 días, usando cada vez 250 µl de la solución
por tubo. Las plántulas se desarrollaron en cuarto iluminado, con temperatura y
fotoperíodo controlados: 12/12 h de luz/oscuridad y 30ºC respectivamente. Se utilizó un
diseño experimental completamente aleatorio con 5 repeticiones por tratamiento. Los
tratamientos controles con y sin N se incluyeron en todos los ensayos. A los 20 d
después de la siembra, las plántulas fueron extraídas cuidadosamente, separando la
parte aérea de la radical para la determinación de peso seco. Para determinar el peso
seco las muestras se colocaron en estufa a 60ºC hasta alcanzar peso constante. Los
resultados se expresaron en mg por planta de peso seco de la parte aérea y de la raíz, los
datos se analizaron por ANOVA y Fisher LSD (p<0,05) (Di Rienzo et al., 2010).
3.5.2 - Ensayo en invernáculo
Se determinó en ensayo en invernáculo el aporte de la FBN en 3 variedades
comerciales de maíz inoculadas con 4 de las cepas endófitas-diazótrofas en estudio. Las
variedades utilizadas fueron NK940, PAU871 y Maizón; las dos primeras son comerciales
y Maizón es una variedad uruguaya con menor uso en las siembras comerciales. NK940 y
PAU871 al igual que NK900 y DK682 (Ítem 3.3) son materiales empleados en la
alimentación animal, mientras que Maizón se utiliza para la alimentación humana. Las
cepas utilizadas en este ensayo fueron elegidas teniendo en cuenta los resultados de su
caracterización: Herbaspirillum frisigense-EMA117, Pantoea sp.-EMA82, Rahnella sp.-
EMA83 y Pseudomonas fluorescens-EMA38. Se utilizaron macetas conteniendo 3kg de
una mezcla suelo:arena (2:1). Las principales características químicas del suelo son: pH 5
(en H20); materia orgánica 1.3%; N-total 0.065%; P extraíble 10ppm (Bray I); K 0.29, Ca
0.6, Mg 0.4 y Na 0.06 Meq/100g de suelo. Para la determinación de la FBN se utilizó la
técnica de dilución isotópica 15N siguiendo los lineamentos generales de los trabajos de
Boddey y colaboradores(1995) y Boddey y Knowles (1987) para ensayos en invernáculo.
Como fertilizante nitrogenado marcado se utilizó sulfato de amonio ((15NH4)2SO4) con
10,16% de átomos en exceso de 15N (%a.e.15N.) obtenido de la Agencia Internacional de
Energía Atómica (IAEA)-Viena, Austria. A partir de la misma se preparó una solución al
7% (p/v), disolviendo 5,68 g de (15NH4)2SO4 en 800 ml de agua destilada. Previo a la
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
20
incorporación del fertilizante marcado, las macetas se regaron a capacidad de campo con
agua destilada estéril. A las 24 h se dispensaron 10 ml de la solución de (15NH4)2SO4 por
maceta (equivalente a 15 mg de N.maceta-1) y se mezcló cuidadosamente el sustrato con
varilla de vidrio con el fin de homogenizar el máximo posible el 15N en espacio y
profundidad, dejándolas sin ningún tratamiento por 48 hs.
Los inóculos de cada una de las 4 cepas se prepararon como fue descrito en el ítem
3.3 en 100 ml de TY hasta D.O.620 de 0.8. La determinación del número de UFC ml-1 se
realizó como fue descrito en el ítem 3.3. Se sembraron 4 semillas esterilizadas
superficialmente (Ítem 3.3) por maceta y en los tratamientos inoculados se distribuyó
homogéneamente 3 ml de cultivo bacteriano sobre cada semilla, procediendo a tapar las
semillas inmediatamente. A los 2 días después de la siembra, se seleccionaron las
plántulas por tamaño homogéneo, dejando 2 por maceta. Los tratamientos evaluados
fueron: 3 variedades, 4 cepas y 1 control sin inocular. A los controles se les aplicó igual
cantidad de fertilizante-15N que a los tratamientos inoculados. El ensayo se llevó a cabo
en el invernáculo del CIN (Facultad de Ciencias) y las plantas se regaron con agua
corriente y 2-3 veces por semana con medio Farhaeus sin N. La cosecha se realizó a los 60
días después de la siembra. Las plantas se extrajeron de las macetas y se lavaron las
raíces cuidadosamente con agua corriente. Se determinó el peso seco de la parte aérea y
radical (Ítem 3.5.1). Una muestra de la parte aérea de las plantas se molió (polvo fino) en
molino para analizar el de nitrógeno (%N) y el % 15N a.e. por espectrometría de masa (VG
Prism Series II, Universidad Autónoma de Madrid). El porcentaje de N derivado de la
atmósfera (%Ndda) se determinó por la siguiente fórmula:
%Ndda = [(1 – (%15N a.e.F / %15N a.e.NF) X100]
El %15N a.e.F corresponde al enriquecimiento en 15N de las plantas fijadoras y %15N
a.e.NF al enriquecimiento de las plantas no fijadoras (Eldor, 2007). En este experimento
no se incluyeron plantas como no fijadoras controles y se utilizó como tratamiento no
fijador (NF) las plantas del tratamiento con el mayor valor de enriquecimiento de 15N.
Los datos fueron analizados por ANOVA con LSD-Fisher (p<0,05) (Di Rienzo et al., 2010).
Con los datos de %N en la parte aérea se calculó la concentración de N por mg de peso
seco (mg/gPSPA) y la acumulación de mg de N por planta (mg N/pl.)
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
21
4 - Resultados y discusión
En el trabajo se utilizaron 15 cepas de bacterias endófitas-diazótrofas nativas,
seleccionadas de una colección de aislamientos de 19 variedades comerciales de maíz
(Zea mays L.). Se eligieron teniendo en cuenta la variedad de maíz, órgano vegetal del
que fueron aisladas, capacidad de reducción de acetileno (ARA), presencia del gen nifH y
que correspondieran a diferentes géneros (Tabla 2).
4.1 - Capacidad de solubilizar fosfato inorgánico in vitro
Todas las cepas estudiadas mostraron capacidad de solubilizar fosfato in vitro,
excepto Herbaspirillum frisingense-EMA117 que no formó el típico halo translúcido en el
medio de cultivo (Tabla 3). En la Figura 4 se muestra una placa con medio NBRIP. Se
obtuvo el índice de solubilización de fosfato, clasificando las cepas en tres categorías:
bajo 0-2, media de 2-3 y alta solubilización mayor a 3.
Los resultados mostraron 6 cepas con baja capacidad de solubilizar fosfato (CSP), 8
con media y 1 que no solubiliza (Tabla 3) en las condiciones experimentales establecidas.
Si bien EMA-171, 130, 15 y 149 mostraron una CSP baja y a sus ves son aislamientos
provenientes de raíz, a grandes rasgos no se encuentra relación entre la solubilización de
fosfato y el órgano o variedad del cual se aisló la cepa (Tabla 3). Por otra parte, los
resultados indican que la solubilización de fosfato es una característica constante de las
cepas, varió solamente en EMA-149, 35, 46, 175 y 82 (Tabla 3). Las cepas EMA-149, 35 y
46 mostraron un incremento en su CSP, mientras que EMA-82 disminuyó su CSP (Tabla
3).
Figura 4. Placa de NBRIPsembrada con las cepas EMA-35 yEMA-38.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
22
CepaÍndice de solubilización de P**
CSP CSPp
Burkholderia sp. (EMA-171) 1,4 1,8
Pantoea agglomerans (EMA-
130)1,5 1,6
Enterobacter sp. (EMA-15) 1,7 1,7
No identificada (EMA-149) 1,9 2,1
Pantoea sp. (EMA-35) 1,9 2,3
Rahnella sp. (EMA-46)1,9 2,6
Rahnella sp. (EMA-175)2,0 3,2
Pantoea sp. (EMA-82)2,1 1,4
Rahnella sp. (EMA-169)2,2 2,5
Pseudomona fluorescens (EMA-
68)2,2 2,5
Rhizobium sp. (EMA-176)2,3 2,0
Rahnella sp. (EMA-83)2,3 2,7
Brevundimonas sp. (EMA-177) 2,6 2,4
Pseudomonas fluorescens
(EMA-38)2,9 2,1
Herbaspirillum frisingense
(EMA-117)NS* NS
* NS: No solubiliza. ** Los valores indican la relación entre el diámetro de la coloniay el diámetro del halo de solubilización. (n= 4).
Luego del nitrógeno, el fósforo es el segundo macronutriente en importancia para
el crecimiento de las plantas. Su concentración en el suelo puede ser alta pero no está en
formas disponibles para los vegetales (Calderón-Vázquez et al., 2009). Sin embargo,
existen bacterias rizosféricas y endófitas que mediante la liberación de enzimas o
producción de ácidos orgánicos, solubilizan el fosfato haciéndolo disponible para las
plantas ( Kuklinsky-Sobral et al., 2004; Rodríguez et al., 2006). Los resultados de este
Tabla 3. Capacidad de solubilización de P (CSP) in vitro por lascepasendófitas-diazótrofas asociadasa maíz y CSP luego de sucesivosrepiques en medio rico TY (CSPp).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
23
trabajo indican que la CSP es una característica bastante común en las cepas estudiadas,
o sea que tienen “potencial” de PCV por esa característica en particular. Por el contrario,
llama la atención que Pantoea sp.-EMA82 fue la única cepa de las 15 estudiadas que
mostró disminución en su CSPp. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos por
Azziz (2010) quien determinó que de 13 cepas aisladas de suelos agrícolas uruguayos, 7
mostraron su CSP disminuida. En la metodología empleada por Azziz (2010) se realizan
12 subcultivos en medio rico mientras que en el presente trabajo se realizaron 5, esto
puede ser una de las razones en la diferencia de los resultados, teniendo en cuenta que
se utilizó el mismo medio de cultivo y condiciones de crecimiento bacteriano similares
para evaluar la CSPP. Asimismo, en el estudio mencionado, los géneros bacterianos
estudiados fueron Pseudomonas spp., Enterobacter spp. y un aislamiento de Rahnella
spp. (Azziz, 2010). En nuestro caso, las cepas de Rahnella sp. EMA-46 y 175 aumentaron o
mantuvieron EMA-169 y 83 su CSP, mientras que Azziz (2010) encontró una disminución
de la CSP en ese género. Los resultados evidencian que si bien es una característica fácil
de detectar in vitro, es a su vez muy variable por la incidencia de factores biológicos y
ambientales. La observación de que el 64% de las cepas estudiadas conservan un nivel
de solubilización invariable luego de sucesivos repiques en medio rico, indicaría que es
una característica intrínseca de las cepas y no solamente el producto de una respuesta
ambiental. Por lo tanto, se destaca que la solubilización de fosfato es una característica
común de las cepas endófitas-diazótrofas estudiadas en este trabajo y que es estable en
las condiciones de cultivo utilizadas. Sin duda, queda por saber si es una característica
funcional en otras condiciones ambientales. Las investigaciones cuyo principal objetivo
es detectar bacterias solubilizadoras de fosfato son numerosas en la bibliografía
(Rodríguez et al., 2006; Avis et al., 2008; Adesemoye y Kloepper, 2009).En Argentina, se
recomienda la inoculación de trigo con una cepa de Pseudomonas sp. solubilizadora de
fosfato para obtener mejores rendimientos en el cultivo (Ventimiglia et al., 2008). Para
maíz existen en Argentina formulaciones comerciales con cepas de Pseudomonas sp. que
muestran incrementos en el rendimiento de hasta el 17% comparado con plantas sin
inocular (Carrasco y Zamora, 2002). La co-inoculación en arroz y trigo con bacterias
solubilizadoras de fosfato y fijadoras de nitrógeno mostró un efecto sinérgico sobre la
promoción del crecimiento vegetal (Kundu y Gaur, 1980; Gyaneshwar et al., 2002). La
solubilización de P en bacterias endófitas puede aumentar la disponibilidad de P durante
las etapas iniciales de la colonización (Kuklinsky-Sobral et al., 2004).Nuestros resultados
y los de la bibliografía resaltan el interés real en continuar con la selección de bacterias
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
24
que fijen N y solubilicen fosfato para al menos, un suministro parcial de esos nutrientes,
reduciendo la aplicación de fertilizantes en cultivos de importancia para la alimentación
humana y animal.
4.2 - Efecto de la bacterización de semillas en el crecimiento de la radícula
El objetivo fue determinar si las cepas en estudio afectan el crecimiento de la
radícula al estar en contacto con las semillas durante su germinación. El interés
específico fue determinar mediante un método indirecto algún indicio de presencia de
metabolitos que promovieran el crecimiento de la radícula en la variedad NK900. Las
semillas se inocularon y colocaron en placas de agar-agua para su germinación como se
observa en la Figura 5.
En la Tabla 4 se presentan las medias de longitud de la radícula de semillas tratadas
con inóculos de alta y media densidad de bacterias.ml-1 y las de semillas sin inocular. Los
resultados muestran una respuesta variable, dependiendo de la cepa y de la dilución del
inóculo. En general, las semillas tratadas con inóculos diluidos presentaron en promedio
radículas de mayor longitud (3,10 cm) comparado con aquellas con inóculos sin diluir
(2,48 cm).
Figura 5. Placa de agar-agua con semillas
de maíz germinando e inoculadas con EMA-
117.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
25
La aplicación de Pseudomonas fluorescens-EMA38 mostró un valor medio de
longitud de radícula significativamente mayor al control, efecto no observado cuando se
utilizó el inóculo diluido (Tabla 4). Brevundimonas sp.-EMA177 dio una media de radícula
de 3,44 cm con inóculo sin diluir, valor más alto que el control cuando se inoculo con
107UFC.ml-1, pero sin diferencia significativa. La inoculación con EMA-15, 130, 117 redujo
significativamente el crecimiento de las radículas, independientemente de la
concentración bacteriana en el inóculo. Por el contrario, el empleo de inóculos sin diluir
Cepa InoculadaLargo de radícula (cm)
Densidad celular en inóculos
107 UFC ml-1 103 UFC ml-1
Control sin inocular 3.37 e 3.45 d-f
Pantoea agglomerans (EMA-130) 1.28 a 1.65 a
Enterobacter sp. (EMA-15) 1.4 ab 2.11 ab
Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 1.5 ab 1.96 ab
Pantoea sp. (EMA-35) 1.98 bc 3.25 c-e
Rahnella sp. (EMA-169) 2.63 cd 3.58 ef
Rahnella sp. (EMA-46) 2.75 de 3.26 c-e
Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 2.79 de 2.55 bc
Burkholderia sp. (EMA-171) 2.83 de 3.68 ef
Rhizobium sp. (EMA-176) 2.84 de 3.69 ef
Pantoea sp. (EMA-82) 2.97 de 3.24 c-e
Sin identificar (EMA-149) 2.99 de 3.41 d-f
Rahnella sp. (EMA-175) 3.11 de 2.83 cd
Rahnella sp. (EMA-83) 3.21 de 3.81 ef
Brevundimonas sp. (EMA-177) 3.44 ef 3.49 d-f
Pseudomonas flourscens (EMA-38) 4.10 f 4.09 f
Letras diferentes indican diferencia significativa según Fisher-LSD (p>0,05). (n= 12)
Tabla 4. Longitud media de radícula de semillas bacterizadas con inóculossin diluir y diluidos de las cepas en estudio (48h después de labacterización)
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
26
de EMA-169 y EMA-35 mostraron valores significativamente menores al control (Tabla
4).
Como se mencionó hubo un incremento significativo en la longitud promedio de las
radículas cuando se utilizó la cepa P.fluorescens-EMA38, lo cual sugeriría la posibilidad de
que excrete al medio algún metabolito promotor del crecimiento; probablemente con
un inóculo diluido la concentración del compuesto pierde el efecto promotor. Por el
contrario, es más difícil explicar el efecto en la reducción de las radículas, se podría
asumir que es consecuencia de la producción, por las bacterias, de algún metabolito
inhibitorio o en concentración inhibitoria. Investigaciones de Barazani y Friedman (1999)
demostraron que concentraciones de ácido indol-acético (AIA) de 195 μM reducen el
crecimiento radical de semillas de lechuga (Lactuca sativa) mientras que valores de 51
μM lo promueven. Se ha observado que las bacterias endófitas de distintos vegetales
son capaces de producir diversas sustancias bioreactivas como antibióticos,
antioxidantes, antivirales entre otros (Guo et al., 2008). Los resultados de la bibliografía
consultada, sugieren que en nuestro caso es probable que algunas de las bacterias
estudiadas produzcan sustancias inhibitorias. El empleo de bajas concentraciones de
bacterias en el inóculo resultaron en mayor longitud de radícula en comparación a los sin
diluir, el menor largo radical de los últimos puede ser causado por componente del
medio o por productos del metabolismo bacteriano liberados que actúen en detrimento
del poder germinativo de las semillas. El tiempo transcurrido desde la bacterización
hasta la medida de las radículas, es un factor que incide en los resultados. En un ensayo
previo con la misma variedad y similares condiciones, no se obtuvo incremento en el
largo de la radícula medido a las 24 hs de la bacterización (datos no mostrados). En la
bibliografía se menciona que la producción de diversas sustancias por bacterias está
regulada por Quorum sensing, mecanismo de comunicación celular que es controlado por
la densidad poblacional (Badri et al., 2009). La existencia de Quorum sensing en alguno de
los casos de inoculación de semillas estudiados, podría explicar los resultados obtenidos.
Sería interesante determinar si las cepas estudiadas se comunican para la producción de
sustancias estimulantes o inhibidoras involucradas en el crecimiento de la radícula. Las
bacterias deberán evaluarse en otras variedades de maíz, con concentraciones
bacterianas aún menores a las utilizadas en este trabajo y con tiempos de exposición
más amplios. Dichos factores podrían ampliar la información sobre la interacción
cepa/semilla en el desarrollo radical temprano.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
27
4.3 - Tolerancia al glifosato
En nuestro país, el cultivo extensivo de maíz se realiza por siembra directa. Este
sistema de producción implica el uso de un herbicida, por lo general “Roundup®”, que es
de amplio espectro, de aplicación por aspersión y utilizado para controlar la vegetación
antes de la siembra o post-emergencia. Este producto ampliamente utilizado en la
agricultura, sobre todo en cultivos transgénicos que son tolerantes al mismo. El
ingrediente activo es el glifosato, más exactamente, la sal isopropilamina de glifosato y
su modo de acción es inhibir la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, lo que resulta en
el agotamiento de los aminoácidos aromáticos esenciales necesarios para la
supervivencia de las plantas (Beste, 1983). El glifosato es aplicado por lo menos 1 mes
antes de la siembra (Dabalá, 2009).
Como conocimiento adicional de las cepas en estudio, se determinó su tolerancia al
glifosato en su formulación “Roundup®” (Glifotec® de Agritec). El lapso que deja el
agricultor entre la aplicación del herbicida al suelo y la siembra de maíz, es
razonablemente prolongado como para anular un efecto negativo del agroquímico sobre
las bacterias ubicadas alrededor de las semillas (en caso de estar bacterizadas). Para
corroborar esta hipótesis se determinó la capacidad de tolerancia de las cepas al
glifosato semejando una “inoculación” de las semillas y teniendo en cuenta que el efecto
podría no deberse al ingrediente activo sino a otros ingredientes químicos de la
formulación como solventes, coadyuvantes, colorantes, etc. La tolerancia de las cepas al
glifosato se evaluó en medio de cultivo TY con 250 y 500 mg.l-1 y se determinó las UFC
ml-1 de cultivo (Tabla 5).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
28
Tabla 5. Tolerancia de cepas endófitas-diazótrofas a glifosato: 250 mg.l-1 (G250) y 500 mg.l-1(G500).
Cepa Control G250 G500
Enterobacter sp. (EMA-15) 8,5 8,7 8,6
Pantoea sp. (EMA-35) 8,6 <6 <6
Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 8,7 8,7 8,7
Rahnella sp. (EMA-46) 7,6 <6 <6
Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 8,7 8,6 8,6
Pantoea sp. (EMA-82) 9,0 8,9 8,9
Rahnella sp. (EMA-83) 7,7 7,9 7,8
Sin identificar (EMA-149) 8,8 8,8 8,8
Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 8,6 8,4 8,5
Pantoea agglomerans (EMA-130) 8,5 8,6 8,5
Rahnella sp. (EMA-169) 8,7 8,6 8,7
Burkholderia sp. (EMA-171) 8,6 8,7 8,6
Rhanella sp. (EMA-175) 7,5 7,6 7,5
Rhizobium sp. (EMA-176) 8,9 <6 <6
Brevundimonas sp. (EMA-177) 7,5 7,6 7,6
Valores en log UFC ml-1 de cultivo. (n=6).
Las dosis de glifosato utilizadas no afectaron el crecimiento de 12 de las 15 cepas
estudiadas, pero si inhibieron el crecimiento de EMA-35, 46 y 176 en ambas dosis
utilizadas (Tabla 5). Si bien el 87% de las cepas estudiadas mostraron tolerancia a los dos
niveles de glifosato, es interesante notar que ninguna de las cepas mostró un mayor
crecimiento por el herbicida en el supuesto de que lo utilizara en su metabolismo como
fuente de algún nutriente. Para ninguna cepa se observó inhibición total del crecimiento
(Tabla 5). Por otra parte, llama la atención que no fueran afectadas un mayor número de
cepas dadas las altas concentraciones de glifosato utilizadas. Es probable, que al utilizar
en la siembra las cepas crecidas en medio TY líquido, se haya atenuado el efecto del
glifosato sobre las mismas. La sensibilidad que presentan las cepas de EMA 35, 46 y 176
probablemente se debe a algún compuesto químico en la formulación del “RoundUp®”,
como por ejemplo el surfactante o algún vehículo empleado en el producto. Rizobios
tolerantes a 250 mg.l-1 de glifosato fueron aislados de suelos agrícolas de Argentina por
Zabaloy y Gómez (2005). Por otro lado, Moneke y Anyanwu (2010) estudiaron bacterias
rizosféricas de arroz en medio rico con distintas concentraciones de “Roundup®” y
obtuvieron bacterias tolerantes a 250 mg.ml-1 de glifosato. Existen 2 vías para la
biodegradación del glifosato, formando glicina o aminomethylphosphonate (AMPA)
(Pipke et al., 1987; Jacob et al., 1988; Kremer y Means, 2009). La vía de AMPA conlleva a
la producción de fosfato biodisponible para la bacteria, la misma se encuentra regulada
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
29
por las necesidades nutricionales bacterianas de este elemento (Jacob et al., 1988;
Moneke y Anyanwu, 2010). Esto podría representar una ventaja competitiva respecto a
microorganismos rizosféricos incapaces de biodegradar glifosato por esa vía.
Cabe resaltar que se considera de interés determinar la tolerancia al herbicida en
otras condiciones experimentales, ambientales y en medio de cultivo líquido, para poder
ponderar los resultados con las cepas estudiadas.
4.4 - Respuesta de maíz a la inoculación bacteriana
Se estudió la respuesta de variedades de maíz a la inoculación con las cepas
endófitas-diazótrofas en condiciones gnotobióticas e invernáculo. Ambas
aproximaciones tuvieron el objetivo de detectar algún efecto positivo sobre el
crecimiento de las plantas de maíz.
4.4.1 - Ensayo en condiciones gnotobióticas
En una primera instancia se evaluó la respuesta a la inoculación en condiciones de
laboratorio utilizando tubos para planta con zona estrecha (Figura 6).
Figura 6. Sistema de crecimiento de
plántulas de maíz in vitro.
Como se muestra en la Tabla 6 la variedad NK900 sin inocular mostró valores de
peso seco parte aérea (PSPA) y peso seco radical (PSR) más altos en comparación a
DK682 en los tratamientos sin N (-N), con 35 (+N35) y 70 (+N70) ppm de N. Este
resultado indica que esa variedad es capaz de lograr mayor producción de biomasa en las
condiciones de crecimiento utilizadas. Para el variedad NK900, los valores medios de
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
30
PSPA obtenidos con las cepas EMA-38, 82 y 149 son significativamente más altos que el
de las plantas control –N, pero sin diferencia de aquellas con +N35 y +N70 (Tabla 6).
Tratamiento
Peso seco (mg.planta-1)
NK900 DK682
PSPA PSR PSPA PSR
-N 81.3 bc 88.4 bc 67.2 ab 74.3 b-e
+ N35 110.3 gh 89.9 bc 101.8 gh 87.7 b-f
+ N70 110.1 f-h 82.8 a-c 102.1 h 80.5 b-e
Rahnella sp. (EMA-169) 69.7 ab 71.4 a 87.6 d-f 93.4 d-f
Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 79.2 a-c 75.3 ab 91.2 e-h 110.0 f
Rahnella sp. (EMA-175) 86.1 b-d 85.2 a-c 64.6 ab 67.8 a-d
Rahnella sp. (EMA-83) 87.7 c-e 80.1 ab 74.0 a-d 62.4 ab
Pantoea sp. (EMA-35) 89.9 c-e 76.2 ab 101.8 gh 98.0 ef
Brevundimonas sp. (EMA-177) 92.4 c-e 80.4 ab 81.0 c-e 83.2 b-e
Enterobacter sp. (EMA-15) 96.4 d-f 90.4 b-d 66.1 ab 49.2 a
Enterobacter sp. (EMA-130) 94.0 c-e 68.7 a 89.0 d-g 84.7 b-f
Rahnella sp. (EMA-46) 89.7 c-e 74.4 ab 62.2 a 50.7 a
Rhizobium sp. (EMA-176) 92.5 c-e 74.5 ab 91.7 e-h 90.4 c-f
Pantoea sp. (EMA-82) 95.9 c-e 83.2 a-c 79.5 b-e 69.7 a-d
Enterobacter sp. (EMA-149) 103.4 e-g 99.6 cd 67.9 a-c 72.2 a-e
Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 101.3 d-g 82.7 a-c 75.9 a-e 64.1 a-c
Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 121.1 h 104.0 d 86.6 d-f 80.3 b-e
Burkholderia sp. (EMA-171) 63.8 a 69.5 a 79.5 b-e 88.1 b-f
La inoculación con EMA-117 en NK900 produjo valores de PSPA significativamente
más altos que con el resto de los tratamientos inoculados (Tabla 6). Un 66% de las cepas
inoculadas en NK900 no produjeron diferencias de PSR respecto a los controles con y sin
N. Cuando se inoculó con EMA-35, 130, 169, 171 y 176 la respuesta en PSR fue
significativamente menor a los controles con y sin N (Tabla 6).
La inoculación de DK682 con EMA-130, 35, 68, 176 y 169 resultó en valores medios
de PSPA significativamente superiores a los de plantas -N pero similares a las que
Los valores en la misma columna seguidos por la misma letra no son significativamentediferentes según Fisher-LSD (p<0.05). –N control no inoculado y sin N, +N35 control sin inoculary fertilizado con 35ppm de N, +N75 control sin inocular y fertilizado con 70 ppm de N.
Tabla 6. Valores medios de peso seco parte aérea y peso seco radical de plantas de
maíz variedades NK900 y DK682 inoculadas con cepas de endófitos-diazótrofos. (n =
5).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
31
presentaron +N35 y +N70 (Tabla 6). Los valores de PSR en la variedad DK682, al igual
que en NK900, no mostraron diferencias entre los controles con y sin nitrógeno. Once de
las 15 cepas estudiadas no indujeron diferencias en el PSR respecto al control -N. A
diferencia de NK900, EMA-46 y EMA-15 provocaron un aumento significativo de los
valores de PSR respecto a -N, +N35 y +N70 en DK682. Al inocular con EMA-68 el PSR en
DK682 aumentó significativamente respecto -N y +N70 (Tabla 6).
Teniendo en cuenta los datos de los 2 variedades conjuntamente, las plantas
inoculadas con H.frisigense-EMA117 mostraron PSPA significativamente mayor (46% de
incremento) a las plantas sin inocular y -N (Tabla 7)). La inoculación con Rahnella sp.-
EMA46 disminuyó un 23% el PSR respecto al control sin inocular (Tabla 7).
TratamientoVariedad
NK900 DK682
Burkholderia sp. (EMA-171) -23 a 13 a-d
Rahnella sp. (EMA-169) -10 ab 29 c-e
Pseudomonas fluorescens (EMA-68) -1 b-d 37 d-f
Rahnella sp. (EMA-175) 7 b-d 5 ab
Brevundimonas sp. (EMA-177) 13 cd 16 b-d
Rahnella sp. (EMA-83) 14 cd 9 a-d
Pantoea sp. (EMA-35) 14 cd 52 ef
Enterobacter sp. (EMA-15) 16 cd 3 ab
Enterobacter sp. (EMA-130) 16 c-e 40 ef
Rahnella sp. (EMA-46) 16 c-e 8 a
Rhizobium sp. (EMA-176) 16 c-e 35 d-f
Pantoea sp. (EMA-82) 19 de 13 a-d
Enterobacter sp. (EMA-149) 19 de 0 a-c
Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 25 de 6 a-c
+N35 33 e 49 ef
+N70 34 e 52 f
Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 35 e 18 b-d
Los resultados de la Tabla 7 muestran que varias de las cepas promueven el
crecimiento de la parte aérea de plantas de maíz en las condiciones experimentales
Los valores en la misma columna seguidos por la misma letra no sonsignificativamente diferentes según Fisher-LSD (p<0.05). –N control no inoculadoy sin N, +N35 sin inocular y fertilizado con 35ppm de N, +N75 sin inocular yfertilizado con 70 ppm de N.
Tabla 7. Valores de índice relativo de peso seco de la parte aérea
respecto al control sin nitrógeno (control=100) en las variedades
NK 900 y DK682 inoculados con cepas de endófitos diazótrofos.
(n = 5)
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
32
utilizadas. La mayoría de los valores de PSPA fueron significativamente mayores a los del
tratamiento control sin N, alcanzando un 52% de incremento en DK682 inoculado con
Rhanella sp.-EMA83 (Tabla 7).
Los resultados indican además especificidad entre la cepa inoculada y la variedad
utilizada, dicha relación debe ser tenida en cuenta en futuros experimentos de
inoculación. La cepa H.frisingense-EMA117 se destaca dado que es capaz de promover el
crecimiento de la parte aérea en NK900 y DK682 (35% y 18%, respectivamente)
comparado al control sin N. La cepa Pantoea sp.-EMA35 mostró valores de PSPA iguales a
los controles +N35, +N70 diferenciándose del -N, siendo su respuesta es similar en
ambos variedades.
En la literatura, H. frisingense se señala como bacteria endófita diazótrofa
promotora del crecimiento vegetal asociada a importantes cultivos como arroz, caña de
azúcar, sorgo y maíz (Elbeltagy et al., 2001; Roncato-Maccari et al., 2003).
Los resultados de Shaharoona y colaboradores (2006) mostraron un incremento del
11,7% en la biomasa aérea de las plantas de maíz al inocularlas con rizobacterias en
condiciones axénicas. Experimentos gnotobióticos en maíz realizados por Gutiérrez-
Zamora y E Martínez-Romero (2001) obtuvieron respuestas a la inoculación con
aumentos de biomasa entre 26-40% respecto a controles sin inocular.
Es de destacar, que los valores de incremento de PSPA obtenidos en estas
condiciones de crecimiento de las plantas concuerdan en general con los obtenidos en la
bibliografía para este cultivo. Con la finalidad de continuar la evaluación se
seleccionaron las cepas más promisorias y se evaluaron en invernáculo.
4.4.2 - Ensayo en invernáculo
Se evaluó la respuesta de PAU871, NK940 y Maizón a la inoculación con Rahnella
spp.-EMA83, H. frisingense-EMA117, Pantoea sp.-EMA82 y P. fluorescens-EMA-38 estos
aislamientos fueron seleccionados por su capacidad de solubilizar fosfato, promover el
crecimiento de la radícula de semillas, tolerar el glifosato y presentar respuesta positiva
a la inoculación de plántulas en condiciones gnotobióticas.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
33
La variedad NK940 mostró en promedio menor respuesta a la inoculación que
PAU871 y Maizón (Figura 7, Tabla 8). Por lo tanto, la respuesta a la inoculación seria
PAU871 > Maizón > NK940. Se observó que los valores medios de PSPA de las plantas de
PAU871 inoculadas con Rahnella sp.-EMA83 y Pantoea sp.-EMA82 fueron
significativamente más altos que el control pero no entre ellas (Gráfico 1, Tabla 8); la
combinación PAU871-EMA83 produjo valores de PSPA más altos que P.fluorescens.-
EMA38.
En las variedades Maizón y NK940, la inoculación con Rahnella sp.-EMA83 resultó en
valores PSPA significativamente mayores a las plantas inoculadas con Pantoea sp.-
EMA82 (Figura 7). Para NK940, la inoculación con Pantoea sp.-EMA82 redujo los valores
de PSPA y PSR respecto a las plantas control, lo cual indicaría que la cepa tiene un efecto
negativo en el crecimiento de las plantas de NK940. Este resultado no se observó en
PAU871, indicando interacción cepa vs. variedad.
Figura 7. Peso seco parte aérea (azul) y peso seco radical (rojo) de las variedades NK940, PAU871 y
Maizón inoculados con las cepas EMA-117, 38, 82 y 83. El análisis estadístico se realizó para cada variedad,
letras diferentes indican diferencias estadísticas según Fisher-LSD (p<0,05).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
34
El PSR en plantas inoculadas de Maizón fue mayor en promedio que en PAU871 y
NK940. Es de destacar la mayor producción significativa de raíces en Rahnella sp.-EMA83
en PAU871 y Maizón; en NK940 produjo mayor PSR que el control pero sin diferencias
significativas (Figura 7, Tabla 8). En general, la mayoría de los tratamientos inoculados
mostraron valores más altos en PSR que el tratamiento control (Figura 7, Tabla 8).
También se observaron valores de PSR más altos que las plantas control al inocular
Maizón con P. fluorescens.-EMA38 y PAU871 con H. frisingense-EMA117. Estos resultados
podrían indicar que esas cepas de bacterias producen algún metabolito estimulante del
crecimiento radical en esas condiciones, los cuales podrían inducir una mayor producción
de parte aérea.
Estos resultados conjuntamente con los obtenidos en el ensayo en condiciones
gnotobióticas muestran que la cepa H. frisingense-EMA117 promueve la producción de
biomasa aérea, reafirmando la posibilidad de que sea una bacteria PCV en las
condiciones experimentales empleadas. Existe concordancia de nuestros resultados con
los de la bibliografía (Marques et al., 2010; Mehnaz et al., 2010). Riggs y colaboradores
(2001) evaluaron 160 combinaciones cepa-variedad con y sin agregado de fertilizante
nitrogenado (224 kg de N/ha) en ensayo de invernáculo. Los autores obtuvieron
aumento del índice de biomasa vegetal respecto al control sin inocular en 30
combinaciones cuando fertilizaron con N y en 16 cuando no fertilizaron. Según los
autores, cuando no agregan N, la inoculación no alivia los síntomas de déficit de N en las
plantas a pesar del incremento de biomasa respecto a las plantas sin inocular. Por otro
lado, Wu y colaboradores, (2005) señalan los beneficios de la inoculación de maíz con
microorganismos PCV en condiciones controladas. Ellos inocularon plantas de maíz con
una combinación de cepas bacterianas: Azospirillum chroccocum (fijador de N), Bacillus
megaterium (solubilizador de fosforo), Bacillus mucilaginous (solubilizador de K) y 2
especies de hongos micorrícicos. Los autores encontraron que las plantas co-inoculadas
con micorrizas y bacterias PCV triplicaron en biomasa seca a las plantas de maíz que
crecieron con fertilizante orgánico y fosfato de roca. También en maíz, Mehnaz y
colaboradores (2010) demostraron que la inoculación con bacterias PCV endófitas
resulta en un incremento en el PSPA y PSR de 32% y 31%, respectivamente, comparado a
plantas sin inocular.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
35
Tabla 8. Valores medios de peso seco parte aérea (PSPA) y raíz (PSR), % de átomos en exceso de 15N
(%a.e. 15N), concentración de N (mgN/gPSPA) y acumulación de N (mg N/pl.) en ensayo de inoculación de
variedades de maíz en invernáculo. (n = 5).
Variedad Cepa inoculada PSPA (g/pl.) PSR (g/pl.) % a.e.15N N en PSPA(mg/gPSPA)
Acumulaciónde N (mg N/pl)
Maizón
H. frisingense(EMA-117)
23,5 bc 12,3 ab 0,22 ab 5,4 b 126,9 ab
Rahnella sp.(EMA-83) 24,7 c 14,4 b 0,19 a (5%)* 6,4 ab 158,1 c
Pantoea sp.(EMA-82)
15,8 a 7,0 a 0,32 b 6,1 ab 96,4 a
P. fluorescens(EMA-38)
20,4 a-c 14,6 b 0,26 ab 6,7 ab 136,7 bc
Control 18,5 ab 7,7 a 0,20 a 6,9 a 127,7 a-c
PAU871
H. frisingense(EMA-117) 22,6 ab 9,4 b 0,19 a (30%)* 6,0 a 135,6 a
Rahnella sp.(EMA-83)
26,9 b 11,5 b 0,18 a (34%)* 4,7 b 126,4 a
Pantoea sp.(EMA-82)
24,5 b 7,8 ab 0,19 a (30%)* 5,5 ab 134,8 a
P. fluorescens(EMA-38)
19,5 a 8,8 ab 0,32 b 5,8 ab 113,1 a
Control 16,5 a 5,4 a 0,27 ab 5,5 ab 90,8 a
NK940
H. frisingense(EMA-117)
21,2 b 8,7 a 0,25 ab 5,6 b 118,7 a
Rahnella sp.(EMA-83)
23,8 b 7,2 a 0,22 ab 5,5 b 130,9 a
Pantoea sp.(EMA-82)
16,8 a 5,3 a 0,28 b 6,6 ab 110,9 a
P. fluorescens(EMA-38)
19,3 ab 8,4 a 0,25 ab 7,3 a 140,9 a
Control 22,3 b 6,8 a 0,16 a 5,8 b 129,4 a
El análisis estadístico se realizó independientemente para cada variedad. Los valores en la misma columnaseguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según Fisher-LSD (p<0.05). * %Ndda
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
36
En la Tabla 8 se presentan los resultados de la determinación de la capacidad de
FBN de las plantas utilizadas. Valores menores de enriquecimiento en %15Na.e. indican
que las plantas incorporaron mayor proporción de nitrógeno atmosférico (14N) en
relación al del fertilizante marcado en el sustrato. El %a.e.15N en Maizón fue más alto en
los tratamientos inoculados comparado con el control, excepto para Rahnella sp.-EMA83,
sin diferencia significativa. Se calculó un valor de 5 %Ndda (%N derivado de la
atmósfera) para esa cepa, destacándose que también muestra el mayor valor de
acumulación N, no significativo.
En PAU871, la FBN se evidencio con la inoculación de EMA-117, 82 y 83 al presentar
valores de 30%, 34% y 30% de %Ndda respectivamente. Esto concuerda con los valores
de acumulación y concentración de N mayor (no significativa) obtenida en las
mencionadas combinaciones cepa-variedad (Tabla 8). En el caso de NK940, ninguno de
los tratamientos inoculados dieron valores de %a.e.15N menores que el control. Cabe
destacar que en esta variedad todos los tratamientos muestran valores similares de
concentración y acumulación de N (Tabla 8). Se observa en la Tabla 8 la posible
interacción cepa-variedad, un ejemplo es la cepa P. fluorescens-EMA38 que inhibe la FBN
en PAU871 pero no así en Maizón y NK940.
En un ensayo previo, Montañez y colaboradores (2009) determinaron por dilución
isotópica de 15N el potencial de aporte de la FBN a plantas de varios variedades de maíz
sin inocular. Los resultados mostraron que los valores de %15N a.e. fueron más altos que
los hallados en el presente trabajo: 0,43% PAU871, 0,43% Maizón y 0,40% NK940,
indicando variaciones posiblemente debido a diferencias en la microbiota, disponibilidad
de nutrientes y contenido de materia orgánica del sustrato empleado como también en
las condiciones experimentales como temperatura y fotoperíodo. Si bien el nitrógeno
combinado puede inhibir la FBN también se sabe que una disponibilidad de ese
elemento puede nutrir la planta durante el crecimiento inicial (Reis et al., 1994). Plantas
más vigorosas durante esta etapa posiblemente permitan que la planta hospede una
población mayor o más activa de bacterias endófitas.
La inoculación con H. frisigense-EMA117 en PAU-871 represento un beneficio dado
que aumentó el contenido en N de la planta, el cual posiblemente deriva de la FBN
considerando el bajo valor de %15Na.e reportado, no significativo. También esta
combinación cepa-variedad logro PSPA mayores, aunque no significativamente
diferentes al control sin inocular.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
37
5 - Conclusiones
A partir de los resultados del presenta trabajo se pueden extraer las siguientes
conclusiones:
a) Se detectaron cepas, de diferentes géneros y aisladas de diferentes órganos de
plantas de maíz con potencial de fijar biológicamente nitrógeno (diazótrofas) y
con la capacidad estable de solubilizar fosfato inorgánico in vitro.
b) El herbicida glifosato en concentraciones recomendadas comercialmente no
afecto el crecimiento de las cepas in vitro.
c) La cepa de Pseudomonas fluorescens-EMA38 promovió significativamente el
crecimiento temprano de la radícula de maíz, efecto que atribuido a la producción
de algún metabolito que favorece el crecimiento radical.
d) La inoculación de maíz con Herbaspirillum frisingense-EMA117 produjo un
aumento significativo en la biomasa aérea de las plantas de NK900 medida a los
20 días de crecimiento en condiciones controladas.
e) La metodología de dilución isotópica 15N mostró que la inoculación de la variedad
PAU871 resulta en mayor fijación de N que las variedades Maizón y NK940 en
condiciones de invernáculo. Se detectó que combinaciones maíz-cepa tienen la
capacidad de contribuir a la nutrición nitrogenada de maíz en las condiciones
experimentales utilizadas (siendo EMA-38 y EMA-117 las más promisorias en la
variedad PAU871).
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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6 - Perspectivas
Las perspectivas que plantea este trabajo son: continuar con el estudio y selección
de nuevas características promotoras del crecimiento vegetal (producción de
sideróforos y AIA, control de fitopatógenos etc.) en Pseudomonas fluorescens-EMA38, H.
frisingense-EMA117, Rahnella sp.-EMA83 que aparecen como promisorias. Dar un paso
adelante con algunas cepas pre-seleccionadas para evaluarlas en medios de cultivo semi-
industriales, conjuntamente con su sobrevivencia en soportes utilizados en inoculantes y
en la rizosfera, estudios en etapa piloto. Posteriormente acentuar los ensayos de
inoculación de nuevas combinaciones de variedades de maíz-cepa en invernáculo y luego
en campo. Evaluar otros métodos de inoculación brindaría mayor robustez a los datos
obtenidos hasta el presente. El desafío es continuar con los esfuerzos de identificar
bacterias fijadoras de nitrógeno para lograr la producción de maíz como una práctica
agrícola sustentable.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
39
7 – Anexo 1
Medios de cultivo
TY
Reactivo Cantidad por litro
Extracto de levadura 3 g
Triptona de soja 5 g
CaCl2 (2,5 % ó 3.3%
c/H2O)
H2O csp.
4 ml
1 litro
Para solidificar se utilizó agar a una concentración de 17 g/l. pH 7.
NBRIP
Reactivo Cantidad por litro
Glucosa 10 g
Ca3(PO4)2 5 g
MgCl2 · 7H2O 0,25 g
KCl 0,2 g
(NH4)2SO4
H2O csp.
0,1 g
1 litro
Para solidificar se utilizó agar a una concentración de 17 g/l. pH 7.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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Fahreus
Reactivo (concentración) Cantidad por litro
CaCl2 (10g/l) 10 ml
MgSO4 · 7H2O (12g/l) 10 ml
KH2PO4 (10g/l) 10 ml
Na2PO4 · 2H2O (15g/l) 10 ml
FeC6H6O7 (0,5 g/l) 10 ml
Solución micronutrientes
H2O csp.
1 ml
1 litro
pH 7.
Solución micronutrientes
Reactivo Cantidad por litro
CuSO4 5H2O 0,40 g
ZnSO4 7 H2O 0,12 g
H3BO3 1,40 g
Na2MoO4 2 H2O 1 g
MnSO4 H2O
H2O csp.
1,50 g
1 litro
pH 7.
Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas
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