Download - Protocolo de trabajo para met
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Presentador:
Kenneth Walker
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica
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Procesamiento de muestra
Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM
clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.
Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer
fosfato salino 0.1M por 2hrs.
Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en
buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4
por 1hr a 0°C.
Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%.
Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.
Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.
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La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad
antigénica.
Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°
La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo
que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor
o igual a 24hrs.
Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2
a 3 días).
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Impregnación e inclusión
For Resin Concentration
of solvent
Time in min T in°C
KM4 & HM20 30% 30 min 0
50% 60 min -20
70% 60 min -35
100% 2x60min -50
The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method
http://www.emsdiasum.com/
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ImmunoGold
Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min,
diluido en TBS
Ac primario contra la proteína buscada en TBS + NGS (2.5%
suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%
Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS
Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos
Ag-Ac.
Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.
Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son
necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.
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Contraste
Acetato de uranilo al 4% por 10 min.
y citrato de plomo de Reynolds 5 min.
Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de
plomo de Reynold 3min
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Montaje
Los cortes siempre son sensibles al haz
de electrones. Para mejorar su
resistencia, cubrirlos con FORMVAR en
una etapa final. Esto permitirá el mejor
acceso de los anticuerpos por ambos
lados del corte.
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Resultados hipotéticos
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GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature
neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature
neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such
as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.
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Aparato de Golgi
Envoltura nuclear
Cromatina finaNucléolo
MitocondriasRER
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Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra
cargado de vesículas de secreción (NT).
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Conclusiones
El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.
El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.
La técnica satisface los requerimientos de la investigación.
Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.
El estudio implica más técnicas a parte de la ME.
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Bibliografía
1. H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display
a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012,
Pages 59-77, ISSN 0306-4522.
2. Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell
membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.