Download - Protocolo de Extracción
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATOFACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Ingeniería Genética “Metodología para a extracción, purificación y amplificación del gen
del alfa-1-antitripsina de una proteína de origen animal”
Grupo de TrabajoOctavo Bioquímica
EXTRACCIÓN
RUPTURA CELULARLa fragmentación mecánica se obtiene triturando la muestra original puede ser de hígado.
Se debe utilizar una disolución amortiguadora de pH para obtener fragmentos tisulares pequeños
Luego se centrifuga y se lava con agua estéril retirando el sobrenadante
RUPTURA CELULAR
Posteriormente se realiza la degradación química de la membrana citoplasmática aplicando una solución de detergente SDS,
Se puede utilizar EDTA el cual desestabiliza la adhesión entre células y con la matriz extracelular.
Las proteínas de la matriz se pueden digerir con proteinasas K que degradan ADNasa y ARNasa para proteger al ADN de degradación.
SEPARACIÓN DE ADN
Para la extracción de ADN se añade una mezcla 1:1 (v/v) de fenol: cloroformo
Se centrifuga con lo cual se logra separación de fases en la fase acuosa ADN, ARN y glúcidos
Quedan los lípidos de la membrana. Se extrae el sobrenadante en el cual está el ADN
PURIFICACIÓN
PURIFICACIÓN
Se añade a la fase acuosa alcohol
absoluto o isopropanol
Se somete a centrifugación para que se
separe el ADN que queda al fondo del
tubo
Se retira el resto de agua, y se hace evaporar restos de
alcohol.
Se conserva el ADN a 4°C en
disolución de agua congelándolo.
AMPLIFICACIÓN
Materiales
Para la amplificación se utiliza como mejor método el PCR, en la que interviene un termociclador
La muestra pura que se obtuvo, debe tener la siguiente adición de reactivos. Se debe mezclar la cantidad de reactivos necesarios, dependiendo la proporción que se desea amplificar
AMPLIFICACIÓN
AMPLIFICACIÓN
Los 4 dNTPs, en exceso, como sustratos para la síntesis de las innumerables copias.
Para ser reconocidos los dNTPs deben ir acompañado con una porción de Mg2+.
Dos oligonucleóticos de cadena sencilla, sus secuencias deben ser complementarias a los extremos 3’ de la región de interés anterior a amplificar
La adición de una polimerasa Termoestable. Se adiciona una Taq. Polimerasa la cual es resistente a la variación de temperatura que se produce en el termociclador.
Materiales
Número de copias de la sección del gen
• Para tener un número de copias aceptables se le programa al termociclador con un número de ciclos de 30, que nos permitiría tener un número exacto de:
• Tendremos un número de copias al final de los 30 ciclos en el termociclador de la sección de gen amplificado de:
HIBRIDACIÓN
Para esta etapa de la amplificación se requieren de cebadores o primers ,los cuales son diseñados previamente para que reaccionen con la hebra sencilla del DNA
Éstos se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases para que la polimerasa los extienda entre el espacio comprendido entre ambos primers colocando dNTP’s de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’.
De este modo se sintetiza la secuencia complementaria de las hebras del DNA.
Para la elección del primers se elige una secuencia altamente conservada que varíen entre 15 y 30 pb
Los primers más cortos pueden no proporcionar una alta especificidad
Los primers más largos son más caros de sintetizar.
La longitud del primer es la suma de la región especifica más la de los nucleótidos no específicos o zonas de reconocimiento.
HIBRIDACIÓN
Se debe evitar las repeticiones largas del mismo nucleótido ya que pueden disminuir la especificidad.
El contenido de G+C de los primers debe aproximarse o superar ligeramente al contenido de G+C de la región a amplificar ya que pueden no competir efectivamente por la unión originando un bajo rendimiento.
El primer usado en lo posible deben terminar en T 3´ ya que son más tolerantes a la incorporación de errores.
HIBRIDACIÓN