___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
1
Universidad Dr. José Matías Delgado
Facultad Ciencias de la Salud
Dr. Luis Edmundo Vásquez Escuela de Medicina
TESIS
Para optar al título de: Doctor en Medicina
“EFECTO HEPATOPROTECTOR DE ACIDO ETILENDIAMINOTETRACÉTICO Y SELENATO
DE SODIO EN UN MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO EN RATONES”
Investigadores:
Br. Juan Francisco Granados Colocho Br. Pedro Eduardo Sobenes Romero
Asesora:
Lic. Teresita Bertoli de Masferrer
Patólogo: Dr. José Nicolás Astacio Soria
2010
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2
AGRADECIMIENTOS ESPECIALES A
A DIOS que siempre ha estado con nosotros y nos ha mostrado la luz en momentos de oscuridad,
a nuestros padres que nos han apoyado y acompañado en cada sacrificio durante todos estos años,
a nuestros catedráticos por su empeño en comunicarnos nuevos conocimientos,
a Lic. Teresita Bertolí, al Dr. Nicolás Astacio y al Dr. Carlos Flores, por habernos apoyado durante la realización de este trabajo, así como su
esfuerzo por cultivar en nosotros el espíritu de investigación, contribuyendo a enriquecer el conocimiento científico nacional.
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3
INDICE PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ........................................................................ 6
PREGUNTA. .................................................................................................................... 8
JUSTIFICACION ............................................................................................................. 9
OBJETIVOS ................................................................................................................... 11
OBJETIVO GENERAL: ........................................................................................... 11
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................. 11
MARCO TEÒRICO ....................................................................................................... 12
FISIOLOGÍA HEPÁTICA ......................................................................................... 13
CIRROSIS HEPÁTICA ............................................................................................ 15
ETAPAS DE LA ACTIVACIÓN DE HSC .............................................................. 16
AGENTES ASOCIADOS A DAÑO HEPÁTICO .................................................. 19
TIOACETAMIDA ................................................................................................. 21
ESTRÉS OXIDATIVO EN HEPATOPATÍAS ...................................................... 24
HIERRO ..................................................................................................................... 29
ORIENTACIONES TERAPÉUTICAS .................................................................... 34
NUEVAS OPCIONES TERAPÉUTICAS EN ESTUDIO .................................... 35
ANTIOXIDANTES .................................................................................................... 35
SELENIO ................................................................................................................ 36
QUELANTES DE HIERRO ..................................................................................... 38
MÉTODOS PARA EVALUAR DAÑO HEPÁTICO ................................................... 42
HIPOTESIS DE TRABAJO: ........................................................................................ 46
HIPOTESIS ESTADISTICAS: ..................................................................................... 46
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H1 ............................................................................................................................... 46
H0 ............................................................................................................................... 46
DELIMITACIÓN DEL TEMA ........................................................................................ 46
METODOLOGIA ........................................................................................................... 47
TIPO DE ESTUDIO .................................................................................................. 47
POBLACIÓN Y MUESTRA..................................................................................... 47
DIETA ......................................................................................................................... 47
DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................... 48
CRITERIOS DE INCLUSION ............................................................................... 50
CRITERIOS DE EXCLUSION. ............................................................................ 50
OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES ..................... 51
ESTANDARIZACIÓN DE MODELO DE INDUCCIÓN DE DAÑO CRÓNICO .... 52
EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y EL SELENIO. ............................ 53
SOLUCIONES ............................................................................................................... 54
DETERMINACIÓN DE LA SOBREVIDA .................................................................. 55
ANÁLISIS DE MUESTRAS ......................................................................................... 55
ANÁLISIS BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 55
ANÁLISIS MACROSCÓPICO ................................................................................ 55
ANÁLISIS MICROSCÓPICO .................................................................................. 56
MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS ..................... 56
PRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN. .............................................................. 57
CONSIDERACION ETICAS. ....................................................................................... 57
RESULTADOS .............................................................................................................. 58
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ESTANDARIZACIÓN DEL MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO
INDUCIDO POR TIOACETAMIDA EN RATONES ............................................. 58
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DEL MODELO ...................................................... 59
EVALUACIÓN DEL EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y
DEL SeNa .................................................................................................................. 60
HALLAZGOS MACROSCÓPICOS ....................................................................... 60
ANÁLISIS MICROSCÓPICO .................................................................................. 61
DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA, NECROSIS E HIPEREMIA PASIVA
CRÓNICA .............................................................................................................. 61
HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS ................................................................ 63
ANALISIS BIOQUÍMICOS ..................................................................................... 64
HEPATOPROTECCIÓN ......................................................................................... 65
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 69
Modelo experimental de daño hepático crónico mediante
Tioacetamida en Ratones. ...................................................................................... 69
Evaluación del efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa .......................... 71
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 75
RECOMENDACIONES ................................................................................................ 76
BIBLIOGRAFIA: ............................................................................................................ 77
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
El Fallo Hepático se define como una enfermedad que resulta de la imposibilidad
de las células hepáticas de mantener una adecuada función. En ocasiones el fallo
multiorgánico acompaña a la falla hepática aguda, y los índices de mortalidad
varían dependiendo el soporte vital desde un 50% a un 90%.
El daño hepático crónico puede ser producido por múltiples causas entre estas
tenemos
• Esteato - Hepatitis (Alcohólica y No Alcohólica).
• Hepatitis Crónica (Virus, autoinmune, medicamentos).
• Colestasis Crónica (CBP, CEP, otros).
• Enfermedades Metabólicas.
• Hígado Congestivo Crónico.
• Daño Hepático Crónico Criptogénico.
Esta enfermedad afecta a un amplio grupo de la población y posee diversas
complicaciones. Sabemos que la progresión de la hepatopatía crónica puede ser
retardada, pero difícilmente detenida. En la mayoría de los casos, la acción
terapéutica está limitada al manejo de las complicaciones, con especial énfasis en
la detección de factores reversibles que producen descompensación.
Actualmente este problema es abordado con el uso de fármacos, restricciones
alimenticias en algunos casos y en otros con adiciones alimentarías dependiendo
la evaluación nutricional del paciente y el nivel de progresión de la enfermedad.
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Algunos estudios1, 2 demuestran los beneficios que tiene la disminución de los
niveles de hierro sérico ya sea mediante la dieta1 o mediante el uso de un agente
quelante1 como la deferoxamina y su contribución en el proceso de curación de la
hepatopatía crónica. El hierro es un productor de estrés oxidativo y tiene un papel
muy importante en la progresión de la lesión hepática1 en pacientes con
hepatopatía crónica.1
La actividad oxidativa dañina también puede ser reducida con la utilización de
antioxidantes que ayuden a la disminución del estrés oxidativo a nivel de los
tejidos lo cual produce una respuesta favorable para la disminución de la
progresión de la hepatopatía y para la regresión en algunos casos de la
enfermedad ya establecida.
La terapia quelante de hierro usual con deferoxamina implica un alto costo
económico; así, por ejemplo, la dosis para talasemias de 20-40mg/kg/día, en una
persona de 65kg. a una dosis media equivaldría a 1.95g/día, con precio en el
mercado de $75.73 x cada 2g, representaría aprox. $530/semana. Si se utilizara
Ácido Etilendiaminotetracético, a la dosis máxima de 7000mg/día, con precio de
$30 x cada 100g, sería un total de 49g/semana o $30, representando una
alternativa notablemente económica; por lo que estudios en la utilización de este
quelante tendrían gran valor aplicativo si demuestra su efectividad en patologías
con alto componente oxidativo.3
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8
Al momento no está bien definida la importancia de la terapia combinada
mediante un agente quelante de iones bivalentes como el Acido
Etilendiaminotetracético (EDTA) y la administración de un antioxidante como el
selenato de sodio (SeNa) para la reducción del estrés oxidativo logrando mejorar
los índices de curación en daño hepático. Por lo que hemos decidido evaluar el
efecto de la terapia combinada en un modelo de daño hepático crónico en ratones.
PREGUNTA.
¿Cuál es el efecto hepatoprotector del ácido etilendiaminotetracético y el selenato
de sodio en un modelo de daño hepático crónico en ratones?
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JUSTIFICACION
En todo el mundo las patologías hepáticas crónicas representan un porcentaje de
mortalidad considerable por cada 100,000 hab. Para casos de hepatitis B y C que
van desde un 19.7%—19.5% en la República de Nauru y Sierra Leona, hasta un
0.1% en países como Australia; y un 0.0% en Georgia y Rumania. Así mismo la
cirrosis hepática representa 89.2 muertes por cada 100,000 hab. En Moldavia
parte de Europa Oriental4.
Regionalmente Bolivia es el país más afectado por cirrosis hepática con 27.9
muertes/100,000 hab. , según la OMS, dejando a Haití como el principal afectado
por mortalidad relacionada a hepatitis B con 9.7%. 4
A nivel nacional las patologías hepáticas han demostrado un considerable
incremento desde la década pasada ya que datos a partir de 1997 en cuanto a la
mortalidad general, revelan que dichas patologías representaron el 10º lugar con
142 defunciones de un total de 7,327; un año después en 1998 se encontraron en
8º lugar. Y posteriormente como se aprecia en el siguiente cuadro, tomando en
cuenta los últimos datos de 2008 se ubican en 4º lugar solo superado por VIH,
traumas e insuficiencia renal; representando un no despreciable 8.7% del total. 5
Cuadro 1.-
1997 1998 2008
Mortalidad por Patologías Hepáticas
10º Lugar 8º Lugar 4º Lugar
1.9% 4.4% 8.7%
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Es por ello que se han estudiado diversas formas para retrasar o detener el
avance de estas patologías variando cada una según su causa; abarcando desde
la utilización de interferones, antivirales, supresión de sustancias hepatotóxicas
hasta el transplante hepático.6 En los últimos años se han detectado nuevas
alteraciones en estas patologías encontrando niveles bajos de selenio y otros
antioxidantes séricos, promoviendo el rol importante de estos en la progresión del
daño hepático.7, 8 Así mismo se ha propuesto recientemente la importancia del
hierro en el estrés oxidativo que ocurre en la cirrosis hepática.1 Ambas nuevas
propuestas en el tratamiento actual de la patología hepática crónica, puesto que a
nivel mundial se encuentran en sus primeros pasos y en nuestra región no existe
indicio de su utilización o comprobación en el avance de dichas patologías; se
vuelve importante tanto para el conocimiento científico mundial y regional el
desarrollo de un modelo que contribuya al posterior desarrollo de nuevas terapias
adyuvantes al tratamiento actual de una de las morbimortalidades mas
importantes de nuestra era.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Determinar el efecto hepatoprotector del ácido etilendiaminotetracético y el
selenato de sodio en un modelo de daño hepático crónico en ratones.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Estandarizar un modelo de daño hepático crónico en ratones mediante el
uso Tioacetamida (TAA).
• Determinar efecto hepatoprotector del SeNa como agente antioxidante en el
modelo experimental.
• Determinar el efecto hepatoprotector del agente del EDTA como agente
quelante de iones bivalentes en el modelo experimental.
• Determinar el efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa como terapia
combinada en el modelo experimental.
• Evaluar el daño hepático histopatológica y bioquímicamente en muestras
biológicas del modelo experimental.
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MARCO TEÒRICO
El consumo de alcohol, hepatitis viral y la esteato hepatitis alcohólica son las tres
principales causas de hepatopatía crónica llevando a fibrosis hepática, cirrosis y
cáncer hepático.
A nivel nacional las patologías hepáticas han demostrado un considerable
incremento desde la década pasada ya que analizando datos a partir de 1997 en
cuanto a la mortalidad general en el país, dichas patologías representaron el
décimo lugar con 142 defunciones de un total de 7,327; un año después en 1998
se encontraron en octavo lugar con 308 de un total de 6,953 defunciones. Aún, a
principios de esta década se colocan en noveno lugar del total de defunciones
anuales con un porcentaje de entre 4.03% -- 4.12%. De tal manera que los datos
obtenidos por el ministerio de salud nacional en los años 2006—2007; las
patologías hepáticas han verificado un ascenso hasta ubicarse en el tercer lugar
con un 8 a 9% del total, solo rebasadas por patologías traumáticas y aquellas
relacionadas con el VIH. Y tomando en cuenta los últimos datos de 2008 se ubican
en cuarto lugar solo superado por VIH, traumas e insuficiencia renal;
representando un no despreciable 8.7% del total. 5
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13
FISIOLOGÍA HEPÁTICA
Dentro del Hígado existen células parenquimatosas hepáticas que constituyen de
70 a 80% y el 20 a 30% restante son células no parenquimatosas.
Los hepatocitos son células parenquimatosas que se encuentran en la mayor
parte de la masa hepática, y tienen una conformación radial alrededor de las
venas centrales. 9
El hígado es un órgano muy versátil, cuyas funciones principales incluyen:
Metabolismo de carbohidratos: manteniendo la homeostasis de glucosa según las
necesidades, mediante el almacenamiento, síntesis y/o liberación de esta.
Metabolismo graso: realizando oxidación de ácidos grasos, síntesis de colesterol,
triglicéridos, fosfolípidos y lipoproteínas.
Metabolismo proteico: llevando acabo reacciones de transaminación y
desaminación tanto para la síntesis de aminoácidos como para la degradación de
estos. Las reacciones de transaminación están catalizadas por transaminasas
localizadas en el citoplasma del hepatocito: glutamato-oxalacetato tranasminasa
(TGO) y glutamato-piruvato transaminasa (TGP). Las cuales son abundantes en el
corazón y en el hígado, se liberan por las células durante la lesión celular que se
produce en el infarto de miocardio, hepatitis infecciosa u otras lesiones de órgano.
Las determinaciones de estas actividades enzimáticas en suero sanguíneo
pueden utilizarse para el diagnóstico y seguimiento de la evolución de un paciente
durante el tratamiento. Así mismo, en la degradación de aminoácidos es
importante la conversión de amonio a urea para su eliminación.10,11
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14
Depósito: el almacenamiento de glucógeno, minerales entre ellos hierro para la
producción de sustancias de coagulación de la sangre y vitaminas liposolubles.
Síntesis de bilis: para la excreción de bilirrubina, colesterol, electrolitos y secreción
de sales biliares. La fosfatasa alcalina, es una enzima localizada en la membrana
celular de canalículos biliares. Niveles séricos muy elevados indican enfermedad
del sistema biliar.
Detoxificación de metabolitos, hormonas y fármacos: mediante reacciones de
modificación o inactivación de sustancias y reacciones de conversión de
liposolubilidad a hidrosolubilidad para su eliminación.12, 11
Los hepatocitos están delimitados por células endoteliales que conforman los
sinusoides, que presentan fenestraciones la cual es una característica
indispensable para mantener el hígado en óptimo estado. El espacio de Disse se
encuentra entre los cordones de hepatocitos y las células sinusoidales.9
En el espacio de Disse, existe una mezcla organizada de proteínas denominada
matriz extracelular (MEC) está en contacto directo con la lámina basal.
Constituyendo aproximadamente 0.5% del peso total del hígado, es el sostén para
las células parenquimatosas y, funciona como refuerzo de la arquitectura del
órgano. Gracias a su disposición no fibrilar hace posible el intercambio de
moléculas, que funciona como un flujo semi continuo fundamental para el
mantenimiento de las funciones hepáticas. Dentro del espacio de Disse, e
incluidas en la MEC, se encuentran las células estearato hepáticas (HSC, por sus
siglas en inglés), también conocidas como células de Ito, representan 15% de la
celularidad total. En estado normal almacenan ésteres de retinol (vitamina A).9
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La MEC representa el principal sostén de las células hepáticas y permite diversas
funciones. Para asegurar una función satisfactoria, es indispensable un equilibrio
constante entre la síntesis y degradación de dichas proteínas. Esta actividad es
realizada por unas enzimas llamadas metaloproteinasas (MMPs), que tienen la
capacidad de degradar cada uno de los componentes de la MEC.9
Varios factores como toxinas, virus, estrés oxidativo, necrosis, apoptosis y factores
de crecimiento dañan los hepatocitos sus componentes de membrana, producen
metabolitos tóxicos y células inflamatorias que activan las células Kupffer, y
posteriormente estas células Kupffer activadas liberan citoquinas importantes que
activan células HSC en reposo, las cuales tienen un papel importante en la
patogénesis de la cirrosis hepática.
CIRROSIS HEPÁTICA
En la cirrosis hepática13, el colágeno tipo I y III se depositan en los lobulillos
hepáticos creando septos irregulares que pueden llegar a ser muy gruesos y que
seccionan y circundan porciones del lobulillo hepático (nódulos de regeneración).
Esto provoca el reclutamiento de células inflamatorias. Durante la fibrosis hepática
la mayor parte del colágeno depositada es producto de las células HSC. Estas
células sufren un cambio radical llamado activación. Algunos de estos cambios
son que adquieren fenotipo miofibroblástico, proliferan y se convierten en fuertes
productoras de colágeno, TIMP-1 (inhibidor tisular de metaloproteinasas), TIMP-2
y TGF-β (factor de crecimiento transformante-β). 9
La transformación de las células HSC quiescentes hacia células tipo
miofibroblastos, que poseen una capacidad incrementada de síntesis de colágeno,
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con la expresión de proteína del citoesqueleto α actina de músculo liso, inicia el
proceso crónico de fibrosis hepática, que lleva al estadio fatal de cirrosis hepática.
La expresión de la α actina es característica de las células HSC activadas, por lo
que es considerado un marcador de exacerbación de la fibrosis hepática.14 Son
precisamente las células hepáticas de estearato la principal fuente de colágeno
tipo I en la fibrosis hepática, produciendo también metaloproteinasas de la matriz
que remodelan estas proteínas. 15,16
ETAPAS DE LA ACTIVACIÓN DE HSC
En la primera etapa de activación de la HSC17, conocida como iniciación se
produce una respuesta programada, en donde la célula se encuentra en un estado
pre-inflamatorio, aquí son predominantes los cambios en la expresión génica.9,18
Luego continúa con la fase de perpetuación en la cual se amplifica el fenotipo
activado, y la expresión de citoquinas. La capacidad de respuesta ante las
citoquinas se aumenta de manera autocrina y paracrina; también se acelera la
producción de MEC. La citoquina mitogénica (factor de crecimiento derivado de
plaquetas PDGF) es el estimulo que dirige la producción de la MEC.
En la fibrogénesis se caracteriza por la expresión descontrolada de proteínas de
MEC a cargo de TGF-β; también se secretan diferentes tipos de MMPs
(metaloproteasas), TIMP-1 y TIMP2, lo que conduce a recambio de tipos
moleculares de colágeno.
Las HCS se tornan contráctiles con el fin de aumentar la resistencia portal, esto
impide el flujo sanguíneo portal y causa una contracción hepática en general,
también se libera Endotelina-1 (ET-1) que contribuye a este fenómeno. Otros
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fenómenos observados son la liberación del factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF), quimiotaxis y apoptosis, fenómenos que se atribuyen principalmente al
proceso de regeneración hepática y mecanismos de remoción de células HSC
activadas.9
Es por esto que la cirrosis se define por sus hallazgos histológicos, nódulos de
hepatocitos en regeneración y la deposición anormal de tejido conectivo dentro y
alrededor de los nódulos (fibrosis). En algunas ocasiones aunque el daño que
causo la fibrosis ceda o desaparezca, la fibrosis puede ser irreversible. Si las
fenestraciones sinusoidales son obliteradas esto causa una obstrucción del
espacio Disse, y el reemplazo de los canales vasculares, por lo que se aumenta la
resistencia al flujo sanguíneo. La elevación de presión resultante causa un "Shunt"
del flujo portal alrededor del hígado, lo que causa hipertensión portal. Además la
fibrosis previene el intercambio de nutrientes y metabolitos.
Otros estudios indican que la mitocondria también se ve afectada y vulnerable al
daño inducido por las especies reactivas de oxígeno, y los productos de la
peroxidación lipídica; sin embargo, estudios sobre disfunción mitocondrial en
hepatocitos de ratones han concluido que proteger este daño mitocondrial puede
retrasar los estadíos tempranos de la fibrogénesis, pero dicha protección
eventualmente sucumbe cuando las especies reactivas de oxígeno se siguen
produciendo en lugares extramitocondriales y continúan activando las HSC. 19
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18
Se han encontrado niveles elevados de citoquinas proinflamatorias involucradas
en el proceso de fibrosis hepática tales como el factor de necrosis tumoral alfa
(TNFα), dichas elevaciones ocurren en fallas hepáticas fulminantes, hepatitis viral,
abuso de alcohol, enfermedades metabólicas, autoinmunes y obstrucción biliar así
como hepatotoxicidad inducida químicamente, de tal forma que incluso se llega a
correlacionar la elevación en TNFα con la severidad de cirrosis alcohólica. Así
mismo, en algunas otras condiciones hepáticas fisiopatológicas, tales como
isquemia/perfusión; el influjo masivo y sostenido de neutrófilos, que es
influenciado por TNFα, juega un papel central en asegurar la injuria hepática
mediante la liberación de especies reactivas de oxígeno o RLO y proteasas.20 De
tal manera, que el TNFα es un mediador endógeno principal de la hepatotoxicidad
mediante la citotoxicidad directa, producción de óxido nítrico y el
desencadenamiento de una cascada inflamatoria, como se ha establecido por
diferentes experimentos de injuria hepática.
De tal forma que la respuesta fibrogénica, es una cascada dinámica que se inicia
con el daño del hepatocito seguida por activación de células inflamatorias por
metabolitos tóxicos, activación y proliferación de células HSC, y la liberación de
mediadores fibrogénicos. Este resultado provoca un incremento de la matriz
extracelular y acumulación de colágeno. Mientras que la fibrosis hepática es
reversible, la cirrosis, etapa final de la fibrosis, generalmente no lo es y es la
tercera causa más común de muerte en poblaciones urbanas de entre 25—64
años. 20
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AGENTES ASOCIADOS A DAÑO HEPÁTICO
La disponibilidad de modelos animales es crucial para el estudio de la fibrosis
hepática; por ello existen diversos modelos según su etiología: tóxicos,
nutricionales, inmunológicos, colestáticos, alcohólicos, genéticos metabólicos y
transgénicos; utilizados en variedad de especies como ratas, ratones, conejos,
perros y monos. Todos los anteriores presentan ventajas e inconvenientes de
diversa índole adecuados según el objetivo a investigar, así tenemos agentes
hepatotóxicos comúnmente utilizados para inducir fibrosis y cirrosis hepática como
el Tetracloruro de carbono (CCl4), dimetilnitrosamina (DMNS), Tioacetamida
(TAA), y D-galactosamina (GalN). De los anteriores el más ampliamente utilizado
es el CCL4, que produce significativa inflamación, necrosis y depósitos de tejido
conectivo fibrótico en hígado con daño mínimo a otros órganos, en diversos
modelos de roedores; asemejando la fibrosis y cirrosis hepática humana en
aspectos morfológico y fisiopatológico; sin embargo, su utilización representa alta
toxicidad pulmonar por lo que en países como el nuestro no se habilita su
importación. Por otro lado la DMNS y la TAA son agentes carcinogénicos
hepáticos comunes, utilizados para la inducción de cirrosis hepática y más
recientemente la TAA ha sido utilizado ampliamente para la inducción de fibrosis
en ratas y el estudio del papel de especies reactivas de oxigeno, y la acción
protectora de antioxidantes en hepatopatías crónicas, como se explicará más
adelante. Además, la TAA, desde 1995, ha demostrado ser un modelo
experimental conveniente que origina una patología comparable a aquella que
ocurre en humanos en la inducción de cirrosis. También, el Acetaminofén produce
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daño hepático al inhibir la cadena respiratoria mitocondrial e inducir estrés
oxidativo; sin embargo, ha producido amplias diferencias en los resultados según
su dosis. El GalN induce daño hepático similar a la hepatitis viral humana que
guarda cierta similitud con los cambios morfológicos en la hepatopatía biliar
crónica. Estos modelos con hepatotoxinas presentan diversos inconvenientes
entre ellos, el ajuste de dosis y las variables susceptibilidades tanto
interespecíficas como etáreas. 21,22,23
Así mismo, la fibrosis hepática inducida por otros métodos nutricionales con dietas
de alto contenido graso y baja proteínas produce fibrosis nutricional o cirrosis en
ratas; requiriendo una duración prolongada y dietas específicas fabricadas en
laboratorios fuera de nuestras fronteras. Inmunológicamente se ha logrado
producir fibrosis con infecciones en ratones por Schistosoma mansoni, mediante la
respuesta inflamatoria al parásito. Así como infecciones con Helicobacter pylori se
han asociado a pacientes con hepatopatías crónicas incluyendo cirrosis,
detectando fragmentos de antígeno positivos en el hígado de estos pacientes; y en
modelos animales, han causado cambios degenerativos funcionales y
morfológicos en hepatocitos.14,21
También se describe la inducción por alcohol de cirrosis y fibrosis hepática
especialmente en roedores, que sin embargo, presenta un problema en la
estabilización del modelo debido al control de ingesta de etanol, pues solo unos
cuantos reportes han establecido el entrenamiento, implantación y mantenimiento
técnico requerido de catéteres gástricos, en décadas. Recientemente, avances en
la biología molecular en laboratorios sofisticadamente avanzados, han permitido
modelos transgénicos que expresan genes específicos para el desarrollo de
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hepatitis crónica, Por último, quirúrgicamente mediante la ligación del conducto
biliar común se ha producido fibrosis o cirrosis hepática colestática en ratas,
conejos, perros y monos; presentando así mismo, problemas técnicos de
reversibilidad y diferencias en las respuestas que varían según la especie.21
El metabolismo de agentes hepatotóxicos en humanos y varias especies de
animales no es exactamente el mismo; por tanto, no hay modelo animal de fibrosis
o cirrosis hepática que pueda replicar precisamente la enfermedad en humanos;
pero sirven para enriquecer nuestro entendimiento de los mecanismos
patogénicos de la fibrosis hepática, ayudando en los ensayos preliminares de
novedosas medidas terapéuticas con resultados prometedores.21
TIOACETAMIDA
La TAA es un potente hepatotóxico centrilobular ampliamente utilizado como
componente de modelos para inducir enfermedad hepática aguda y crónica; la
TAA sufre su bioactivación en dos pasos por la enzima CYP2E1 microsomal hacia
TAA sulfóxido (TASO) y posteriormente a TA-S,S-dióxido (TASO2) un metabolito
reactivo que inicia la necrosis celular, por unión covalente a macromoléculas
hepáticas. La CYP2E1 parece catalizar al menos el 75% de la conversión de TAA
a TASO; por lo que es la principal enzima que media la bioactivación, siendo
también una enzima toxicológicamente significativa con alta relevancia en el
humano pues bioactiva muchos fármacos, solventes industriales y carcinógenos.
Numerosos investigadores utilizan TAA para estudiar mecanismos de necrosis
hepática debido a su vida media relativamente corta y a una ventana de tiempo
amplia entre su efecto necrogénico y la falla hepática. Así, las vidas medias de
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TAA y TASO son de 1 a 1.5h y 1.5 a 2h respectivamente, después de una dosis
única de 200mg/kg de TAA. 24
La ventaja de utilizar TAA como modelo hepatotóxico incluye su alta especificidad
por el hígado como órgano blanco, excepto a dosis excesivas, pues a estas dosis
puede también causar daño renal transitorio. Basados en experimentos con TAA,
los niveles plasmáticos alcanzan su pico alrededor de 60-90min para una dosis de
50mg/kg, mientras que la concentración máxima se alcanza a 180min para dosis
de 300-600mg/kg. Las evidencias experimentales demuestran que la bioactivación
de la TAA es saturable a dosis altas, ya que el metabolismo de TAA hacia TASO
se satura, en contraste con su metabolismo a concentraciones menores; por tanto
TAA exhibe un metabolismo dosis-dependiente, por lo que dicha saturación es
responsable de la falta de respuesta del daño hepático ante dosis mayores de
TAA. 24
Adicionalmente se ha demostrado que la utilización de la TAA en modelos
animales para la inducción de daño hepático causa una reducción de selenio en el
hígado y en el plasma de estos. 25
Durante la biotransformación de la TAA, tanto la monooxigenasa de flavina (FMO),
como la citocromo P450 oxidasa, reducen la TAA-S-oxido a TAA-S-dióxido, que
posteriormente se cataliza para formar peróxido de hidrogeno. Es así que el estrés
oxidativo está profundamente involucrado en el daño hepático inducido por la
TAA;25 evidenciándose por la cuantificación de Malondialdehído (MDA) el cual es
un buen indicador de la peroxidación lipídica, pues es proporcional a la oxidación
de los ácidos grasos poliinsaturados a partir de los radicales libres de oxigeno.26
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
23
En el estudio conducido por Zhang et al. Las actividades de las selenoenzimas
Tioredoxina Reductasa (TrxR), Glutatión peroxidasa (GPx) fueron medidas
después de 24 a 72 horas de la aplicación de TAA; demostrando un incremento en
la actividad de TrxR y una disminución de la actividad de GPx en una significativa
correlación negativa entre la actividad de TrxR y GPx; también fue concomitante
la disminución del contenido hepático de Selenio. Así mismo, tampoco se
encontró ninguna mejoría en la cirrosis o en la actividad de las selenoenzimas,
debido a la suplementación con Selenio ya sea histopatológicamente o en la
actividad sérica de Alanina aminotransferasa (ALT) y Aspartato aminotransferasa
(AST). 25
Sin embargo, a pesar de lo anteriormente expuesto, dichos hallazgos indican que
la administración de TAA impide específicamente la biodisponibilidad de Selenio
en el hígado, y no en la orina; de manera similar a como ocurre en otras
hepatopatías alcohólicas y no alcohólicas. 25, 27 Por ende, esto implica que la
suplementación de Selenio a sujetos con cirrosis y deficiencia nutricional de este,
puede mejorar pero no restaurar completamente la GPx y el Selenio hepáticos.
Además, se ha visto que en ratas sometidas a lesión por quemadura, el Selenio se
incrementa en el riñón pero disminuye en hígado, sugiriendo que el estrés
oxidativo de uno o más tejidos puede llevar al Selenio a redistribuirse en diferentes
tejidos, siendo el riñón un importante tejido para el secuestro de Selenio. 25
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
24
Por tanto, si el Selenio es el eje central causante de la actividad inversa entre la
TrxR y GPx, la suplementación de Selenio debería ser útil para atenuar la
disminución de la actividad de GPx; sin embargo, la administración oral en estos
estudios de selenio no contrarrestó la disminución en la actividad de GPx,
indicándonos que la relación inversa entre las actividades de estas dos enzimas
no se relaciona con el requerimiento de Selenio. 25
Siendo aún, más probable que sea el estrés oxidativo asociado a la toxicidad
hepática y evidenciado por la acumulación del MDA, que cuantifico Zhang et al.; el
que promueva la biosíntesis de TrxR e inhiba la GPx; ya que este mismo estrés
oxidativo suprime la biosíntesis de las selenoproteinas de pequeño peso
molecular. 25
ESTRÉS OXIDATIVO EN HEPATOPATÍAS
Figura 1.- Formación de Radicales libres en la cadena mitocondrial28
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
25
El estrés oxidativo se inicia cuando hay un desbalance entre la actividad
generadora de radicales y la actividad eliminadora de radicales; y por tanto esto
puede incrementar la formación de productos de la oxidación con una disminución
o depleción de mecanismos endógenos de protección antioxidante.27
El estrés oxidativo es un importante factor en el desarrolló y la progresión de
fibrosis hepática. Los radicales libres de oxigeno (RLO) pueden oxidar muchas
proteínas, pero los lípidos representan un blanco mayor. Las moléculas oxidadas
pueden tener efectos negativos en el metabolismo celular. Los ácidos grasos en
las membranas celulares son altamente susceptibles a un ataque por RLO lo cual
genera peróxidos lipídicos. Estos peróxidos pueden continuar su oxidación y
convertirse en aldehídos. Estos últimos estimulan la expresión de genes de
colágeno en los fibroblastos. Ocasionando fibrosis hepática que posteriormente
causa Cirrosis.
Estudios en animales y humanos sugieren que el estrés oxidativo juega un papel
importante en la progresión de las patologías hepáticas29. Así mismo esta relación
ha sido demostrada en modelos animales de hepatopatías agudas y crónicas; y en
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
26
estudios clínicos de humanos con una variedad de desordenes hepáticos
incluyendo hepatitis crónica viral y hepatopatía alcohólica30. Por tanto el estrés
oxidativo es ahora un componente reconocido de la enfermedad hepática
crónica.27
El estrés oxidativo estimula la fibrogénesis;31 las especies reactivas de oxígeno
(ERO) son principalmente generadas por un incremento en la NADPH oxidasa que
produce aniones superóxido (O2•-) a partir del oxígeno (O2).28 El anión superóxido
entonces genera H2O2 radical hidroxilo (OH-).32 Así mismo, otras ERO como el
óxido nítrico (NO), se han detectado en pacientes con cirrosis y otras alteraciones
hepáticas inflamatorias, lo cual sugiere que este contribuye a la progresión de la
cirrosis, puesto que se ha detectado que puede actuar como un agente oxidante
por si mismo ya que da origen a especies oxidante secundarias tales como el
peroxinitrato que puede dañar las células y producir peroxidación lipídica,
induciendo el estrés oxidativo. 33,34
La descomposición lipídica causada por reacciones de peroxidación conlleva a la
generación de reactantes del ácido tiobarbitúrico (TBA) que son el 4-hidroxynoneal
(4HNE) y el malonaldehido (MDA) los cuales son utilizados como marcadores de
la peroxidación lipídica. La peroxidación lipídica afecta la membrana plasmática de
la célula e incrementa la fragilidad membranal de diferentes organelos como los
lisosomas (que guardan el exceso de hierro) la mitocondria y el retículo
endoplásmico, lo que conlleva a una disfunción celular. La peroxidación lipídica de
la membrana mitocondrial (figura 1) puede llevar a un incremento en la
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
27
permeabilidad de la membrana mitocondrial lo que resulta una pérdida de el
gradiente electroquímico y en la liberación de citocromo C. A este fenómeno se le
llama transición de permeabilidad mitocondrial. El daño en la mitocondria genera
más radicales libres que incrementan el daño a la célula y las señales
proapoptóticas35,36. Otra consecuencia de la peroxidación lipídica es el daño al
ADN y a las proteínas.37
Aunque en algunas patologías como la cirrosis biliar primaria, aún no se tiene con
claridad si el estrés oxidativo está involucrado en la iniciación del proceso
patológico; se puede decir con certeza que si es un factor importante en la
progresión de la enfermedad. 27 Así mismo, el estrés oxidativo debido al depósito
de hierro en hepatocitos o células de Kupffer contribuye a la iniciación y
perpetuación de la injuria hepática; esto ha sido demostrado en estudios con
fibrosis hepática inducida por TAA en los que una dieta deficiente en hierro o la
utilización de deferoxamina como agente quelante de hierro, han suprimido el
depósito de colágeno y atenuado el proceso de activación de células HSC,
mayores productoras de colágeno en el hígado. En la actualidad se conoce que
los iones de metales libres son importantes en la producción de radicales libres.
Por lo que la depleción de hierro dificulta los procesos de estrés oxidativo,
inflamación y activación de HSC, resultando en una inhibición de la fibrosis
hepática. 1
Minerales como Selenio y Cobre sirven como co-factores en procesos enzimáticos
de eliminación de radicales libres, por lo que su deficiencia puede causar una
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
28
disminución notable en la actividad enzimática y un incremento en concentración
de ERO.
Disminución de los niveles de cobre causa una disminución en la actividad de la
ceruloplasmina, catalasa hepática, y glutatión peroxidasa. Compuestos
antioxidantes conteniendo magnesio y cobre han demostrado resultados
prometedores relacionados con la reducción de anormalidades serológicas y
disminución de daño hepático histológico.
El exceso de cobre puede resultar en estrés oxidativo en consecuencia de su
habilidad de catalizar reacciones entres aniones superoxido y peroxido de
hidrógeno produciendo radicales libres hidroxilo, por lo que su homeostasis es de
suma importancia. 38, 39
Figura 2.- Transporte hepático de hierro. 40
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
29
HIERRO
La mayoría del hierro corporal es contenido en eritrocitos como componente de
hemoglobina y circula por el cuerpo permitiendo procesos biológicos. El hierro en
la forma de ferritina y hemosiderina constituye solamente el 23% del hierro
corporal.41 La mayoría del resto del hierro se almacena en el bazo e hígado como
componente de enzimas como citocromo P450.
El hierro es un elemento esencial para la vida, Sin embargo las formas libres de
hierro son prácticamente insolubles y potencialmente toxicas. Por lo que el hierro
se encuentra asociado a ligandos específicos que permiten a los organismos
utilizar las propiedades del hierro sin causar daño. La mayoría del hierro
hepatocelular está contenido en la ferritina (80%) con un 2-3% presente como
grupo hemo. El resto está unido a transferrina o presente en las reservas.
Histológicamente el hierro esta distribuido alrededor de las regiones periportales
del hígado con un gradiente que disminuye en las regiones centrolobulares. 40
El mediador para el ingreso de transferrina el receptor TFR1 (figura 2) el cual
regula la entrada de transferrina al hepatocito. La expresión de TFR1 se encuentra
regulada principalmente por un mecanismo post transcripcional que es sensible a
los niveles de hierro, niveles de oxigeno y a la demanda celular de hierro en los
periodos de crecimiento. Existe también otro sitio receptor de transferrina de
menor afinidad TFR2 el cual también interviene de manera significativa en la
incorporación de hierro al hepatocito. TFR2 es un censor de la saturación de
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
30
transferrina y controla el metabolismo de hierro regulando la expresión de
hepcidina.
La proteína de hemocromatosis (HFE) está asociada al TFR1 posiblemente
limitando la cantidad de hierro liberada por la transferrina. Después de su
endocitosis y la acidificación vesicular el hierro es reducido a su forma ferrosa
antes de ser trasferido a través de la membrana endosomal.
El gen STEAP3 genera una hemoproteína que incrementa la actividad de la
ferrireductasa (proteína encargada de la reducción a hierro ferroso). La forma
ferrosa del hierro es transportada desde el interior del endosoma hacia el citosol
por una proteína llamada DMT1 (una glicoproteína transmembranal).
El hierro puede ser ingresado a la célula hepática sin necesidad de la transferrina
mediante el proceso que se conoce como Ingreso de hierro no asociado a
Transferrina o NTBI (por sus siglas en ingles). NTBI esta disminuido en presencia
de al algunos minerales como Cadmio, Cobre, magnesio y Zinc. Esto se debe a la
mayor afinidad que posee DMT1 por estos minerales, lo que confirma que DMT1
esta altamente implicado en NTBI. Existe otro transportador para NTBI el cual es
el ZIP14 al cual originalmente se le atribuyo el trasporte de zinc hacia el hepatocito
pero se ha evidenciado que puede mediar transporte de NTBI. Otros complejos
transportadores de hierro hacia el interior de la célula comprenden el transporte de
ferritina y lactoferrina mediante receptores específicos.
La ferroportina (FPN) es el mediador para la liberación de hierro del hepatocito.
Hepcidina es un péptido el cual es producido en los hepatocitos en condiciones de
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
31
suficiencia de hierro. Su expresión es regulado por la inflamación y la hipoxia y los
niveles he hierro. Es un punto focal en la vía reguladora del hierro involucrando
HFE, TFR2 y HJV. La expresión de hepcidina es incrementada por citoquinas
como IL-6.
Haemojuvelina (HJV) es una proteína que tiene un rol muy importante en la
homeostasis hepática del hierro. Se expresa en músculo esquelético adulto, y en
tejido hepático adulto y fetal en los hepatocitos periportales. La ausencia de la HJV
resulta en niveles aumentados en plasma de transferrina saturada y ferritina en
humanos. La función primordial de HJV es la regulación de los niveles de
hepcidina. La HJV puede aumentar la trascripción de hepcidina mediante vías
alternas e independientes de HFE, TFR2 e IL6.
Las células de Kupffer son los macrófagos residentes del hígado su rol principal en
el metabolismo hierro hepático es la de guardar depósitos de hierro en forma de
ferritina. Las células de Kupffer también expresan FPN. Después de la
eritrofagocitosis por el hepatocito, se da un incremento en la expresión de FPN lo
que resulta en mayor excreción de hierro por parte del hepatocito. Las células de
Kupffer tienen la capacidad de expresar TFR1 indicando que puede obtener hierro
de transferrina si lo necesitan. Interesantemente las células de Kupffer también
expresan niveles altos de HFE.40,42
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
32
Hemocromatosis
Hemocromatosis
Expresión Génica
Injuria Celular
Mutación DNA
Daño Proteico
Peroxidación Lipidica
Figura 3.- Interacción Celular del Hierro y reacciones Fenton.37
El aumento de los niveles de hierro resulta en la formación de oxigeno reactivo
(figura 3). Esto conlleva a la oxidación de los lípidos de membrana en la
mitocondria, microsomas, y lisosomas; la peroxidación lipídica resultante conlleva
a daño celular causando problemas funcionales con estructuras celulares. Por lo
que un aumento en el hierro incrementa la peroxidación lipídica causando daño
celular irreversible. Esto activa las células de Kupffer que producen RLO y
citoquinas fibrogénicas, 43 contribuyendo a la iniciación y perpetuación del daño
hepático. 37
Se ha demostrado una acumulación inusual de hierro frecuentemente en algunas
hepatopatías44, incluyendo hepatitis viral, daño hepático alcohólico y esteato
hepatitis no alcohólica (EHNA). El hierro libre induce la producción de mediadores
fibrogénicos y proinflamatorios como factor de crecimiento Beta (TGF-ß) y el factor
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
33
nuclear kß (NF-kß). La fagocitosis por macrófagos hepáticos resulta en depósito
de hierro de la hemoglobina en el hígado y contribuye a la patogénesis de la
EHNA. Por tanto se ha determinado que la sobrecarga de hierro puede estar
asociada con hepatitis, cirrosis o cáncer hepático. 1
En un experimento con ratas con hepatopatía crónica inducida por TAA,
administrándoles una dieta corriente (DC) vs. una dieta deficiente en hierro (DDH),
significativamente redujo el hierro en hígado y suero en aquellos con dieta
deficiente de este metal, obteniendo una disminución de la mortalidad hasta de un
87%. Así mismo, los productos oxidativos, y la lipoproteína peroxidasa (LPO)
fueron claramente disminuidos en el hígado del grupo con DDH, indicando un
claro papel del hierro en el estrés oxidativo; y a nivel macroscópico se demostró
una superficie nodular en el hígado de ratas con DC y una superficie lisa casi
intacta en aquellas con DDH. 1
La regulación aumentada o disminuida en la producción de hepcidina por
hepatocitos bajo condiciones patológicas regula la absorción de hierro desde el
intestino delgado. Sin embargo, no se han descubierto medicamentos que regulen
la producción de esta enzima; por lo que actualmente la flebotomía es una terapia
relativamente segura y conveniente para deprivar el hierro del cuerpo aprox. 50mg
de hierro/100ml. A pesar de esto para mantener niveles bajos de hierro se
requieren flebotomías repetidas siendo una alternativa inconveniente por lo que
procesos alternativos como la terapia quelante de hierro y/o dieta deficiente de
este metal representan una nueva alternativa para reemplazar dichos procesos. 1
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
34
Figura 4.- Reacciones de Oxido – Reducción. 45
Como se ha explicado anteriormente es clara la inducción del hierro sobre el
proceso del estrés oxidativo impulsado por radicales libres de oxígeno como H2O2,
cuya explicación aceptada actualmente es la vía de las fentonas(figura 4)46,47: Fe2+
+ H2O2 Fe3+ + HO + HO-- la cual genera hidroxiradicales (OH) una molécula
fuertemente reactiva. Por lo tanto el control de la homeostasis del hierro hepático
puede ser una estrategia terapéutica en hepatopatía crónica. 1
ORIENTACIONES TERAPÉUTICAS
Actualmente la única terapia efectiva para tratar la fibrosis hepática es eliminar el
agente causal Ej.: terapia antiviral exitosa en pacientes con hepatitis C crónica. Se
encuentran en desarrollo terapias antifibrogénicas para aquellos pacientes en los
cuales la causa subyacente no puede ser eliminada como la utilización de agentes
antiinflamatorios que eliminan los estímulos encargados de activar las células
HSC. Se ha experimentado con el uso de algunos fármacos con actividad
antifibrótica indirecta, porque reducen la acumulación de células que favorecen la
fibrogénesis. También se han utilizado diferentes estrategias antioxidantes (como
Reacción Fenton
Reacción Habber - Weiss
Peroxidación LDL
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
35
el tocoferol o vitamina E), IFN-γ y HGF para inhibir la transformación fenotípica de
las HSC en miofibroblastos. Y aunque muchos resultados iniciales se ven
prometedores actualmente no existen terapias antifibróticas efectivas. Durante los
años recientes, se han estado llevando investigaciones en mecanismos
moleculares y celulares involucrados en la fibrosis hepática así como
intervenciones farmacológicas; sin embargo, no existe aún una terapia aprobada
por la FDA (administración de fármacos y comida de los EEUU) para impedir la
progresión de la hepatopatía fibrótica. 9, 48
NUEVAS OPCIONES TERAPÉUTICAS EN ESTUDIO
ANTIOXIDANTES
Los componentes antioxidantes individuales incluyen las vitaminas A, C y E, y el
Selenio, un co-factor esencial de la GPx. El glutatión es un componente principal
del sistema antioxidante contra ERO y se sintetiza y afluye a partir de este. El
hígado es la principal fuente de glutatión en plasma. Algunos estudios sugieren
que el metabolismo del glutatión solo se ve alterado en un estado avanzado de los
desordenes hepáticos; sin embargo estudios recientes realizados en pacientes
con cirrosis biliar primaria demostraron que el estrés oxidativo no solo es un
componente de las etapas tardías o avanzadas de la enfermedad hepática sino
también un componente importante de la cirrosis biliar temprana. 27
Vitaglione et al, sugirió que los antioxidantes naturales ingeridos en mezclas
complejas con la dieta son más eficaces que los compuesto puros en prevenir el
estrés oxidativo relacionado a patologías. 49
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
36
SELENIO
La función reductora del selenio en las proteínas como selenocisteina es
importante para la reducción de lípidos oxidados. La deficiencia de selenio se ha
relacionado a infecciones virales, inflamación, enfermedad cardiovascular50 y
cáncer51. En estudios multicéntricos52 bajas concentraciones de selenio han sido
inversamente correlacionadas con infarto al miocardio53.
En la dieta humana el selenio es encontrado predominantemente en la forma de
selenato, selenocisteina y selenometionina. Selenita y selenato son considerados
fuentes mayores de selenio en proteínas que requieren selenio para funciones
catalíticas, mientras que la selenometionina parece ser incorporada azarosamente
en las proteínas en vez de metionina. El selenio del plasma esta principalmente
asociado con tres proteínas: selenoproteinas, GPx y albúmina. Selenometionina y
selenocisteina son absorbidos mediante transporte activo compartido con los
aminoácidos correspondientes. El selenato es absorbido en parte mediante un
transportador mediado de sodio compartido con sulfato, mientras que selenita
parece que se introduce a la célula mediante difusión pasiva. El selenito ingerido
es reducido a selenida (selenide) el que puede ser metilado para formar
compuestos menos tóxicos que pueden ser excretados mediante las heces y
orina. La vida media es aproximadamente 1.7 días con una retención aproximada
de 3 días.3 El cuerpo humano parece adaptarse de diferentes maneras a las bajas
concentraciones de selenio. Disminución de su excreción urinaria y redistribución
entre las selenoproteinas. 52
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
37
El selenio como se estableció anteriormente es un co-factor esencial de la GPx, la
cual es responsable de la catálisis en la reducción de hidroperóxidasas en la
presencia del glutatión; catalizando ERO como en la reducción de H2O2 a H2O, por
conversión del glutatión reducido (GSH) a su forma oxidada. 32 Se ha demostrado
que tanto en la hepatopatía alcohólica como la no alcohólica, los niveles de
selenio están reducidos en el hígado y en el suero; mas no en la orina. 27 Así
mismo se ha demostrado que el selenio en plasma disminuye en proporción a la
severidad de la condición cirrótica y una variedad de hepatopatías.54
Las selenoenzimas tales como la TrxR y la GPx, juegan un papel importante en la
homeostasis de reducción-oxidación; de tal manera que la deficiencia de Selenio y
de GPx se ha asociado con niveles elevados de ERO y de peroxidación lipídica,
evidenciada por sus productos tales como el Malondialdehído (MDO). 32 Estos
hallazgos indican que los pacientes con cirrosis probablemente deficientes en
selenio se beneficiarían de un suplemento del mismo. Sin embargo, estudios de
Valimaki et al. Demostraron que un suplemento de Selenio no mejoró la función de
pacientes con cirrosis, sin embargo no reporta la existencia de cambios en la
progresión de la patología. 25
Así como se expuso anteriormente en los cambios en la severidad de
hepatopatías inducidos por selenio, este también ha demostrado que al haber una
disminución en sus niveles concomitantemente se manifiesta una disminución en
la actividad plasmática de GPx. 25
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
38
En estudios con selenio y tetracloruro de carbono como agente hepatotóxico,
demostraron una disminución en la inflamación y en el número de HSC, y un
aumento en su apoptosis; a pesar que el mecanismo exacto por el cual se induce
este efecto se mantiene incierto. Así también, se evidenció una disminución de la
fibrosis hepática, asociada a un incremento en la degradación del colágeno. Así
como una disminución en la cantidad de MDO hepático. 32
QUELANTES DE HIERRO
La quelación es una reacción química que resulta de la unión formada entre un ión
metálico y una molécula orgánica (Ej. Carbón). El complejo resultante, metal unido
a molécula es denominado “quelado” y contiene una o más anillos de átomos en
los cuales el ión metálico esta tan firmemente unido que no puede escapar. El
hierro es un elemento esencial para el organismo, sin embargo puede iniciar o
mantener reacciones inflamatorias e incluso dañar tejidos mediante la formación
de radicales libres; es por ello que se han buscado diferentes maneras de
eliminarlo, entre ellas diversos agentes quelantes.2, 55
La Deferoxamina (C25H48N6O8), un quelante específico de hierro en las células
HSC. En el organismo es capaz de combinarse con el hierro férrico de los
depósitos de ferritina y hemosiderina y en menor grado con la transferrina,
aproximadamente 1 g de deferoxamina se combina con 85mg de hierro férrico. En
modelos de ratas dichas células demostraron partículas lipídicas que contienen
vitamina A, localizadas alrededor de núcleos agrandados y en proceso de
multiplicación, pero al exponerlas a un medio con deferoxamina mantuvieron su
fenotipo quiescente y núcleos pequeños. En particular, estas células en respuesta
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
39
Figura 5.- Configuración de EDTA56
a un ambiente de estrés oxidativo cambian sus características fenotípicas de
almacenaje de vitamina A hacia un fenotipo productor de colágeno contribuyendo
a la formación fibrótica típica de un hígado crónicamente inflamado. 1
Lo anteriormente mencionado se comprueba con los estudios de modelos que
utilizan ratas expuestas a TAA y dietas DDH y DC; puesto que el hierro libre
involucrado en la inducción del estrés oxidativo puede inducir la activación de este
tipo de células, demostrando en ratas con DDH una marcada atenuación del
progreso de la fibrosis hepática y la inhibición de la activación de células HSC. 1
Hasta el momento el tratamiento de elección en diversas patologías que
involucran la quelación de hierro como las talasemias ha sido la deferoxamina
pero involucra algunos inconvenientes entre ellos el elevado costo, ya que uno de
los precios más accesibles encontrado en el mercado es de aprox. $75.73/vial.3
El EDTA es un acido poliaminocarboxílico, es
utilizado ampliamente como disolvente, debido a su
actividad como agente quelante de iones metálicos
como Ca2+, Cu2+ y Fe2+. Posterior a ser quelados los
iones se mantienen en solución pero demuestran
reactividad disminuida.
Debido a que los iones metálicos son extensivamente envueltos por EDTA, sus
propiedades catalíticas son suprimidas a menudo. Debido a que los complejos de
EDTA son aniónicos, tienden a ser altamente hidrosolubles. Por esta razón, el
EDTA es capaz de disolver depósitos de metal oxidados y carbonatos. 56
Por tanto a diferencia de la deferoxamina el EDTA puede quelar iones Fe2+, Zn2+,
Cu2+ y Ca2+.57
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
40
Usualmente EDTA es utilizado para quelar metales tales como plomo en
intoxicaciones, quelante de calcio en el tratamiento de hipercalcemia y
anticoagulante en bancos de sangre, así como para remover el hierro en exceso a
consecuencia de excesivas transfusiones sanguíneas en el tratamiento de
talasemias. Así mismo se ha estipulado que el EDTA actúa como antioxidante
para prevenir el daño producido por radicales libres en las paredes de vasos
sanguíneos. Inclusive en estudios clínicos se ha encontrado un fuerte efecto
antioxidante y protector contra oxidación lipídica del EDTA al aplicarse en
tratamiento quelante. 56
La dosis promedio es 700—3500mg/12h (ajustado al peso corporal, edad y
función renal) añadido a 500 ml de “solución transportadora” (agua estéril) con una
mezcla de vitaminas y minerales, siendo administrado de manera parenteral ya
que solo se absorbe parcialmente en el tracto gastrointestinal. Su vida media es
de 1 hora. Como se ha expuesto el EDTA controla el daño por radicales libres
pues quela las coenzimas catalizadoras metálicas y por tanto inhibe la
peroxidación lipídica sirviendo como antioxidante. 56
Se ha demostrado mediante estudios comparativos que la producción de radicales
libres se ve disminuida con la adición de quelantes de hierro como deferoxamina y
EDTA. Utilizando 5.5-dimetil -1 -pirrolina N - Oxido (DMPO) y su medición con
resonancia electrónica (ESR) se puede saber si los radicales hidroxilo se
aumentan o disminuyen al agregar un compuesto. Mediante este método se
compararon diferentes quelantes incluyendo Deferoxamina y EDTA, concluyendo
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
41
que la deferoxamnia tiene una mayor capacidad inhibitoria comparada con el
EDTA. Sin embargo el EDTA posee aproximadamente un 79% de actividad
supresora de radicales libres comparado con la Deferoxamina. 47
Otro estudio reveló que la deferoxamina posee una habilidad para bloquear la
peroxidación lipídica aun en aquellas reacciones donde interviene el hierro
almacenado en la oxihemoglobina. El EDTA es menos efectivo que la
deferoxamina como un inhibidor de las reacciones de peroxidación en las cuales
interviene la oxihemoglobina, pero si se aumenta la concentración puede causar
una inhibición de las reacciones causantes de radicales libres en las cuales se ve
involucrada la oxihemoglobina.58
Los resultados de estos estudios47, 58 demuestran que a pesar que la
deferoxamina como quelante de hierro es más eficaz en la disminución de
producción de radicales libres por la reacción Fenton, el EDTA también ha
demostrado eficacia al disminuir la producción de radicales libres.
Bajo condiciones fisiológicas en las cuales el hierro ha sido quelado totalmente; el
hierro quelado puede ser reducido a complejos que pueden ser incorporados a la
reserva interna de hierro. Y si existe la presencia de un quelante que se una
fuertemente al hierro es poco probable que se produzcan en condiciones
fisiológicas radicales hidroxilo o especies relacionadas.59
Aunque hay estudios que apoyan la teoría que en condiciones fisiológicas puede
existir producción de radicales libres sin intervenir la vía de las fentonas, esta vía
es la principal productora de radicales libres. El uso de quelantes de hierro
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
42
produce una reducción en la cantidad de reacciones de oxidación en las cuales se
ve involucrado el hierro lo que reduce grandemente la producción de radicales
libres que pueden causar peroxidación lipídica.46, 47, 60
MÉTODOS PARA EVALUAR DAÑO HEPÁTICO
Se han desarrollado diferentes sistemas como el score de fibrosis de Knodell61
METAVIR (modificado por Ishak), el score de Scheuer, y el análisis morfométrico
asistido por computadora como FibroScan®.43, 62
Se han utilizado diversos métodos para detectar una gran cantidad de elementos
bioquímicos e histopatológicos que revelen el daño hepático crónico representado
por fibrosis, necrosis e inflamación hepática, entre los cuales tenemos:
El conteo de plaquetas que es una medida conveniente para la evaluación de la
fibrosis. En etapas avanzadas de la enfermedad el conteo de plaquetas disminuye.
Este hallazgo correlaciona moderadamente con el grado histológico de fibrosis,
con un coeficiente de correlación de 0.46 a 0.50.
El péptido procolágeno III también se ha utilizado como marcador de fibrosis
hepática. 62 Otro marcador sérico de fibrosis es la relación aspartato
aminotransferasa/plaquetas el cual es calculado utilizando los niveles de GOT y
conteo de plaquetas. Este score ha sido utilizado hasta el momento en pacientes
con hepatitis viral y no se recomienda para la evaluación de pacientes con
hepatopatías causadas por otras patologías.62
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
43
La detección de alfa actina del músculo liso como hallazgo específico de la
activación de células HSC, mediante tinción inmunofluorescente y la expresión de
genes de procolágeno alfa 1 medidos por PCR de tiempo real, en estudios con
dicha tecnología han indicado un incremento de sus niveles en hígados
característicamente fibróticos.14
Las transaminasas son marcadores indirectos que reflejan alteraciones en la
función hepática. La medición de las transaminasas como enzimas citosólicas:
Aspartato aminotransferasa (AST/TGO) y Alanina aminotransferasa (ALT/TGP); y
de fosfatasa alcalina (ALP) como marcadores convencionales de daño
hepatocelular, han sido determinados en múltiples experimentos con daño
hepático crónico. 1,33 Dichos valores enzimáticos varían según el daño hepático
como se evidencia en la figura 6 63. También existen marcadores directos de
fibrosis que demuestran alteraciones séricas relacionadas a proteínas de la matriz
extracelular.
Se ha determinado también niveles aumentados de Malondialdehido como
producto de peroxidación lipídica, así como de transaminasas y glutatión en
hígados de ratones tratados con TAA y otros hepatotóxicos, indicando su
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
44
correlación con la existencia de estrés oxidativo e injuria hepática. 25
La actividad de enzimas caspasa ha sido detectada por substratos fluorescentes
específicos para medir actividad proteolítica en diversos estudios avanzados en
los cuales los niveles de dichas enzimas se correlacionaban con la apoptosis de
células HSC. 32
Histopatológicamente, los cambios morfológicos asociados con injuria hepática
crónica y hepatotóxicidad se han visualizado con tinción de hematoxilina-eosina,
incluyendo necrosis, inflamación y fibrosis (figura 7-1). Por lo que se han utilizado
diversos métodos semicuantitativos para su detección: La Fibrosis ha sido
determinada en estudios con la siguiente escala: 0, normal; 1, fibrosis portal; 2,
fibrosis periportal; 3, fibrosis septal y 4, cirrosis.
Cirrosis ha sido adjudicada según los criterios a seguir: 0, hígado normal; 1,
colágeno perivenular engrosado y septum de colágeno delgado; 2, septum
delgado con conexiones entre regiones portales; 3, septum delgado y conexiones
extensas; 4, septum engrosado con conexiones completas de regiones portales y
apariencia nodular.
Septos Fibróticos
Nódulos de Regeneración
Ductos Biliares
Figura 7-1.- Comparación microscópica de lobulillo hepático sano y hepatocito fibrótico.58,59
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
45
Y la necrosis fue evaluada, basada en los siguientes criterios: 0, ausente; 1,
mínimo; necrosis puntiforme; 2, necrosis moderada en áreas no confluentes; 3,
necrosis submasiva con áreas confluentes; y 4, necrosis masiva.20,25
Técnicas imagenológicas como elastografia hepática y resonancia magnética se
han utilizado como métodos no invasivos para indagar sobre fibrosis hepática.43
Finalmente macroscópicamente (figura 7-2) se ha detectado disminuciones
significativas en el peso de hígados de ratones sometidos a agentes hepatotóxicos
en comparación con aquellos sometidos a placebos. Así también, la apariencia en
ratones sometidos a hepatotóxinas, demostró superficies nodulares indicativas de
cirrosis en períodos que van de 1 a 3 meses, en comparación con hígados de
superficies lisas en ratones no sometidos a estas injurias. 1
Debido a la variedad de indicadores de daño hepático crónico y la complejidad
tecnológica involucrada en la detección de muchos de ellos, nuestro proyecto se
centrará en aquellos indicadores más utilizados tales como transaminasas,
hallazgos histopatológicos y macroscópicos entre otros. 64
Figura 7-2.- Comparación macroscópica de Hígado sano e Hígado
Normal Cirrótico
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
46
HIPOTESIS DE TRABAJO:
El efecto antioxidante del SeNa y quelante del EDTA proveen una acción
hepatoprotectora en un modelo de daño hepático crónico en ratones.
HIPOTESIS ESTADISTICAS:
H1
La utilización de EDTA como quelante de hierro y Selenato de sodio como
antioxidante disminuye la progresión y gravedad de la hepatopatía crónica de los
ratones en estudio.
H0
La utilización de EDTA como quelante de hierro y de Selenato de Sodio como
antioxidante no disminuye la progresión ni la gravedad de la hepatopatía crónica
de los ratones en estudio.
DELIMITACIÓN DEL TEMA
• No se determinaron los niveles de hierro sérico o en la dieta del modelo
experimental.
• La evaluación del daño hepático se realizó mediante el análisis
macroscópico, microscópico y bioquímico en los diferentes grupos
experimentales.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
47
METODOLOGIA
TIPO DE ESTUDIO • Experimental, Controlado.
POBLACIÓN Y MUESTRA.
Se utilizaron para el estudio ratones heterocigotos derivados de la línea de ratones
albinos suizos adultos mayores de 6 semanas, de sexo femenino, criados en las
instalaciones del laboratorio de la Universidad Dr. José Matías Delgado en un
ambiente de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con una temperatura de
27°C y los cuales mantuvieron una dieta marca Knino y agua ad libitum.
DIETA
A continuación se detallan las diferencias entre los principales componentes según
los análisis garantizados proveídos por los fabricantes entre la dieta de marca
Knino de empresa nacional Tecnutral que ha sido elegida para la alimentación de
la población experimental y la dieta AIN-93G, una de las más utilizadas en
experimentos de laboratorio debido a su aporte nutricional ideal para roedores de
experimentación en crecimiento.65, 66
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
48
Cuadro 2-1
Dieta
Componente
Dieta Knino
Dieta AIN-93G
Proteína minima 18.0% 18.7%
Grasa minima 7.0% 7.0%
Fibra mínima 6.0% 5.0%
DISEÑO EXPERIMENTAL
Estandarización modelo
Para la estandarización del modelo de daño hepático se tomo una n de 10 ratones
divididos en 2 grupos, uno de inducción (grupo TAA) y otro control sano (grupo S)
de 5 ratones cada uno descritos a continuación. (Ver cuadro 3-1)
Cuadro 3-1 GRUPO DESCRIPCIÒN INTERVENCIÒN
Grupo TAA
n=5
Grupo para inducción de fibrosis hepática crónica con TAA
Inyección intraperitoneal de 200mg/Kg. de TAA dos veces por semana
Grupo S
n=5
Grupo control negativo con aplicación de Solución salina
Inyección intraperitoneal de SSN 0.9% dos veces por semana
Experimento
Durante el experimento se utilizó una n de 20 ratones, divididos en 4 grupos, en
los cuales grupo I control de inducción, que es similar a grupo TAA de la
estandarización del modelo y los grupos II, III y IV, como grupos experimentales,
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
49
en los cuales grupo II y III miden individualmente las funciones hepatoprotectoras
de EDTA y SeNa; y grupo IV aplica ambas simultáneamente. (Ver cuadro 3-2)
Cuadro 3-2
GRUPO DESCRIPCION INTERVENCION Grupo I
n=5 Control de fibrosis hepática crónica positivo con TAA
Inyección intraperitoneal de 200mg/Kg. de TAA dos veces por semana
Grupo II n=5
Grupo experimental con SeNa Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + administración trisemanal con cánula Intragástrica de 500ug/kg vo.de SeNa, a partir de 2ª semana.
Grupo III n=5
Grupo experimental con quelante de hierro EDTA
Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + 0.02mg/g intraperitoneal de EDTA bisemanal a partir de 2ª semana.
Grupo IV n=5
Grupo experimental con SeNa mas EDTA
Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + 500ug/kg vo. de SeNa trisemanal a partir de 2a semana + 0.02mg/g intraperitoneal de EDTA (0.01umol/uL) bisemanal a partir de 2ª semana.
A continuación se muestra un cuadro con la vida media de cada componente
utilizado.
Cuadro 3-3 3, 24, 56
Compuesto Horas TAA 1,5
EDTA 1SeNa 40
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
50
CRITERIOS DE INCLUSION
• Ratones adultos mayores de 6 semanas de edad de sexo femenino.
• Ratones sin enfermedades crónico – degenerativas evidentes.
CRITERIOS DE EXCLUSION.
• Ratones a los cuales no se pueda aplicar la totalidad de las dosis de EDTA
y SeNa.
• Ratones que fallezcan previamente a la terminación del experimento por
causas ajenas a la inducción de hepatopatía.
• Ratones que desarrollen alguna alteración degenerativa durante el proceso
experimental.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
51
OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES
Cuadro 4.- Variable Definición Medición
Daño hepático causado por TAA en
un modelo experimental en
ratones.
Injuria hepática causada por la administración aplicación bisemanal de 200mg/Kg. de TAA durante un período
de 6 semanas en un modelo experimental con ratones.
Verificación mediante análisis macroscópico e histopatológico de las lesiones hepáticas causadas por TAA.
Concentraciones de SeNa en la
alimentación de los animales de
experimentación.
Cantidad presente de SeNa en el agua administrada a los animales de
experimentación.
Aplicación de SeNa una vez al día oralmente a dosis de 500ug/Kg
Concentraciones de EDTA administrada intraperitonealmente
a los animales de experimentación.
Cantidad presente de EDTA en la preparación intraperitoneal que se
administra a los animales de experimentación
Se aplicará una solución estéril de EDTA a dosis de 0.02mg/g en inyección
intraperitoneal
Efecto hepatoprotector de la terapia con EDTA.
Disminución en la injuria hepática en animales de experimentación con
terapia con EDTA. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas
(TGO,TGP)
Verificación mediante análisis macroscópico e histopatológico de las lesiones hepáticas causadas por TAA.
Análisis bioquímico de TGO y TGP
Efecto hepatoprotector de la
terapia con SeNa.
Disminución en la injuria hepática en animales de experimentación con
terapia con SeNa. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas
(TGO,TGP)
Verificación mediante análisis macroscópico e histopatológico de las lesiones hepáticas causadas por TAA.
Análisis bioquímico de TGO y TGP
Efecto hepatoprotector de la terapia combinada de
EDTA y SeNa.
Disminución en la injuria hepática en animales de experimentación con
terapia combinada de EDTA y SeNa. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas
(TGO,TGP)
Verificación mediante análisis macroscópico e histopatológico de las lesiones hepáticas causadas por TAA.
Análisis bioquímico de TGO y TGP
Análisis macroscópico de
muestras hepáticas. Análisis microscópico
de muestras hepáticas
Análisis bioquímico de TGO y TGP
Verificación de las lesiones hepáticas a nivel macroscópico y microscopio en las
muestras hepáticas tomadas de los animales de experimentación.
Verificación de los niveles bioquímicos de TGO y TGP
Verificación de la apariencia lisa o de rugosidades en la superficie hepática así como cambios de color en su superficie y posteriormente se enviarán a estudio por
un patólogo Verificación mediante un laboratorio clínico de los niveles de TGO y TGP
Correlación entre los hallazgos
macroscópicos y microscópicos de los
diferentes grupos experimentales.
Comparación entre las diferentes verificaciones de las lesiones hepáticas a nivel macroscópico y microscópico en las muestras tomadas de los animales
de experimentación.
Análisis estadístico, por medio de una prueba U de Man-Whithney, para
experimentos independientes o Kruskall-Walis, para comparación entregrupos
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
52
Correlación entre los hallazgos de los
diferentes niveles de TGO y TGP de los diferentes grupos experimentales.
Comparación entre los diferentes niveles de TGO y TGP de las muestras
sanguíneas tomadas de todos los animales de los diferentes grupos
experimentales.
Definición de los valores encontrados para el grupo de TAA como 0% de protección y comparación con los niveles encontrados
en los otros grupos.
ESTANDARIZACIÓN DE MODELO DE INDUCCIÓN DE DAÑO CRÓNICO
Se utilizó una n de 10 ratones albinos de 200—260g, divididos en dos grupos con
el objetivo de determinar la efectividad de nuestro modelo para la inducción del
daño hepático crónico, por lo que cada grupo constó de una n de 5, aplicando al
primer grupo una dosis de TAA de 200mg/kg intraperitonealmente dos veces por
semana, durante seis semanas: y el segundo grupo de 5 ratones resultó el grupo
control a los que se les aplicó inyecciones intraperitoneales con solución salina
dos veces por semana, durante un período de seis semanas; posterior a lo cual
son sacrificados mediante dislocación cráneo cervical, tomándose muestras
histopatológicas de hígado mediante extracción de este por laparotomía,
estandarizando el tipo de daño hepático producido por TAA.
Figura 8.-
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
53
EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y EL SELENIO.
Durante el experimento con el fin de determinar la mejor terapia que pueda
contribuir con la reducción de fibrosis hepática se utilizaron 4 grupos, con una n de
5 ratones albinos de 200—260g cada uno, de los cuales el grupo I se sometió a
una aplicación bisemanal de 200mg/Kg. de TAA intraperitoneal durante un período
de 6 semanas; el grupo II se le aplicó 200mg/Kg. de TAA intraperitoneal
bisemanalmente por 6 semanas, además de la aplicación oral de SeNa
trisemanalmente a dosis de 500ug/Kg por medio de una cánula intragástrica,
iniciando en la 2ª semana; al grupo III se le aplicó 200mg/Kg. de TAA
intraperitoneal bisemanalmente por 6 semanas y una solución estéril de EDTA a
dosis de 0.02mg/g en inyección intraperitoneal bisemanalmente iniciando en la 2ª
semana; finalmente al grupo IV se aplicaron dosis intraperitoneales
bisemanalmente de 200mg/Kg. de TAA por 6 semanas e inyecciones
intraperitoneales de 0.02mg/g de EDTA bisemanalmente, mas SeNa 500ug/Kg.
tres veces por semana oralmente, ambas a partir de la 2ª semana. Al cabo de 6
semanas los animales se sacrificaron mediante dislocación cráneo cervical,
tomándose muestras histopatológicas de hígado mediante extracción de este y
muestras sanguíneas para procesamiento de enzimas hepáticas, procediendo al
análisis de las muestras.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
54
Figura 9.-
SOLUCIONES
Tioacetamida(Chemimpex) en forma sólida cristalina; para su administración fue
diluida en solución salina al 0.9% a manera de obtener una concentración, para su
inyección intraperitoneal.
SeNa(Twinlab),en forma sólida en cápsulas de gel y con excipientes de celulosa y
almidón en concentración de 250ug por cápsula, por lo que para su administración
fueron diluidas dos cápsulas en 3cc de agua bidestilada, obteniendo dilución del
SeNa en el sobrenadante, de manera suficiente para una aplicación semanal,
repitiéndose dicho proceso tres veces por semana.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
55
DETERMINACIÓN DE LA SOBREVIDA
La sobrevivencia de los animales de experimentación en diferentes estudios, en
los que son sometidos a un daño hepático crónico mediante la utilización de TAA,
con un dosis promedio de 200mg/kg, han demostrado niveles de mortalidad
progresivamente mayores hasta del 40% después de 6 a 8 semanas.67
ANÁLISIS DE MUESTRAS
ANÁLISIS BIOQUÍMICOS
1. Se recolectó sangre de cada uno de los sujetos de estudio mediante una
punción cardíaca, utilizando sedación con éter y se obtuvo
aproximadamente 1 ml de sangre para análisis, posterior a lo cual se
incorporaron las muestras individuales en un conglomerado por cada grupo.
2. Se enviaron las muestras sanguíneas de cada conglomerado grupal a un
laboratorio para determinar los niveles de TGO, TGP y fosfatasa alcalina.
3. Se procedió a sacrificar los animales de estudio utilizando dislocación
cráneo cervical en concordancia con protocolos internacionales de ética
animal.
ANÁLISIS MACROSCÓPICO
Se disecó quirúrgicamente el hígado de los sujetos de estudio, mediante
una incisión de una laparotomía abdominal verificando la apariencia lisa o
de rugosidades en la superficie hepática así como cambios de color en su
superficie.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
56
ANÁLISIS MICROSCÓPICO Se realizó tinción con hematoxilina y eosina para evaluar inflamación porta,
infiltración celular inflamatoria, necrosis centrizonal, displasia de hepatocitos,
degeneración de balón, congestión vascular, cambios grasos y fibrosis.
Las muestras fueron examinadas por un experto patólogo con método doble
ciego, utilizando las siguientes escalas20:
Cuadro 5.-
HALLAZGO HISTOPATOLÓGICO
ESCALA 0 1 2 3 4
FIBROSIS Normal Fibrosis Portal Fibrosis Periportal
Fibrosis Septal
Cirrosis
CIRROSIS Normal Colágeno perivenular engrosado y septum de colágeno delgado
Septum delgado con conexiones entre regiones
portales
Septum delgado y
conexiones extensas
Septum engrosado con conexiones completas de
regiones portales y apariencia nodular
NECROSIS Ausente/ sano
Mínimo, necrosis
puntiforme o inicial
Necrosis leve en áreas no
confluentes
Necrosis submasiva o
moderada con áreas
confluentes
Necrosis masiva o severa
DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA
TURBIA
Ausente/ sano
Daño inicial Daño leve Daño moderado
Daño severo
DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA
VACUOLAR
Ausente/ sano
Daño inicial Daño leve Daño moderado
Daño severo
HIPEREMIA PASIVA CRÓNICA
Ausente Escasa Aumentada
MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS
Los datos obtenidos se almacenaran en una base de datos creada en Microsoft
Excel para Windows XP, y se realizaron los gráficos correspondientes con
GraphPad Pris5.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
57
PLAN DE PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LOS DATOS
El análisis estadístico, se realizará con el programa SPSS v15.0 por medio de una
prueba no paramétrica: U de Man-Whithney, para experimentos independientes y
Kruskall-Walis, para demostrar diferencias entre los grupos.
PRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN.
Tablas comparativas, con los resultados observados según su codificación y
resultados estadísticos, realizados en el programa SPSS versión 15, utilizando
medidas de tendencia central, tablas y gráficos comparativos según necesidad.
Si se encuentran variables que puedan asociarse, se realizará.
CONSIDERACION ETICAS.
El tratamiento que se les dará a los animales de experimentación estará basado
en el acta de bienestar animal (AWA) y en el documento: “Elementos esenciales
para investigación animal, una guía para la investigación personal” del centro de
información del bienestar animal del departamento de agricultura de Estados
Unidos de América, provocando el mínimo dolor posible a los ratones tanto en la
aplicación de los medicamentos como en el método utilizado para su sacrificio
previo a la extracción de sangre para los análisis bioquímicos, y a su autopsia y
extracción del hígado utilizado para el estudio histopatológico posterior.68
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
58
RESULTADOS
ESTANDARIZACIÓN DEL MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO
INDUCIDO POR TIOACETAMIDA EN RATONES
La estandarización se realizó con los grupos detallados en el Cuadro 3-1,
utilizando una n=10, de los cuales en el grupo S se excluyó a un sujeto de
investigación por haberse encontrado sepsis peritoneal al momento de la
disección.
En el Cuadro 6, se observan los resultados obtenidos de la estandarización del
modelo de daño hepático crónico. Según los hallazgos histopatológicos en el
grupo tratado con TAA se obtuvo una degeneración hepatocítica turbia y vacuolar,
así como necrosis multifocal, no encontrándose cambios fibróticos o cirróticos, por
lo que se decidió excluir las escalas de evaluación para dichos cambios. Por su
parte grupo S (SSN) o control negativo, no desarrolló necrosis ni fibrosis alguna,
sin embargo presento leves degeneraciones hepatocíticas turbias.
Cuadro 6.- Hallazgos histopatológicos en grupos de investigación fase de estandarización
Grupo de Investigación
TAA n=5 SSN n=4 DegeneraciónHepatocítica Turbia**
Ausente 0 .0% 0 .0%
Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 4 100.0% Daño moderado 5 100.0% 0 .0% Daño severo 0 .0% 0 .0% DegeneraciónHepatocítica Vacuolar
Ausente 4 80.0% 4 100.0%
Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño moderado 1 20.0% 0 .0% Daño severo 0 .0% 0 .0% Necrosis Ausente 5 100.0% 4 100.0%
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
59
*Diferencia significativa para p<0.05 **Diferencia muy significativa para p<0.01 +Hallazgos comparados utilizando prueba no paramétrica U de Mann-Whitney.
Como se aprecia anteriormente, los resultados obtenidos para degeneración
turbia, necrosis multifocal e hiperemia pasiva crónica presentaron diferencias muy
significativas entre los dos grupos con una p=0.005, p=0.009 y p=0.005
respectivamente. Sin embargo, para la degeneración vacuolar, necrosis focal y
fibrosis, se obtuvo en todos los casos una p≥0.05, siendo aún mayor para fibrosis
y necrosis focal.
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DEL MODELO
El análisis histopatológico no revela fibrosis alguna en ninguno de los grupos de
estandarización del modelo, sin embargo en todas las muestras del grupo TAA se
Focal Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño
moderado 0 .0% 0 .0%
Daño severo 0 .0% 0 .0%
Necrosis Multifocal*
Ausente 0 .0% 4 100.0%
Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño
moderado 3 60.0% 0 .0%
Daño severo 2 40.0% 0 .0%
Fibrosis
normal 5 100.0% 4 100.0% portal 0 .0% 0 .0% periportal 0 .0% 0 .0% septal 0 .0% 0 .0% cirrosis 0 .0% 0 .0%
Hiperemia Pasiva Crónica**
Presente 5 100.0% 0 .0% Ausente 0 .0% 4 100.0%
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
60
destacan cambios histopatológicos crónicos correspondientes a Hiperemia pasiva
crónica y macrófagos necróticos, como se observa en la figura 10.
Figura 10.- Hallazgos histopatológicos Fase 1
EVALUACIÓN DEL EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y DEL SeNa
Esta fase se realizó con una n de 20 ratones distribuidos como lo detalla el cuadro
3-2 con una n final de 19 ya que en el grupo IV (TAA-EDTA+SeNa) se registró el
fallecimiento de un sujeto de experimentación en la cuarta semana, por lo que fue
excluido del estudio.
HALLAZGOS MACROSCÓPICOS
Al comparar los pesos promedio de cada grupo de investigación al inicio y al final
de la fase experimental se encontraron aumentos significativos de peso en los
grupos I, II y III (TAA, TAA + SeNa y TAA + EDTA correspondientemente) y la
única disminución se encontró en el grupo IV (TAA+EDTA+SeNa), como se
observa en la figura 11
HPC, hiperemia pasiva crónica; MC, macrófagos necróticos.
HPC
HPC
MC
MCMC
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
61
Figura 11. Cambios de peso inicial a final.
Durante la disección y extracción del hígado se observó en los grupos I, II y III
superficies hepáticas nodulares pálidas, mientras que en el grupo IV
(TAA+SeNa+EDTA) se observaron superficies hepáticas nodulares brillosas.
ANÁLISIS MICROSCÓPICO
DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA, NECROSIS E HIPEREMIA PASIVA
CRÓNICA
En el grupo TAA+SeNa+EDTA, se encontraron un 25% de sujetos sin daño
hepático, y un 75% con daños iníciales a leves. El grupo TAA + EDTA y TAA +
SeNa evidenciaron resultados con daños de iníciales a leves, sin embargo, no se
obtuvo sujetos en estos grupos en los que no se encontrara daño alguno. En
contraposición a estos grupos el control positivo TAA obtuvo resultados de daño
hepático severo, demostrando necrosis multifocales en todos los sujetos de
investigación, así como hiperemia crónica aumentada.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
62
Figura 12.- Gráficas de reporte histopatológico A) Degeneración Hepatocítica
Turbia B) Degeneración Hepatocítica Vacuolar C) Necrosis Focal D) Necrosis
Multifocal E) Hiperemia Pasiva Crónica
A) B) C) D)
E)
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
63
HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS
Los hallazgos histopatológicos anteriormente mencionados se observan en la
figura 13. Así mismo, en la imagen A se observa cariorrexis, cariolisis y picnosis
correspondientes al grupo I (TAA). Como hallazgo patológico crónico se observa
en las figura 13 macrófagos pigmentados que corresponden a la hiperemia pasiva
crónica (Fig. 13-A), los cuales en las imágenes B, C y D se van haciendo más y
más escasos, así como los demás parámetros histopatológicos que en la imagen
D (grupo IV) se hacen prácticamente inexistentes.
Figura 13.- Hallazgos histopatológicos A) grupo TAA, B) grupo TAA+SeNa, C)
grupo TAA+EDTA, D) grupo TAA+SeNa+EDTA
A) B)
C) D)
VC
S
DV, Degeneración vacuolar, N, necrosis
DV
HPC, Hiperemia pasiva crónica
HPC
TC, Tejido Conectivo
TC
VC, Vena Centrilobulillar; S, sinusoides DH, Degeneración hepatocítica
DH
N
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
64
ANALISIS BIOQUÍMICOS
Para el análisis de Transaminasas y fosfatasa alcalina como parámetros de
función hepática se utilizaron muestras sanguíneas a partir de punción cardíaca,
posterior a lo cual se unificó la muestra por grupo debido al escaso volumen de
suero obtenido en cada uno y se enviaron las muestras para su procesamiento a
un laboratorio particular que se mantuvo doble ciego, obteniendo los resultados
que se evidencian en la figura 14.
Figura 14.-Valores de Transaminasas y Fosfatasa Alcalina según grupo de
experimentación
A)
B)
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
65
C)
Como se aprecia en las gráficas anteriores, los rangos de valores normales para
los sujetos de investigación utilizados se representan con barras lineales.69 Para
los valores de Transaminasa Glutámica Oxaloacética (TGO) el único grupo que
obtuvo resultados dentro del rango normal fue el Grupo IV (TAA+SeNa+EDTA), al
igual que para los valores de Transaminasa Glutámica Pirúvica (TGP).
HEPATOPROTECCIÓN
Cuadro 7.-HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS SEGUN GRUPO DE INVESTIGACIÓN Grupo de Investigación TAA TAA +
SeNa TAA + EDTA
TAA + SeNa + EDTA
P
Degeneración Hepatocítica Turbia*
Ausente .0% .0% .0% 25.0%
Daño inicial .0% 60.0% 60.0% 50.0% Daño leve 40.0% 40.0% 40.0% 25.0% 0.025 Daño
moderado .0% .0% .0% .0%
Daño severo 60.0% .0% .0% .0%
Degeneración Hepatocítica Vacuolar*
Ausente .0% 60.0% 60.0% 75.0%
Daño inicial 40.0% 40.0% 40.0% 25.0% Daño leve 60.0% .0% .0% .0% 0.025 Daño
moderado .0% .0% .0% .0%
Daño severo .0% .0% .0% .0%
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
66
Necrosis Focal
Ausente 100.0% 40.0% 80.0% 100.0%
Daño inicial .0% 60.0% 20.0% .0% Daño leve .0% .0% .0% .0% 0.086 Daño
moderado .0% .0% .0% .0%
Daño severo .0% .0% .0% .0%
Necrosis Multifocal**
Ausente .0% 60.0% 80.0% 50.0%
Daño inicial .0% 40.0% 20.0% 50.0% Daño leve 40.0% .0% .0% .0% 0.006 Daño
moderado 60.0% .0% .0% .0%
Daño severo .0% .0% .0% .0%
Hiperemia Pasiva Crónica*
Ausente .0% .0% .0% 25.0%
Escasa 40.0% 100.0% 100.0% 75.0% 0.03 Aumentada 60.0% .0% .0% .0%
* Diferencia significativa p<0.05 **Diferencia muy significativa p<0.01 +Hallazgos comparados utilizando prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis De los cuatro grupos de investigación podemos observar que en el grupo TAA se
obtuvieron hallazgos histopatológicos congruentes con el modelo estandarizado
en el 100% de los ratones, en el rango de leves a severos, para la degeneración
turbia y vacuolar, y la necrosis multifocal, así como un 40-60% para hiperemia
crónica.
En los grupos TAA+SeNa y TAA+EDTA, obtuvieron resultados similares ya que en
ninguno de los ratones tratados se encontraron daños severos, presentándose
hasta en un 60% daños iniciales a leves en degeneración turbia y vacuolar, así
como necrosis inicial e hiperemia escasa únicamente. Adicionalmente en el grupo
TAA+EDTA más del 80% de sujetos no presentaron necrosis alguna.
En el grupo con terapia combinada TAA+SeNa+EDTA entre el 25 al 75% de los
sujetos no presentaron ninguna degeneración histopatológica y entre el 50—100%
no presentaron necrosis alguna. Solo el 75% de los animales tratados presentó
hiperemia pasiva crónica.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
67
Como podemos observar existen diferencias estadísticamente significativas entre
los grupos de experimentación en cuanto a lesiones de degeneración turbia,
vacuolar, necrosis multifocal e hiperemia pasiva crónica, obteniendo disminución
en la progresión y gravedad de estos hallazgos histopatológicos para los grupos
terapéuticos.
Sin embargo, se aprecia una diferencia no significativa para las lesiones de
necrosis focal, nótese que en todos los grupos de experimentación, el 100% de los
sujetos de investigación se encontraron en valores sanos, normales o con lesiones
iníciales de necrosis focal (cuadro 7).
Para evaluar la intensidad del daño hepático, se estableció un puntaje por grado
de lesión histopatológico en base a las escalas utilizadas de necrosis,
degeneración hepatocítica e hiperemia pasiva crónica, obteniéndose los
resultados promedio en cada grupo, detallados en el cuadro 8.1. Podemos
observar que el grupo con la menor intensidad de daño hepático es el grupo con
doble terapia, siendo este 11.12 veces menor al daño obtenido por el grupo TAA.
Cuadro 8.- Intensidad de la lesión hepática por grupo de experimentación
Grupo de
Investigación N Rango promedio P Intensidad de lesion TAA 5 17.00 TAA + Se 5 9.20 TAA + EDTA 5 7.10 .008
TAA + Se + EDTA 4 5.88 Total 19
Prueba de Kruskal-Wallis Variable de agrupación: GrupInvest
Como se aprecia en el cuadro anterior, al comparar los resultados de la intensidad
de la lesión hepática global de cada grupo, la diferencia entre los grupos resulta
ser estadísticamente significativa con una p<0.05.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
68
El grupo I (TAA) se categorizó como 0% de protección y 100% de Desprotección.
Luego se realizó una correlación con los valores de los otros grupos obteniendo el
siguiente cuadro.
Cuadro 9 – % de protección / % Desprotección Bioquímicos.
Enzimas/ Grupos
% Protección/ % desprotección TAA TAA+SeNa TAA+EDTA TAA+SeNa+EDTA
ASAT (TGO)
% desprotección
100,0% 27,3% 14,6% 9,3%
ALAT(TGP) % desprotección
100,0% 25,0% 12,7% 6,0%
ASAT (TGO)
% Protección 0,0% 72,7% 85,4% 90,7%
ALAT(TGP) % Protección 0,0% 75,0% 87,3% 94,0% De acuerdo a la correlación anteriormente descrita el grupo con terapia combinada
da un porcentaje de desprotección menor y por ende un porcentaje de protección
mayor en comparación con los otros grupos.
Tomando el dato de TAA como 0% de protección y 100% de desprotección
referente a la intensidad de la lesión, la correlación entre los datos obtenidos para
los otros grupos se muestra en el siguiente cuadro.
Cuadro 9.1 % de Protección/ % Desprotección Histopatológica.
INTENSIDAD DE LA LESION / GRUPOS
% Protección/ % desprotección
TAA TAA+ SeNa
TAA+ EDTA
TAA+ SeNa+ EDTA
INTENSIDAD DE LA LESION % Protección 0,0% 45,9% 58,2% 65,3%
INTENSIDAD DE LA LESION % desprotección 100,0% 54,1% 41,8% 34,7%
La correlación muestra que el grupo con terapia combinada posee un % de
protección mayor en comparación con los otros grupos.
Así mismo la correlación entre la histopatología como Gold Standard y los valores
de transaminasas, indican una asociación significativa entre la administración de
SeNa + EDTA y Intensidad de la lesión. Indicando una disminución en la
progresión histopatológica de la injuria hepática.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
69
Aplicando la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para análisis de diferencia
entre dos grupos, podemos observar una diferencia estadísticamente muy
significativa entre la intensidad de lesión de los grupos terapéuticos y el grupo
control positivo (TAA), sin embargo, no se aprecia diferencia significativa entre los
resultados de los grupos terapéuticos.
DISCUSIÓN
Modelo experimental de daño hepático crónico mediante Tioacetamida en
Ratones.
El daño hepático crónico puede ser provocado por diversas causas (alcohol, virus,
medicamentos hepatotóxicos, colestasis entre otras) 6, activando una cascada
dinámica que se inicia con el daño del hepatocito, activación de células
inflamatorias por metabolitos tóxicos, activación y proliferación de HSC.
Produciéndose un estrés oxidativo por desbalance entre la producción y
.007
.008
.012
.007 .381
.241.008
.381 .615.012
.241 .615
(J) grupo experimentalTAA + SeTAA + EDTATAA + Se + EDTATAATAA + EDTATAA + Se + EDTATAATAA + SeTAA + Se + EDTATAATAA + SeTAA + EDTA
(I) grupo experimentalTAA
TAA + Se
TAA + EDTA
TAA + Se + EDTA
Sig.
*.
*. *. *. *.
*.
*.
Cuadro 10.- Análisis de diferencias entre grupos experimentales
La diferencia de medias es significativa al nivel .05.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
70
eliminación de ERO, estimulando la fibrogénesis. Así mismo, el hierro incrementa
la peroxidación lipídica causando daño celular irreversible. Activando células de
Kupffer que producen más ERO, peroxinitratos y citoquinas fibrogénicas,
contribuyendo a la iniciación y perpetuación del daño hepático.33,37,43 Dicho estrés
oxidativo está profundamente involucrado en el daño hepático inducido por la TAA;
que ha sido evidenciado por la cuantificación de MDA como indicador de la
peroxidación lipídica. 25
Las enzimas que catalizan reacciones REDOX (GPx, superóxido dismutasa,
catalasa) son un importante mecanismo de defensa hepático ante la presencia de
ERO, así como mecanismos de homeostasis para evitar exceso de iones
bivalentes. Los metales como: Se, Fe2+ y Cu2+ entre otros, participan como
cofactores de múltiples enzimas para mantener este delicado balance. 38
Durante la estandarización del modelo, el análisis estadístico, indica que para
daño hepático, el grupo experimental presenta diferencias significativas para
lesiones como la degeneración turbia, necrosis multifocal, e hiperemia crónica, en
comparación con el grupo control negativo. Sin embargo, dicho modelo no llega a
producir fibrosis alguna.
Los resultados obtenidos demuestran la reproducción de un modelo experimental
de daño hepático crónico en ratones mediante la utilización de TAA: caracterizado
por inducción de degeneración hepatocítica turbia y vacuolar, así como necrosis
multifocal, e hiperemia pasiva crónica las cuales como se ha descrito
anteriormente indican la activación de la cascada inflamatoria en el parénquima
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
71
hepático. Hecho que usualmente antecede la formación de fibrosis, un reconocido
marcador de cronicidad en la injuria hepática. 15,16, 17
La presencia de degeneraciones hepatocíticas turbias en el grupo S, indica que la
infiltración con SSN intraperitoneal causa un efecto deletéreo mínimo, que
podríamos atribuir a diversos factores como el aumento de volumen
intraperitoneal, el estrés causado a los sujetos, y la técnica de infiltración. La
pérdida de uno de los sujetos debido a sepsis demuestra el cuidado que se debe
tener en cuanto a la manipulación de los sujetos y la adecuada técnica para la
infiltración ya que estos factores son los que mayormente influyen en el desarrollo
de complicaciones pudiendo afectar los resultados de los experimentos .
Evaluación del efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa
Los resultados obtenidos sugieren que al exponer artificialmente el tejido hepático
a una sustancia hepatotóxica como TAA y suministrarle las condiciones antes
descritas, se observa que no es posible evitar por completo una injuria hepática,
sin embargo es posible limitar la progresión de esta.
En el estudio realizado, la terapia con SeNa, evidenció una leve disminución en
necrosis multifocal, ausente en un 60% y una hiperemia pasiva crónica escasa. En
comparación con el grupo TAA con necrosis multifocal presente en el 100% e
hiperemia crónica aumentada; sugiriendo que la administración exógena de SeNa
disminuye pero no detiene el daño causado por TAA.25
En el grupo con terapia de EDTA, se evidenció ausencia de necrosis en el 60% de
los sujetos de estudio y una hiperemia crónica similar al grupo con SeNa.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
72
Una mejor respuesta hepatoprotectora, se obtuvo por parte del grupo con EDTA y
SeNa (65.3%) en comparación con los grupos con monoterapia de EDTA (58.2%)
y SeNa (45.9%) como se observa en las Figura 12.
El daño hepático está asociado a una serie de cambios sistémicos como
retención de líquidos, y aumento del peso hepático; estos datos se correlacionan
con el aumento de peso total presentado en los grupos TAA, TAA+SeNa y
TAA+EDTA. El aumento más marcado fue en el grupo TAA el cual demostró
daños histopatológicos y enzimáticos severos. En contraste, el grupo con doble
terapia fue el único con una leve disminución del peso final en comparación al
peso inicial. Sugiriendo que las alteraciones hepáticas causadas por TAA no
ocasionaron cambios en el peso. Sin embargo, este grupo fue el más expuesto a
manipulación para la administración de los componentes, lo cual pudo haber
influido en el patrón alimenticio de los animales de experimentación.
Es importante considerar además del potencial como terapia, la importancia de
los resultados debido a la disponibilidad de SeNa en los suelos de origen
volcánico como el nuestro y la mayoría los suelos del trópico húmedo en
Latinoamérica70, 71 la cual suele ser de concentraciones bajas, en particular debido
a que las formas de Selenio comúnmente encontradas, son insolubles y las menos
disponibles para su absorción por las plantas.72 Los niveles bajos de Selenio se
han encontrado en patologías hepáticas, por lo que la baja disponibilidad de
Selenio en suelos nacionales, podría disminuir las ventajas de este antioxidante
para nuestra población.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
73
Estudios realizados con aplicación de TAA demuestran una significativa
correlación negativa entre la actividad de TrxR y GPx; y una concomitante
disminución del contenido hepático de Selenio.25 La producción de ERO disminuye
la biodisponibilidad de Selenio y su utilización por las GPx, por lo que su
suplemento adicional beneficiaría la actividad de GPx. Como podemos observar
en los resultados obtenidos el grupo TAA+SeNa presenta menores daños
hitopatológicos que el grupo TAA, con valores de transaminasas más cercanos a
valores normales y con un porcentaje de protección 45.9% mayor; sugiriendo una
mejoría parcial en la actividad antioxidante. 25,27
El EDTA gracias a sus propiedades quelantes es capaz de reducir la cantidad de
iones bivalentes de hierro, de manera moderada evitando la interacción con
reacciones de peroxidación73 y estrés oxidativo, reduciendo la producción de
radicales libres; sin embargo, aunque existen vías de peroxidación lipídica
independientes de las reacciones de FENTON estas no representan una
formación de radicales libres significativa. Es así como dicho efecto se ve
reflejado en el grupo TAA+EDTA, que obtuvo un porcentaje de protección del
58.2%, resultando en daños histopatológicos iniciales a leves, similares a los del
grupo TAA+SeNa, además, en comparación con éste, se encontró una menor
elevación de los valores de transaminasas, acercándose más al valor normal.
Como se describió anteriormente, el efecto antioxidante del SeNa ha demostrado
ser cofactor importante de GPx, que cataliza la reducción de ERO, disminuyendo
el estrés oxidativo, aumentando la degradación de colágeno y disminuyendo la
producción de éste al reducir la activación de células estearato. Siendo esta la
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
74
causa mas probable de limitación del daño hepático con la utilización del SeNa,
logrando potenciar dicho efecto con la suplementación de EDTA como agente
quelante, el cuál disminuye la producción de ERO y aumenta así el efecto
antioxidante.32, 56, 57
Esta actividad sinergizante, se ve evidenciada en el grupo TAA+SeNa+EDTA, con
un 25% de sujetos sin daño hepático y un 75% con daños iniciales a leves. Siendo
además, el único grupo con valores de TGO y TGP en rangos normales,
conservando por ende la funcionalidad hepática. Obteniendo así, un porcentaje de
protección hepática (65.3%) mayor al logrado por SeNa y EDTA como
monoterapia. Por lo que la terapia combinada, podría contribuir a disminuir la
producción de ERO, aumentar la biodisponibilidad de Selenio y la actividad de
GPx, disminuyendo el daño hepático. 32, 56, 73
Los datos estadísticos muestran una diferencia muy significativa entre las terapias
utilizadas y el grupo con TAA únicamente, indicando una disminución en la
progresión y gravedad del daño hepático crónico, no encontrando aun así alguna
diferencia entre cada uno de los grupos terapéuticos. Sin embargo, los datos
histopatológicos y principalmente enzimáticas demuestran que la terapia
combinada posee mayor efectividad en la disminución de la progresión en el daño
hepático. Representando una buena opción como tratamiento coadyuvante ya que
posee un costo-beneficio mejor en comparación con terapias quelantes actuales.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
75
CONCLUSIONES
• El modelo de daño hepático con TAA en ratones es efectivo para producir
daño hepático crónico, sin embargo requiere más tiempo para llegar a fase
de fibrosis y cirrosis.
• La utilización de SSN vía intraperitoneal causa efectos deletéreos mínimos
en el parénquima hepático.
• La monoterapia con SeNa o EDTA es efectiva en reducir la intensidad de la
lesión en comparación al grupo de TAA.
• El SeNa y el EDTA tienen efectos similares en hepatoprotección ante un
daño hepático crónico.
• La combinación de SeNa como antioxidante y el EDTA como quelante de
iones bivalentes reducen la progresión y la gravedad del daño hepático
crónico disminuyendo los niveles de transaminasas a valores normales.
• El EDTA como agente quelante de hierro representa una terapia más
económica que la deferroxamina.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
76
RECOMENDACIONES
• Ampliar el tiempo de administración de TAA como agente hepatotóxico para
lograr fases más avanzadas del daño hepático crónico como fibrosis y
cirrosis.
• Comprobar el efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en otros modelos
animales de inducción de daño hepático crónico.
• Utilizar nuevos agentes antioxidantes en combinación a EDTA en
hepatopatía crónica para comparar sus efectos con los obtenidos por SeNa
y EDTA.
• Aumentar la muestra de los grupos experimentales.
• Medir niveles de SeNa, proteínas séricas y marcadores indirectos de
disfunción hepática como bilirrubinas y la vía intrínseca de la cascada de
coagulación TTPa, así como marcadores directos de estrés oxidativo como
MDA.
___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________
77
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