Propiedades antivirales Propiedades antivirales de las proteínas y de las proteínas y
péptidos de la lechepéptidos de la lecheRAVINDER NAGPAL1, CHAITANYA. S1, MONICA PUNIYA2, AARTI
BHARDWAJ3, SHALINI JAIN4 AND HARIOM YADAV4*
1Microbiología láctea, 2Nutrición de ganado de lácteos, 4Bioquímica animal,Instituto Nacionald e Investigación Láctea, Karnal 132001,
Haryana, Instituto Meerut de Ingeniería y Tecnología, Meerut-250002, U.P., India.*Email: [email protected]
Introducción
• Las proteínas y péptidos de la leche poseen propiedades biológicas más allá de su significancia nutriológica.
• En 1987, lactoferrina (LF) - Virus asociado a leucemia (FLV)
• Proteínas y péptidos de la leche modificadas químicamente.
• Proteínas con actividad
antiviral:
Lactoferrina (LF)
Lactadherina
Glicoproteína
Inmunoglobulina (Ig)
Lactoferrina (LF)Lactoferrina (LF)
• Hierro multifuncional unido a glicoproteína
• Liberada en el estómago por pepsin cleavage a pH ácido
• LF - Actividad antiviral para virus DNA y RNA
ACCIÓN DE VIRUS ENVUELTOS POR LF:
Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Citomegalovirus humano (CMV)
Virus del herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV)
Virus de la hepatitis B, C y G
Papilomavirus humano (HPV) y
Alfavirus
- Virus no cubiertos:
Rotavirus
Enterovirus
Poliovirus
Adenovirus y
Calicivirus felinos
Efectos antivirales de las proteínasEfectos antivirales de las proteínasVirus
(Cubierto)
Proteína Comentarios/acción propuesta
HIV LF
Leche
bLF & hLF bloquea la absorción de HIV-1 por células objetivos
Inhibe la unión de HIV-1 a receptor en CD4
HSV-1 y 2 LF bLF y hLF se une a las partículas virales y efecto sinérgico con acyclovir
HCMV LF o Interfiere con virus en células objetivo
o Regulación de células asesinas
o Efecto antiviral sinérgico con cidofovir
HCV LF o Une a proteínas de cubierta viral E1 y E2
o bLF administrado oralmente puede ser efectivo en combinación con interferón
Alfavirus LF hLF inhibe interacción de virus con receptores sulfato heparan
Hantavirus LF o Efecto sinérgico con ribavirina sobre la replicación viral
o bLF administrado oralmente puede ser efectivo en combinación con interferón
HPV LF Interfiere con la interiorización del virus en la células del huésped
Virus(No envuelto)
Proteína Comentarios/acción propuesta
Rotavirus
Lactoadhesina
Glicoproteína de alto peso molecular; leche de vaca
Concentrado de Ig
Lactoadhesina protege a los alimentados al seno de la infección
Efectiva in vitro; el modo de acción no se conoce
Un efecto in vivo; 100 veces más alto que el obtenido con leche humana
PV LF Se une a células objetivo
Virus humano de la influenza
LF Inhibe la hemoaglutinación por los virus
FCV LF bLF interfiere con la absorción de virus por las células objetivo
Adenovirus LF bLF y hLF compiten con virus por receptores comunes de membrana
Mecanismos antivirales de LF
Mecanismo de Mecanismo de acciónacción
• Primero, LF parece interactuar con los receptores de la superficie celular, tales como los glicosaminoglicanos los cuales son sitios de unión para muchos virus.
• Segundo, LF se une directamente a partículas virales e inhibe la adsorción viral a células objetivo.
• Efectividad antiviral: Las diferencias en secuencia de
aminoácidos de región antiviralCadenas de Glycan y el número de
puente disulfuro entre hLF y bLF
• HIV, HSV, CMV y adenovirus, reconocen proteoglicanos de la superficie celular (heparina y sulfato de heparina) como receptores.
Entrada de HIV-1 en las Entrada de HIV-1 en las células objetivocélulas objetivo
Mediada por glicoproteina gp-120 y gp-41
Receptor CD4 y co-receptores CCRS, CXCR4
Fusión de membranas celulares y virales
Interacción entre el curva V3 y heparan sulfato adhiere
el virus a la superficie celular
Componentes positivamente cargados (AMD3100 y
ALX40-4C) bloquean la replicación de VIH-1,
interactúan con co-receptores cargados negativamente.
Cont…
Purificación de las proteínas y péptidos de la Purificación de las proteínas y péptidos de la leche de vacaleche de vaca
α-S2 Caseína, LFcina-B bovina y k-caseína bovina
Hidrólisis con pepsina
Cromatografía de intercambio de cationes
Fragmentos obtenidos caracterizados por HPLC y ESI-MS
• β-caseína bovina y β lactoglobulina son modificadas por ácido maleico
(Ikura et al., 1984)
• As2-caseína es modificada con 3-hidroxiftalico anhídrido
• El grado de modificación checado con orto-ftaldialdeído. (Berkhout et al., 1997)
Cont…
Métodos para checar Métodos para checar propiedades antiviralespropiedades antivirales
• ELISA
• Ensayo MTT
• Método de radioisótopos
1. ELISA1. ELISAAdicione proteína de leche(1-10 µM ),antes de
adicionar el virus VIH-1
Supresor T1 del crecimiento de la línea celular en medio RPMI con 10% FCS a 37 ºC en 5% CO2
Virus sembrado en un pico de producción y almacenado a - 70 ºc
Cuantificado en antígeno CA-P24 ELISA
2. Ensayo MTT2. Ensayo MTT
Línea celular MT2 T infectada con VIH-1 - aumentó la concentración de proteínas de la leche.
Después de 5 días de post-infección
Células vivas convierten el MTT {3-(4,5-dimethylethiazole-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
Producto azul (formazina)
3. Método de radioisótopo3. Método de radioisótopo
Vaso de cultivo celular (Nunclon de 24 placas)
Inhibidores de proteínas no específicas
Adiciones aupresor de células T1 en un medio completo (RPMI)
Etiquete radiactivamente con 125 I-bLF e incube las placas de 4 ºc a 37 ºc por 1 hora
Cantidad de radioactividad recuperada fue determinada por contador Gamma.
Resistencia a lactoferrinaResistencia a lactoferrina
1. Aislamiento HIV-1 LA1 cultivado en presencia de 10µM bLF
2. Células libres de virus son pasadas a células supresoras T1 no infectadas.
3. Observe la formación masiva de sincitio en el cultivo
4. Muestra del virus es tomada después de varios días.
5. Prueba para infección paralela con y sin LF
6. Células infectadas congeladas a -80 ºc para análisis subsecuente de DNA
7. PCR amplificada , Gel purificada y clonada en una vector clonador.
8. Múltiples clones son insertados como fragmento Bam H1 en el clono moclecular PLA I
9. Pruebe su capacidad de replicación con y sin bLF
Cont…
Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la replicación de VIH-1replicación de VIH-1
Sin actividad antiviral los péptiodos cargados negativamente
b-caseína 1-28 kcaseína 1-10 y CMP-A y CMP- B a 10 mM
Inhibición viral completa - proteína de la leche cargada negativamente modificada químicamente 3HP-CN
Péptidos cargados positivamente nisina y lactoferricina
10 µM - moderadamente inhiben VIH-1 100 µM - completa inhibición pero se observa
citotoxicidad
bLF significativamente inhibe a concentración de 0.1-1.0 µM
LF humana - proteína nativa y recombinante moderadamente actúan como inhibidores a concentración de 3.1 µM
Cont…
Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5-Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5-usando virususando virus
Lactoferrina tiene cargas positivas y negativas a pH fisiológico
Eso interfiere con la interacción virus-co-
receptor
Estos VIH-1 usados para infectar línea celular U87CD4 que fueron transfectadas con CXCR4/CCR5
bLF es un componente superior anti- VIH-1
comparado con LF humana y LF murina, en cualquier forma, nativa o recombinante
bLF es 69% y 64% identica a hLF y mLF respectivamente
Plasma bovino y proteínas de la leche están ampliamente disponibles
Estas proteínas industriales son producidas a gran escala, a través de simples modificaciones químicas
Cont…
Provee antivirales relativamente baratos para administración local o sistémica
Uso sistémico de proteínas de la leche químicamente modificadas en el humano puede ocasionar mayor toxicidad y problemas de inmunogenicidad
Excepto la suc-HAS & 3HP-LA que muestra bajo nivel de toxicidad e inmunogenicidad
Cont…
Propiedades antivirales de otras Propiedades antivirales de otras proteínas de la lecheproteínas de la leche
Lactadhesina
Glicoproteina
Inmunoglobulina (Ig)
• Lactoadhesina :
Receptor que se une a virusÁcido siálico juega un papel importante en
su acción antiviral Lactoadhesina humana protege a los
lactantes alimentados al seno contra infección sintomática por rotavirus
• Glicoproteína: Fracción de alto peso molecular de la
leche de bovinosEfectiva contra rotavirus humano in
vitro
• Inmunoglobulina láctea: Hiperinmunizada con rotavirus humano
durante la gestación de vacas.100 veces- leche humana10 veces – IG comercial
Péptidos antivirales Péptidos antivirales derivados de las derivados de las
proteínas de la lecheproteínas de la leche Lactoferricina
GMP
Complejo mucina
Virus Péptido Comentarios/modo de acción propuesto
HSV-1 y 2 LFcina Un efecto in vitro; más débil que LF: produce un efecto sinérgico con acyclovir
HCMV, FCV, Adenovirus
LFcina Un efecto in vitro; más débil que LF
Efecto antiviral de péptidosEfecto antiviral de péptidos
Virus
(Cubierto)
Péptido Comentarios
Virus Epstein–Barr
GMP Previene cambios morfológicos en linfocitos de sangre periférica
Virus (No cubierto)
Péptido Comentarios
Rotavirus Complejo mucina; leche humana
Inhibe replicación de rotavirus in vitro y previene gastroenteritis in vivo
Fomento de actividad Fomento de actividad antiviral por modificación antiviral por modificación
químicaquímica• Modificaciones químicas dan lugar a cambios en
las cargas sobre las proteínas de la leche lo cual puede fomentar sus propiedades antivirales
(Swart, Harmsen, et al., 1999; Waarts et al., 2005)
• Dos principales formas:Acilación para aumentar cargas negativasAminación para aumentar cargas positivas
Succinilación y aconitilación de LF tienen efectos más fuertes anti- VIH-1 (2-4 veces más activos que la LF original)
(Swart, Harmsen, et al.,1999)
• Algunas otras proteínas - b-Lg, a-La y HSA, también han incrementado el efecto contra VIH-1 y VIH-2
(Jiang, Lin, Strick, Li, & Neurath, 1996)
• Cargas negativas adicionales fueron introducidas a través de modificaciones de residuos de lisina.
Cont…
• b-Lg modificada con ácido 3- hydroxyphthaloyl (3HP) interfirió con la infección por HIV-1, HSV-1 y 2, y HCMV
(Berkhout et al., 2002; Swart, Kuipers, et al., 1996)
• También se encontró que 3HP-a-La y 3HP-as2-caseína fueron también efectivos contra HIV-1
Cont…
• 3-HP-b-Lg podría ser un agente eficaz para prevenir transmisión vaginal de infecciones por el virus herpes virus.
• Aumento de carga positiva neta sobre LF
Aminación deroga su efecto anti-VIH pero incrementa el efecto anti-HCMV
Acilación inhibe propiedades anti-HCMV de LF pero es efectiva contra el virus de la influenza.
Cont…
ConclusiónConclusión
• Proteínas de la leche mejoran la salud de pacientes afectyados por infecciones virales.
• LF bovina mostró considerable acción inhibitoria contra la mayoría de los virus.
• Resultados de investigación emprendidas a la fecha, primariamente bajo condiciones in vitro.
• En años recientes, efectos in vivo han sido reportados en modelos de ratones y ratas.
• A corto plazo, para prevención y terapia de infecciones virales en animales y humanos.
• Beneficios de algunas de las modificaciones químicas observadas in vitro podrían explorarse.
• Para aplicaciones específicas en atención en salud de humanos y animales.
Cont…