Producción In vitro de Resveratrol y empleo de Tecnologías de ADN recombinante para la
expresión de la hTOPO I
Estructura química de Resveratrol
• Es un compuesto polifenólico (3,5,4´-trihidroxiestilbeno) encontrado en gran variedad de plantas.
• Está conformado por un doble enlace, lo que significa que existe en dos isoformas, trans-resveratrol y cis-resveratrol.
• El isómero trans- es la forma más estable.
Fuentes naturales de procedencia• Se encuentra en altas concentraciones en la piel de las uvas
tintas, pero también está presente en maníes, moras, piñas y extractos de raíces de Poligonum cuspidatum (Ko-jo-kon).
• La piel de las uvas frescas contiene 50-100 μg/g de Resveratrol aprox.
• Sin embargo, existen varios factores que provocan un aumento en su concentración, por ejemplo, el estrés ambiental debido a la radiación UV, la presencia de metales pesados, como así también, las condiciones ambientales en que fueron crecidas las uvas.
• En vino, las concentraciones de Resveratrol van desde valores mínimos de 0,2 mg/L hasta valores máximos de 10,6 mg/L.
• Hoy en día, mayores niveles de este compuesto son conseguidos mediante técnicas de ingeniería genética.
´Biosíntesis de Resveratrol: Ruta de los fenilpropanoides
Rol biológico de Resveratrol en las plantas
• La producción de varios tipos de fenilpropanoides es inducida tanto por factores abióticos como bióticos, siendo por esto último clasificados como fitoalexinas.
• La resistencia a patógenos combina respuestas defensivas tanto constitutivas como inducidas. En el caso de los estilbenos, en la respuesta se combinan contenidos elevados pre-existentes además de los que son alcanzados luego del ataque microbiano.
• Estos compuestos ejercen diversas funciones en las plantas: antimicrobianas, nematicidas, insecticidas, antifúngicas y deterrentes frente a herbívoros. Además, pueden actuar como aleloquímicos, inhibiendo el desarrollo y la fotosíntesis de plantas aledañas. Esto indica que los estilbenos actúan como señales químicas entre las diversas especies de plantas.
Propiedades terapéuticas de Resveratrol
Desde la identificación de los efectos beneficiosos en la salud relacionados con Resveratrol y dada su gran
abundancia en ciertas plantas y comidas, el descubrimiento de nuevos estilbenos de ocurrencia natural, como así también de análogos modificados químicamente, está
siendo esperado.
Secuestrador de
radicales libres
Actividades antioxidantes Inhibidor de la
agregación plaquetaria
Modulador de la
producción de NO
Inhibidor del
citocromo P450Modulador de
receptores de
estrógeno
Remodelador de
la cromatina
Moderador en la
transducción de señales
Neuroprotector
Preventivo del cáncer
Pero además, Resveratrol cuenta con otra gran cantidad de propiedades quimiopreventivas, entre las que podemos nombrar:
Objetivos
• Establecer la línea celular de Vitis vinífera.
• Obtener la producción In vitro de Resveratrol.
• Obtener derivados químicos de Resveratrol y de trans-estilbeno.
• Lograr la expresión de la enzima Topoisomerasa I humana (hTopo I).
• Evaluar las propiedades antitumorales de los estilbenos comerciales además de los derivados obtenidos químicamente.
Obtención de línea celular deVitis vinífera L.
HOJAS
TALLOS
• Hipoclorito de sodio
• Agua destilada
Desdiferenciación de
los cultivos
Cultivos sumergidos:
obtención de
metabolitos secundarios
Extracción y metilación de medio de
crecimiento, análisis GC
Variedad Red Globe
Preparación de medio Murashige --Skoog (MS)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
PATRON DE
RESVERATROL
PATRON +
MEDIO DE
CRECIMIENTO
Toposisomerasa I humana (hTopo I)• La Topoisomerasa humana (hTopo) es una enzima nuclear
que cataliza cambios topológicos en el ADN realizando rupturas transitorias sobre las hebras, las que luego son unidas por la misma enzima.
• Existen dos tipos de Topoisomerasas:
- Topoisomerasa I: provoca la ruptura de una hebra de ADN y luego la une sin utilizar ATP;
- Topoisomerasa II: cataliza la ruptura sobre la doble hebra de ADN; posteriormente la une utilizando ATP.
Por las actividades que desempeñan, las Topoisomerasas
actúan en procesos tales como la replicación, la
transcripción y la recombinación del ADN, es por esto que
se convierten en un blanco excepcional para probar la
eficacia de compuestos con posibles propiedades
antitumorales.
Estructura de la hTopo I• La hTopo I es una proteína de 91 kDa de 765 aa;
estructuralmente puede dividirse en cuatro dominios:
- N-terminal (1-195)
- core (196-651)
- linker (652-691)
- C-terminal (691-751)
Aplicación de Tecnologías de ADN recombinante : Ingeniería Genética
1)Hallar una fuente que me permita aislar el gen de la hTopo I
2)Búsqueda de la secuencia del cDNA para hTopo I
>gi|19913404|ref|NM_003286.2| Homo sapiens topoisomerase (DNA) I (TOP1), mRNA
CAAATGCGAACTTAGGCTGTTACACAACTGCTGGGGTCTGTTCTCGCCGCCCGCCCGGCAGTCAGGCAGCGTCGCCGCCGTGGTAGCAGCCTCAGCCGTTTCTGGAGTCTCGGGCCCACAGTCACCGCCGCTTACCTGCGCCTCCTCGAGCCTCCGGAGTCCCCGTCCGCCCGCACAGGCCGGTTCGCCGTCTGCGTCTCCCCCACGCCGCCTCGCCTGCCGCCGCGCTCGTCCCTCCGGGCCGACATGAGTGGGGACCACCTCCACAACGATTCCCAGATCGAAGCGGATTTCCGATTGAATGATTCTCATAAACACAAAGATAAACACAAAGATCGAGAACACCGGCACAAAGAACACAAGAAGGAGAAGGACCGGGAAAAGTCCAAGCATAGCAACAGTGAACATAAAGATTCTGAAAAGAAACACAAAGAGAAGGAGAAGACCAAACACAAAGATGGAAGCTCAGAAAAGCATAAAGACAAACATAAAGACAGAGACAAGGAAAAACGAAAAGAGGAAAAGGTTCGAGCCTCTGGGGATGCAAAAATAAAGAAGGAGAAGGAAAATGGCTTCTCTAGTCCACCACAAATTAAAGATGAACCTGAAGATGATGGCTATTTTGTTCCTCCTAAAGAGGATATAAAGCCATTAAAGAGACCTCGAGATGAGGATGATGCTGATTATAAACCTAAGAAAATTAAAACAGAAGATACCAAGAAGGAGAAGAAAAGAAAACTAGAAGAAGAAGAGGATGGTAAATTGAAAAAACCCAAGAATAAAGATAAAGATAAAAAAGTTCCTGAGCCAGATAACAAGAAAAAGAAGCCGAAGAAAGAAGAGGAACAGAAGTGGAAATGGTGGGAAGAAGAGCGCTATCCTGAAGGCATCAAGTGGAAATTCCTAGAACATAAAGGTCCAGTATTTGCCCCACCATATGAGCCTCTTCCAGAGAATGTCAAGTTTTATTATGATGGTAAAGTCATGAAGCTGAGCCCCAAAGCAGAGGAAGTAGCTACGTTCTTTGCAAAAATGCTCGACCATGAATATACTACCAAGGAAATATTTAGGAAAAATTTCTTTAAAGACTGGAGAAAGGAAATGACTAATGAAGAGAAGAATATTATCACCAACCTAAGCAAATGTGATTTTACCCAGATGAGCCAGTATTTCAAAGCCCAGACGGAAGCTCGGAAACAGATGAGCAAGGAAGAGAAACTGAAAATCAAAGAGGAGAATGAAAAATTACTGAAAGAATATGGATTCTGTATTATGGATAACCACAAAGAGAGGATTGCTAACTTCAAGATAGAGCCTCCTGGACTTTTCCGTGGCCGCGGCAACCACCCCAAGATGGGCATGCTGAAGAGACGAATCATGCCCGAGGATATAATCATCAACTGTAGCAAAGATGCCAAGGTTCCTTCTCCTCCTCCAGGACATAAGTGGAAAGAAGTCCGGCATGATAACAAGGTTACTTGGCTGGTTTCCTGGACAGAGAACATCCAAGGTTCCATTAAATACATCATGCTTAACCCTAGTTCACGAATCAAGGGTGAGAAGGACTGGCAGAAATACGAGACTGCTCGGCGGCTGAAAAAATGTGTGGACAAGATCCGGAACCAGTATCGAGAAGACTGGAAGTCCAAAGAGATGAAAGTCCGGCAGAGAGCTGTAGCCCTGTACTTCATCGACAAGCTTGCTCTGAGAGCAGGCAATGAAAAGGAGGAAGGAGAAACAGCGGACACTGTGGGCTGCTGCTCACTTCGTGTGGAGCACATCAATCTACACCCAGAGTTGGATGGTCAGGAATATGTGGTAGAGTTTGACTTCCTCGGGAAGGACTCCATCAGATACTATAACAAGGTCCCTGTTGAGAAACGAGTTTTTAAGAACCTACAACTATTTATGGAGAACAAGCAGCCCGAGGATGATCTTTTTGATAGACTCAATACTGGTATTCTGAATAAGCATCTTCAGGATCTCATGGAGGGCTTGACAGCCAAGGTATTCCGTACATACAATGCCTCCATCACGCTACAGCAGCAGCTAAAAGAACTGACAGCCCCGGATGAGAACATCCCAGCGAAGATCCTTTCTTATAACCGTGCCAATCGAGCTGTTGCAATTCTTTGTAACCATCAGAGGGCACCACCAAAAACTTTTGAGAAGTCTATGATGAACTTGCAAACTAAGATTGATGCCAAGAAGGAACAGCTAGCAGATGCCCGGAGAGACCTGAAAAGTGCTAAGGCTGATGCCAAGGTCATGAAGGATGCAAAGACGAAGAAGGTAGTAGAGTCAAAGAAGAAGGCTGTTCAGAGACTGGAGGAACAGTTGATGAAGCTGGAAGTTCAAGCCACAGACCGAGAGGAAAATAAACAGATTGCCCTGGGAACCTCCAAACTCAATTATCTGGACCCTAGGATCACAGTGGCTTGGTGCAAGAAGTGGGGTGTCCCAATTGAGAAGATTTACAACAAAACCCAGCGGGAGAAGTTTGCCTGGGCCATTGACATGGCTGATGAAGACTATGAGTTTTAGCCAGTCTCAAGAGGCAGAGTTCTGTGAAGAGGAACAGTGTGGTTTGGGAAAGATGGATAAACTGAGCCTCACTTGCCCTCGTGCCTGGGGGAGAGAGGCAGCAAGTCTTAACAAACCAACATCTTTGCGAAAAGATAAACCTGGAGATATTATAAGGGAGAGCTGAGCCAGTTGTCCTATGGACAACTTATTTAAAAATATTTCAGATATCAAAATTCTAGCTGTATGATTTGTTTTGAATTTTGTTTTTATTTTCAAGAGGGCAAGTGGATGGGAATTTGTCAGCGTTCTACCAGGCAAATTCACTGTTTCACTGAAATGTTTGGATTCTCTTAGCTACTGTATGCAAAGTCCGATTATATTGGTGCGTTTTTACAGTTAGGGTTTTGCAATAACTTCTATATTTTAATAGAAATAAATTCCTAAACTCCCTTCCCTCTCTCCCATTTCAGGAATTTAAAATTAAGTAGAACAAAAAACCCAGCGCACCTGTTAGAGTCGTCACTCTCTATTGTCATGGGGATCAATTTTCATTAAACTTGAAGCAGTCGTGGCTTTGGCAGTGTTTTGGTTCAGACACCTGTTCACAGAAAAAGCATGATGGGAAAATATTTCCTGACTTGAGTGTTCCTTTTTAAATGTGAATTTTTATTTCTTTTTAATTATTTTAAAATATTTAAACCTTTTTCTTGATCTTAAAGATCGTGTAGATTGGGGTTGGGGAGGGATGAAGGGCGAGTGAATCTAAGGATAATGAAATAATCAGTGACTGAAACCATTTTCCCATCATCCTTTGTTCTGAGCATTCGCTGTACCCTTTAAGATATCCATCTTTTTCTTTTTAACCCTAATCTTTCACTTGAAAGATTTTATTGTATAAAAAGTTTCACAGGTCAATAAACTTAGAGGAAAATGAGTATTTGGTCCAAAAAAAGGAAAAATAATCAAGATTTTAGGGCTTTTATTTTTTCTTTTGTAATTGTGTAAAAAATGGAAAAAAACATAAAAAGCAGAATTTTAATGTGAAGACATTTTTTGCTATAATCATTAGTTTTAGAGGCATTGTTAGTTTAGTGTGTGTGCAGAGTCCATTTCCCACATCTTTCCTCAAGTATCTTCTATTTTTATCATGAATTCCCTTTTAATCAACTGTAGGTTATTTAAAATAAATTCCTACAACTTAATGGAAA
3)Diseño de primers
www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
4)Amplificación del cDNA de hTopo I
Primers ForwardBam HI
5´- GGA TCC ATG AGT GGG GAC
CAC CTC – 3´
5´- GGA TCC AAA CCC AAG AAT
AAA GAT AAA GAT AAA - 3´
Primers ReverseEco RI
5´ GAA TTC CTA AAA CTC ATA
GTC TTC ATC AGC 3´
5)Clonado en vector de pTrcHis Topo
6)Transformación de bacterias de la cepa TOP10 mediante
el método de shock térmico.
7)Minipreparación de ADN plasmídico (MINIPREP) mediante
el método de lisis alcalina.
8)Digestión con enzimas de restricción para verificar
orientación del fragmento clonado (Bam HI o Eco RI).
P 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
9)Digestión del fragmento con Bam HI + Eco RI.
10)Ligación en alguno de los siguientes vectores de expresión: pRSET A o pGEM-T.
11)Transformación de la cepa BL21 para expresión.
12)Inducción de la expresión utilizando IPTG como inductor.
13)Identificación de la proteína por Western Blot .