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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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COLORACION MYCOBACTERIUM LEPRAE
1. Propósito u objetivo
Realizar un examen oportuno y de valor diagnóstico para el médico.
2. Alcance
Se realiza a todo usuario que se le haya ordenado y el cual haya sido facturado.
3. Responsable
Área de Microbiologia, Bacterióloga, asignada de turno.
4. Fundamento e información general
La lepra es causada por la bacteria Mycobacterium leprae. No es muy contagiosa y tiene un
largo período de incubación (tiempo antes de que aparezcan los síntomas), lo cual dificulta
saber dónde y cuándo alguien contrajo la enfermedad. Los niños son más propensos que los
adultos a contraerla.
La lepra tiene dos formas comunes: la tuberculoide y la lepromatosa. Ambas formas ocasionan
úlceras en la piel, pero la forma lepromatosa es la más grave y produce grandes protuberancias
e hinchazones (nódulos).
La lepra es común en muchos países del mundo y en los climas templados, tropicales y
subtropicales.
5. Información de seguridad
Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio
aceptados para el trabajo con suero o plasma.
No use las pipetas aspirando con la boca.
Para mejores resultados, siga las instrucciones.
No use después de la fecha de caducidad
Utilice las normas de Bioseguridad
Este test se almacena a temperatura ambiente. No requiere refrigeración.
6. Muestra, materiales y equipos.
Materiales:
Alcohol Acido
Fuscina ZN
Azul de metileno
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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Laminas
Pinzas Kelly
Lancetas
Aplicadores
7. Procedimiento
RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador
laboratorio
P Velar por la adquisición, recepción y
almacenamiento de insumos para el área de
Inmunología.
Formato
solicitud de
pedido.
Auxiliar de
Laboratorio
H Protocolo de Lavado de Manos
Auxiliar de
Laboratorio
H Solicitar el esquema corporal.
Auxiliar de
Laboratorio
H Revisar sitio de la lesión.
Auxiliar de
Laboratorio
H Láminas desengrasadas con alcohol al 70%
(nuevas).
Auxiliar de
Laboratorio
H Utilizar Lápiz de punta de diamante.
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Auxiliar de
Laboratorio
H Utilizar puntas tipo kelly, recubiertas en los
extremos.
Auxiliar de
Laboratorio
H Muestrear: Linfa o Líquido intersticial del lóbulo de
oreja izquierdo, lóbulo de oreja derecho, codo
izquierdo, codo derecho y moco nasal
Auxiliar de
Laboratorio
H Filtrar los colorantes cada 8 días.
Auxiliar de
Laboratorio
H Fijar láminas con mechero.
Auxiliar de
Laboratorio
H Cubrir la lamina con 2 mL de fuscina de ZN por 10
minutos.
Auxiliar de
Laboratorio
H Decolorar con 2 mL de alcohol acido por 1 minuto.
Auxiliar de
Laboratorio
H Enjuagar y agregar 2 mL de azul de metileno por 2
minutos.
Auxiliar de
Laboratorio
H Enjuagar con agua de chorro.
Auxiliar de
Laboratorio
H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su
lectura
Bacteriólogo H Leer la lamina por índice bacilar
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento.
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
A Enviar el formato y las laminas al LSP
RESULTADOS
Índice Bacilar: 2+2+2+1+1/5= 1.6
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VALOR DE REFERENCIA:
IB= 0.2-3.0 si se leen 5 muestras
8. Anexos o Bibliografía
Guía del Laboratorio de Salud Publica.
Guía del Instituto Nacional de Salud
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COLORACION DE FIELD-GOTA GRUESA
1. Propósito u objetivo
La prueba tiene por objeto, ser el método de identificación de hemoparásitos en las
muestras sanguíneas, gracias a la visualización de las diferentes formas del Plasmodium
después de un adecuado proceso de tinción.
2. Alcance
Identificar las diferentes formas de Plasmodium en las muestras sangre, después de una
correcta coloración.
3. Responsable
Área de Parasitologia, Bacterióloga, asignada de turno.
4. Fundamento e información general
La gota gruesa es una técnica de realización sencilla, cuya finalidad es la observación de
trofozoitos de hemoparásitos (fundamentalmente el género Plasmodium, al que pertenecen
las diferentes especies causantes del paludismo o malaria), cuando éstos no pueden
visualizarse directamente en la extensión o frotis sanguíneo.
5. Información de seguridad
Prueba para diagnostico microscópico
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
No utilizar después de la fecha de caducidad.
Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.
Debe evitarse su contaminación durante su uso.
Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como
agente altamente infeccioso.
Realizar control de calidad.
6. Muestra, materiales y equipos.
6.1 Muestra: Sangre total tomada en tubo tapa lila (EDTA) Y por punción digital.
6.2 Materiales:
Papel absorbente.
Laminas.
Colorante de Field A
Colorante de Field B.
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Azul de metileno.
Solución de buffer o amortiguadora
Marcador o lápiz de cera.
Caja de petri/ Lamina concava
6.3 Equipos:
Microscopio.
9. Procedimiento
Modelo forma de Extendido:
RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador
laboratorio
P Velar por la adquisición, recepción y
almacenamiento de los colorantes.
Formato
solicitud de
pedido.
Bacteriólogo P Alistar la papelería para el registro de los datos
clínicos del paciente, anexar ficha notificación de
SIVIGILA
Bacteriólogo H Se marcan tres láminas, dos para gota gruesa y
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uno para extendido de sangre periférica (el
extendido se colorea con wrigth técnica
estandarizada por el laboratorio clínico.
Bacteriólogo H Se toma la muestra de sangre con una lanceta
nueva del dedo índice o medio del paciente, se
limpia con algodón y alcohol y después se seca
con una torunda de algodón seco, se limpia la
primera gota de sangre y luego se coloca la gota
sobre la lámina.
Bacteriólogo H Se coloca la gota utilizando otra lamina
portaobjetos formando un cuadrado homogéneo
y se extiende la sangre realizando el menor número
de movimientos sobre la muestra para no dañar la
morfología del parasito
Bacteriólogo H Dejar secar las gotas horizontalmente a
temperatura ambiente.
Bacteriólogo H Para la coloración de Field: Sumergir la lámina
seca por 2 segundos en azul de metileno.
Bacteriólogo H Dejar escurrir.
Bacteriólogo H Preparar en un tubo 3 ml de solución
amortiguadora Ph 7.2, 1 gota de solución A, 1 gota
de solución B, por cada lámina a colorear.
Bacteriólogo H Los colorantes se filtran cada 8 días
Bacteriólogo H Alistar la caja de petri con un aplicador partido en
dos, de tal manera que cada extremo de la lámina
quede sobre el aplicador o sobre la lámina
cóncava.
Bacteriólogo H Colocar la lámina invertida y adicionar el colorante
con una pipeta de pasteur de tal manera que
ocupe todo el espacio, evitar burbujas deje actuar
por 10 minutos.
Bacteriólogo H Dejar escurrir en una toalla de papel y dejar secar.
Bacteriólogo H Informar negativo si no se observa ninguna forma
parasitaria en 200 campos microscópicos.
Bacteriólogo H Si observa Plasmodium, proceder a identificar la
especie parasitaria.
Bacteriólogo H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su
lectura.
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento de
coloración y recuento de parásitos.
Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de
tolerancia, tomar las medidas correctivas
Registrar
Formato Acta
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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necesarias.
de Calidad
Resultados
Lineamientos nacionales para la lectura de la gota gruesa
Gota gruesa: Negativo
Resultado negativo:
Se considera cuando se revisan como mínimo 200 campos y no se observa en la muestra
ninguna forma parasitaria:
Resultado positivo:
Especie:
Recuento: parasitos/uL
Realizar el recuento con 200 leucocitos, de la siguiente manera:
Numero de parásitos / μl de sangre = Numero de parásitos x 8.000 leucocitos/μl
200 leucocitos
Si hay menos de 100 parásitos en 200 leucocito, hacer el recuento hasta 500 leucocitos,
así:
Numero de parásitos / μl de sangre = Numero de parásitos x 8.000 leucocitos/μl
500 leucocitos
Si la parasitemia es muy alta contar 500 parásitos y los leucocitos que haya encontrado,
usando la fórmula:
Numero de parásitos / μl de sangre = 500 parásitos x 8.000 leucocitos/μl
Numero leucocitos contados
Para Plasmodium vivax:
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Se cuentan todas las formas indistintivas a la vez, es decir no se clasifican sus formas.
Para Plasmodium falciparum:
Se cuentan todas las formas sexuadas (Gametocitos) o asexuadas (trofozoitos y esquizontes)
presentes en la lámina.
Para infección mixta:
Primero se cuenta la especie más predominante y posteriormente la que se encuentra en menor
número.
EJEMPLO DE INFORME DE RESULTADOS
En los resultados, para los casos en los que se presenten lecturas dudosas en láminas, éstas se
reportaran escribiendo una nota de pendientes por confirmación, y a la mañana siguiente ,
previo informe y revisión con la epidemióloga de la Clínica (para los casos detectados en el
turno de la noche, fines de semana y festivos) y para los casos diurnos su confirmación se
efectuará en las tres horas siguientes como máximo, tiempo en el cual se elevará consulta y
apoyo con la lámina del caso correspondiente al Laboratorio de Salud Pública – Secretaria
de Salud de Florencia.
En caso de que el resultado sea negativo y el cuadro clínico sea muy sugestivo de esta
patología se debe proceder a tomar muestras en los picos febriles del paciente.
Reportar todo caso positivo con género, especie y recuento sin importar la especie.
Toda lámina positiva o negativa debe guardarse para enviar con el reporte a la Secretaría
de Salud Departamental.
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La forma infectante del parásito es el Esporozoito, las formas asexuadas son los trofozoitos
y las formas sexuadas los gametocitos.
Luego del tratamiento se debe realizar controles a los pacientes, para el caso de P. vivax
control al día 14 y en el caso de P.falciparum al 3 y 5 día; en casos de malaria complicada
y pacientes hospitalizados el control de debe realizar a diario.
Control de Calidad a la coloración:
El control de calidad se debe realizar con una muestra de un Cuadro Hemático el cual
tenga eosinofilia para poder así valorar la viabilidad de la coloración de Field.
7. Anexos o Bibliografía
Manual de microbiología.
Protocolo de Vigilancia y Control de Malaria- Instituto Nacional de Salud
Diagnostico Malaria: Morfología y recuento – Instituto Nacional de Salud 2013
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COLORACION DE ZIEHL NEELSEN (ZN)
1. Propósito u objetivo
La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación del Micobacterium
tuberculosis en las muestras de esputo enviadas al laboratorio para su análisis.
2. Alcance
Identificar el Micobacterium tuberculosis en el laboratorio clínico.
3. Responsable
Área de Microbiologia, Bacteriólogo, asignada de turno.
4. Fundamento e información general
La tuberculosis constituye un grave problema de salud pública en Colombia; por tanto, se
requiere de una ardua labor de todas las entidades y personas involucradas en el control
y prevención de la enfermedad. El laboratorio clínico es fundamental en el diagnóstico de
esta patología; por ello, la necesidad de un proceso definido y claro de trabajo para así
lograr una acertada identificación.
La baciloscopia, es la búsqueda microscópica mediante la coloración de Ziehl Neelsen de
bacilos ácido-alcohol resistentes (baar) en cualquier espécimen clínico.
El mecanismo de la acido alcohol resistencia (AAR) es doble y requiere la penetración de
la fucsina al citoplasma bacilar, así como la interacción química con los ácidos micólicos y
los péptidos, glicolípidos presentes en la pared celular de las micobacterias.
Esta reacción impide la salida de la fucsina atrapada en el citoplasma celular, cuando es
expuesta a la acción de alcohol-acido, lo cual asegura la brillantez y el color rojo intenso
de los gérmenes.
El papel del mordiente (solución fenolada) es definitivo porque fomenta la penetración de
la fucsina y su unión con los lípidos bacilares, haciéndola más liposoluble y menos
hidrosoluble.
La coloración se realiza en tres tiempos: tinción, decoloración y contraste.
5. Información de seguridad
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Prueba solo para diagnóstico in Vitro.
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
No utilizar después de la fecha de caducidad.
Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.
Debe evitarse su contaminación durante su uso.
Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como
agente altamente infeccioso.
Realizar control de calidad.
6. Muestra, materiales y equipos.
6.1 Muestra: Esputo.
6.2 Materiales:
Papel Kraft.
Escobillones.
Laminas.
Bata desechable.
Utilizar Elementos de Protección Personal
Tapa Boca N95-
Colorante Fucsina de Ziehl Neelsen.
Alcohol acido
Colorante azul de metileno.
6.3 Equipos:
Microscopio.
10. Procedimiento
Modelo forma de Extendido:
RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador P Velar por la adquisición, recepción y Formato
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laboratorio almacenamiento de los colorantes. solicitud de
pedido.
Auxiliar del
Laboratorio
H Lavarse las manos
Auxiliar del
Laboratorio
H Limpiar el mesón con Hipoclorito de Sodio al 1% y
colocar el papel KRAFT (50 cm aproximadamente).
Auxiliar del
Laboratorio
H Partir un bajalengua en dos tratando que las
puntas queden asperas
Auxiliar del
Laboratorio
H Extender homogéneamente suficiente cantidad
de la partícula mas purulenta y realice el
extendido en un pequeño ovalo centrado de 2
cm*1cm
Auxiliar del
Laboratorio
H Elimine el bajalengua inactivando con hipoclorito
de sodio al 2.5% por 10 minutos y luego descarte
en el guardián.
Auxiliar del
Laboratorio
H Flamear la lamina tres veces por el mechero.
Auxiliar del
Laboratorio
H Filtrar los colorantes cada 8 días
Auxiliar del
Laboratorio
H Cubrir la lámina con 2 ml de fucsina de ZN por un
tiempo de 5 min. Se flamea por 5 min. Calentando
3 veces (sin dejar hervir).
Auxiliar del
Laboratorio
H Enjuagar con agua de chorro.
Auxiliar del
Laboratorio
H Decolar con 2 ml de alcohol acido por 3 min.
Auxiliar del
Laboratorio
H Enjuagar y agregar 2 ml de azul de metileno por 1
min.
Auxiliar del
Laboratorio
H Enjuagar con agua de chorro.
Auxiliar del
Laboratorio
H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su
lectura.
Bacteriólogo H Deje caer una gota de aceite de inmersión sobre
el extendido, evitando que la punta del gotero
entren el contacto con el extendido.
Al enfocar la lámina con el objetivo de 100X, se
observaran los bacilos tenidos de color rojo intenso
sobre un fondo azul claro.
Leer e informar
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento
de la coloración.
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
A Enviar el formato y las láminas al LSP
Informe de Resultados: Escala Semicuantitativa
RESULTADO INFORME
No BAAR en 100 campos No se observan BAAR en la muestra
examinada
1-9 en 100 campos Nº exacto de bacilos en 100 campos
10 y 99 en 100 campos +
1-10 por campo en 50 campos ++
Mayor a 10 por campo en 20
campos
+++
Control de calidad de la coloración
Se debe realizar en forma rutinaria cada vez que se efectué la coloración de Ziehl
Neelsen.
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7. Anexos o Bibliografía
Guía del Laboratorio de Salud Pública.
Guía del Instituto Nacional de Salud
COLORACION DE WRIGHT
1. Propósito u objetivo
La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación de las diferentes
células sanguíneas, gracias a la visualización de la morfología de las mismas después de
un adecuado proceso de tinción.
2. Alcance
Identificar las diferentes células sanguíneas, partiendo de una muestra sangre y después
de una correcta coloración.
3. Responsable
Área de Hematologia, Bacteriólogo, asignada de turno.
7. Fundamento e información general
El frotis sanguíneo, una vez seco, se somete a un proceso de fijación y posteriormente a una
tinción mediante un colorante adecuado. En la mayoría de los laboratorios los colorantes
más empleados para la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky, constituidos
fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno.
La coloración de Wright es una modificación de la de Leishman (especialmente indicada
para la visualización de parásitos del paludismo) y sus características son similares a las de la
tinción de May-GrÜnwald-Giemsa.
8. Información de seguridad
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Prueba solo para diagnóstico in Vitro.
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
No utilizar después de la fecha de caducidad.
Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.
Debe evitarse su contaminación durante su uso.
Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como
agente altamente infeccioso.
Realizar control de calidad.
9. Muestra, materiales y equipos.
6.1 Muestra: Sangre total tomada en tubo tapa lila (EDTA).
6.2 Materiales:
Papel absorbente.
Laminas.
Colorante de Wright.
Marcador o lápiz de cera
6.3 Equipos:
Microscopio.
11. Procedimiento
RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador
laboratorio
P Velar por la adquisición, recepción y
almacenamiento de los colorantes.
Formato
solicitud de
pedido.
Bacteriólogo H Cubrir la lamina con 3 ml del colorante de WRIGTH
por 3 minutos.
Bacteriólogo H Agregar 2 ml de agua destilada y se sopla hasta
que salga el brillo metálico, tener precaución de
no desbordar el liquido dela lamina se deja por 2
minutos.
Bacteriólogo H Enjuagar con agua de chorro.
Bacteriólogo H Dejar secar y se lleva a la bacterióloga para su
lectura.
Bacteriólogo V Observar el microscopio los aspectos morfológicos
de las células.
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento de
coloración.
Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de Registrar
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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tolerancia, tomar las medidas correctivas
necesarias.
Formato Acta
de Calidad
Resultados
Mediante la coloración de Wright pueden distinguirse los siguientes aspectos morfológicos
de las células:
- forma, dimensiones y contorno de las células sanguíneas.
- Núcleo celular y Restos de cromatina: color purpura.
- Citoplasma de linfocitos: color azul.
- Citoplasma de monocitos: color grisáceo.
- Granulaciones polinucleares: Eosinofilos (naranja), Basófilos (azul oscuro), neutrófilos
(color pardo).
- Hematíes: color rosa pálido.
- Reticulocitos: color azulado.
8. Anexos o Bibliografía
Manual de hematología.
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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COLORACION LEISHMANIA
1. Propósito u objetivo
Es un método rápido, económico y de fácil realización. Su sensibilidad varía con el
tiempo de evolución de la lesión (a menor tiempo de evolución mayor sensibilidad). El
examen directo puede realizarse de dos maneras: haciendo un raspado del borde
interno de la ulcera o haciendo una incisión y raspando el borde activo de la lesión. La
primera metodología tiene la ventaja de ser menos dolorosa, sangrar menos y ser más
fácil, rápida y económica que la segunda.
2. Alcance
Identificar las diferentes amastigotes, después de una correcta coloración.
3. Responsable
Área de Parasitologia, Bacterióloga, asignada de turno.
10. Fundamento e información general
El agente etiológico de la Leishmaniasis es un protozoario del genero de Leishmania, que
pertenece al reino Protista, subreino Protozoa, orden Kinetoplastida y a la familia
Trypomastidae. En la actualidad, el género de Leishmania se divide en dos subgéneros,
según su desarrollo en el intestino de los flebótomos vectores: Leishmania, en el intestino
medio o anterior y Viannia, en el intestino posterior, medio y anterior de los flebótomos. Las
leismaniasis se presentan bajo dos formas diferentes. Una promastigota que es móvil y
flagelada, comúnmente encontrada en el vector invertebrado, libre, alargado de 10 a 14
por 1.5 a 3.5 mm, se multiplica en el vector y migra a la parte anterior del mosquito y estalla
allí hasta ser inoculada. Y la amastigota es inmóvil, intracelular, dentro de los macrófagos y
otras células del sistema reticuloendotelial del huésped vertebrado.
11. Información de seguridad
Prueba solo para diagnóstico in Vitro.
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
No utilizar después de la fecha de caducidad.
Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.
Debe evitarse su contaminación durante su uso.
Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como
agente altamente infeccioso.
Realizar control de calidad.
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12. Muestra, materiales y equipos.
6.1 Muestra: Cualquier tipo de muestra dependiendo la lesión como pápulas, nódulos o
placas, según solicitud de personal médico.
6.2 Materiales:
Guantes.
Algodón.
Alcohol al 70%.
Solución salina.
Jabón quirúrgico.
Gasa estéril.
Laminas portaobjetos.
Lancetas u hojas de bisturí.
Colorante de Field A
Colorante de Field B.
Azul de metileno.
Agua destilada.
Marcador o lápiz de cera
6.3 Equipos:
Microscopio
12. Procedimiento
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RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador
laboratorio
P Velar por la adquisición, recepción y
almacenamiento de los colorantes.
Formato
solicitud de
pedido.
Bacteriólogo H Realizar una limpieza del sitio de la lesión, utilizando
gasa impregnada de alcohol, solución salina y/o
jabón quirúrgico.
Si hay costra se debe remover cuidadosamente,
raspando el borde activo de la lesión.
Si hay dos o más lesiones escojan la de MENOR
EVOLUCION.
NOTA: Para la limpieza de la lesión no se debe
utilizar ninguna solución yodada, ya que puede
interferir en la lectura del examen.
Bacteriólogo H Realizar un raspado con el borde romo de una
lanceta o de una hoja de bisturí. Hágalo de
manera tal que no sangre mucho, presionando el
sitio de la lesión hasta hacer isquemia.
Bacteriólogo H Hacer una incisión con bisturí de 3-6mm de
longitud por 1-3mm de profundidad y raspado del
borde activo de la lesión, previa infiltración de 0.1-
0.2 ml de xilocaina, se debe lograr hemostasia
haciendo presión con los dedos.
Bacteriólogo H El material así obtenido se extiende en forma suave
sobre una lamina portaobjetos nueva,
previamente limpia, desengrasada y debidamente
rotulada. Se toman otras tres muestras de la misma
forma, para realizar tres laminas por paciente.
Bacteriólogo H Dejar secar las muestras a temperatura ambiente
teniendo las precauciones necesarias en climas
cálidos y húmedos.
Bacteriólogo H Introducir la lámina en azul de metileno por 5
(nombre del paciente)
(identificación de la lesión)
(fecha)
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segundos.
Bacteriólogo H Sacar e inmediatamente poner en contacto con
una preparación de 3 ml de sales fosfatadas y una
gota solución de Field A y una gota de solución
Field B. se puede ayudar para esto, con una caja
de petri o un vaso plástico inclinado contra el
mesón para que facilite la capilaridad y el
contacto muestra-solución.
Bacteriólogo H Dejar por 25 minutos.
Bacteriólogo H Dejar secar.
Bacteriólogo H Leer al microscopio en objetivo de 100X con aceite
de inmersión, para buscar los amastigotes que
pueden encontrarse intra o extracelularmente.
Para identificar un amastigote como tal debe
observarse las formas ovaladas o redondeadas y
distinguirse claramente la membrana celular, el
núcleo y el kinetoplasto.
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento de
coloración.
Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de
tolerancia, tomar las medidas correctivas
necesarias.
Registrar
Formato Acta
de Calidad
Resultados
- POSITIVO: Cuando se encuentran uno o más amastigotes al recorrer toda la lámina.
- NEGATIVO: Cuando no se encuentran amastigotes al recorrer toda la lámina.
4. Anexos o Bibliografía
Manual de parasitología.
Guía para la Atención Clínica Integral del Paciente con Leishmaniasis.
Protocolo de Vigilancia y control de Leishmaniasis- INS-Ministerio de la Protección Social.
COLORACION DE GRAM
1. Propósito u objetivo
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PROCEDIMIENTOS TECNICOS COLORACIONES
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La prueba tiene por objeto, servir como método de identificación de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas de las muestras enviadas al laboratorio para su análisis.
2. Alcance
Identificar las bacterias Gram negativas y Gram positivas en el laboratorio clínico.
3. Responsable
Área de Hematologia, Bacteriólogo, asignada de turno.
4. Fundamento e información general
La pared celular de las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano,
además de dos clases de acidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie el
ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como
mureina). Por el contrario la capa de péptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta la
interna) por medio de lipoproteínas.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípidos y lipopolisacaridos. Por lo tanto,
ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de
su pared.
La clave es el peptidoglicano ya que es el material que confiere su rigidez al a pared celular
bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram
negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana
externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos como alcohol/acetona. La
capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el
complejo de cristal violeta/yodo que se formo previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario las Gram positivas al
poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros
cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul-violácea.
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El Cristal Violeta: (colorante básico/catiónico), se combinan con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos
ácidos, este penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas).
El Lugol: Está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está
presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en
solución acuosa con el cristal violeta. La mayor cantidad de ácidos grasos en los
microorganismos gran positivos generan más afinidad por los agentes oxidantes. Todos los
mordientes (como el yodo) son oxidantes; su efecto consiste en dar a la sustancia oxidada
un carácter más ácido.
El Alcohol-Acetona: Sirve para realizar la decoloración. El alcohol acetona empleado para
aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con
mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram
negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se
disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta
con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general
de la pared celular.
Fucsina: Es un colorante de contraste utilizado para distinguir las bacterias Gram
negativas. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen azules.
5. Información de seguridad
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Prueba solo para diagnóstico in Vitro.
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
No utilizar después de la fecha de caducidad.
Filtre los reactivos o colorantes antes de usar.
Debe evitarse su contaminación durante su uso.
Todas las muestras deben considerarse potencialmente peligrosas, manipular como
agente altamente infeccioso.
Realizar control de calidad.
6. Muestra, materiales y equipos.
6.1 Muestra: Cualquier tipo de muestra, según solicitud de personal médico.
6.2 Materiales:
Papel absorbente.
Laminas nuevas.
Colorante violeta de gram.
Colorante lugol de gram.
Alcohol cetona.
Colorante fucsina de gram.
Marcador o lápiz de cera
6.3 Equipos:
Microscopio.
Reloj cronometro digital.
13. Procedimiento
RESPONSABLE P-H-V-A ACTIVIDAD REGISTRO
Coordinador
laboratorio
P Velar por la adquisición, recepción y
almacenamiento de los colorantes.
Formato
solicitud de
pedido.
Bacteriólogo H Flamear la lámina tres veces por el mechero.
Bacteriólogo H Colocar las láminas fijadas sobre el soporte con el
extendido hacia arriba, separadas y con el número
de identificación orientado hacia quien colorea.
Bacteriólogo H Cubrir el extendido con 0.5 ml de violeta de gram,
Dejar por 1 minutos.
Bacteriólogo H Enjuagar con agua de chorro.
Bacteriólogo H Agregar 0.5 ml de lugol de gram, por 1 minuto.
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Bacteriólogo H Enjuagar con agua de chorro.
Bacteriólogo H Decolorar el extendido con 0.5 ml de alcohol
cetona por 15 segundos.
Bacteriólogo H Enjuagar con agua de chorro.
Bacteriólogo H Agregar al extendido 0.5 ml de fucsina de gram
por 40 segundos.
Bacteriólogo H Lavar con agua de chorro y escurrir.
Bacteriólogo H Dejar secar.
Coordinador
de
laboratorio o
de calidad
V Seguimiento al cumplimiento del procedimiento de
coloración.
Bacteriólogo A Si los resultados se hallan fueran del rango de
tolerancia, tomar las medidas correctivas
necesarias.
Registrar
Formato Acta
de Calidad
Resultados
Los microorganismos Gram positivos: al microscopio se observan de color violeta.
Los microorganismos Gram negativos: al microscopio se observan de color rojo.
Control de calidad de la coloración
Se debe realizar en forma rutinaria cada vez que se efectué la coloración de Gram.
Control Gram positivos
Se debe efectuar con una cepa de Gram positivos previamente identificada y conocida, para
lo cual se pueden emplear extendidos pequeños, utilizando una gota de solución salina estéril y
una colonia de la cepa seleccionada, dejar secar, fijar, rotular como control de Gram positivos y
guardar protegidos de la luz para ser usados cada vez que se realiza la coloración de Gram.
Control Gram Negativos
Se debe efectuar con una cepa de Gram negativos previamente identificada y conocida, para
lo cual se pueden emplear extendidos pequeños, utilizando una gota de solución salina estéril y
una colonia de la cepa seleccionada, dejar secar, fijar, rotular como control de Gram negativos
y guardar protegidos de la luz para ser usados cada vez que se realiza la coloración de Gram.
Control De Calidad Interno
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Se prepara varios extendidos disponiendo sobre las láminas portaobjetos una gota de
solución salina
Se coge una colonia de la cepa ATCC de Gram (+) y se emulsiona en la solución salina
Se coge una colonia de la cepa ATCC de Gram (-) y se emulsiona en la misma gota de
la solución salina.
Se extiende y se deja secar.
Se marca en un extremo: Control Gram
Se guardan en una caja de láminas marcada: Control de coloración de Gram y la fecha
de la preparación.
Se colorea una lámina de control de Gram al tiempo con las láminas de las muestras de
los pacientes de la rutina.
Se realiza la lectura: verificando la presencia del germen Gram (+) y Gram (-), violeta y rosada
respectivamente.
9. Anexos o Bibliografía
Manual de microbiología.
JACQUELINE OLAYA MARTINEZ CARGO: AUDITORA DE CALIDAD DE APOYO DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICO.
NOMBRE: ESAIN CALDERON IBATA. CARGO: COORDINADOR DE GARANTIA DE LA CALIDAD
NOMBRE : DAVID ANDRES CANGREJO TORRES CARGO: GERENTE
ELABORO REVISO APROBÓ