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8/18/2019 Principios Cromatografía
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“SeparacionesCromatográficas”
M. en C. Martha Hernández
Labra
Principios
• Fue inventada ydenominada así, aprincipios del sigloXX por el botánicoruso Mikhail Tswett.
Historia Sus estudiospioneros
se enfocaron
en la separaciónde clorofilas y
xantofilas
usando unsolvente
en una columnaempacada conCaO y alumina.
El nombre fue dadopor Tswett , viene delgriego chroma quesignifica color ygraphien que significaescritura,literalmente: escriturade color.
Definición
• Método de separación en el que seaprovechan las diferencias en elcomportamiento de partición entreuna fase móvil y una fase estacionariapara separar los componentes de unamezcla.
http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Chromatography_of_chlorophyll_results.jpghttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Chromatography_of_chlorophyll_results.jpg
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Definición de Términos
En todas las separaciones cromatográficasparticipan:
una fase móvil yuna fase
estacionaria
La fase estacionaria:
Consiste en partículas, general-mentesólidas, pequeñas y con una superficiemicroporosa, de forma que presenta unamplio desarrollo superficial.
Puede estar empaquetada en forma decolumna o extendida en forma de capa.
Fase EstacionariaSólidos muy porosos con
capacidad adsorbente: Gel desílice (SiO2); Alúmina (Al2O3),
CelitaLa superficie del gel de sílice
interacciona con los compuestosorgánicos mediante
interacciones de carácter polar :• Puentes de hidrógeno
• Interacciones electrostáticas
Los compuestos más polaresinteraccionan
más fuertemente con la sílica
La fase móvil:
• Puede ser un
líquido o un gas, y su función estransportar a loscomponentes de lamezcla a travésdel sistema cro-matográfico.
En cromatografía de líquidos(columna, capa fina, HPLC) lafase móvil es una mezcla de
disolventes llamada:ELUYENTE
En cromatografía de gases lafase móvil es el
GAS PORTADOR.
Fase móvil
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El Eluyente puede ser:
• Una solución isocrática que consisteen el empleo del mismo eluyente paralograr la separación.
• Una elución por gradiente queconsiste en mezclar dos o maseluyentes distintos de modo que lacomposición de la fase móvil cambiecon el trascurso del tiempo.
Eluyentes polares:Rompen más
eficazmente lasuniones de los
compuestos con lafase estacionaria.
Arrastran másrápidamente a los
compuestos.
Naturaleza del eluyente:
Eluyentes no polares:
No rompen lasuniones de los
compuestos con lafase estacionaria.
Arrastran muy
lentamente a loscompuestos.
Tendencias en las Fases móviles masempleadas y en Compuestos a
Separar
Clasificación
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Cromatografía de Intercambio Iónico
• En condiciones determinadas serán retenidasen la columna las muestras que tengan una
carga complementaria a la matriz del gel,siendo eluidas las restantes.• Para eluir las muestras retenidas se puede
variar la carga iónica del solvente o su pH deforma que se alcance al punto isoeléctrico dela muestra de interés o el de la matriz,neutralizando de este modo la fuerza queretiene a la muestra en la columna.
Cromatografía de Intercambio Iónico
• Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta.
• La carga de la matriz de la columna así como la carga
de la muestra dependerá del pH del solvente y de su
fuerza iónica (proporcional a la concentración de
iones).
• Se usa en la separación de moléculas grandes
(proteínas y ácidos nucleícos).
Carga negativa: intercambio de cationes
Carga positiva: intercambio de aniones
Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes seemplean intercambiadores iónicos inorgánicos.
Cromatografía de Afinidad o de ExclusiónMolecular
Cromatografía de Exclusión
• Hay diferentes tamaños de partículapara un gel.
• Este técnica se emplea en la separaciónde proteínas de alimentos,determinación de glucosa y fructosa enzumos de fruta, etc.
A menor tamaño mayor resolución ymenor gasto en la columna.
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Cromatografía de Afinidad
Permite la separación de mezclas por su afinidad o capacidad de unión a undeterminado ligando.
Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unenespecíficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente ala matriz de la columna.
Después de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eluídasa través de la columna, la muestra de interés que ha quedado retenida en lacolumna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución quecontiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre elligando y la proteína
Cromatografía de Filtración en Gelo de Adsorción
Técnicas Manualesde
Laboratorio
Cromatografía en CapaFina
Se utiliza para separar
moléculas relativamentepequeñas.
Consiste en una faseestacionaria y una móvil.
Fase estacionaria: CelulosaAlmidón, Azucares, Gel desílice (silicagel), Óxido dealuminio (alúmina) ,Carbón activo (carbón enpolvo)
•Lo anterior unido a unasuperficie sólida (vidrio,aluminio, plástico o papel) El principio es : La sustancia de interés se adherirá a la
fase estacionaria o se moverá con la fase móvil,viajando una distancia que es inversamenteproporcional a la afinidad por la fase estacionaria.
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La polaridad es la basede esta técnica.
La fase estacionariaformada por gel de sílicees polar y los analitos a
separar presentarándiferentes polaridades.
Quedarán mas retenidospor la fase estacionaria
los mas polares y,
la elección deldisolvente en función de
su polaridad,
hará que los analitossean arrastrados mas
rápidomas despacio,
incluso quedarcompletamente
retenidos en la faseestacionaria,
consiguiendo suseparación.
Factor de Retención
El factor de retención es un parámetro
dentro de la cromatografía que nos permitecuantificar la interacción entre la fase móvil yel analito que se esta logrando separar.
Dentro de la cromatografía en capa fina, esnecesario eluir la placa, revelarla, determinarla distancia que recorrió el analito para poderobtener el Factor de Retención.
Punto deaplicación
Frente delEluyente
Factor deRetención
Mezclas con menorpoder de elución:Arrastran poco a loscompuestos Rf menor
Influencia de la estructura de los compuestos en el Rf
Influencia del eluyente en el Rf
Mezclas con mayor poderde elución (más polares):Arrastran mucho a loscompuestos Rf mayor
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreadoses necesario revelar la posición de dichoscompuestos, para ello existen dos tipos de
métodos:
Métodos Físicos Métodos Químicos
Métodos
Químicos
Utilización de reactivosreveladores como:
Generales
Yodo, ácidosulfúrico.
Específicos
2,4 – dinitrofenilhidracina
(paraaldehidos ycetonas).
Verde debromocresol(para ácidoscarboxílicos).
Para-dimetilaminobenzalde
hido
(para aminas).
Ninhidrina(para
aminoácidos).
Métodos
Físicos
El más común
UV-Visible Temperatura
Reveladores
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Cromatografía en Columna
También es consi-
derada como croma-tografía preparativa,puesto que esutilizada para purificarsuficiente cantidad desustancia para un usoposterior, más quepara análisis.
En la cromatografía encolumna la separación seconsigue haciendo fluir lamezcla a través de unacolumna de adsorbente.
Los compuestos emergende la columna a tiemposdiferentes, y pueden serrecogidos en fraccionesseparadas.
Comúnmente se suele usarcomo adsorbente alúmina osílice. Las fases móviles seusan en función de lapolaridad de los compuestosa separar.A continuación se enumerauna lista de menor a mayorpolaridad de las fases mó-
viles comúnmente usadas:
HexanoTolueno
DiclorometanoCloroformo
Dietil éterAcetato de etilo
Acetona1-Propanol
EtanolMetanol
Agua