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Estación de Viticultura e Enoloxía de Galicia
• Microorganismos en la industria enológica y su relación con la calidad del vino
Pilar Blanco Camba
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Las levaduras y el vino
CARACTERÍSTICAS GENERALES
•Hongos microscópicos unicelulares
•Células eucariotas
•Morfología variada: esféricas, elípticas , ovaladas, alargadas, apiculadas
•Reproducción vegetativa o asexual por gemación (algunas por bipartición)
•Reproducción sexual. Formación de esporas
•Responsables de la fermentación alcohólica (transformación de azúcar en alcohol +CO2)
•Alteraciones (flor, refermentaciones)
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Organización de una célula procariota (A) y eucariota (B)
A B
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Principales levaduras vínicas
Nombre: Saccharomyces cerevisiaeCaracterísticas:
•Morfología elípticas u ovoides
•Alta capacidad fermentativa
•Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas)
•No asimila nitratos ni escinde arbutina
•Crecimiento en presencia de etanol
•Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa y rafinosa.
•No fermenta ni asimila lactosa
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Principales levaduras vínicas
Nombre: Kloeckera apiculata
Hanseniaspora guillermondii•Morfología: apiculadas (forma de limón)
•Aparece al inicio de la fermentación
•Fermenta la glucosa
•Bajo poder fermentativo (4%)
•Fuerte producción de ácidos volátiles
•No esporula (Hanseniaspora si esporula)
•No asimila nitratos
•No escinde la arbutina
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Principales levaduras vínicas
Nombre: Metschnikowia pulcherrima•Morfología: células ovoides aisladas o en parejas. A veces células grandes con un grueso gránulo central de grasa.
•Fermenta la glucosa
•Bajo poder fermentativo (1%)
•No asimila nitratos
•Escinde la arbutina
•Crece bien en presencia de alcohol
•No esporula
•En placa colonias blancas, brillantes con ligera coloración rojiza
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Principales levaduras vínicas
Nombre: Schizosaccharomyces pombe•Morfología : Células alargada o cilíndricas aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) µm
•División por fisión
•Esporulada
•No asimila nitratos ni escinde la arbutina
•Buena capacidad fermentativa
•Capacidad para degradar ácido málico a etanol y CO2 (fermentación maloalcohólica)
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Otras levaduras vínicas
Debaryomyces hansenii
Brettanomyces
Torulaspora
Cryptococcus
Debaryomyces hansenii
Rhodotorula
Levaduras formadoras de velo
•Saccharomyces (flor)
•Candida
•Pichia
•Hansénula
•Zygosaccharomyces
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Requerimientos nutricionales de las levaduras
•Fuente de carbono: azúcares•Fuente de nitrógeno•Sustancias minerales
•Factores de crecimiento (vitaminas)
El mosto reúne los requisitos adecuados para el desarrollo de las levaduras (Excepciones: maduración inadecuada, el ataque por botritis-falta de nitrógeno, etc). pH ácido-impide el desarrollo de muchas bacterias
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Origen de las levaduras de vinificación
Uva (flora epifítica)
Material de bodega
Inóculo (LSA)
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Sucesión de la población de levaduras a lo largo de la fermentación
Fase inicial
Predominio de levaduras apiculadas y de otras morfologías con baja producción de alcohol y elevada producción de ácidos volátiles (acético) Ex: Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Candida sp,etc.
Fase tumultuosa
Saccharomyces invade el medio, acaba dominando la fermentación y desaparecen las levaduras de la fase inicial
Fase final
Predominio de especies del género Saccharomyces. Produce más alcohol y menos productos secundarios
Albariño
900
950
1000
1050
1100
1150
1 3 5 7 9 11 13 15
Tiempo (días)
Dens
idad
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Evolución de la población de levaduras viables durante la fermentación
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
0 5 10 15
Tiempo (días)Lo
g NL
VFase inicial : 104-105
Fase tumultuosa: 107-108
Fase final: 105
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La fermentación alcohólica
Glucosa Acido pirúvicoGlucolisis
Acetaldehido
Etanol
Piruvato descarboxilasa
Alcohol deshidrogenasa
CO2
NADH2
NAD+
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Fermentación alcohólica: Influencia del temperatura y O2
Rango de Temperatura para fermentación en blancos: 14-20ºCRango para fermentación en tintos: 25-30ºC
Temperatura crítica >35ºC
TREIXADURA
9801000102010401060108011001120
0 10 20
Tiempo (Días)
Dens
idad
nTT16
nTT19
nTT22
O2: Las levaduras requieren O2 para su multiplicación ya que interviene en la síntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y responsables de su permeabilidad (práctica de remontado)
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Productos secundarios originados durante la fermentación alcohólica
•Glicerina – suavidad y aterciopelado
•Succínico- es el ácido que más impresiona el gusto (sabor a bebida fermentada, entre salado y amargo)
•Ácidos orgánicos (málico, cítrico, láctico, ácidos volátiles
• Acético y su éster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1ª fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino
•Metabolitos del ciclo diacetilo-acetoínico (a concentraciones elevadas son negativos)
glucosa Glicerina + pirúvico
Fermentación gliceropirúvica
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BACTERIAS LÁCTICAS•Gram +, catalasa -, no esporuladas, no móviles
•División por bipartición
•Microaerófilas o anaerobias facultativas y fermentadoras de azúcares
•Morfología: cocos y bacilos
•Según el metabolismo de la glucosa pueden ser:
-Homofermentativas- ác. láctico
-Heterofermentativas-ác. láctico, acético, CO2 , etanol, acetaldehido, acetoína, diacetilo,etc
•Responsables de la fermentación maloláctica
•Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones
•Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas para la salud
Oenococcus oeni
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BACTERIAS LÁCTICAS
aldolasa
Metabolismo homofermentativo de la glucosa (vía glucolítica de Embden-Meyerhof)
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BACTERIAS LÁCTICAS
Metabolismo heterofermentativo de la glucosa (ruta de Warburg-Dickens)
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Clasificación de las bacterias lácticas
L. oeni (O.oeni)L. mesenteroides(ssp. mesenteroides)
HeterofermentativosLeuconostoc
No descritas en vino
L. caseiL. plantarum
L. brevisL. hilgardii
I. Homofermentativos estrictos(No fermentan pentosasGlucosa- 2 ác. Láctico)II. Heterofermentativ. facultativos(Fermenta las pentosas y la glucosa)II. Heterofermentativ. obligatorios(No poseen el enzima aldolasa, fermentan la glucosa mediante la vía de las pentosa fosfato)
LactobacillusBacilos
P. damnosusP. pentosaceous
HomofermentativosPediococcusCocos
EspeciesMetabolismo de la glucosaGéneroForma
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Características de los principales géneros de bacterias lácticas
Algunas spcontienen ácidos teicoicos
Sin ácido teicoico
Sin ácido teicoico
Pared celular36-47%34-42%38-44%(G+C)%
NoNo Algunas cepasHidrólisis de la arginina
láctico, etanol, acético, CO2
DL ó L lácticoNo carbónico
CO2, láctico, etanol
Metabolismo de la glucosa
0,5-1,2 X 1,0-10 µm
1-2 µm ø0,5-0,7 µm øTamaño
Alargadas en pares e en cadenas
EsféricasDivisión en dos planos-tétradas
Esféricas o un poco alargadasEn pares o en cadenas
Morfología de las células
LactobacillusPediococcusLeuconostocCaracterística
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BACTERIAS LÁCTICAS: ecología
Origen•Uva •Material de bodega•Inóculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos puros o mezclas de 2-3 cepas)Evolución durante la fermentación•En uva- población muy baja •Mosto- 102-104 UCF/ml. Disminuyen por proliferación de las levaduras durante la fermentación alcohólica•Fase final – Empieza a aumentar la población de bacterias lácticas (lisis de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las condiciones de bajo pH y elevada concentración de etanol•La fermentación maloláctica se inicia cuando las UFC/ml= 106
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FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA
Málico Láctico + CO2
Enzima maloláctica(Bacterias lácticas)
Repercusiones en el vino•Desadificación biológica del vino
•Disminuye la acidez total y el málico (sabor astringente)
•Aumenta el ácido láctico (suavidad)
•Protege al vino de las enfermedades por bacterias lácticas
•Otras: Producción de diacetilo (aroma a “mantequilla”)
•A bajas concentraciones –bouquet
•A elevadas concentraciones - rancio
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Posibles rutas del ácido málico
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BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón malolácticaFactores que influyen en la fermentación maloláctica
•Características de la variedad (relación tartárico/málico), residuosfitosanitarios
•pH del medio (Actúan mejor a pH> 3.5; Tª óptima 4.2-4.5). El pH condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar(*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que sedesarrolle la FML pero también mayor peligro de que aparezcan enfermedades.•temperatura (19-25º)•Aireación (la presencia de una pequeña proporción de O2 es favorable)•Etanol (< 13%)•SO2 (no superior a 50 mg/L)
•Prácticas de vinificación (El tiempo de contacto del vino con los hollejos, contacto con las lías, trasiegos, etc. determinan la población de bacterias lácticas al final de la fermentación alcohólica) •Interacción de las bacterias con otros microorganismos
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BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica
Aplicación de la fermentación maloláctica•En tintos Mejora gustativa
Color menos rojo vivoAroma evolucionado (menos a uva y más a vinosidad)
•En blancos Puede ser deseable:•Repercute en el equilibrio grado/acidez•Disminuye la sensación de dureza y verdor•Peligroso en vino dulce
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BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica
Ventajas e inconvenientes de la fermentación maloláctica
Formación de aminas biógenas y carbamato de etilo
Mayor complejidad y atributos de envejecimiento
Aparición de olores y sabores anómalos
Reducción de amargor y astringencia
Incremento de acidez volátilIncremento aromático
Reducción de aromas varietalesGarantía de estabilidad
Reducción del colorReducción de la acidez y suavización organoléptica
InconvenientesVentajas
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Metabolismo del cítrico
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Bacterias acéticas•Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas
•Morfología variable (células elípticas o con forma de bastón corto agrupadas en pares o en cadenas)
•Tamaño: 0.6-0.8 x 1-4 µm
•Inmóviles o móviles por flagelos:
polares (G. Gluconobacter)
peritricos (G. Acetobacter)•Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica)•Oxidan el alcohol a ácido acético e incluso a CO2 y H2O•Producción de polisacáridos extracelulares (celulosa-afecta la filtrabilidad del vino) y pigmentos•Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO2
• Formación de velo
•En el vino pueden dar lugar al picado acético y su desarrollo esindeseable en todas las etapas de vinificación
.
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Bacterias acéticasECOLOGÍA DE LAS BACTERIAS ACÉTICAS
•Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas alcohólicas como el vino, la cerveza o la sidra
•En uva la población de bacterias acéticas depende del estado sanitario de la vendimia.
En uva sana: 102-103 UFC/mL (G. oxydans)
En uva atacada por Botrytis: 105-106 (mezcla de Guconobacter y Acetobacter)
•Durante la fermentación alcohólica la adición de sulfuroso y el desarrollo de las levaduras no afecta la población de bacterias acéticas. Existe una sucesión de bacterias acéticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por A. pasteurianus y A. aceti.
•Durante la fermentación maloláctica se mantiene la población
•Durante la conservación la población de bacterias acéticas puede aumentar y causar enfermedades.
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Clasificación de las bacterias acéticas
A. acetiA. pasteurianusA. liquefaciens
A. hansenii
G. oxydansEspecies
53-6556-64(G+C)%
+-Oxidación de acético hasta CO2
++Oxidación de etanol a acético
++Crecimiento a pH 4.5
peritricapolarFlagelación
AcetobacterGluconobacterCaracterística
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Metabolismo de las bacterias acéticas
•Oxidación del etanol a ácido acético (Gluconobacter y Acetobacter)
etanol acetaldehido Ácido acético
Alcohol deshidrogenasa
Aldehidodeshidrogenasa
•Oxidación del ácido acético a CO2 (Acetobacter)
CO2+H2OÁcido acético
TCA
*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la α-cetoglutaratodeshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa
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Metabolismo de las bacterias acéticas
•Metabolismo de los azúcares
Oxidación de los azúcares vía hexosas monofosfato
Oxidación de azúcares a cetonas
Glucosa – ácido 2-5 dicetoglucónico
Fructosa-cetofructosa
Xylosa-cetoxylosa
•Metabolismo del ácido láctico
Oxidación a pirúvico, acetaldehido y acético
•Metabolismo del glicerol
Oxidación a dihidroxiacetona
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ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO
•Introducción
•Alteraciones microbianas
Bacterias lácticas
Picado láctico
Amargor
Vuelta
Grasa o ahilado
Bacterias del ácido acético: Picado acético
Levaduras
Flor
Refermentaciones
Brettanomyces
•Sustancias tóxicas de origen microbiano
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INTRODUCCIÓN•Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante laelaboración y/o durante la conservación del vino
• Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formaciónde sustancias indeseables
•Evidencias: Turbidez, Gas, Transformación del color
•Factores a favor:
Composición del vino (ácidos orgánicos, azúcares, factores de crecimiento y sales minerales)
•Factores en contra:
Grado alcohólico elevado
pH bajo
Baja temperatura
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Las bacterias lácticasProducen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del vino aunque haya sido bien elaborado
Microaerófilos o anaerobios facultativos
Importancia de la higiene en la bodega
Alteraciones producidas
Picado láctico- fermentación de azúcares residuales
Amargor- fermentación del glicerol
Vuelta – fermentación del tartárico
Grasa o ahilado –formación de polisacáridos en el vino
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Bacterias lácticas: PICADO LÁCTICO
PICADO LÁCTICO
•Fermentación de azúcares residuales con formación de acético y láctico
•Puede aparecer en vinos con azúcares residuales por cese de la fermentación alcohólica (Ex. Por altas temperaturas)
•Efecto en el vino: sabor agridulce (por el acético y el azúcar) y aumento de la acidez volátil
•También tiene lugar la fermentación manítica – formación de manitol a partir de fructosa (Vuelta manítica)
• Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitadoracional control de la temperatura
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Bacterias lácticas: AMARGOR
AMARGOR
•Fermentación del glicerol formando lactico, acético, ácidos grasos y acroleína (reacciona con compuestos fenólicos como los taninos dando sabores amargos)
•Efecto en el vino: sabor amargo
•Muy rara, aparece e casos de mala cosecha
•Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentación de tartárico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)
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Bacterias lácticas: VUELTA
VUELTA• Origen: Fermentación del ácido tartárico para dar láctico, acético y CO2
•Efecto en el vino:No apto para el consumoDisminuye la acidez fija y aumenta la acidez volátil y el pHPierde sabor (insípido, flojo)Color apagadoTurbidez Formación de gas, vino con “aguja”“olor a ratón” (vuelta + otras causas-formación de 2-acetiltetrahidroxipìridina )
•Ataca a vinos poco ácidos, los mejores vinos son los más propensos
•No suele darse.
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Bacterias lácticas: GRASA
GRASA O AHILADO
•Causa: formación de polisacáridos en el vino que le dan aspecto oleoso.
•Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin ruido. La acidez volátil no siempre es elevada.
•Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones
•Prevención: empleo racional de sulfuroso que no impida la Fermentación Maloláctica pero sí la formación de grasa
•Corrección: con sulfuroso y agitado
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Bacterias lácticas: Otras alteraciones
Metabolismo de la argininaFormación de carbamato de etilo
Metabolismo de los aminoácidos del mostoFormación de aminas biógenas
Formación de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir del ácido sórbico
Olor a geranio
Formación de 2-acetil-tetrahidropiridinaOlor a ratón
Producción de diacetilo a partir del cítrico o del piruvato
Olor a mantequilla
CausaAlteración
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Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO
PICADO ACÉTICO O AVINAGRAMIENTO
•Oxidación del alcohol a ácido acético- Necesitan O2
•Causado por las bacterias acéticas o del vinagre que constituyen parte de la microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis
•Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales
•Avinagramiento- afecta a más volumen
•Efecto en el vino:
En cata- olor a acetaldehido
Enturbiamento y formación de velo
Aumento de la acidez volátil (Máxima permitida 0,65 g/L)
Producen acético (retrogusto, final de boca áspero y agrio) y acetato de etilo (indicativo de mala calidad)
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Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO
•Enfermedad muy corriente, perjudicial y difícil de corregir
•Prevención: Relleno de los depósitos y cierre hermético
Evitar trasiegos en períodos cálidos (la elevada temperatura aumenta la probabilidad de picado acético)
Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l)
Higiene de la bodega y los depósitos
•Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis
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LEVADURAS: Flor
FLOR•Enmohecimiento de la superficie del vino, velo
•Causado por levaduras que requieren O2
Candida mycoderma
Pichia membranifaciens
Hansenula anómala
Zygosaccharomyces
•Crecen en vino con alcohol < 13º y no tienen capacidad fermentativa
•Saccharomyces-”flor” útil para crianza biológica de los vinos
•Diferenciación: morfología al microscopio, aspecto del velo, capacidad fermentativa
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LEVADURAS: Flor
Buena. En mosto dan turbidez y carbónico
Nula o muy baja. En mosto forman velo
Capacidad fermentativa
Velo grueso, color crema y rugoso
Velo delgado, blanco o grisaceo, liso o poco plegado
Aspecto del velo
Células elípticas-ovoidesEn parejas o flóculos
Células cilíndricas, alargadas. A veces forman cadenas ramificadas
Observación a microscopio (forma y agrupación)
Saccharomyces “Flor”Levaduras de veloCaracterística
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LEVADURAS: Flor
•Efectos en el vino:
Disminuye la acidez fija y volátil
Disminuye el alcohol
en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del vino y origina turbidez
• La aparición de “flor” no es grave
•Recomendaciones para su prevención:
Filtración amicróbica
Cerrar bien los depósitos
Sulfitado adecuado
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LEVADURAS: Refermentaciones
Refermentaciones
• Provocan enturbiamiento y formación de gas
•No se forma velo
•Causadas por Saccharomyces, vía anaerobia
•Ocurren cuando hay azúcares residuales (<2 g/L)
•Control microbiológico: observación directa a microscopio
•En vinos con pocos azúcares residuales puede aparecer sedimentos
en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del
vino.
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LEVADURAS: Brettanomyces
Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporógena)
•Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentación)
•Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohólico con o sin azúcares
•Especie más frecuente: Brettanomyces bruxellensis
•Origina fenoles volátiles
p-cumárico 4-vinil-fenol 4-etil-fenol
p-ferúlico 4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol
VPR
*VRP-vinil fenol reductasa
descarboxilasa
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LEVADURAS: Brettanomyces
•Afecta las características organoléptica del vino
•Defectos causados por Brettanomyces:
Olores fenólicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al metabolismo de bacterias y levaduras
4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad
Alto contenido-defecto
Gusto a ratón (más raro)- derivados de la tetrahidropirina.
*También originados por bacterias lácticas Lactobacillus y Pediococcus
Producción de aminas biógenas
•Puede causar acidez volátil elevada
•Prevención: limpieza y desinfección de las barricas
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Sustancias tóxicas de origen microbiano
Origen de sustancias tóxicas en el vino
•Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc)
•Aditivos (SO2)
•Metabolismo microbiano
Etanol
Metanol
Aminas biógenas (descarboxilación de aminoácidos)
Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina)
Ocratoxina A
•Peligrosas para la salud humana
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Aminas biógenas
•Se originan por descarboxilación de los aminoácidos•Principales aminas biógenas en el vino:
Histidina-HistaminaOrnitina-Putrescina (diaminobutano)Tirosina-TiraminaEtilaminaFeniletilaminaCadaverina
•Origen de las aminas biógenas:Bacterias lácticas Levaduras
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Aminas biógenas
Efectos sobre la salud:
•Dolor de cabeza
•Problemas respiratorios
•Problemas de corazón (Palpitaciones)
•Hipertensión, hipotensión
•Cuadros de alergia
La sensibilidad a estos compuestos depende de cada individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol y/o drogas.
La histamina es la más tóxica.
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Aminas biógenas: papel de las bacterias lácticas
•Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas biógenas presentes en el vino.
•Baja concentración después de la F. Alcohólica
•El contenido aumenta durante la FML
•El contenido de aminas en vino varía de unas zonas a otras
•Depende de la microflora (varía con la cepa bacteriana) y de la presencia de aminoácidos en el vino (composición del mosto, metabolismo levaduras, prácticas enológicas-contacto con las lías)
•La microflora es más compleja cuanto más alto es el pH
•Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus ,
•La descarboxilación de aminoácidos tiene lugar en condiciones de estrés, como vía alternativa para obtención de energía
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Carbamato de etilo
• Se forma en el vino por reacción entre:Etanol+compuesto carbamílico
• El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras que conducen la fermentación. Las bacterias lácticas también degradan la arginina
• También se forma urea a partir de la degradación de ácidos nucleicos o de componentes de la uva
PrevenciónLimitar el contenido de nitrógeno en los mostos (evitar abonos nitrogenados y terrenos muy fértiles)Limitar activadores de fermentación y controlar las levaduras utilizadasControl de la temperatura durante las fermentacionesEliminación de la urea con ureasa ácidaBaja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo
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Alteraciones causadas por mohos
•Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduración
•Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros
•Efectos causados en el mosto y/o vino:
Reducción de la cosecha
Afecta el contenido de nitrógeno
Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra oxidásica
Alteraciones organolépticas
Afecta la estabilidad fisico-química del vino
Olor y sabor a moho
Aspergillus niger
Penicillium citroviride
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Ocratoxina A
•Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous, P. verrucosum, A. carbonarum)
•Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 días
Nefrotóxico
Cancerígeno (Grupo 2B-IARC “International Agency for Research on Cancer”
•Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5 ng/Kg dia (1998).
•Contenido máximo en vinos para el 2005 (2µg/L). (Propuesto en la 82 asamblea de la OIV)
•Detección : ELISA ó HPLC
•Incidencia:
Mayor en los países calidos, mediterráneos que en zonas frías
Mayor en vinos tintos que blancos
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Ocratoxina A
Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN ENOLOGÍA
•Toma de muestras
•Tratamiento de las muestras
•Siembra en medios de cultivo adecuados
•Recuento de células viables
•Aislamiento de microorganismos en cultivo puro
•Identificación de los microorganismos aislados
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Controles microbiológicos: Toma de muestras
•Viña (de uva, suelo, madera...)
•Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...)
•Mosto (antes y después de sulfitar)
•Fermentación (diariamente o en las distintas fases)
•Vino (después de la estabilización, clarificación, filtrado, embotellado...)
NOTA: Utilizar un recipiente estéril y manipular todo lo más asépticamente posible
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Tratamiento de las muestras
•Uva-Incubación en medio líquido apropiado durante 1h y siembra en placa para el recuento de células
•Mosto- Recuento al microscopio y cálculo de la dilución adecuada para siembra en placa y recuento de células
•Muestras de fermentación-Recuento, dilución apropiada y siembra
•Vino-filtración
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Recuento del nº de células viables por mL
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Medios de cultivo•Generales (YEPD, Agar mosto, WL)
•Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el crecimiento de los distintos grupos microbiano
Bacterias-antibióticos como el cloranfenicol
Bacterias lácticas- estreptomicina, penicilina, nisina
Levaduras-cicloheximida, pimaricina
Hongos- propionato sódico
•Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante microscopía con epifluorescencia)
•Conservación de las cepas (a -80ºC)
Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol)
Levaduras: YEPD+15% glicerol
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Aislamiento de levaduras
Toma de muestras• Uva• Mosto (sulfitado y sin sulfitar)• Fermentación
– Fase inicial– Fase tumultuosa– Fase lenta o final
Recuento y dilución adecuada de la muestraSiembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de
crecimiento bacteriano y de hongos)– YEPD– Agar malta– Agar Mosto– WL nutrient agar
Aislamiento en cultivo puro y conservación– Aislamiento: YEPD // Conservación: YEPD+15% glicerol
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Identificación de levaduras•Pruebas de identificación:
•Morfológicas (en placa, medio líquido y al microscopio)
•Esporulación
•Fisiológicas y Bioquímicas (dependen del estado fisiológico y del medio de cultivo)
Asimilación y fermentación de azúcares
Asimilación de compuestos nitrogenados
Producción de enzimas
Requerimiento de factores de crecimiento
Resistencia a cicloheximida,etc
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Identificación de levaduras
Pruebas de biología molecular:•Análisis del cariotipo•Análisis de DNA mitocondrial•Secuenciación y análisis de restricción del rDNA•PCR
Métodos rápidos de detección y cuantificación:(Especialmente útiles para microorganismos de crecimiento lento o para células viables pero no cultivables)
•Bioluminiscencia: (actividad metabólica; Ex. luciferasa)•Epifluorescencia: (tinción con un colorante fluorescente, Ex. Naranja de acridina)•PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RT-PCR•Hibridación in situ con sondas específicas marcadas con un fluorocromo
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Análisis del cariotipo
•Mediante electroforesis de campo pulsante
•Detecta polimorfismo del DNA genómico
•Diferenciación entre especies y cepas, mediante diferencias de número y tamaño de los cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de tamaño entre 250 y 2500 Kpb)
•Equipamiento específico, costoso y largo
•Requiere personal especializado y cepas aisladas
•Más discriminante que la técnica de PCR y DNA mitocondrial
Schuller et al. 2003
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Análisis del DNA mitocondrial
•Análisis del polimorfismo del DNA mitocondrial (muy polimorfo y estable)
•Requiere poca infraestructura de laboratorio
•Relativamente rápida y económica
•Diferenciación entre especies
•Diferenciación entre cepas de S. cerevisiae
•Requiere cepas aisladas y personalespecializado
EVEGA 2004
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Análisis de restricción del rDNA
•Implica la comparación de secuencias de genes que codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos (ITS
Comparación de secuencias
Comparación de fragmentos de restricción (PCR-RFLP)
•Requiere previa amplificación mediante PCR
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PCR
•Amplificación de secuencias específicas utilizando un termociclador
•Equipamiento costoso, personal especializado
•Técnica rápida que permite actuar en caso de necesidad
•Seguimiento de implantación de levaduras inoculadas en fermentación (Permite diferenciar LSA)
Schuller etal. 2003
•RAPDs- amplificación de regiones genomicas al azar utilizando primerscortos e inespecíficos (poco reproducible)
•ITS
•Amplificación de secuencias delta- flanquean el retrotransposón Ty
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Aislamiento e identificación de Brettanomyces
•Filtración de la muestra
•Siembra en un medio específico (crecimiento lento, en medios
convencionales las otras levaduras crecen más rápido)
Medio DBDM
Crecimiento 25º C, 2 semanas
•Identificación : métodos convencionales
•Métodos moleculares: PCR, hibridación in situ con fluorescencia,
PCR a tiempo real
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Aislamiento e identificación de bacterias acéticas
•Medios de cultivo
•Suplementados con inhibidor del crecimiento de levaduras y de bacterias lácticas
WL+ 2% etanol (ó 10% de vino estéril). Colonias color verde
GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO33%, agar %)
Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura 1%, agar 1,5%)
MRS + 2% etanol
•Temperatura de incubación: 25-28º C (5-7 días)
•Condiciones aeróbicas
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Aislamiento e identificación de bacterias acéticas
•Pruebas de identificación
Gram +, Catalasa –
Oxidación del etanol, glicerol y lactato
Formación de compuestos cetónicos
Crecimiento en acetato sódico o etanol como única fuente de carbono
Crecimiento en dulcitol
Producción de pigmentos marrones en GYC
Producción de celulosa (filtrabilidad del vino)
•Métodos moleculares (PCR y secuenciación de rRNA 16S)
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Aislamiento e identificación de bacterias lácticasAISLAMIENTO• Medios de Cultivo
AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni)MRS
• Incubación en estufa de anerobiosis• Temperatura y tiempo de incubación. 30º durante 48 h• Pruebas de Identificación
– Gram +– Morfología (coco o bacilo)– Homofermentativa o heterofermentativa– Fermentación de azúcares– Crecimiento en determinadas condiciones de pH, Tª
• Técnicas moleculares–PCR específica (primers del gen-enzima maloláctica) (O. oeni)
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Aislamiento e identificación de bacterias lácticas
Características identificativas de Oenoccocus oeni
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Control microbiológico de vinos embotellados
Filtración de una cantidad de vino conocida utilizando un sistema adecuado
Colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado
Crecimiento a temperatura adecuada
Recuento de microorganismos viables presentes en la muestras
Identificación de los microorganismos encontrados
Evaluación del riesgo
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Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos
•Mantener unas condiciones higiénicas adecuadas en la bodega
•Procurar que la uva entre en buenas condiciones
•Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con una concentración de azúcar < 2g/l
•Sulfitado adecuado (25-30 mg/L)
•Conservación adecuada: Mantener los depósitos llenos y cerrados y a baja temperatura
•Filtración amicróbica de los vinos antes del embotellado
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Selección de levaduras y bacterias en enología
• Papel en la calidad del vino
• Bacterias
Criterios de selección
Uso de bacterias seleccionadas
• Levaduras
Criterios de selección
Levaduras seleccionadas
Levaduras autóctonas: ventajas e inconvenientes
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Selección de bacteriasCaracterísticas deseables para cultivos iniciadores de bacterias lácticas
•Elevada degradación de ácido L-málico
•Resistencia a grado alcohólico elevado (en torno al 15%)
•Resistencia a SO2 (a concentración 50 mg/L)
•Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez)
•Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas
•Baja producción de acidez volátil
•Buenas propiedades organolépticas (ausencia de caracteres sensoriales -)
•Metabolismo limitado de azúcares
•Resistencia al ataque de bacteriofagos
•No producción de polisacáridos extracelulares
•No producción de compuestos tóxicos (Ej: aminas biógenas)
•Fácil obtención de biomasa y resistencia a los procesos de congelación y liofilización
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Selección de bacterias
Obtención de cultivos iniciadores de bacterias
Obtención de biomasa, centrifugado y liofilización
Utilización de bacterias comerciales
Siembra directa o con rehidratación y/o reactivación previa
Control de calidad de las cepas comerciales
•Caracterización de la especie
•Viabilidad (UFC/g)
•Determinación de la actividad maloláctica
•Verificación de la ausencia de contaminantes (coliformes, estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos)
•Verificación de caracteres fisiológicos sobre medios sintéticos y vinos
•Verificación de la ausencia de fagos
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Selección de levaduras autóctonas
Criterios generales:•Ser autóctona•Buena capacidad fermentativa (rápido arranque y acabado)•Alta producción de etanol y regularidad fermentativa• Alta tolerancia al etanol•Producción baja de acidez volátil•No formación de espuma•Resistencia a sulfuroso •Baja producción de sulfhídrico•Otras: fenotipo killer
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Selección de levaduras autóctonas
Levaduras seleccionadas para elaboración de blancos•Tolerancia a bajas temperaturas•Potenciación de aromas varietales y expresión de aromas secundarios•Capacidad de acidificación y desacidificación biológica•Crecimiento disperso en medio líquido
Levaduras seleccionadas para tintos•Alta producción de acetaldehido y pirúvico-estabilización del color•Baja capacidad de adsorción de antocianos a la PC•Producción de glicerol- suavidad•Degradación del ácido málico
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Selección de levaduras autóctonas
Uso de levaduras comerciales (LSA)Ventajas
•Calidad más uniforme, garantiza repetitividad
•Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentización o
paradas de fermentación
•Homogeneidad en los vinos
Inconvenientes
•Pérdida de complejidad en el vino final
•No son propias de la región
•Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras
presentes en el mosto
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Selección de levaduras autóctonas
Ventajas de las levaduras autóctonas
•Específicas del área
•Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona
•Totalmente adaptada al tipo de mosto
•Responsables de características únicas de los vinos (tipicidad)
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