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Prcticas de Laboratorio de Microbiologa
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1.1. Determinar efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin deoxgeno, sobre la morfologa y desarrollo de cultivos bacterias aislados en la
prctica anterior.
1.2. Aprender tcnicas de siembra y lectura de crecimiento en cultivos slidos ylquidos, y en cultivos en anaerobiosis
1.3. Realizar tcnica de microcultivo de Hongos para optimizar las observaciones ycaracterizacin de estructuras vegetativas y reproductivas
Para estudiar un microrganismo es necesario previamente poder aislarlo y cultivarlo en
las condiciones del laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cules son las
condiciones medioambientales y los nutrientes que requieren para su ptimo desarrollo y
reproduccin. En general, cuando se habla de desarrollo o crecimiento microbiano este
puede ser definido por un aumento de la masa celular, en el caso de las bacterias la
mayora de las veces nos referimos a un crecimiento poblacional mediado por los
procesos de replicacin del ADN y divisin celular, donde cada clula aislada o UFC
(Unidad Formadora de Colonia) origina primero 2 clulas hijas por fisin binaria hasta
conformarse una colonia y es una medida cuantitativa del nmero de bacterias iniciales.
En los hongos podramos hablar de un crecimiento celular ya que de una misma hifa o
espora se puede generar una gran cantidad de masa celular sobre el medio de
crecimiento formndose, y una vez que esporula cada espora es un individuo potencial y
hablamos de crecimiento poblacional. En esta oportunidad nos vamos a centrar en los
factores medioambientales o abiticos que condicionan las capacidades metablicas de
los microrganismos y por lo tanto su crecimiento, dejando de lado las relaciones intra e
inter-especficas que pueden afectar la dinmica del crecimiento microbiano.
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Ya sea que hablemosde crecimiento poblacional o celular factores como la temperatura, el pH, la presin
osmtica, la tensin de oxgeno, la intensidad lumnica y la presin atmosfrica afectan,
retardan, aceleran o definitivamente detienen el crecimiento de los microrganismos y los
llevan a la muerte. El identificar la influencia sobre el desarrollo y crecimiento
microbiano de dichos factores nos ayudar a explicar su distribucin en la naturaleza y
a disear mtodos para su control o inhibicin total (ver 6. Lectura complementaria).
No todos los microrganismos responden de la misma forma a un factor ambiental
determinado, convirtindose en una herramienta til a la hora de su aislamiento, cultivo,
clasificacin e identificacin en el laboratorio, dependiendo de si el microrganismos espatgeno (causante de enfermedad), saprfito (flora inocua que vive en la materia
orgnica muerta y ayuda a su descomposicin) u oportunista (puede causar enfermedad
o no dependiendo de los factores nutricionales, estructurales e inmunes del husped y
del medio), siendo este ltimo el que puede adaptarse a rangos ms amplios de dichas
condiciones. De hecho una condicin ambiental puede ser daina para un
microrganismo o beneficiosa para otro, pueden tolerar algunas condiciones adversas, que
rebasadas nos les permiten crecer y por lo tanto debemos diferenciar entre las
condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproduccin.
a. Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de ms de 2000reacciones bioqumicas de una gran diversidad, y la velocidad con que se efectan
dichas reacciones esta influida por la temperatura, l cuela puede determinar en parte la
velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microrganismos. Las
variaciones en temperatura pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa
celular. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento
clasificndose segn esto en los siguientes grupos:
Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima esalrededor de los 15 C. Ej: Flavobaterium sp
Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. Ej: Escherichia coli Euritermfilas: termfilas facultativas, aquellas que son capaces de crecer entemperaturas de las mesfilas. Ej: Bacillus stearothermophilus
Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C. Ej: Thermococcus celer Hipertermfilas: crecen a temperaturas superiores a los 80 C 1Pyrodictium brockii1
Hasta hace poco la temperatura ms alta de crecimiento reportada era de 105 C, entonces se crea que el
lmite de temperatura para la vida era de 100 C (punto de ebullicin del agua). Se han encontrado bacterias
que crecen en chimeneas calientes hidrotermales o "black smokers" (fumarolas negras) ubicadas en las
grietas del suelo ocenico que expulsan aguas bentnicas a temperaturas superiores a los 350 C. Se ha
demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 C.
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b. Potencial de hidrgeno, es un de los factores ms importantes ya que condiciona ladisponibilidad de nutrientes del medio para el microrganismo y refleja a la vez los
efectos sobre el medio del metabolismo mismo del microrganismo. Algunos
microrganismos toleran cambios de pH de 3 o 4 unidades. Los microrganismos que
soportan pH cidos se denominan acidfilos y pueden llegar a crecer en ph 4, los que
soportan pH bsicos se llaman basfilos o alcalinfilos. Como ya se sabe el pH
depende del tipo de soluciones que se encuentren presentes y disociadas en el medio,
y as mismo el pH puede cambiar por los procesos metablicos de los microrganismos
que generan sustancias cidas o bsicas que son liberadas al medio por la clula:
Utilizacin de carbohidratos---->Produccin de cidos orgnicos----> Acidificacin Catabolismo de protenas---->Produccin de materiales nitrogenados---->Alcalinizacin
Aunque los microrganismos crecen a menudo en medios con amplios rangos de pH, su
tolerancia tiene un lmite ya que variaciones intensas pueden alterar la membrana
citoplasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras, la
muerte bacteriana se produce su el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5, los
cambios de pH pueden ionizar los nutrientes disminuyendo su disponibilidad por el
organismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas
tampn o buffer que mantenga el pH del medio regulado durante todo el crecimientopara que no se vea afectado por el metabolismo del microrganismo. Uno de los ms
utilizados en microbiologa es la combinacin de Fosfatos de Potasio (KH2PO4 y
K2HPO4, manteniendo el pH del medio en aprox. en 6,8) tambin se usa la peptona.
El pH del medio se puede ajustar antes de esterilizarlo, titulando parte del medio con
Hidrxido de Sodio (NaOH) o Acido Clorhdrico (HCL) y ajustando el resto con las
mismas sustancias. De acuerdo al rango de pH ptimo de crecimiento los
microrganismos pueden clasificarse como:
Acdofilos: 0 a 5,5 Ej: Thiobacillus thiodoxidans, ptimo 2,0 a 3,5 Neutrofilos: 5,5 a 8.0 Ej: Escherichia coli, ptimo 6,0 a 7,0 Basfilos o Alcalfilos: 8,5 a 11,5, Ej: Bacillus alcalophilus, ptimo 10,6 (alcalfiloextremo)
c. Presin osmtica/Disponibilidad del agua: Los medios de cultivo deben ser ligeramente
hipotnicos que el interior de la clula, ya que de esta manera se facilita el flujo de
agua con nutrientes disueltos hacia el interior de las clulas. Aunque para la mayora
de los microrganismos el Cloruro de Sodio (NaCl) no es indispensable para su
crecimiento (salvo para las bacterias marinas (%NaCl=3) que requieren de
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concentraciones de Na en el medio para mantener en su interior concentraciones de K
adecuadas. Existen bacterias que requieren de medio hipertnicos denominadas halfilascomo Halobacterium sp (halfilo extremo) que pueden soportar hasta un 20% de
concentracin de NaCl, encontrado en lagos salados como los del Mar muerto (aw=
0.75)
La concentracin de solutos esta condicionada por la cantidad de agua disponible en el
medio, expresada en trminos fsicos como actividad del agua aw2. Se presenta en
rangos desde 1.0 (agua pura y pan), pasando por 0,95 (conservas), 0.80 los lagos
salados, 0,75 (cereales, caramelos, frutos secos, chocolate) hasta 0.60 (leche en
polvo). Por debajo de 0,55 se altera el ADN y por lo tanto no hay sobrevivencia.
La mayora de los microroganismos crecen e aw superiores a 0.95 donde se ubican losdel mar aw= 0,98. En actividades de agua inferiores hablamos de organismos
osmotorelantes que sintetizan o acumulan sustancias en el citoplasma para obtener agua
del medio denominadas solutos compatibles (pues no inhiben la bioqumica celular),
tales como la batana, prolina, glutamato, sacarosa, ectona, etc., esta capacidad esta
regulada genticamente permitiendo clasificar dichos microrganismos de acuerdo a la
concentracin y tipo de soluto compatible encontrado en su citoplasma. Existen especies
sacarfilas como la levadura Sacharomyces rouxii que pueden soportar aw cercanos a
0,60, otros se denomina xerfilos que crecen en ambientes muy secos con poca
disponibilidad de agua.
d. Tensin de Oxgeno:Los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el
oxgeno y el dixido de carbono. Casi todos los organismos superiores son aerbicos
obligados, donde el oxgeno acta como, aceptor final de electrones durante la
respiracin aerbica, adems los eucariotes utilizan el oxgeno para sintetizar esteroles y
cidos grasos instaurados. Los microrganismos presentan una respuesta amplia y variable
al oxgeno libre (Ver Tabla en la siguiente pgina)
Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la
exposicin de estos microrganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de
anaerobiosis por los siguientes mtodos: Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sdico,para disminuir el contenido de O2.
Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y remplazndolo por N2 o CO2. Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivoinoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender
una vela se consume el oxigeno presente.
2aw: Razn entre la presin de vapor de aire con una sustancia o solucin y presin de vapor del agua pura a
la misma temperatura de la sustancia, inversamente proporcional a la presin osmtica.
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Tabla 3.1.: Relaciones de los microrganismos con el Oxgeno
Grupo Requerimiento
O2
Metabolismo Ejemplo Hbitat tpico del
Ejemplo
Aerbicos
Obligados o
Estrictos
Si Respiracin aerbica Micrococcus luteus Piel, polvo
Facultativos No Respiracin aerbica y
anaerobia, Fermentacin
Escherichia coli Intestino
Microaerfilos Si, baja
tensin
Respiracin aerbica Spirillium
volutans
Lagos
Anaerobios
Aerotolerantes No Fermentacin Streptococcus
pyogenes
Tracto respiratorio
Obligados o
Estrictos
Letal Fermentacin,
Respiracin anaerobia
Methanobacterium
formicicum
Diverso, rumen
Para los microaerfilos que no soportan tensiones de oxgeno atmosfricas mayores
(20%) se deben suministrar tensiones de 2 al 10%. Entre bacterias y protozoos
podemos encontrar todos los 5 grupos de tolerancia e intolerancia al O2, los hongos son
normalmente aerbicos, las levaduras anaerobias facultativas y las algas son aerbicas
obligadas. El oxgeno puede llegar a ser txico para algunos organismos ya que
muchas enzimas se inactivan cuando se oxidan. Cuando los organismos tienen comoaceptor de electrones al oxgeno, deben protegerse a si mismos sintetizando enzimas
como la superoxido dismutasa y la catalasa, ya que los productos de la reduccin del
oxgeno mismo son extremadamente txicos, como el radical superxido, el perxido de
hidrgeno y el radical hidrxilo. Estas enzimas son ausentes en los anaerobios
estrictos.
e. Suministro de luz: Los organismos fotosintticos o fototrfos debern ser expuestos a
una fuente de iluminacin ya que la luz es su fuente de energa, como es el caso de
las cianobacterias y algas. Esta fuente de iluminacin no debe plantear problemas de
variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con undesprendimiento mnimo de calor.
Para reproducir los microrganismos en
el laboratorio es necesario suministrarles adems de las condiciones ptimas para su
desarrollo, los nutrientes necesarios: fuentes de carbono (principalmente azcares), sales
inorgnicas (macro y oligoelementos), protenas (aminocidos y N orgnico) y factores
de crecimiento (vitaminas) necesarias a travs de la formulacin de medios de cultivo
sintticos o la utilizacin de materias primas naturales. Sea cual fuere el origen del
medio, este debe prepararse y esterilizarse de tal forma que facilite la observacin del
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crecimiento microbiano y la seguridad de contar con un medio libre de otros organismos
contaminantes. Los medios de cultivo deben ser diseados segn la especificidad delanlisis, el tipo de microrganismo interviniente y sus condiciones ptimas de desarrollo.
Los medios comnmente utilizados renen los requerimientos bsicos de la mayora de
los hetertrofos. En general los medios de cultivo se clasifican segn:
a. Estado:
Medios lquidos Medios slidos, llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacridoproducido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una
concentracin del 1,5%
Medios semislidos: agar a una concentracin del 0,7%.a. Composicin: Medios sintticos o qumicamente definidos, tienen un fuente de carbono, fuente denitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a
concentraciones conocidas.
Medios complejos o de composicin indefinida, estos llevan ingredientes como extractode levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen
nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni
cuantitativa de estos nutrientes.
Medios de enriquecimiento, son medios complejos (normalmente) con aditivosadicionales para favorecer el crecimiento de determinados microrganismos (particularmente
hetertrofos exigentes). Ej: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales
y plantas.
Medios selectivos, son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especficode un microrganismo particular (o grupo de microrganismos). Es de gran utilidad para
el aislamiento de microrganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ej: CO2
como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe
el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo
crecern los que usen maltosa.
Medios diferenciales, son aquellos destinados a facilitar la discriminacin demicrorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos
medios. Ej: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia
lactosa (+) de lactosa (-).
Medios de mantenimiento, suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que elcrecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas, por lo
general se les suprime la glucosa para mantener una poblacin normal, evitando la
acidificacin del medio que afecte las clulas
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Medios de recuento, utilizados para realizar recuentos de microrganismos con algnnivel de seleccin, Ej: Verde bilis brillante, TSA Triptona Soya Agar para mesfilosviables.
Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras
tomadas por cada grupo.
3.1. Efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno. Materiales
por grupo:
temperatura pH presin osmtica tensin de oxgeno
3 cajas de petripequeas con Agar
Nutritivo AN
3 Cajas de petripequeas con AN con
los siguientes pH
4 tubos de ensayocon CN con las
siguientes
concentraciones:
1 tubo de ensayo conAN sin solidificar para
siembra con prueba
de tensin de O2
Temperaturas a
cultivar:
4 C, 37oC, 60o C
1 caja con pH 2
1 caja con pH 6.8
1 caja con pH 8.5
1 tubo con [0.85%]
de NaCl
1 tubo con [3%] de
NaCl
1 caja de petri
pequea con AN para
cultivo en anaerobiosis
1 tubo de ensayo con
TSB Caldo Triptona
Soya efecto
temperatura deebullicin (100oC)
Caja de galletas o
frasco de boca ancha
de 30 cms, 2 velas
Nevera, Incubadoras (37oCy 60oC), Bao Mara
Procedimiento.
1. Realizar pases de la cepa purificada y caracterizada con asa redonda en cada uno
de los medios segn sea lquido o solido, y de acuerdo a las pruebas de temperaturas,
pH, presin, etc.
2. Salvo las pruebas de temperatura incubar el resto de los medios sembrados a 37oC
3. Realizar pase de la cepa en tubo de ensayo con TBS, someter 15 minutos a 100
C en Bao Mara, realizar extensin y tincin con Gram y luego incubar a 25 oC4. Realizar siembra profunda de la cepa, aplicando AN fundido para observar efecto de
la tensin de oxgeno sobre el crecimiento
5. Realizar siembra en caja de petri con AN y someter en cmara de anaerobiosis
(caja de galletas con velas encendidas)
6. Realizar lecturas comparando crecimiento, morfologa macro y micro de la cepa
purificada para determinar efecto de la temperatura y los otros factores sobre la cepa
6. Mantener cepa purificada en nevara sellado con vinipel, no descartar el primer
aislamiento.
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3.2. Crecimiento en Agar Inclinado y Motilidad
1 Tubo con Agar Nutritivo Inclinado1 Tubo con medio para ver motilidad SIM3
Procedimiento.
1. Sembrar inoculo de la cepa bacteriana aislada con asa recta en tubo de agar
inclinado y tubo con medio SIM, de forma precisa y recta.
2. Observar y describir tipo de crecimiento en ambos medios, en el medio SIM observar
coloracin y reaccin segn literatura.
3.3. Crecimiento y observacin de estructuras microscpicas de Hongos en Microcultivo
Cepas de hongos aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras
tomadas por cada grupo. 1 montaje de microcultivo esterilizado por cada grupo conmedio PDA o Saboraud
Figura 1. Tcnica de Microcultivo
Procedimiento.
Se deposita un cuadrado del medio estril sobre un portaobjetos previamente esterilizado.
Se siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjeto sobre el cuadrado de
medio, se lleva a incubadora de 25oC, hacen observaciones a las 24, 48 y 72 horas.
Cuando se verifica crecimiento de micelio del hongo sobre el medio y por ende en el
cubreobjeto, se toma este cuidadosamente y se coloca sobre una gota de azul de
lactofenol o azul de metileno, se sella con esmalte y se observa al microscopio para
hacer descripcin microscpica de las estructuras vegetativas y de reproduccin del
hongo. Anote en cuadro sobre estudio de su cepa de hongo que viene complementando
desde la clase anterior
Otros materiales.
Coloraciones de Gram, Azul de Lactofenol, Azul de Metileno Portas y cubreobjetos Microscopio, Hipoclorito, Alcohol, Solucin salina (0,85%), Asas, Pinzas, Gradilla y Mechero3Medio SIM: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de
hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
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Cinta de enmascarar, vinipel
5.1. Investigue otros 2 ejemplos de microrganismos, segn la clasificacin realizada deacuerdo las condiciones de temperatura, pH, tensin de oxgeno, presin
osmtica,
5.2. Investigue otros ejemplos de medios de cultivo segn los tipos presentados, cuales la composicin y el principio de lectura del medio SIM que se utilizo para ver
motilidad
5.3. Cules con los organismos barotolerantes y barfilos, donde se encuentran, citeejemplos.
Anote y dibuje de esta manera sus observaciones de las cepas aisladas/ sembradas en
los diferentes medios y factores (temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de
oxgeno), referenciado los resultados de crecimiento4 y morfologa macro y microscpica
de la cepa
No.
Grupo/
Muestra
Morfologa
previa
Macro y
Micro del
Aislamiento
4 C 25 C 60 C 100 C
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Anote los resultados sobre efecto del pH:
No.
Grupo/
Muestra
Morfologa
previa
Macro y
Micro del
Aislamiento
pH 2 pH 6.8 pH 8.5
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:
4Crecimiento: Abundante: +++ , Medio: ++ , Escaso: + , Nulo: 0
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No.Grupo/
Muestra
Morfologaprevia
Macro y
Micro del
Aislamiento
0.2 % Na Cl 0.85% Na Cl 15% NaCl
Crecimiento Morfo. Crecimiento Morfo. Crecimiento Morfo.
Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:
No.
Grupo/
Muestra
Morfologa
previa
Macro y
Micro del
Aislamiento
0.2 % Sacarosa 0.85% Sacarosa 15% Sacarosa
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Crecimiento
Morfo
Macro y
Micro
Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en cuenta la siguiente
clasificacin:
Aerbico
Facultativo
Aerbico
Obligado o
Estricto
Microarerfilo Anaerobio
Aerotolerante
Anaerobio
Obligado o
Estricto
O
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CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS:ESTERILIZACION Y DESINFECCION
Reconocer las principales tcnicas de control de las poblaciones microbianas:
Esterilizacin y Desinfeccin, revisin terica
a. Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas.
b. Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos.
c. Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el
desarrollo de los microrganismos e incluso pueda matarlos.d. Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microrganismos al campo de
trabajo.
e. Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del
crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.
f. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microrganismos
(antibacterianos, antifngicos, etc.)
g. Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las
esporas de un microrganismo (bactericida, fungicida, etc.).
h. Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microrganismos
(bacteriostticos, fungistticos, etc.).i. Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.
j. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.k. Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.l. Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de
enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas
malignas.
m. Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otroser vivo
Otro aspecto necesario y crtico en el trabajo en microbiologa es el lavado, desinfeccin
y esterilizacin adecuados segn el tipo de material y su uso. En general se utiliza
material de vidrio y algunas veces de plstico como el polipropileno, polietileno y el
niln (entre ms opaco el material como el niln ms soporta calor y puede ser
esterilizado. En todos los casos debe ser esterilizado primero el medio de cultivo o
material usado o contaminado antes de descartarlo, luego se retira con cepillo y agua
los desechos y se sumerge por 3 horas en detergente, se lava bien y se deja secar
en un horno o a temperatura ambiente. Si se requiere estril se lleva al autoclave, el
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cual funciona a base de calor hmedo a temperatura de 121C por 15 libras/pulgada2
de presin, durante 15 a 30 minutos. Tambin se puede esterilizar en fro con oxidode etileno, con radiaciones ionizantes (rayos gamma emanados por fuentes de Cobalto
68 o cesio 139), rayos catdicos (generadores de electrones), rayos X (mortales para
todas las clulas), ests tcnicas son costosas, sin embargo son efectivas y puede
utilizarse constantemente con material de plstico. La luz ultravioleta (bactericida desde
los 333 nm) es usada frecuentemente en laboratorios especializados y quirfanos para
reducir el nmero de bacterias del ambiente, sin embargo no se usa para esterilizar
material del laboratorio debido a su poca penetrabilidad.
Es conveniente tapar o envolver el material antes de esterilizarlo con tapones de algodn
y gasa y con papel kraft, mantenindolos en un lugar seco hasta su uso (de estaforma una material esterilizado puede durar hasta un ao disponible). De la misma
forma una vez preparados y bien disueltos los medios de cultivo se esterilizan en fiolas
llenas hasta la mitad y sin cerrar totalmente. Para luego verterlas en los tubos o cajas
de petri siempre al lado del mechero.
Los procedimientos de esterilizacin y desinfeccin por calor se basan en que los
diferentes microrganismos tienen rangos de temperatura especficos, teniendo un mximo
de temperatura sobre la cual detienen su crecimiento y pueden morir por la
desnaturalizacin de sus sistema enzimtico y una temperatura mnima bajo la cual no
se desarrollan ya sea porque los proceso de sntesis de protenas son extremadamentesensibles al fro o por que los lpidos empiezan de su estructura celular empiezan a
solidificarse. Cada microrganismo se ubica dentro de un lmite estrecho de temperatura
ptima que favorece su metabolismo y reproduccin. Para la mayora de las bacterias
patgenas la temperatura ptima esta entre 35 y 37 C, de esta forma en un proceso
infeccioso la fiebre es un mecanismo de defensa del ya que al presentarse una
temperatura mayor se desnaturalizan protenas esenciales del patgeno causando su
muerte o deteniendo su proliferacin. Las clulas vegetativas son ms sensibles al
calor que las esporas, que se constituyen en estructuras de resistencia en las cuales ha
ocurrido un proceso de deshidratacin y acumulacin de sustancias como el dipicolinato
de calcio en la pared celular. Sin embargo con la temperatura que puede alcanzar el
autoclave la mayora de las esporas se inactivan.
Criterio de muerte de un microrganismo: prdida irreversible de la capacidad de
reproduccin en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana
(la muerte de los microrganismos) se utilizan tcnicas que descubran a los
sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de
reproducirse estn muertos. Esto se determina generalmente mediante mtodos
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cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque
forman colonias.
Cuando una poblacin microbiana se expone a un agente letal, la cintica de la muerte
es casi siempre exponencial ya que el nmero de supervivientes disminuye de forma
geomtrica con el tiempo. Si representamos grficamente el logaritmo del nmero de
supervivientes frente al tiempo se obtiene una lnea recta cuya pendiente negativa define
la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice solamente que fraccin de la
poblacin inicial sobrevive a un determinado perodo de tratamiento. Para determinar el
nmero real de sobrevivientes es necesario conocer adems el tamao inicial de la
poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilizacin hay
que tener en consideracin dos factores: la tasa de mortalidad y el tamao de lapoblacin inicial. En la prctica de la esterilizacin la poblacin microbiana que ha de
ser destruida es mixta. Como los microrganismos difieren ampliamente en su resistencia
a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao de la
poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la
poblacin mixta. Para asegurar la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin se utilizan
suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de
esterilizacin se disean siempre de forma que proporcionen un amplio margen de
seguridad.
a. Temperatura: a mayor temperatura mayor accin.b. Tipo de microrganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms
susceptibles que las esporas.
c. Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que lasviejas.
d. Ambiente: El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en lapenetracin del agente.
Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistenciatrmica de los organismos.
La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de losagentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microrganismo.
a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es
uno de los mtodos ms efectivos para destruir microrganismos. Hay que distinguir entre
calor hmedo y calor seco. El hmedo mata los microrganismos porque coagula sus
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protenas siendo ms rpido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus
constituyentes qumicos. La accin letal del calor es una relacin de temperatura ytiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium
botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que
se necesitan alrededor de 2 horas de exposicin al calor seco para obtener los mismos
resultados.
Esterilizacin por calor hmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)
Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agentems prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas
superiores a las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave
(una olla que regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio seemplean generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la
presin atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de
exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes
pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son
mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben
esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser
alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microrganismos que contengan. Otras
sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose
en estos casos otros mtodos de esterilizacin.
Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse porencima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material
de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin.
Las esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente
exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas.
Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) sesometen a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de
microrganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura
seleccionada para la pasteurizacin se basa en el tiempo trmico mortal de
microrganismos patgenos (es el tiempo ms corto necesario para matar una suspensin
de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los
microrganismos patgenos ms resistentes al calor que puede transmitirse por la leche
cruda y se destruye en 15 minutos a 60 C. Posteriormente se descubri que Coxiella
burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms
resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la
leche se realiza a 62,8 C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente
superior, 71,7 C durante 15 segundos (Flash-Pasteurizacin).
Esterilizacin por calor seco: (se utiliza para materiales slidos estables al calor)
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Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material devidrio y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el hornoPasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de
exposicin a 160 C.
Incineracin: La destruccin de los microrganismos por incineracin es una prcticarutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros
Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacin de residuos hospitalarios.
b. Bajas Temperaturas. En general, el metabolismo de las bacterias est inhibido a
temperaturas por debajo de 0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los
microrganismos sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Esta
circunstancia es aprovechada por los microbilogos para conservar los microrganismosindefinidamente. Los cultivos de microrganismos se conservan congelados a -70 C o
incluso mejor en tanques de nitrgeno lquido a -196 C.
c. Radiaciones
Radiaciones ionizantes:
Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas porciertos istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este
istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma
pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y
despus esterilizar. Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizarmaterial quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se
puede esterilizar despus de empacado (ya que stas radiaciones penetran las
envolturas) y a la temperatura ambiente.
Radiaciones no ionizantes
Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiacionesdesde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen
mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin
microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y
para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV
tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microrganismos que
se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin
de la luz UV son susceptibles de ser destrudos.
d. Filtracin
Algunos materiales como los lquidos biolgicos (suero de animales, soluciones de
enzimas, algunas vitaminas y antibiticos) son termolbiles. Otros agentes fsicos como
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las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprcticos para esterilizarlos,
por lo que se recurre a la filtracin a travs de filtros capaces de retener losmicrorganismos. Los microrganismos quedan retenidos en parte por el pequeo tamao
de los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su paso
a travs del filtro debido a la carga elctrica del filtro y de los microrganismos. Debido
al pequeo tamao de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los
mtodos de filtracin que dejan libre de bacterias una solucin, se van a eliminar
tambin los virus.
Filtros de membrana: Los filtros de membranas son discos de steres de celulosacon poros tan pequeos que previenen el paso de los microrganismos. Existen distintos
tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems
de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico deaguas ya que concentran los microrganismos existentes en grandes volmenes de agua.
Filtros HEPA: Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto porpliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los
microrganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.
e. Desecacin. La desecacin de las clulas vegetativas microbianas paraliza su actividad
metablica. Este proceso fsico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la
refrigeracin. El tiempo de supervivencia de los microrganismos despus de desecados
depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos
Gram (-) son ms susceptibles a la desecacin que los cocos Gram (+). Las
endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecacin pudiendo permanecerviables indefinidamente.
a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que
sea voltil as como txico para los microrganismos, de manera que pueda ser
fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se
utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para
la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a
temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos
objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta
inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante
una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H).
b. Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad
antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y
hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.
a. Esterilizacin: es el proceso de destruccin de todas las formas de vida microbiana.
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b. Desinfeccin: es el proceso de destruccin de los agentes infecciosos.
Desinfectantes: son aquellas sustancias qumicas que matan las formas vegetativas y nonecesariamente las formas de resistencia de los microrganismos patgenos. Se refiere a
sustancias empleadas sobre objetos inanimados.
c. Antispticos: son aquellas sustancias qumicas que previenen el crecimiento o accin
de los microrganismos ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se
refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.
INORGANICOS. Metales: Los ms efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc.Actan inactivando las protenas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos
de mercurio que se emplean como antispticos en heridas superficiales de la piel y
mucosas estn el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos deplata utilizados como antispticos est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al
1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de los recin
nacidos aunque actualmente se est remplazando por antibiticos como la penicilina.
Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se
utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. Tambin es
fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fngicas de plantas (Mezcla
Bordolesa).
Acidos y lcalis: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En
general los cidos son ms eficaces que los lcalis. Dentro de estos compuestos se
encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido sdico (NaOH) ehidrxido potsico (KOH). Tienen aplicacin limitada debido a su naturaleza custica y
corrosiva. Aun as el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de
madera.
Compuestos inorgnicos oxidantes: actan oxidando los componentes de la membrana y
enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes) se utiliza como
antisptico en pequeas heridas de la piel.
Halgenos: Los halgenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos
antimicrobianos. Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son
altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las clulas
microbianas. Cloro: La muerte de los microrganismos por accin del cloro se debe en
parte a la combinacin directa del cloro con las protenas de las membranas celulares y
los enzimas. As mismo en presencia de agua desprende oxgeno naciente (O) que
oxida la materia orgnica:
Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (cido hipocloroso)
HClO ----------------> HCl + O (oxgeno naciente)
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El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El
hipoclorito sdico (leja) al 1% se puede utilizar como desinfectante domstico.
Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su accin antimicrobiana es debido
a su accin oxidante. Adems la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el
aminocido tirosina resulta en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El iodo se
puede utilizar como antisptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solucin
alcohlica (tintura) de iodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI). ii)
iodforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actan como agentes
transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine)
es un complejo de iodo y polivinilpirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la ventaja de
que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente paradesinfectar la piel as como en la desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los
vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.
ORGANICOSAlcoholes: El alcohol metlico (1C) es menos bactericida que el etlico (2C) y adems
es altamente txico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la
longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior
al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se
suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas,
disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usacomo antisptico de la piel y como desinfectante en los termmetros clnicos orales y
algunos instrumentos quirrgicos.
Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata rpidamente a
las clulas vegetativas de los microrganismos. Sin embargo, las esporas son mucho ms
resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un olor desagradable ya
casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado por compuestos
fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms activas frente a
los microrganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenlicos que se utiliza para
desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y
compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana citoplsmica as
como desnaturalizando protenas.
a. Tcnica de dilucin en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente
qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada
tubo se le aade la misma cantidad de una suspensin del microrganismo utilizado como
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prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alcuota de cada tubo a
otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a latemperatura ptima de crecimiento del microrganismo utilizado como prueba durante 24 a
48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microrganismo mediante
la aparicin de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento
-). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilucin a la cual ese
agente qumico mata al microrganismo utilizado como prueba cuando este microrganismo
es expuesto al agente qumico durante ese perodo de tiempo.
b. Tcnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo
slido con el microrganismo utilizado como prueba. El agente qumico se coloca en el
centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al
cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento -) alrededor delagente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente qumico
en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula
con el microrganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento
microbiano.
c. Tcnica del coeficiente fenlico: Es una tcnica estandarizada que se utiliza para
comparar el poder desinfectante de un agente qumico frente al del fenol. Es una
modificacin de la tcnica de dilucin en tubo tal como se describe a continuacin: (i)
Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del
desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan
diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 mlde un cultivo de 24 horas del microrganismo utilizado como prueba (cepas especficas
de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se
recoge una alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de
cultivo estril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se
observa el crecimiento del microrganismo (aparicin de turbidez). (vi) La mayor
dilucin del desinfectante que mate a los microrganismos en 10 minutos pero no los
mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos
resultados. El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante.