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Métodos espectroscópicos para la caracterización de macromoléculas biológicas
• Interacción de radiación electromagnética con la macromolécula en estudio
• Se usa amplio rango del espectro electromagnético (desde radiofrecuencia hasta RX)
• Cada una aporta distinta información estructural
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Regiones útiles en espectroscopía de biopolímeros
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Técnicas espectroscópicas
• ABSORCIÖN (UV-VIS, IR)
• EMISIÓN (fluorescencia)
• DISPERSIÓN ( Raman)
• DIFRACCIÓN ( Rayos X)
• Luz polarizada (dicroismo circular)
• Resonancia (RMN, EPR)
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Absorción en el uv-vis 100 - 400 nm UV transición electrónica
400 – 700 nm VISIBLE
Absorción en el infrarrojo 700 nm – 2.5 μ transición vibracional
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Aplicaciones de la espectroscopía de absorción uv-vis
• Cualitativa, Identificación de cromóforos por el espectro
A vs
• Cuantitativa, medir la concentración del cromóforo
A = ε b C
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Las proteínas absorben en el uv-vis?
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ABSORBANCIA
max (nm)
ε (M-1 cm-1)
Triptofano 278287
56004500
Tirosina 275 1400
Fenilalanina 258 200
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Espectro de BSA 0.45 µM en buffer fosfato pH 7.0
Espectro de absorción uv
de una proteína, seroalbúmina bovina (BSA)
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Espectro de absorción uv de seroalbúmina bovina BSA
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Absorción uv-vis de Proteínas
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Absorción en el uv de residuos aromáticos
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Estimación del coeficiente de absortividad molar de una proteína
ε 280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)
n(Trp) = número residuos de triptofano en la secuencia
n(Tyr) = número residuos de tirosina en la secuencia
n(SS) = número de enlaces disulfuro en la proteína
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Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm
Titulación espectrofotométrica de Ribonucleasa pancréatica bovina
RNasa tiene 6 residuos de tirosina
Espectro uv de la RNasa en función del pH
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Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm
RNasa tiene 6 residuos de tirosina.
El resultado muestra que unas 3 tirosinas se titulan reversiblemente con un pKa = 10.2
Las otras 3 tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH más elevado que provoca la desnaturalzicación de la proteína
Absorción a 295 nm en función del pH
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Los ácidos nucleicos, absorben en el uv-vis?
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Absorción en el UV lejano de los ácidos nucleicos
Cromóforo, responsable de la absorción, las bases nitrogenadas
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Diferencias en estructura secundaria, afecta el espectro de absorción uv?
Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:
La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción
Polipéptido con estructura “ovillo estadístico”, es el espectro de una amida (―).
Polipéptido con estructura α-hélice (…) que tiene grupos amida orientados y que interaccionan unos con otros, el espectro cambia: banda a 195 nm menos intensa y hombro a 205 nm
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Inserto: Espectro de absorción uv de RNasa nativa y desnaturalizada (8 M urea)
Espectro diferencial
Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv
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Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv
Cambios de absorción de RNase a 286 nm y 292 nm al aumentar la temperatura
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Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:
La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción
Espectro de absorción uv de ADN de doble cadena (línea sólida), ADN cadena simple (línea de trazos) y tras hidrólisis hasta obtener nucleótidos libres (línea punteada). Todos los espectros a igual concentración de bases.
HIPOCROMISMO
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Aplicación del efecto hipocrómico para seguir desnaturalización de ADN
Al perder estructura secundaria, los residuos nucleotídicos pierden rigidez, se desordenan, entonces la intensidad de absorción a 260 nm aumenta (se pierde efecto hipocrómico).
Se determina Tm (temperatura a la cual la mitad de ADN se desnaturalizó)
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Cambios espectrales por perturbación del solvente
A) Triptofano (N-acetil éster)(a),Tirosina (b), Fenilalanina (c) en agua (línea sólida) o en 20%DMSO (línea punteada)
B) Espectros diferenciales
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Aplicaciones espectroscopía de absorción uv-vis
• Identificación• Cuantificación• Cinética• Determinación de parámetros estructurales:
desnaturalizaciónubicación de residuosionización de residuosasociación con ligandos