Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Reacciones enzimáticas en temperaturas extremas
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
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Introducción a los extremófilos
• ¿Qué son?– Microbios viviendo donde nadie más puede
Extremófilos
• ¿Cómo sobreviven?– Extremo-enzimas
• ¿Por qué son interesantes?– El anzuelo para tener a los estudiantes interesados
• Los extremos nos facinan– Vida en otros planetas
• Las aplicaciones prácticas son interesantes
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Extremófilos
Historia– Se suponía su existencia hace 30 años– Se suponía su existencia hace 30 años– Conocidos y estudiados por cerca de 20 años
• Temperaturas extremas– ebullición o congelamiento, 100 °C a 4 °C (212 °F a 34 °F)
• Químicos extremos– vinagre o amonia (<5 pH o >9 pH)– Alta salinidad, más del doble del agua de mar
(1 M Na Cl )
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FE"OTIPO MEDIO AMBIE"TE
GÉ"ERO TÍPICO
Termofílico 55 – 80 oC Methanobacterium, Thermoplasma, Thermus*,
algunas especies de bacillus
Hipertermofílico 80 – 113 oC Aquifex*, Archaeoglobus, Hydrogenobacter*,
Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium,
Extremófilos y su medio ambiente
Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium,
Pyrolobus, Sulfolobus, Thermococcus,
Thermoproteus, Thermotoga*
Psicrofílico -2 – 20 oC Alteromonas*, Psychrobacter*
Halofílico 2 – 5 M NaCl Haloarcula, Halobacterium, Haloferax, Halorubrum
Acidofílico pH < 4 Acidianus, Desulfurolobus, Sulfolobus,
Thiobacillus*
Alcalifílico pH > 9 atronobacterium, atronococcus, algunas especies de bacillus*
* Género del dominio bacteria, todos los otros son “Archaea”
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Temperaturas extremas
• Termófilos - Altas temperaturas– Respiraderos térmicos y fuentes calientes
– Podrían ir de la mano con los químicos extremos– Podrían ir de la mano con los químicos extremos
• Psicrófilos - Bajas temperaturas– Ártico y Antártico
• ½ de la superficie de la tierra es oceano entre 34 y 38 °F
• La mayoría cuentan con la fotosíntesis
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Químicos extremos
• Acidófilos - Ácidos– Otra vez respiraderos térmicos y algunas fuentes calientes
• Alcalífilos - Alcalinos– Lagos de sosa en África y el oeste de USA
• Halófilos – Altamente salinos– Lagos salados naturales y estanques artificiales
– Algunas veces ocurre con alcalinidad extrema
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Sobrevivencia
• Temperaturas extremas– Cada parte del microbio debe
funcionar al extremofuncionar al extremo• Enzimas “rudas” para Termófilos • Enzimas “eficientes” para
Psicrófilos
– Muchas enzimas de estos microbios son interesantes
Life at High Temperatures, Thomas M. Brock
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Sobrevivencia
• Químicos extremos– El interior de la célula es “normal”
– El exterior protege la célula• Los Acidófilos y Alcalófilos excretan substancias protectoras y
enzimas
• Los Halófilos tienen altas concentraciones de un soluto en el interior por protección
– Algunas enzimas de estos microbios son interesantes
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Aplicaciones prácticas
• Extremo-enzimas�Enzimas de Extremófilos
– Industria & Farmacéutica
• Qué sucede si quieres una enzima para trabajar … – ¿En una industria caliente?
– ¿Un tanque de una solución fría?
– ¿En un estanque ácido?
– ¿Aguas residuales (amonia)?
– ¿Una solución altamente salina?
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Una solución puede ser
• Pagar a un ingeniero genetista para que diseñe unas “super” enzimas ...– Enzimas resistentes al calor
– Subrevivan a bajas temperaturas
– Capaces de resistir ácidos, álcalis y/o sales
• Esto podría tomar años y mucho dinero
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Los extremófilos llegaron primero
• La Naturaleza nos ha dado ya la solución a estos problemas– Los extremófilos tienen las enzimas que trabajan en condiciones
extremasextremas
Endolithic algae from Antarctica; Hot springs in Yellowstone National Park, © 1998 Reston Communications, www.reston.com/astro/extreme.html
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Termófilos
Obsidian Pool,Yellowstone National ParkHydrothermal Vents
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Termófilos
• Las aplicaciones prácticas más interesantes por mucho
– Muchos procesos industriales involucran altas temperaturas– 45 oC (113 oF) es un problema para la mayoría de las enzimas– El primer extremófilo se encontró hace 30 años– El primer extremófilo se encontró hace 30 años
Life at High Temperatures, Thomas M. Brock
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Psicrófilos
• Enzimas eficientes para trabajar en el frío
– Enzimas para trabajar en alimentos que – Enzimas para trabajar en alimentos que necesitan estar refrigerados
– Detergentes para lavado en frío
Algal mats on an Antarctic lake bottom, © 1998 Reston Communications, www.reston.com/astro/extreme.html
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Acidófilos
pH 0-1 of waters at Iron mountain
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Acidófilos
• Enzimas usadas para incrementar la eficiencia de la incrementar la eficiencia de la alimentación animal– Las enzimas ayudan a los
animales a extraer nutrientes de los alimentos
• más eficientes y menos caros
Life at High Temperatures, Thomas M. Brock
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Alcalífilose.g. Mono Lake alkaline soda lake, pH 9 salinity 8%
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Alcalífilos
• Pantalones “deslavados”• Pantalones “deslavados”– Enzimas Alcalifilicas suavizan telas y liberan algunos de los
colorantes, dando una apariencia y sensación de usado
• Detergentes– Enzimas para disolver proteinas o grasas– Enzimas Alcalófilicas pueden trabajar con detergentes
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Halófilos
solar salternsOwens Lake, Great Salt Lakecoastal splash zonesDead Sea
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Halófilos
• Únicamente usos experimentales• Extracción de petróleo
– Los pozos petroleros son calientesy frecuentemente salados
Image from NASA, http://pds.jpl.nasa.gov/
y frecuentemente salados– Las enzimas de Halófilos son usadas en múltiples
etapas del proceso• Inyectar una substancia gomosa mezclada con arena• La goma ayuda a la arena a fluir dentro de pequeñas
fracturas• Hacer estallar la explosión• La arena mantiene pequeñas hendeduras abiertas• La enzima, activada por calor, disuelve la goma así el
petróleo puede fluir al exterior
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MICRO-ORGA"ISMOS
E"ZIMAS Y OTRAS BIOMOLÉCULAS
APLICACIO"ES Y PRODUCTOS
Termófilos
(50-100 oC)
Amilasas, glicosidasas
Lipasas
Procesamiento de alimidón, glucosa, fructosa, trealosa, digestión de lactosa en leche, enzimas de sacarificación, síntesis de oligosacáridosTratamiento de aguas residuales, formulación de detergentesBlanqueo de papel
Ejemplos de enzimas y otras biomoléculas aisladas de extremófilos y sus aplicacuiones previstas
XilanasasProteasas
DNA polimerasa
Blanqueo de papelProcesamiento de alimentos, detergentes, producción de amino ácidosIngeniería genética
Psicrófilos
(0-20 oC)
Amilasas, proteasas, lipasas
Deshidrogenasa
Agentes degradadores de polímeros en detergentes
Biosensores
Alcalífilos
pH ≥ 9
Celulasas, proteasas
Amilasas, lipasas
Ciclodextrinas
Agentes degradadores de polímeros en detergentes
Aditivos de alimentos
Halófilos
3-20 % de sales
Solutos compatibles
Membranas
Medicinas
Aditivos de cosméticos
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Estructura y función de las extremo-enzimas
Se ha encontrado que muchas enzimas termofílicas son sustancialmente estabilizadas a altas temperaturas por altas presiones. presiones. Este efecto parece correlacionarse con la hidrofobicidad interna y/o rigidez estructural de la proteína.Estudios a altas presiones han ayudado a elucidar la importancia de la interacciones hidrofóbicas y la flexibilidad interna en la estabilización de la proteína. Significativa activación por presión ha sido observada también para algunas proteínas termofílicas
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Protección de la enzima
• Los termófilos extremos contienen enzimas (extremoenzimas) que están equipadas para trabajar a altas temperaturasaltas temperaturas
• Las extremoenzimas mantienen su estructura 3-D junta doblándose apretadamente
• Los termófilos también contienen una pequeña cantidad de glicina.
• Glicina: un aminoácido que ayuda a la proteína a ser flexible
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¿Pueden las propiedades de las extremoenzimasser referidas a sus características estructurales específicas?
• Pueden las propiedades de lasextremoenzimas ser únicamente explicadas en términos de:
• Puentes de hidrógeno
• Uniones salinas
• Interacciones hidrofóbicas
• Composición de amino ácidos
• Composición de la estructura secundaria
• Rigidez de la cadena principal
• Estabilidad del núcleo
• Cargas superficiales
• etc…...
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Dihidrofolato reductasa Halofílica(archaeon Haloferax volcanii) del Mar Muerto
• La estructura contiene unincremento en el número de puentes salinosde puentes salinos
• La superficie de lamolécula esta cubierta con residuos acídicos
• Concuerda con otras estructuras halofílicas:
• Malto deshidrogenasa y2Fe-2S ferredoxina
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Comparación de dihidrofolato reductasa halofílicacon mesofílica
• Halofílica mesofílica
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Alfa-amilasa Psicrofílica
La alfa-amilasa adaptada al frío tiene:
• Pocas uniones salinas
• Interactions aromáticas reducidas dentro del núcleo hidrofóbico
• Reducción en número de Pro y Arg
• Reducción de hidrofobicidad
• Incremento en el número deinteracciones con el solvente
• Estructura reducida, adaptada para actividades a bajas temperaturas
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Thermophilic subtilisin
Thermophilic subtilisin tiene:Thermophilic subtilisin tiene:
• 276 enlaces H en comparación a 259 paramesofílicos
• 7 uniones salinas encomparación a 2 paramesofílicos
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Comparación entre subtilisin termofílica y mesofílica
• Termofílica mesofílica
• Subtilisn tiene las propiedades de una enzima termoestable promedio
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Thermophilic rubredoxin
Rubredoxin representa una pequeñaenzima termofílica (solamenteenzima termofílica (solamente54 aa) la cual es estable hasta 110°C.
Contiene 6 nuevos enlaces H y unanueva unión salina comparado con la enzima mesofílica
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Comparación de rubredoxin termofílica y mesofílica
• Termofílica mesofílica
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Gliceraldehido - 3 - fosfato deshidrogenasa termofílica
GPD es una enzima GPD es una enzima tetramérica
El enrollamiento y estabilidad del tetrámero es manejado por entropia. 120 nuevos enlaces H han sidoformados, pero no nuevas uniones salinas
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Resumen de los cambios establecidos en termofílicos
Intercambio de los cinco principales residuos
En hélices:
• Gly a Ala
• Asp a Gln
• Phe a Leu
• La densidad de enlaces hidrógeno al solvente se incrementa
• El incremento de la densidad de nitrógeno (R) y oxígeno sobre la superficie = el incremento de la interacción electrostática• Phe a Leu
• Val a Ala
• Lys a Arg
En hebras:
• Val a Ile
• Gly a Ala
• Ser a Thr
• Lys a Arg
• Leu a Ile
interacción electrostática
• Evidencia de doblamiento por entropia
• La densidad de enlaces hidrógeno internos se incrementa
• Las uniones salinas se incrementaron en 30% de los casos
• Incremento en hélices y hebras, mientraspuentes-β, vueltas y enrollamientos son reducidos
• Gly a Ala y Lys a Arg son las mutaciones principales