Nuevas estrategias analíticas con MS de alta resolución
Herramientas y Flujos de trabajo
Jaume C. Morales
LCMS Product Specialist
Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo
2
El TOF es un cronómetro que mide el
tiempo que tardan los diferentes iones
en llegar al detector desde que se
disparan en el PULSER.
Los iones más ligeros llegan antes y
los más pesados, más tarde.
Ese tiempo se contrasta con una
calibración del equipo t <-> m/z y
sabemos con exactitud la m/z del ión.
Genéricamente se entiende por masa exacta cuando el error en la medida es menor de 5 ppm.
Los sistemas basados en SQ/QQQ suelen mostrar un error de masa > 150ppm.
(Masa Medida - Masa Calculada)
Masa Calculada
= ppmError en la medida = X 1.000.000
HRMS TOF/QTOF
TOF
QTOF
TOF
Full Scan acquisition
QTOF
Full Scan acquisition
MS/MS spectrum
Tiapride 0.8 ppm
Tiapride 0.8 ppm
5
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
Los equipos de LCMS de alta resolución aportan alta cantidad de información
CUALITATIVA
y
CUANTITATIVA
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
Los equipos de LCMS de alta resolución aportan alta cantidad de información
CUALITATIVA¿Que necesita el analista del HR LCMS?
Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):
• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio elenco de
sospechosos, sin patrón).
• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”
tras un análisis diferencial
tras una síntesis orgánica
Un análisis de estabilidad de un fármac0
¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?
Hay tres informaciones CLAVE que un equipo de LCMS de alta información puede aportar :
• Masa Exacta.
• Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)
• Perfil Isotópico.
• Baja desviación de abundancias relativas (altura, %)
• Espectro de MS/MS de masa exacta.
• Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)
8
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?
Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS
• Masa Exacta. Bajo error en la exactitud de masa medida (Ɛ, ppm)
P.e. La masa exacta de la 3,4Metilen Dioxi Meta-amfetamina
(MDA) es M=179,09463 y el ión [M+H]+= 180,10191
En Este caso la masa medida es = 180,10197
Con un error de 0,00006. Ɛ = 0,25ppm
1ª INFORMACION SUMINISTRADA
9
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?
Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS
• Perfil Isotópico.Baja desviación de abundancias relativas (altura, %)
El perfil isotópico nos permite diferenciar isobáricos.
Se evalúa la abundancia relativa entre los isótopos presentes Y
la masa exacta Ɛ de los mismos.
En Este caso las abundancias relativas y la masa exacta Ɛ de
los isotopos nos dan un Score de : 98 (sobre 100)
2ª INFORMACION SUMINISTRADA
10
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
¿Cómo OBTIENE esta información un equipo de LCMS de alta resolución?
Hay tres informaciones CLAVE Masa Exacta, Perfil Isotópico y Espectro MS/MS
• Espectro de MS/MS de masa exacta. Bajo error en la exactitud de
masa medida (Ɛ, ppm)El espectro MS/MS nos enseña los
fragmentos del compuesto al
someterlos a una colisión con N2 o Ar
en la celda de colisión.
El éxito de esta información es que los
fragmentos den una masa exacta Ɛ
suficiente para poder verificar que
pertenecen al ion “Padre”.
3ª INFORMACION SUMINISTRADA
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):
• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio
elenco de sospechosos, sin patrón).
• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”
tras un análisis diferencial
tras una síntesis orgánica
All Ions MS/MSMayor confianza en la identificación
La mejor solución para screening de compuestos conocidos en alimentación, medioambiente y toxicología
• Único de Agilent:
- Base de datos de masa exacta y perfil isotópico
- Librerías de espectros MS/MS para la identificación de fragmentos
- Innovador “Coelution Score” para confirmar qué fragmentos pertenecen al ión precursor
• Re-interrogación de los datos para desconocidos sin volver a inyectar
• Adición rápida de los desconocidos a la librería de espectros MS/MS e inclusión en el screening
• Creación rápida del método de cuantificación para un target screening multi-compuesto
12
Example for all ions spectraCarbofuran in multi-residue solvent standard
20/11/2015
AccMass_Screening_Pesticides
13
Low energy
spectrum
High energy
spectrum
Example for all ions spectraCarbofuran in multi-residue solvent standard
20/11/2015
AccMass_Screening_Pesticides
14
Low energy
spectrum
High energy
spectrum
Cuantificación dirigida
con confirmación
adicional por fragmentos
All Ions MS/MS Targeted Screening Workflow
Acquisition PCDL Qual Quant
MassHunter Acquisition
Alto/Bajo
Fragmentor
Voltage en TOF
Pesticide
library (~450-
500
compounds
with spectra)
Forensics
/Tox library
(2720
compounds
with spectra )
Alta/Baja
Collision Energy
en Q-TOF
Find by Formula
on MS low
channel
EICs for
fragments on MS
high channel
Correlate qualified
fragments with
target
Find
Extract
Qualify and confirm
fragments
Export
Align EICs of
fragments with
parent EIC
Targets
m/z, ion species
Quant
Report
Qual
Report
15
All Ions MS/MS : Fácil creación del método
El método de MassHunter Acquisition tan sólo necesita programar un canal
de “baja energía” (e.g. Collision Energy=0) y un canal de alta energía (e.g.
CE = 40). NO es necesario programar para cada compuesto como en un
QQQ.
¡El resultado es un método de muy fácil creación!
20 de noviembre de 2015
Customer Presentation
16
New Experiment
# field permite
crear hasta
cuatro diferentes
canales para
cada segmento
de tiempo
All Ions MS/MS : Identificación dirigída por medio de las librerías PCDL Agilent
Las Personal Compound Database and Libraries (PCDLs) contienen
espectros MS/MS. All Ions MS/MS utiliza los fragmentos del product ions
en el espectro para confirmar la identificación a nivel MS. => ¡Menores
falsos positivos!
.
Application PCD PCDL
Forensics / Tox 7360 compounds (w
Marine Biotox)
Adds spectra for 2720
compounds
Pesticides 1609 compounds Adds spectra for 450 to
500 compounds
Veterinary Drugs ~1000 compounds Adds spectra for ~500
compounds
Metabolomics METLIN rev. B.07.00
~220.000 compounds
(Jan 2015)
METLIN rev. B.07.00
(adds spectra for ~9000
compounds)
November 20, 2015
Customer Presentation
17
All Ions MS/MS : Confirmación Cromatográfica de los Product Ions
Sobreposición de los
canales de Alta y Baja
Energía
Curvas de Coelución –
El precursor y los
fragmentos coinciden
exactamante en el
máximo del
Qualitative screening using All Ions MS/MSResults overview
19 WEBEX December 6, 2012
AccMass_Screening_Pesticides
• Carbendazim was found
with 5 valid qualifier
fragments from the PCDL
spectrum
• Overlay of the EICs with the
Coelution Plot shows
excellent agreement
between the products and
precursor ion
Qualitative screening using All Ions MS/MSResults overview
20 WEBEX December 6, 2012
AccMass_Screening_Pesticides
All IONS Acquisition
21 November 20, 2015
Agilent Restricted
Compound results .cef file Quant method
- Accurate mass
EICs for quantifier
and qualifier
- Relative responses
- Retention times
Adduct patternReference pattern library
Import and Build Qual/Quan Method from Qual
22
MH Qual
MH Quant
The Agilent 7200 Series GC-Q/TOF
=+
Quadrupole Time of Flight MS
Time of Flight MS
Triple Quadrupole MS
7890 + 7000 + 6500 = 7200 GC-Q/TOF
Pesticide screening
GC-Q/TOF
7200 Q/TOF Components
7000B TQ6500
Q/TOF
NEW
OpticsNEW
Removable
Ion Source
Two
300 L/s Turbos
Four stages of pumping
Pesticide screening
GC-Q/TOF
Screening LC-Q/TOF vs GC-Q/TOF
Pesticide screening
GC-Q/TOF
LC/MS ESI+GC/MS EI+
Malathion
MWt = 330.0361
CE = OV
La presencia del ión molecular [M]+
es minoritaria
Fragments
[M+H]+ Low energy
CE = OV
High energy
CE > OV
Screening Pesticides with a GC-Q/TOF
• Accurate Mass provides added compound selectivity
- Higher resolution provides added interference selectivity
• TOF mode : Always full spectral data, Non-targeted acquisition
• ‘Unlimited’ number of compounds can be screened (search
accurate mass compound database for identification)
• Sensitivity is the same regardless of number of compounds
screened
• MS/MS (Q/TOF Mode) further assists compound identification
Pesticide screening
GC-Q/TOF
All Ions : Targeted Screening Workflow
1. Acquisition2.
PCDL3. MH Qual SW
4. MH Quant SW
Compound
library
(compounds
with spectra and
RTs)
Quantify target with
additional fragment
ion confirmation
GC-Q/TOF MH Acquisition
Constant
Collision Energy
on Q-TOF (CE=0)
Find by Formula
on MS
EICs for
fragments
Correlate qualified
fragments with
target
Find
Extract
Qualify and confirm
fragments
Export
Align EICs of
fragments
Targets
m/z, ion species
Quant
Report
Qual
Report
Retention Time Locked Method
(optional)
Pesticide screening
GC-Q/TOF
(1)
7200 GC-Q/TOF RTL Pesticide Analyzer CF Method
7890B
GC
PCM
Column (1) : 15m x 0.25mm ID x 0.25um HP-5MSUI (19091S-
431UI)
Column (2) : 15m x 0.25mm ID x 0.25um HP-5MSUI (19091S-
431UI)
Same column configuration and flow rate for 40 minute and 20
minute
methods, only difference is Oven Temperature program
7200
Q/TOF
MMI Inlet
Purged Union
ALS
(2)
Purged ultimate union
1. Acquisition
Mid-Column Back Flush
Pesticide screening
GC-Q/TOF
PCDL : Personal Compound Database Library1. Acquisition 2. PCDL
Pesticide screening
GC-Q/TOF
Accurate mass and Retention time Database + EI Accurate Mass Spectra
• Name
• Mol. Formula
• Mono-isotopic exact mass
• Locked RT
• CAS #
• Accurate mass spectrum
Soluciones de Masa Exacta / Alta Resolución Información aportada por el LCMS
Básicamente existe 2 escenarios posibles (más otros derivados):
• Confirmación de la presencia de un compuesto sospechoso o sus metabolitos. (Amplio
elenco de sospechosos, sin patrón).
• Identificación de compuestos “desconocidos” o “No esperados”
tras un análisis diferencial
tras una síntesis orgánica
Págin
a 31
¿Qué es la Metabolómica?
¿Cuales son las diferencias en
su composición química que se
correlacionan con las
diferencias observadas?
Metabolómica es el estudio sistemático
de las pequeñas moléculas orgánicas
(metabolitos) presentes en un sistema
biológico
Utiliza el análisis estadístico
multivariante para correlacionar: - variaciones en la concentración de metabolitos.
- con distintas propiedades de 2 o más grupos
de muestras comparadas (organismo, órgano,
tejido, célula, fluido, producto, alimento…).
Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis
Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B) y complejos (n Variables)
• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras
Proporciona Muy Potentes Herramientas
Estadísticas y de Visualización Comparación:
• Filtrado simple (test de frecuencia)
• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)
• Análisis de Componentes Principales (PCA)
• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)
• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.
November 20, 2015
MassHunter Profinder Webinar
33
Four Profinder Windows: Compound centric visualization and editing of results
EIC Sample replicate
overlay
Averaged
Sample Spectra
MassHunter Profinder Workflow solution:So what’s new?
• A one-shot process for untargeted and
targeted feature extraction
• Designed specifically for the needs of
the metabolomics user
• Processes many samples!
• Recursive analysis
• Compound Group Centric: new
manual review and editing
functionalities
• Major reduction in processing time
• It’s FREE!!
November 20, 2015
MassHunter Profinder Webinar
34
MassHunter Profinder
Agilent Metabolomics WorkflowG
CM
SC
E/L
CM
S
Separate &
Detect
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter QualFind by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter QualMFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
35
Profiling
ITP 2013
ICP
-MS
GeneSpring Software PlatformStatistical and Visualization Tool with Pathway Analysis
LC/MS
GC/MS
MassHunter
Qual/Quant
Microarrays Feature Extraction
GeneSpring
Platform
Pathway
Architect
• Commitment to the GeneSpring platform systems biology software
36
Abundance
color key
Average compound abundance
by sample group
ITP 2013
Pathway Architect
Map and visualize data from one or two types of -omic data on pathways
Search, browse and filter pathways
Supports biological pathways from publicly available databases
• WikiPathways
• BioCyc
• Supported pathway formats
• BioPAX 3 – Pathway Commons, Reactome, NCI Nature Pathway
• GPML – PathVisio –custom drawing
• Export compound list from pathways
Metabolite Data
Overlay
List of all pathway entities, dynamically
linked to pathway selection
Pathway Architect is an optional
module in MassProfiler Professional
Yeast Omics
37
One of the Stress Activated Pathways in Yeast
Agilent Metabolomics WorkflowG
CM
SC
E/L
CM
S
Separate &
Detect
GC/MSD
GC-QQQ
CE-LC-TOF/QTOF
CE-LC-QQQ
Feature
Finding
MassHunter QualFind by
Chromatogram
Deconvolution
MassHunter QualMFE,
Find by Formula,
Find by Ion
Alignment &
Statistics
Mass Profiler
Professional
(MPP)
Identify
ID Browser
Mass Profiler
(MP)
Pathways //
Profiling
Pathway
Architect
39
Prediction
Model
JAPAN
Country B
Country C
Country A
ITP 2013
Ejemplo 1: Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia
líneas de Arroz y cepas Bacteriales
• TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje• TP309-Xa21 arroz transgénico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada genéticamente: PXO99 (RaxST-).• PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa capaz de generar el péptido AvrXa21.
• PXO99 RaxST- : bacteria modificada genéticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el péptido AvrXa21.• Péptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genéticamente (TP309-Xa21)
PX099
Péptido AvrXa21+
PX099 RaxST -Bacteria salvaje Bacteria transgénica
PXo99
RaxST-
Blanco control tratado
6 (D)
6
6
6 (C)
NA(B)
6
6
6 (A)PXo99
Transgenic
TP309-Xa21
Salvaje
TP309
Condition
(Class)
2 Tipos de Arroz (TP...)
2
tipos d
ebacte
ria (
PX
…)
Blanco control SIN tratar
TP309 TP309-Xa21
2 tipos arroz (TP…)
(A) (B) (C) (D)
Resistente
a la plaga2 tipos
bacterias
Los replicados de muestras de la población son importantes
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)
Página 40
Application Note 5989-6234
Página 41
Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Deconvolución de Cromatogramas LC/MS de Arroz mediante “AgilentMolecular Feature Extractor (MFE)”
MFE deconvoluciona cromatogramas para localizar los tiempos de retención / masa /abundancia de todos los compuestos ionizados. Evalúa isotópos, aductos y coeluciones.
Parámetros utilizados:
- Máx. carga iones = 1
- Umbral Detección en altura (o S/N)
• Iones Positivos: 1000
• Iones Negativos: 500
Número típico de “molecular features”(/compuestos) encontrados:
• Iones Positivos ~ 1500
• Iones Negativos ~ 400
Aprox. 1900 compuestos/muestra
(la gran mayoría desconocidos)
Muestra adquirida con LC/MS-TOF (o QTOF)
MFE Tr, m/z, Int.
Mass Profiler Professional: ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados mediante “Tukey Post-hoc Test”. Modo Iones Positivos
Azul: estadísticamente
equivalentes
Rojo: estadísticamente
diferentes
----- Arroz Salvaje ------
7 C
ondic
iones B
ioló
gic
as C
om
para
das
7 Condiciones Biológicas Comparadas
Infección
ArrocesResisten.
----- Arroz Transgénico ------
A
rro
zS
alv
aje
Arr
oz
Tra
ng
én
ico
Bact. Modif. Gen.
Bact.
Modif.
Gen.
Bact. Salvaje
Bact.
Salv
aje
Bact.
Salv
aje
Bact. Salvaje
Arroces
Resisten.
Infección
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
Página 42
Página 43
Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
MPP: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados: modo Iones Positivos
La comparación mediante ANOVA de 1-vía se realizó para encontrar “molecular features” (/compuestos) de interés biológico.
• Se evaluan 7 condiciones biológicas. De la comparación de resultados se concluye:
- Immunity features: (42) – metabolitos relacionados con la resistancia
- Infected features (22) – metabolitos relacionados con la infección
- Bacterial features (25) – metabolitos producidos por las bacterias
- Rice line features (170) – metabolitos relacionados con diferencias en las líneas de arroz
Diagrama de Venn Comparando
Arroz Infectado Vs. Resistente
GeneSpring MS: Análisis Estadístico Multivariante. Ejemplo
combinación de Análisis de PCA con ANOVA
Proporciona una mucha mejor diferenciación de
clases
3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1
2
3-INF
4
5
6-RES
7-INF
3-INF
7-INF 6-RES
5
2
3-INF7-INF
6-RES
5
2
mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta
ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
Introducción al “Food Profiling”
Preguntas que el análisis tradicional de contaminantes no puede responder :
• ¿Este vino es Cabernet o Pinot noir?
• ¿Este aceite es realmente de Oliva Virgen Extra?
• ¿Este arroz es de Japón o de algún otro sitio?
• ¿Como afecta a mi producto los cambios en el proceso de elaboración o fermentación?
Para poder dar respuesta a estos interrogantes necesitamosFood Profiling
45
Introducción al “Food Profiling”Perfilado en el Campo Alimentario
Perfilado de alimentos(def.) – Procesado de datos de espectros de MS de dos o más muestras de alimentos para discernir los compuestos que tienen una concentración estadísticamente diferencial.
Perfilado de Alimentos
Autenticidad
Degradación
Proceso Producción
Agilent’s Solution:
MassHunter Mass Profiler Professional (MPP)
Agilent Sample Class Predictor (SCP)
Software Solution for
Automated Rule Based
Sample Classification
47
ITP 2013
Introduction to Food ProfilingHow MPP Performs Sample Class Prediction (SCP)
Step 1. Develop a Prediction Model
Test a range of qualified samples to create a prediction model
• Different wine varietals
• Rice grown in different regions
• High quality and low quality or degraded food
November 20, 201548
ITP 2013
SCP - Step 1: Prediction Model Generation
• The front-end of the class prediction model generation is consistent with standard chemometric profiling workflows
• After data is acquired and imported, a class prediction model is built inside MPP
• Each model’s internal parameters can be exported to a sample class prediction model file (.SCP)
Acquisition Feature ExtractionChemometric
Analysis
Model
Prediction Model
Available Class Prediction Algorithms
• Partial Least Squares Discrimination
• Naïve Bayes
• Decision Tree
• Support Vector Machine
• Neural Network
49
ITP 2013
Tests de AutenticidadUso del Sample Class Prediction
Ejemplos de test de Autenticidad:
• Tipo de producto
• Variedad del vino (uva)
• Zumo puro vs. zumo de mezclas
• Punto de Origen (¿En que país o
región ha crecido?)
• Grado de calidad
• Aceite Oliva Virgen Extra vs. Otros…
50
Authenticity: ClassificationVerifying Olive Oil Grade by GC/MS
• Standards exist for classifying Extra Virgin Olive Oil (EVOO)
• Sensory tests are often used to qualify EVOO, but are expensive and subjective
• Prediction model created in MPP based on known EVOO samples
• “Pass/Fail” model set up to accurately determine whether Olive Oil samples could be labeled Extra Virgin
November 20, 201551
Pass/Fail
ITP 2013
Olive Oil Characterization
1. To create a model that could predict
whether olive oil sample would pass
or fail sensory test
2. To find statistically significant olive oil
components that are present at
distinct levels depending on whether
they passed or failed sensory test
7200 Series GC/Q-TOF
• High resolution full acquisition spectra
• Accurate mass measurements
• Fast acquisition of full spectra
• MS/MS mode
- Full spectrum of Product Ions
• With high resolution and accurate mass
• High sensitivity structural elucidation tool
Ideal tool for solving complex analytical problems
EXPERIMENTAL DESIGN
Experimental Design
Pass/Fail
• Olive oil samples had been
subjected to sensory test and
classified as passed or failed.
• Samples were analyzed on the
7200 GC/Q-TOF. Data was
acquired in both EI and PCI
modes.
• MassHunter Qual was used for
deconvolution and Library
Searches.
• Mass Profiler Professional (MPP)
was used for statistical evaluation
of the data including construction of
class prediction model to correctly
predict whether the sample would
pass or fail the sensory test
EI/CI – MassHunter Qual and MPP
MassHunter Qualitative AnalysisDeconvolution and Library Searches
Identification of Compounds using Library Search
Mass Profiler ProfessionalData filtering, PCA, ANOVA, Volcano Plot
• Mass Profiler Professional (MPP) was used for statistical evaluation of the data
including construction of class prediction model to correctly predict whether the
sample would pass or fail the sensory test
RESULTS
EVOOs that Pass Sensory Evaluation
This is why we need powerful data analysis software!
EVOOs that Pass and Fail Sensory Evaluation
442 unique compounds
were distinguished by
chromatographic
deconvolution, most of
which occur only once or
twice and are filtered out by
MPP.
The table shows how many of these 442
compounds were actually found in each sample.
Olive Oil Characterization: Data Filtering
PCA shows how the pass/fail data clusters.The samples that failed the sensory test are marked in red and the ones that passed are blue.
Principal Component Analysis is used to Visualize
failed
passed
The Volcano Plot (on the right) shows fold-change for each entity on the x-
axis and significance on the y-axis.
Compounds accumulated
in the samples that failed
the sensory test.
Fold Change Analysis
Raw Data Verification
It pays to go back to the raw data to visually inspect MPP (multivariate
statistical) results. Here we see the raw data verification of the peak at
27.54 minutes.
Building the Classification Model
Training the model with data:
• Two data classes where established with the compounds
(markers) increased in the failed samples
• Create a model that predicts whether an olive oil sample will
pass the sensory test
x
x
x
x
Testing the Model
All samples correctly predicted. The samples that were not
used for building the prediction model are listed with the training
parameter set as ‘None’.
x
x
x
x
Testing the Model
Commercial unit mass EI spectral libraries can be searched using accurate mass
EI GC/Q-TOF data to identify compounds
Compound spectrum
NIST library spectrum
Compound spectrum
(accurate mass)
EI
Library Searching
C12H17
5.11 ppmC9H11
-3.58 ppm
C8H9
-2.63 ppm
C10H13
0.93 ppm
α-Cubebene, full scan
C15H24
α-Cubebene: MS/MS
Precursor: 204
CE: 10 eV
(replib) α-Cubebene
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 2300
50
100
41
55
69 77
8191
105
119
133147
161
175 189
204
Accurate masses of ion fragments are consistent with molecular formula
MS/MS Analysis
Molecular Structure Correlator
Odor Profile of Compounds Increased in Failed Samples
Searching the flavor company catalogs by CAS number provided
odor profile information on the up-regulated compounds.
1Bedoukian Research2The Good Scents Company
Proposed NIST ID Formula CAS Odor
n-Hexadecanoic acid C16H32O2 57-10-3 Faint Oily1
Octadecanoic acid, ethyl ester C20H40O2 111-61-5 Waxy2
Squalene C30H50 111-02-4 Floral2
α-Cubebene C15H24 17699-14-8 Herbal2
Summary: A model that predicts the classification of extra virgin olive oils was constructed using data from the 7200 GC/Q-TOF and the MassHunter software suite.
High Resolution provides the required
selectivity
Mass Accuracy is essential for
defining compounds
MS/MS is critical of structural
confirmation of unknowns
Comprehensive Software is vital for
turning MS data into pertinent and
relevant results X
Authenticity: Food TypeDetermining Wine Varietal by LC/MS
• 45 red wine samples
used to create a
prediction model
• 15 Cabernet
• 16 Merlot
• 14 Pinot Noir
• Wines sampled
varied in geographic
origin and vintage
• 5 additional wines
which were not part
of the original
sample set were
correctly classified
using model
November 20, 201573
ITP 2013
Application note 5990-8451
Página 74 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Ejemplo de Aplicación de Autentificación de Vinos• 45 Vinos Tintos
• 3 Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)
• 11 países de origen: República Checa, Eslovaquia, Francia,
Italia, Macedonia, Bulgaria, Hungría, Australia, Chile,
Alemania, EE.UU.
• Cosechas: 2004 – 2008
CONJUNTO DE MUESTRAS MUY VARIADO
Página 75 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).
Instrumentación Utilizada
Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb
a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA
Agilent Technologies6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS
Agilent Technologies1200 RRLC system
Jet Stream ESI source
Multimode ion source
Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)
Software de
Análisis Estadístico
Multivariante
?
Página 76 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
?
?
??
?? ? ?
??
???
??
?
???
BLANCO
Procesado de Datos: ejemplo T.I.C.
TIC de Vino y blanco, LC-(ESI+) QTOFMS
???
?
?
?
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??
?
??
?
?
??
VINO
• Datos muy complejos.
• Compuestos minoritarios enmascarados.
Se requiere software que extraiga y
caracterice todos los compuestos
ionizados.
Los espectros corresponden a
múltiples compuestos coeluyentes
Página 77 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”
Find compound by Molecular
Feature Extractor
M.F.E. extrae 20.506 “features” del
conjunto de todas las muestras (en
las condiciones utilizadas)
Página 78 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Filtro por omisión: la existencia del “feature” en el
100%* de las muestras de al menos en un grupo.
En conjuntos de muestras muy variadas, algunos compuestos importantes podrían ser filtrados ...
Ave
rag
e i
nte
nsit
y
663 “features” de 20.506
Procesado de Datos mediante Agilent Mass Profiler Profesional: Filtración de Entradas por Frecuencia (Incidencia en las Clases)
* Filtrando con el 50%
el nº de “features”
aumenta de 663 a 3600
Página 79 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
PCA de los datos:Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26
CABERNET SAUVIGNON
MERLOT
PINOT NOIR
FILTRACIÓN
Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)
Un adecuado
filtrado de los
datos es
esencial para
una buena
clasificación
Página 80 Seminario LC-GC-CE/MS en Metabolómica
Marzo 2009
Validación del Modelo de Predicción de Clases
• Durante la validación del modelo, 2 MERLOT fueron mal clasificados.
• Todos los Cabernet Sauvignon y Pinot Noir se clasificaron correctamente.
• La fiabilidad de predicción del modelo resuelto ser del 95.6%*
El modelo clasificó correctamente las 5 muestras adicionales evaluadas (2 CS, 1M, 2 PN).
Número de muestras utilizadas en la validación: 45
* ANOVA utilizó para filtrar un p≤0.05.
Agenda
November 20, 201581
Intro evolución ciencias ómicas
Flujos de Trabajo en Metabolomica
Aplicaciones en Ciencias de la Vida
Introducción al perfilado
Autenticidad
Degradación de Alimentos
Desarrollo de procesos
Degradación del alimentoCreación de un análisis dirigido para identificar la degradación
Las condiciones ambientales durante el transporte y
almacenaje de un producto alimentario pueden mermar su
estado y degradarse.
• El análisis de productos degradados permite identificar
compuestos que son Indicadores o Marcadores de la calidad
o degradación.
• Esto permite la creación de un método de análisis dirigido de
los marcadores que permite aceptar o rechazar materia
prima o producto final basado en la calidad.
82
Condiciones experimentales
• La muestra de referencia (control) se
refrigera : Reference
La otra muestra se somete a luz
UV y se analiza tras 1 semana y
otra vez tras un mes de
exposición : Sample
Vial Ambar
Vial Incoloro
November 20, 201583
8x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
+ TIC スキャンSAKE_R_N1.D
1 1
8x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
+ TIC スキャンSAKE_T_1WEEK_N1.D
1 1
8x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
+ TIC スキャンSAKE_T_1MONTH_N1.D
1 1
8x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
+ TIC スキャンSAKE_B_1WEEK_N1.D
1 1
8x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
+ TIC スキャンSAKE_B_1MONTH_N1.D
1 1
カウントvs. 測定時間(min)
7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 23.5 24 24.5 25 25.5 26 26.5 27 27.5 28 28.5 29 29.5 30 30.5 31 31.5 32 32.5 33 33.5 34 34.5 35 35.5 36 36.5 37
Test de deterioro por GC/MS Total Ion Chromatogram
Reference (Stored in the refrigerator)
Brown vial, 1 week
Brown vial, 1 month
Transparent vial, 1week
Transparent vial, 1 month
November 20, 201584
Test de deterioro por GC/MSPCA 3D Score Plot
Transparent vial, 1 month
Brown vial, 1 month
Reference
November 20, 201585
Test de deterioro por GC/MSPCA 2D Score Plot y Loading Plot
Hierarchical Cluster Tree
Classification of entities
(compounds) from hierarchical
cluster tree
November 20, 201586
Test de deterioro por GC/MSFiltrado de compuestos con MPP filters
All Entities 441Entities with 100% frequency at
least one condition 260Entities that have significance by
One-way ANOVA p<=0.05 66
Entities with the Fold
Change>=2.0 between
Reference and 1 Month 24
Reference 1 week 1 month
Los filtros aplicados en MPP reducen el tratamiento de datos
extrayendo tan solo aquellos que son diferenciales.
November 20, 201587
Degradación del alimentoSake (Licor Japonés) por GC/MSUna muestra de Sake de buena calidad se divide en 2 viales
• La muestra de referencia (control) se refrigera
• La otra muestra se somete a luz UV y se analiza tras 1 semana y
otra vez tras un mes de exposición.
• El acido piruvico se identifica como buen marcador de la
degradación.
November 20, 201588
Increasing entitiesDecreasing entities
down up
1 week
1 month
Reference
Compuesto menguante: Pyruvic acid (m/z=174)
ITP 2013
Agenda
November 20, 201589
Intro evolución ciencias ómicas
Flujos de Trabajo en Metabolomica
Aplicaciones en Ciencias de la Vida
Introducción al perfilado
Autenticidad
Degradación de Alimentos
Desarrollo de procesos
Desarrollo del ProductoCaracterización de la Calidad o Propiedades
Algunos productos alimentarios como la cerveza y el vino estan
experimentan cambios con el tiempo “envejecimiento”. Este paso del
tiempo en ocasiones provoca efectos no deseados pero en otros
casos mejora el producto.
• Identificación de los compuestos presentes en el producto
deseado
• Optimización del proceso de producción y almacenaje para
potenciar el efecto deseado y atenuar el NO deseado.
Algunos estudios en alimentación buscan las propiedades genéticas
de un alimento para poder entender sus efectos beneficiosos y los
efectos medicinales que provocan en un organismo.
• Comparación de muestras normales frente a aquellas que
provocan un efecto beneficioso. (Nutracéuticos)
• Examinar diferencias genéticas y realizar una análisis de rutas
metabólicas para entender los mecanismos biológicos
relacionados.
90
Desarrollo del ProductoCaracterización de cerveza por LC/MS
• Los cromatogramas TIC parecen similares a lo largo de los días de envejecimiento
• Un análisis Multivarianteutilizando MPP reveló compuestos que sí variaban durante el envejecimiento
• Si extraemos los EIC de éstos compuestos percibimos cambios de más de > 10x en los compuestos de interés después de 14 días de envejecimiento
91
Day 0
Day 5
Day 2
Day 8
Day 14
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1
Day 0
Day 2
Day 5
Day 8Day 14
Novel Ion Mobility Technology for LC/MS
Mass Accuracy Does Not Equal Compound Identification: Seven Golden Rules - Oliver Fiehn
Empirical formula is not unique above
mass m/z 100 (searching PubChem)
Number of formula: ChemSpider mass
search at m/z 400.3787
• 1 ppm mass error → 1742 entries
• 0 ppm mass error → 340 entries
Need additional physical information to
identify
• MS/MS spectra
• Physical properties such as:
• Chromatographic retention time
• Ion mobility cross section (size,
charge)
Number of Database Entries
(Assuming Zero Mass Error)
November 20, 2015
93
What Does Ion Mobility Bring to Mass Spectrometry?
Separation
• A new dimension of separation for increased mass spectral purity especially for complex mixture analysis.
• Ion Mobility resolves of many isomeric analytes otherwise impossible to determine by mass spectrometry alone.
Improves Detection Limits
• Ion Mobility dramatically reduces interference from other analytes and background.
• Efficient ion focusing and transfer through the ion optics maximizes sensitivity for the overall system
Confirmation
• Collision Cross Section data gives additional information supporting compound characterization and identification.
November 20, 2015
94
Ion Mobility – A Brief History…
November 20, 2015
95
1905
Ion mobility theory
Paul
Langevin
1969
Transport of Ions in Gases
McDaniel & Mason
1997
Applications to clusters & biomolecules
Clemmer & Jarrold
2006
Synapt Triwave
G2 in 2009
G2S in 2011
2013
Agilent IMS QTOF
1872 - 1946
Mass Spectrograph
Aston & Thomson
1919
Solving Analytical Problems
November 20, 2015
96
Better IM resolution
Higher IM sensitivity
Resolve complex samples
Direct measurement
of Ω
Preserve molecular structures
• Richard Smith
• Erin BakerPNNL
• Cathy Costello
• Joe ZaiaBoston University
• David Russell
• Fred ZinnellTexas A&M
• John McLean, Jody May and Cody GoodwinVanderbilt University
• Al Yergey
• Peter Backlund. NIH
• Agilent LABS R&DAgilent
Drift Ion Mobility for LC-MS
Cross sectional areas
Complex Samples
Shape and Charge
Conformers
Isomers
Chromatography, Mass Resolution &
now Ion Mobility
2013 ASMS Scientific Presentations:
• Disease research
• Proteomics, Metabolomics, Lipidomics
• Natural Products
• Fundamental studies
Ion Mobility
MS
Pacific Northwest
Labs
Texas A&M
VanderbiltUniversity
Boston University
NIH
November 20, 2015
97
Resolution Is Important!
Chromatographic Ion Mobility Mass
~seconds ~60 milli-seconds ~ 100 m seconds
November 20, 2015
98
It’s All About Separation
Chromatography Ion Mobility Mass
~seconds ~60 milli-seconds ~100 m seconds
November 20, 2015
99
IM-QTOF Instrument OverviewNovel Aspects Achieve New Performance Capabilities
DC only drift tube to achieve lowest ion temperatures
System sensitivity optimized using electrodynamic ion funnels
Designed for both high Ion Mobility and Mass Resolution
Ion Fragmentation can be selected using standard QTOF collision cell (CID)
10x increase in data acquisition system to support the additional data rates of adding the 3rd Ion Mobility Dimension
November 20, 2015
100
IM-MS Operational Modes
101
• QTOF Only Mode
• Mobility Separated Precursor Ion Mode
• Mobility Separated All Ions Fragmentation Mode
• Mobility Separated Targeted MS/MS Mode
m/z selectionON/OFF
FragmentationON/OFF
Mobility
separation
IM-QTOF workshop 01/28/14
tdrift
Detector
Analyte
Ions
Gating
Optics
Ion Mobility Cell
t0
VH VL
Electric Field
Stacked ring ion guide gives linear field
𝑣 = 𝐾 𝐸 ∝𝑒 𝐸
𝑃 𝑇 Ω
Basic Operational Principle of Ion MobilityFor Conventional DC Uniform Field IMS
November 20, 2015
102
Resolving Stereoisomers
α-glucose β-glucose
Ion mobility enables separation of glucose stereoisomers
Melezitose
Raffinose
α-glucose b-glucose
Resolving Different type of Isomers
Conformational Space Occupancy of Biomolecules: Class Association by Trend Curves
Size Shape
Charge
Using a Synapt does NOT allow compound class association
Drift tube IMS allows
Class association
Conformational Space Occupancy of BiomoleculesC
oll
isio
n C
ros
s S
ec
tio
n(Å
2)
Mass (Da)
Hypothetical Ordering of
Biomolecular Classes
lipids
carbohydrates
peptides
oligonucleotides
November 20, 2015
106
Lipid nomenclature
Trivial nomenclature Palmitoleic acid Trivial names (or common names) are non-systematic historical names.
Systematic
nomenclature
(9Z)-octadecenoic
acid
Systematic names (or IUPAC names) derive from the standard IUPAC Rules for
the Nomenclature of Organic Chemistry, published in 1979,[1] along with a
recommendation published specifically for lipids in 1977.[2] Counting begins from
the carboxylic acid end. Double bonds are labelled with cis-trans isomerism-
/trans- notation or E-/Z- notation, where appropriate.
Δx nomenclaturecis,cis-Δ9,Δ12
octadecadienoic acid
In Δx (or delta-x) nomenclature, each double bond is indicated by Δx, where the
double bond is located on the xth carbon–carbon bond, counting from the
carboxylic acid end. Each double bond is preceded by a cis- or trans- prefix,
indicating the conformation of the molecule around the bond.
n−x nomenclature n−3
n−x (n minus x; also ω−x or omega-x) nomenclature both provides names for
individual compounds and classifies them by their likely biosynthetic properties in
animals. A double bond is located on the xth carbon–carbon bond, counting from
the terminal methyl carbon (designated as n or ω) toward the carbonyl carbon.
Lipid numbers
18:3; or 18:3, n-6; or
18:3, cis,cis,cis-
Δ9,Δ12,Δ15
Lipid numbers take the form C:D, where C is the number of carbon atoms in the
fatty acid and D is the number of double bonds in the fatty acid. This notation can
be ambiguous, as some different fatty acids can have the same numbers.
Source: Wikipedia
November 20, 2015
107
Lipid classes
Source: Wikipedia
Fatty acids
Glycerolipids
Glycerophospholipids
Sphingolipids
Sterol lipids
Prenol lipids
Saccharolipids
Polyketides
Main classes Examples of Glycerophospholipids
November 20, 2015
108
Cerebrosides
Cerebrosides are glycosphingolipids called
monoglycosylceramides which are important components in
animal muscle and nerve cell membranes.
November 20, 2015
109
Diseases Based on Sphingolipids
Disease Deficient enzyme Accumulated products
Niemann-Pick disease Sphingomyelinase Sphingomyelin in brain and RBCs
Fabry disease α-galactosidase A Glycolipids in brain, heart, kidney
Krabbe disease Galactocerebrosidase Glycolipids in oligodendrocytes
Gaucher disease GlucocerebrosidaseGlucocerebrosides in RBCs, liver and
spleen
Tay-Sachs disease Hexosaminidase A GM2 gangliosides in neurons
Metachromatic
leukodystrophy
Arylsulfatase A or
prosaposinSulfatide compounds in neural tissue
Source: Wikipedia
November 20, 2015
110
Lipid Analysis
Tetraalkylammonium Salts
+2 ions
+3 ions
+1 ions
+4 ions
Ion
Mo
bilit
y D
rift
Tim
e (
ms)
Mass (Da)
0
0
20
40
50
500 1000 1500 2000
10
30
60
70
L-α-phosphotidylethanolamines (PE)
TAA-3
TAA-16
TAA-12
TAA-10
TAA-8TAA-7
TAA-6
TAA-5
TAA-4
November 20, 2015
111
Lipid AnalysisIo
n M
ob
ilit
y D
rift
Tim
e (
ms)
Mass (Da)
0
0
20
40
50
500 1000 1500 2000
10
30
60
70
PE 60:NPE 62:N
PE 64:N
PE 33:NPE 35:N
PE 37:NPE 39:N
PE 41:N
PE 23:NPE 21:N
PE 19:N
PE oligomers (+1)
PE oligomers (+2)
L-α-phosphotidylethanolamines (PE)
November 20, 2015
112
Lipid AnalysisIo
n M
ob
ilit
y D
rift
Tim
e (
ms)
Mass (Da)
0
0
20
40
50
500 1000 1500 2000
10
30
60
70
PE 35:(6-2) PE 37:(8-4) PE 39:(10-6)PE 33:(4-2)
+Na +K
Mass (Da)
740 760 770 780 790750 800 810 820
PE 60:NPE 62:N
PE 64:N
PE 33:NPE 35:N
PE 37:NPE 39:N
PE 41:N
PE 23:NPE 21:N
PE 19:N
PE oligomers (+1)
PE oligomers (+2)
November 20, 2015
113