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MODULO 4
Disertante:Prof. Dra. Lucía Pareja
Parte IIICONTENIDO
✓ Optimización de un método de cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem
LC-MS/MS (QqQ) (Triple cuadrupolo)
HPLCMuestra
Analizador
SoftwareAnálisis de datos
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
• Q1 Selecciona el [M+H]+
• Q2 Fragmenta el ion seleccionado.
• Q3 Monitorea sólo el ión fragmento
Q0 Q1 Q2 Q3
N2 CAD Gas
Precursor ion
selection
Ion accumulation
Fragmentation
Exit lensSteps MS2: 1 2 3 &4
LC-MS (QQQ)
Sistema de Inyección
Fuente de ionización
Analizador DetectorRegistro de
datos
Espectro de masas
Inyector
✓Inyección directa.
✓ Inyección indirecta.
❑ A partir de un cromatógrafo
-Cromatografía gaseosa (GC).
-Cromatografía líquida (LC).
Modo de introducción de muestra
• Inyección directa
• FIA
• Cromatografía
Modo de introducción de muestra – inyección directa
• Útil para el análisis de compuestos puros
• Determinación de Masa exacta
• Optimización de compuestos en triple cuadrupolo
Usos•Ej: Optimización de compuestos en triple cuadrupolo
(QqQ)
Modo de introducción de muestra –inyección directa
Flujo: 10 µL min-1
Modo de introducción de muestra – inyección directa
¿Qué implica “optimizar” un compuesto?
Al optimizar un compuesto se crea un método de adquisición demasas. Lo que se busca es lograr una reducción del ruido y unaumento de la señal.
Son parámetros exclusivamente del analizador y son dependientesdel compuesto.
Modo de introducción de muestra – inyección directa
Modo de introducción de muestra – cromatografía
Modo de introducción de muestra – FIA
FIA = Análisis por Inyección en Flujo
• En la práctica, se realiza con un cromatógrafo
• Con la diferencia que no se utiliza la columna
• Se reproducen las condiciones de flujo y FM reales
Modo de introducción de muestra – FIA
• Exclusivo para optimizar parámetros de la fuente de ionización
• Voltaje del electrodo
• Temperatura y gases (de secado, de electrodo y cortina)
Modo de introducción de muestra – FIA
Tener en cuenta que las condiciones de ingreso de muestra,para inyección directa (infusión) y a partir del cromatógrafo noson idénticas, lo que puede generar una diferencia en laionización de los compuestos
Sistemas de ionización
✓El rol de la fuente en un espectrómetro de masas es generar ionesen fase gaseosa
✓La elección de la fuente depende de la aplicación
Se alimenta la fuente de ionización(ESI) con una solución quecontenga al compuesto puro.
Dependiendo el modelo delequipo, el fabricante recomiendauna concentración inicial
Optimización de compuestos
✓ Se trabaja monitoreando la intensidad de la señal en función de losvoltajes aplicados
✓ Para DP y EP únicamente trabajamos con Q1
✓ Para CE, posterior a la optimización de DP y EP se trabaja en modoProduct Ion
Optimización
• El voltaje de fragmentación, el entrance potential (EP) y la energía decolisión se optimizan individualmente para cada plaguicida.
• En algunos casos se inyecta cada plaguicida a cuatro voltajes defragmentación diferentes (60, 90, 120, 150 V) y se selecciona el óptimopara aislar el ión precursor deseado.
• Se preparan disoluciones patrón individuales de 1 mg/L en MeCN:H2O1:1 (v/v) y se inyectan mediante el sistema FIA (Flow injection Analysis)o inyección directa
• Se seleccionan como mínimo dos transiciones: una de cuantificación(la más intensa), y otra de confirmación.
Optimización de compuestos
Optimización del Voltaje de Fragmentación
PM 424,4
[M+Na]+ 447,1[M+H]+ 425,1
Optimización de la Energía de Colisión
Optimización de DiazinónN
N
O
P
S
O
[M+H]+
N
N
O
P
S
O
Voltaje de Fragmentación
Energía de Colisión
N
N
O
P
S
O
M+ 153,1
M+ 169
Optimización de compuestos
P es tic ide T rans ition
F rag mentor
(V)
C ollis ion
E nerg y (V)
R etention
time (min)
312→270 15
312→236 15
230→174 15
230→146 20
291→72 20
291→218 20
331,1→268,2 20
331,1→259,1 20
378→159 20
378→70 20
208,1→95,0 10
208,1→152,1 5
268,2→226,2 5
268,2→180,2 15
249→160 20
249→182 15
378,1→184,1 20
378,1→150,2 20
303→145 5
303→85 15
304→217 20
304→234 15
293→204 20
293→182 15
404→372 10
404→344 20
328,2→282,2 15
382,2→254,2 20
330,9→127,1 10
330,9→205,0 20
318,1→160,2 10
339,0→253,7 5
208→151 5
208→109 15
289,2→125,1 20
289,2→70,2 15
302→97 25
302→55 30
376,1→349,2 20
376,1→307,1 20
294,2→225,0 10
294,2→197,1 10
308→70 20
308→125 20
341,1→205,1 20
341,1→189,2 20
311→158 10
311→141 20
369,3→149,2 15
369,3→133,1 20
Terbuthylazine ¿20,3?120
Chloroxuron 20,4
Fenarimol 20,5
120
150
Bromuconazole 20,5 y 21,58
Fenobucarb 20,6
120
90
Diethofencarb 20,6
Linuron 20,6
90
90
Pyrimidifen 20,7
Methidathion 20,760
120
Fenamiphos 20,8
Chlorbromuron 21
120
120
Azoxystrobin 21,06
Fluazifop 20,3
120
150
Dimethylvinphos 21,1
Phosmet 21,190
90
Promecarb 21,14
Myclobutanil 21,2
60
150
Fenhexamid 21,3
Fluquinconazole 21,5
90
150
Triadimefon 21,6
Tebuconazole 21,67
150
90
21,7
Diflubenzuron 22,2
120
120
Methoxyfenozide 22,390
90Isocarbofos 20,3
Pyridaphenthion
P es tic ide T rans ition
F rag mentor
(V)
C ollis ion
E nerg y (V)
R etention
time (min)284→159 20
284→70 15
302,2→116,2 5
302,2→88,2 20
395,2→175,1 10
395,2→339,2 5
330→245 15
330→101 20
314,1→286,2 10
314,1→162,2 20
400,1→238,1 5
400,1→150,2 20
284→252 10
284→176 20
346→278 5
346→73 10
305,1→221,1 10
305,1→263,2 5
284,3→256,3 15
284,3→95,0 20
331→127 10
331→99 20
368,1→160,2 10
368,1→132,2 15
270→238 15
270→162 15
311,0→283,1 10
311,0→173,0 5
275→88 15
275→114 10
265,1→248,1 15
365,1→218,1 20
406→337 15
406→251 20
353,2→296,9 5
353,2→133,1 15
359→155,1 10
359→126,9 15
359→156 15
359→139 20
299,1→163,2 20
299,1→147,2 20
326→294 5
326→208 15
336,2→246,2 15
336,2→229,2 20
437,3→368,2 15
437,3→315,3 20
327→152,2 30
327→77,2 35
292→264 5
292→236 10
368,0→199,0 10
368,0→171,0 20
315→162 20
315→128 15
Penconazole 22,490
Fenoxycarb 22,6
Chromafenozide 22,7
90
90
Iprodione 22,7
Triazophos 22,8
90
150
Alanycarb 22,8
Metolachlor 22,96120
90
Triflumizol 22,9
Propaphos 23
90
90
Procymidone 23
Malathion 23,03
150
90
Azinphos-ethyl 23,1
Alachlor 23,18
150
90
Edifenphos 23,3
Neburon 23,3120
120
Aclonifen 23,5
Difenoconazole
23,59 pico
doble arriba
120
120
Tebufenozide 23,7
Chlorfenvinphos
23,7 (y 24,5
pequeño)
150
120
Triflumuron 24,08
Quinalphos 24,1
120
150
Benalaxyl 24,1
Kresoxim-methyl 24,2
120
150
Fipronil 24,3
TPP 24,6
150
120
Parathion 24,67
Anilofos 24,7
90
120
Triclocarban 24,8120
P es tic ide T rans ition
F rag mentor
(V)
C ollis ion
E nerg y (V)
R etention
time (min)303,0→137,9 5
303,0→102,2 20
306→201 10
306→116 15
461→158 15
461→141 15
306,2→164,2 20
306,2→108,2 20
305→169 15
305→153 20
381→158 20
381→141 20
231→199 15
231→121 15
308,1→196,9 35
308,1→271,9 25
384,1→197,1 20
384,1→171,1 20
528,1→249,1 15
528,1→150,2 15
334,1→171,1 20
334,1→145,1 20
409,2→206,2 10
409,2→186,2 20
427,1→145,1 20
427,1→205,1 5
511→158 20
511→141 20
322→96 10
322→185 20
489→306 15
489→158 15
307,3→161,3 15
307,3→147,2 15
353,1→228,2 10
353,1→168,2 20
385,1→199,0 5
385,1→171,0 10
373,2→175,0 20
373,2→81,0 30
365,2→309,2 10
365,2→147,3 20
385,2→329,2 20
385,2→287,1 20
256→88 20
256→57 20
371→273 5
371→255 20
Clofentezine 24,9150
Buprofezin 24,9
Hexaflumuron 25,06
120
120
Pirimiphos-methyl 25,3
Diazinon 25,3
150
120
Teflubenzuron 25,4
Isofenfos Metil 25,490
90
Quinoxyfen 25,9
Tolfenpyrad 26,1
150
120
Indoxacarb 26,2
Tebufenpyrad 26,3
150
150
Trifloxystrobin 26,4
Fluacrypyrim 26,6
120
90
Lufenuron 26,8
Pyriproxyfen 27,4
120
120
Flufenoxuron 27,5
Fenazaquin 27,8
120
150
Hexythiazox 28,3
Ethion 28,6
120
90
Propargite 29
Pyridaben 29,6
150
120
Spiromesifen 30,3660
Diafenthiuron 29,7
Cartap ¿29,9?120
120
249→160 20
249→182 15 20,690Linuron
376,1→349,2 20
376,1→307,1 20Fluquinconazole 21,5150
Condiciones de Operación de LC-MS/MS
Pesticide Transition
Fragmentor
(V)
Collision
Energy (V)
Retention
time (min)224→167 5
224→109 15
202→145 10
202→127 20
216→174 15
216→146 20
233→72 20
233→160 20
732,5→142 20
732,5→98 20
280→220 10
280→160 20
287→123 20
287→72 20
192,1→119,0 15
192,1→91,1 20
207→72 20
207→165 10
417→227 20
417→159 20
233→160 20
233→72 20
226→164 5
226→107 15
215→148 15
215→126 15
Spinosyn D 746,5→142 120 20 18,3
886,5→158,2 20
886,5→302,4 20
260→149 10
260→171 20
194,1→95,1 15
194,1→152,0 5
388→301 20
388→165 20
226,2→92,9 40
226,2→76,9 40
371,1→325,1 10
371,1→151,1 20
408→182 20
408→301 10
376→308 10
376→266 15
296,2→227,0 5
296,2→70,2 10
207,0→190,1 15
207,0→160,1 20
230→188 20
230→146 20
317→166 20
317→108 20
396,9→351,0 15
396,9→255,1 20
292→125 20
292→70 20
226→169 5
226→121 20
Bendiocarb 16,6
Carbaryl 17,2
90
140
Atrazine 17,3
Fluometuron 17,3120
120
Spinosyn A 17,5
Metalaxyl 17,5
150
120
Difenoxuron 17,56
Deet 17,6
90
120
Isoproturon 17,6
Miconazole 17,7
120
120
Diuron 17,7
Ethiofencarb 17,860
120
Monolinuron 17,9
Emamectin benzoate 18,5 y 19,2
120
90
Metobromuron 18,58
Isoprocarb 18,7
120
90
Dimethomorph 18,8 y
Cyprodinil 18,8
150
150
Thiophanate-ethyl 18,9
Flazasulfuron 19 afinar120
90
Prochloraz 19,5
Triadimenol 19,5 y 19,9
90
60
Dicloran 19,6
Propazine 19,78120
150
Bupirimate 19,85
Ethiprole 20,1
150
120
Cyproconazole 20,13
Methiocarb 20,27
120
90
P es tic ide T rans ition
F rag mentor
(V)
C ollis ion
E nerg y (V)
R etention
time (min)167→85 20
167→125 15
182→137 15
182→73 20
184,1→143,0 5
184,1→125,0 15
189,2→144,1 10
189,2→102,1 15
142,1→125,0 10
142,1→94,1 10
214,1→183,0 5
214,1→125,0 20
214,0→171,8 5
214,0→153,9 15
192→160 15
192→132 20
207→132 5
207→89 10
202→175 5
202→131 10
203,1→129,1 5
203,1→157,1 5
199→128 15
199→171 10
271→225 10
271→99 10
218→202 20
218→190 20
223→166 5
223→106 5
224→127 10
224→98 15
237→72 10
237→90 5
223→148 5
223→86 10
185→128 5 6,2
185→99 10
no se ve 2ª
transición
239,2→182,1 15
239,2→72,2 20
292→211 10
292→181 20
242→185 10
242→170 20
303→261 15
303→217 20
203→175 15
203→104 20
222→104 20
222→92 20
165→120 15
165→72 20
256→209 15
256→175 15
316→191 20
316→284 15
Cyromazine 2,3120
Thiocyclam 2,9
Acephate 3,1790
90
Propamocarb 3,2
Methamidophos 3,2
150
90
Omethoate 3,3
Chlorpropham 3,3
90
90
Carbendazim 3,38
Aldicarb sulfoxide 3,4
150
60
Thiabendazole 3,6
Dinotefuran 3,890
90
Cymoxanil 3,87
Nitempyram 4,57
90
90
Ethoxyquin 4,7
Butoxycarboxin 4,8
150
90
Monocrotophos 4,8
Oxamyl 5,05
60
60
Aldicarb sulfone 5,28
Methomyl
Pirimicarb 6,6150
120
90
Thiametoxam 7,48
Methiocarb sulfoxide 8,14
90
90
Cambendazole 9,1
Metamitron 9,17 y 14,45
120
120
Chloridazon 9,98
Fenuron 10,02
120
90
Imidacloprid 10,32
Oxfendazole 10,34
90
120
P es tic ide T rans ition
F rag mentor
(V)
C ollis ion
E nerg y (V)
R etention
time (min)230→199 5
230→171 10
223→126 20
223→56 15
213→75 15
213→156 5
253→126 20
253→186 10
266→234 20
266→192 20
296→264 20
296→105 20
297→255 15
297→159 20
213→116 10
213→89 15
261→205 10
261→188 20
255→209 15
255→181 20
279→219 5
279→133 20
199→126 20
199→72 15
202→132 20
202→124 20
235→153 10
235→136 20
166→109 5
166→91 20
202→146 15
202→110 20
231→89,2 10
231→61 20
221,1→144,9 10
221,1→109,0 15
200→107 20
200→183 20
298→144 20
298→100 20
242→200 90 20
242→158 90 20
180,1→123,0 5
180,1→95,1 20
300→268 20
300→159 20
242→186 120 20
242→158 90 20
222→165 10
222→123 20
213→72 20
213→140 20
Dimethoate 11,290
16,59
Acetamiprid 11,3
Butocarboxin 13120
120
Thiacloprid 13,28
Albendazole 13,6
120
120
Mebendazole 13,7
Imazalil 13,9
120
150
Aldicarb 13,9
Bromacil 14,23
120
90
Fluroxypyr 14,5
Oxadixyl 14,5
120
90
Monuron 14,58
Simazine 14,5
120
120
Lenacil 15,11
Metolcarb 15,15
90
60
Desethylterbutylazine 15,2
Demeton-S-Metil 15,2780
120
Dichlorvos 15,5
Pyrimethanil 15,6
150
120
Spiroxamine 16,17
Prometryn 16,35
16,4, 16,9 y 17,5
Fenbendazole 16,47
60
120
Chlorotoluron 120
Terbutrin 16,48
Carbofuran 16,5890
XMC
120
242→200 90 20
242→158 90 20Prometryn 16,35
242→186 120 20
242→158 90 20Terbutrin 16,48
233→72 20
233→160 20Fluometuron 17,3120
233→160 20
233→72 20Diuron 17,7120
Spinosyn D 746,5→142 120 20 18,3
Condiciones de Operación de LC-MS-MS
Programa Gradiente
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
Tiempo (min)
AcN
(%
)
Selección de las condiciones cromatográficas
Tipo de columna: Agilent Zorbax, Eclipse XDB – C8 4,6 x 150 mm;5µm
Fase móvil: mezclas de H2O (0,1% ácido fórmico), MeCN, MeOH,entre otros
Flujo de la fase móvil: 0,3-0,6 mL/min
Volumen de inyección: 5-20 µL/min
Ejemplo de gradiente:
Creación del método
Ventana de tiempo 1 2 3 4 5
Tiempo (min) 0-14,1 14,1-18,1 18,1-20,9 20,9-23,4 23,4-33
Cada ventana de tiempo permite 99 transiciones 5 segmentos de tiempo para los 150 plaguicidas.
Inyector Bomba Columna
Analizador
Cromatograma de iones totales en mix de estándares a 100 µg/L
O
CH3
CH3O
O
P
S
O
NH
CH3
H3C
CH3
Carbendazim
Imidacloprid
Imazalil
Pyrimethanil
Atrazine
Triflumizole
Isofenphos methyl
Isocarbophos
LC-QqQ-MS
Estandar Scheduled
Modos Adquisición
•Aumenta el duty cycle, el tiempo en que monitorea un
determinado analito.
•Permite monitorear un mayor número de transiciones.
Optimización instrumental
Herbicida Polaridad tR (min) SRM 1 SRM 2
Imazetapir +/- 7,8 288/244 288/201
Dicamba - 11,2 219/174,8 219/144,8
Quinclorac + 10,8 242/224 242/196
Metsulfurón metil + 11,9 382/167,1 382/141,1
Bentazone - 13,6 239/132 239/197
Penoxsulam + 15,1 484/195,2 484/444,1
Clomazone + 15,9 240/125 240/99,1
Bispiribac Sodio + 16,0 431/275,1 431/119,1
Propanil + 16,3 218/162 218/127
Pirazosulfurón etil + 17,2 415/182,2 415/139,2
Cihalofop butil + 23,7 358,4/256,2 358,4/120,1
LOD del Carbendazim a 0.1 µg/L
Standard mode
Scheduledmode
Triciclazol en muestra real y solución estándar a 0,1 µg/L
Agua cañada
Estándar en matriz
190,1/163,1
190,1/136,1
Ratio 0.8 Ratio 0.8
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