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DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS
CONTAMINANTES DEL AGUA
Dra. Galdy Hernández ZárateMicrobiología Molecular
Departamento de Ciencias del MarInstituto Tecnológico de Boca del Río
Boca del Río, Ver.
Correo-e: [email protected]@live.com
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Temas
1. Importancia de los microorganismos.
2. Calidad microbiológica del agua, inocuidad y calidad
alimentaria, sanidad acuícola y vegetal.
3. Diagnóstico microbiano: métodos tradicionales vs métodos
biomoleculares.
4. Casos de estudio: granjas de producción acuícola/monitoreo
ambiental: calidad del agua (Quintana Roo y Veracruz)
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MédicaSalud publica y socioeconómica
EcológicoDescomposición
Ciclos biogeoquímicosBioindicadores
Biorremediación
Industrial Alimenticia/Farmacéutica
Fermentaciones, probióticos
Ecología humana, animal, vegetalSimbiosis, nutrientes, descomposición
IndustriaAgrícola
EnergéticaBiocombustibles(biogas, biodisel)
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Salud PúblicaBacterias, microalgas virus,
hongos, protozoos
Sanidad AnimalAcuícola/Pecuaria
Sanidad Vegetal (bacterias, hongos, viroides)
Inocuidad y calidad agroalimentariaAgua de riego/fertirrigación
Salud de los EcosistemasFlorecimientos algales nocivos (cianobacterias
dinoflagelados, microalgas)Biorremediación
Prevención, tratamiento, curade
enfermedades
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Problemáticas: brotes de enfermedades en productos de importancia comercial
ACUÍOLAS
1980-Flavobacterium,
Pseudomonas,
Photobacterium, Aeromonas,
Moxarella: P. monodon
1990-V. harveyi, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus:
peces, camarones.
1994-TSV IHHNV, HPV, IMNV,
MBV, YHV y WSSV: P. vannamei
P. stylirostris
AGRÍCOLAS
1990-Salmonella ponna: melon
cantaloupe
1995-E. coli O157:H7 (jugos,
rabanos, alfalfa)
1997-Hepatitis A: fresas
1999-Shigella: perejil
2003-Salmonella: mango
E. coli O157:H7 : ensaladas
2008-Salmonella: chiles
NOM-EM-038-FITO-2002
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Detergentes
Sustancias InorgánicasFertilizantes
Xenobióticosorgánicos: COPs(HerbicidasPesticidas)
MedicamentosY Productos de Uso Personal
HidrocarburosMetales
Pesados
Grasas y Aceites
MICROBIOLÓGICA
Materia
OrgánicaContaminación:
vibrios, florecimientos algales tóxicos (fitoplacton)
PRINCIPALES CONTAMINANTES DEL AGUA
MARCADORES QUÍMICOS
Analgésicos, cafeína. - Bloqueadores solares, jabones, cremas, otros
(DDT y metabolitos)BioacumulaciónBiomagnificación
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¿Por qué Estudiar la Calidad
Microbiologica del Agua?
Restaurantes
Inocuidadalimentaria
Hoteles
albercas, parquesecológicos, TA
Agua de lastrebuques y cruceros
Alimentosacuáticos y terrestres
Hidroagricola
Fertirrigación
(cianobacterias)
Aguas residuales
AmbientePlayas, ríos, lagunas,
lagos, manglarescenotes,
Prevenir la Contaminación Ambiental
Prevención y control de enfermedades, epidemias, plagas y brotesinfecciosos: humana, animal, vegetal y ambiental
Cultivos
Pecuaria, acuicola, agricola pesquera
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Monitoreo de Calidad del Agua y del Producto
Canales de agua
fuente de abastecimiento
de agua y drenes colectores
Actividades de
manejo y procesamiento
Productos acuícolas, agrícolas y hortofrutícolas
verificación/prevención
Calidad
Inocuidad
AN
ALISIS H
AC
CP
Buenas practicas agrícolas,
higiénicas y de manufactura
PRODUCTORES
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Determinación Microbiana: Identificación y Cuantificación
bacteriana
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TTTTÉÉÉÉCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALES
Microscópicas y Bioquímicas
� Tinciones
� Histológicas
� Fenotípicas
� Tiempos prolongados
� Variaciones: plasticidad fenotípica y metabólica
� Células viables no cultivables
� METODOS NORMADOS (NOMs Y NMXs)
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�NMX-AA-102-SCFI-2006 (MF)�NMX-AA-042-SCFI-2005 (NMP)� NMX-AA-120-SCFI-2006 (IDEXX)
� NOM-110-SSA1-1994
Métodos para Detección de Coliformes
Métodos de Norma (NMX)
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Microorganismos Indicadores
� Presencia, entrada, crecimiento o sobrevivencia de patógenos.
� Buenas prácticas de manejo
� Integridad del proceso que se realiza
INDICADORES DE CALIDAD
¿Qué Indica un MicroorganismoIndicador?:
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Métodos para Detección de Coliformes
(Filtracion en Membrana o FM)
Conexión de la bomba de vacío y trampa
Colocación de los filtros Colocación de los embudos
Filtrado de la muestra
Retirar el papel filtroColocar el papel en el mediode cultivo correspondiente
Incubado de la muestra bajocondiciones específicas de
temperatura y tiempo
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Ensayo Medio Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
Aspecto de las colonias
Coliformes totales
m-EndoAgar
35,0 ± 0,5 °C 24 hcolonias rojas con reflejos metálicos
Coliformes fecales(TermotolerantesTermofilicas)
m-FC Agar 44,5 ± 0,2 °C 24 hcolonias azules
Métodos de FM para CT y CFPrueba Presuntiva
CT CF
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• En tubos:En tubos:En tubos:En tubos:
• En charolas En charolas En charolas En charolas multipozosmultipozosmultipozosmultipozos
((((ColilertertColilertertColilertertColilertert////EnterolertEnterolertEnterolertEnterolert))))
Métodos para Detección de Coliformes (Método del NMP)
Ensayos enzimáticos o sustratos fluorogénicos
Tradicionales
Comerciales rápidos
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Pruebas comerciales rápidas
Micro Tester Pro
Amarillo tenue IntensoColiform Test Kit
ColiscanWater Monitoring Kits
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Parámetro Tipos de Agua
E. coli Residuales tratadas
Contacto directo
240 NMP/100 mL
Descarga aguas Residuales tratadas
Contacto ocasional 1,000 NMP/100 mL
Para consumo humano
0
Enterococos Áreas recreativas
0-200 NMP/100 mL
100 NMP/100 mL CERTIFICACIÓN
Shigella/Salmonella Para consumo humano
0
Vibrio cholerae
Para consumo humano
0
Parámetros Microbiológicos de Calidad del Agua Normados paradiferentes Usos del Agua
Descargas vertidas a suelo (uso en riego
agrícola
2,000 NMP/100 mL
NOM-001-ECOL-1996, NOM-001-SEMARNAT-1996, NOM-127-SSA1-1994, NOM-EM-034-FITO-2000
Suelos:<1,000 NMP/gr suelo seco
Manejo postcosechaAusencia
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�E. coli (enteropatógena y otros) Staphylococcus
� Rickettsia Klebsiella
� Enterococcus sp. Listeria monocytogenes
� Salmonella
� Shigella
�Pseudomonas
�Clostridium
�Aeromonas
�Vibrio cholerae
�Vibrio vulnificus
�Vibrio parahaemolyticus
�Campylobacter
�Yersinia enterocolitica
Patógenos Microbianos Monitoreados en AguaBacterias
Asociación Mexicana de Bioseguridad
AMEXBIO
http://amexbio.org/
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Monitoreo de Bacterias Patógenas en Agua
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Monitoreo de Virus y Parásitos en Agua
� Enterovirus
� Virus Norwalk
� Hepatitis A. E
� Rotavirus
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Monitoreo de Microalgas Nocivas en Agua
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METODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
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Basados en la PCR/Secuenciación:
PCR, RFLPs, ARDRAAFLPs, Rep-PCR, RAPDsRIR-PCR, ERIC-PCR,RT-PCR, DGGE, qPCR,Metagenómica
Basados en sondas para ADN o ARN:
ISH, FISH, dot blot
Basados en anticuerpos:
ELISA, Inmunocitoquímica, anticuerposfluorescentes, recombinantes, despliegue en fagos
MMMMÉÉÉÉTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARES(ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN proteproteproteproteíííínasnasnasnas))))
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Caracterización y diversidad genética de aislados ambientales (RADP)
Célula bacteriana
Cromosoma circular
ADN en forma de hélice
Huella genética
Clave de identificación única
G CC GT AT AA TT AG CC GA TA T
Marcadores Moleculares (RFLPs y RAPDs)
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Detección molecular por PCR de genes de virulencia
ADN molde
Multiples copias
(1 millón)
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SoluciSoluciSoluciSolucióóóón n n n de lavadode lavadode lavadode lavado
FormaldehidoFormaldehidoFormaldehidoFormaldehido al 6%al 6%al 6%al 6%
HIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIÓÓÓÓNNNN
LAVADOSLAVADOSLAVADOSLAVADOSVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIÓÓÓÓNNNN
FISHFISHFISHFISHSonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescente
Microscopio de Microscopio de Microscopio de Microscopio de epifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescencia
FIJACIFIJACIFIJACIFIJACIÓÓÓÓNNNN
Hibridación Fluorescente in situ
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INMUNOLOGÍA Anticuerpos recombiantes por Despliegue en Fagos
FvCs
Inmunización
Z3
Síntesis VH y VL
PCRBazo y linfocitos B
Expresión, extracción y purificación de los FvCs contra V. harveyi
Búsqueda y selección de clonasContra V. harveyi por ELISA
RNAT
RT-PCR
Construcción
del vector fasmídico y transformación en E. coli
Despliegue en fagos
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Caso de Estudio 1
Vibriosis y Coliformes en la
Acuicultura
Identificación molecular de Vibrio haveyi
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• AbundanciaAbundanciaAbundanciaAbundancia natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.
• PlasticidadPlasticidadPlasticidadPlasticidad fenotfenotfenotfenotíííípicapicapicapica y y y y metabmetabmetabmetabóóóólicalicalicalica
• UbicuidadUbicuidadUbicuidadUbicuidad y y y y adaptaciadaptaciadaptaciadaptacióóóónnnn a a a a sistemassistemassistemassistemas acuiculturalesacuiculturalesacuiculturalesacuiculturales
• PatPatPatPatóóóógenosgenosgenosgenos oportunistasoportunistasoportunistasoportunistas de de de de organismosorganismosorganismosorganismos acuacuacuacuááááticosticosticosticos
PRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURAPRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURA
PorPorPorPor ququququéééé VibrioVibrioVibrioVibrio spp.?spp.?spp.?spp.?
HOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDEROL. vannamei
PATPATPATPATÓÓÓÓGENOGENOGENOGENOV. harveyi
AMBIENTEAMBIENTEAMBIENTEAMBIENTESistemas
de cultivo
V. harveyi: un patógeno de organismos marinos cultivados
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VHML
FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE VibrioVibrioVibrioVibrio harveyiharveyiharveyiharveyi
Fosfolipasas
Cisteína-proteasaalcalina
Endotoxinas:Lipopolisacáridos
HemolisinasTLH
vhhA y vhhB
Metalo-Proteasa
dependiente de Zn2+,
proteasastermoestables o termolábiles.
ToxinasT1 y T2
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PREVENCIPREVENCIPREVENCIPREVENCIÓÓÓÓNNNN
DETECCIDETECCIDETECCIDETECCIÓÓÓÓNNNN
MONITOREO MONITOREO MONITOREO MONITOREO Identific
ación
molecular de las cepas
Larvas
Juveniles
Adultos
Genes y factores de
virulencia
EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia paraparaparapara la la la la prevenciprevenciprevenciprevencióóóónnnn, control y , control y , control y , control y manejomanejomanejomanejo de de de de laslaslaslas enfermedadesenfermedadesenfermedadesenfermedades bacterianasbacterianasbacterianasbacterianas
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Métodos
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AisladosAisladosAisladosAislados dededede VibrioVibrioVibrioVibrio utilizadosutilizadosutilizadosutilizados en en en en esteesteesteeste estudioestudioestudioestudio....CEPA FUENTE ORIGEN
Ea Sistema de eclosión Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L.stylirostris)
1A-1 Agua de mar cercana a la costa Bahía Santa Bárbara, Son, Méx. (L. stylirostris)
M1 Agua de mar del fondo de estanques con reproductores
Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx (L. stylirostris)
M1-a Agua mar estanques reporductores “
PN-9801 Órgano linfoide de juveniles enfermos Filipinas (P. monodon)
ML Larvas Criadero La Paz, B. C. S., México (L. vannamei)
ML-1 Larvas “
10MZ1 Nauplios Criadero Mazatlán, Sin. México. (L. stylirostris)
10MZ2 Nauplios “
11MZ Nauplios “
Na-1 Nauplios Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)
Na-2 Nauplios “
Z1 Agua de mar del fondo de un estanquecon reproductores
Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)
Z2 Agua de mar de la superficie de un estanque con reprorductores
“
Z3 Agua del mar cercana a la pared de un tanque con reproductores
“
15
ais
lad
os
de
sis
tem
as d
e p
rod
ucc
ión
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Análisis de RestricciónExperimental (Digestión
MspI)
Análisis de RestricciónTeórico
Determinación de CepasVibrio sp.
ANÁLISIS MOLECULAR
Amplificación Gene 16S DNAr
RFLPs
Diseño de Oligonucleótidos
Identificaciónde V. harveyi
PCRRAPDs
Búsqueda de PatronesGenéticos en V. harveyiy Diferenciación entre
Cepas
Generación de AnticuerposEcoliclonales
Phage Display
ELISA
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BBBBaseaseasease de de de de datosdatosdatosdatos deldeldeldelNCBI NCBI NCBI NCBI ((((GeneBankGeneBankGeneBankGeneBank))))
SelecciSelecciSelecciSeleccióóóónnnn de genes de de genes de de genes de de genes de V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyitxR, vhh-1, vhhB, luxL, luxM y
luxN
AlineamientoAlineamientoAlineamientoAlineamiento y y y y disedisedisediseñññño de o de o de o de oligosoligosoligosoligos para para para para pcrpcrpcrpcr usandousandousandousando el el el el programaprogramaprogramaprograma DNAStarDNAStarDNAStarDNAStar y la y la y la y la
base de base de base de base de datosdatosdatosdatos del del del del NCBINCBINCBINCBI
PCRPCRPCRPCR
IDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓÓÓN DE N DE N DE N DE V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi
EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia utilizadautilizadautilizadautilizada paraparaparapara el el el el disedisedisediseññññoooo de primers.de primers.de primers.de primers.
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RESULTADOS
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Amplificación del gen 16S ADNr
1, 500 pb
PM C+ B C D E F G H I J K L M N Ñ O
Confirmación de Vibrio sp.?
14126Aislados ambientales
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RFLPs del gen 16S ADNr con MspI. Carril R, V. harvyei (ATCC 14126), B, B. subtilis, E., E. coli, 1-15, aislados analizados, PM, peso molecular.
PM B 1 C+ B E 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
200015001000750
500
300
150
50
RFLPs: “corte” con enzimas de restricción
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Tabla VIII. Oligonucleótidos utilizados en el PCR.
OLIGOOLIGOOLIGOOLIGO GEN GEN GEN GEN BLANCOBLANCOBLANCOBLANCO PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO FUNCIFUNCIFUNCIFUNCIÓÓÓÓNNNN
TAMATAMATAMATAMAÑO DEL O DEL O DEL O DEL PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO
pbpbpbpb
txRtxRtxRtxR txRtxRtxRtxR TxRTxRTxRTxR ReguladorReguladorReguladorRegulador de la de la de la de la transcripcitranscripcitranscripcitranscripciónnnn
629629629629
vhhvhhvhhvhh----1111
vhhvhhvhhvhh----BBBB
vhhvhhvhhvhh----1111
vhhBvhhBvhhBvhhB
ββββ----lactamasalactamasalactamasalactamasa
hemolisinahemolisinahemolisinahemolisina
HidrHidrHidrHidrólisislisislisislisis del del del del anilloanilloanilloanillo ββββ----lactlactlactlactámicomicomicomico de de de de antibiantibiantibiantibióticosticosticosticosEnzimaEnzimaEnzimaEnzima lisalisalisalisa eritrocitoseritrocitoseritrocitoseritrocitos
818 818 818 818
656656656656
luxLluxLluxLluxL luxLluxLluxLluxL autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor MolMolMolMoléculaculaculacula seseseseñalalalal paraparaparapara la la la la expresiexpresiexpresiexpresiónnnn de la de la de la de la
luminiscencialuminiscencialuminiscencialuminiscencia dependientedependientedependientedependientede de de de densidaddensidaddensidaddensidad celularcelularcelularcelular
292292292292
luxMluxMluxMluxM luxMluxMluxMluxM autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor 393393393393
luxNluxNluxNluxN luxNluxNluxNluxN ProteProteProteProteínananana LuxNLuxNLuxNLuxN SensarSensarSensarSensar y responder al y responder al y responder al y responder al autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor
2048204820482048
Selección de Genes para el Diseño de Oligonucleótidos
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Amplificación de cepas ambientales de V. harveyi con luxN
2048
1500
1000
750
500
PM M1 C+ Z3 Z2
luxNluxNluxNluxN
PCRAmplificación específica
� Hernández-Zárate G. and Olmos-Soto, J. 2000. Molecular
identification of pathogenic and nonpathogenic strains of Vibrio harveyi
using PCR and RAPD. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 722-727 p.
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200015001000
750
500
300
Perfiles RAPDs para cepas V. harveyi
1281 1283 12901247 1254
R Z2 Z3 R Z2 Z3 R Z2 Z3R Z2 Z3 R Z2 Z3
RAPDsAmplificación inespecífica (gel agarosa con bromuro)
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Perfiles RAPDs de aislados de Vibrio spp., V. harveyi y la cepa control, utilizando el oligonucleótido OPS-11.
Ea PN 1A-1 PM M1 Z3 Z2 Z1 R
2072
1500
600
200
RAPDsAmplificación inespecífica (gel poliacrilamida con plata)
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R Vo Pd Vpa Vpe Vca Vpro Val PM
2000
1500
1000
750
500
300
150
50
Perfiles RAPDs de diferentes especies del género Vibrio, incluyendo V. harveyi.
RAPDs
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Clona 8 Clona 18 CT C-
Abs (405 nm)
EnsayoEnsayoEnsayoEnsayo inmunoenziminmunoenziminmunoenziminmunoenzimááááticoticoticotico de de de de laslaslaslas clonasclonasclonasclonas seleccionadasseleccionadasseleccionadasseleccionadas especespecespecespecíííífiicasfiicasfiicasfiicas paraparaparapara V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi. CT, . CT, . CT, . CT, control control control control E. coliE. coliE. coliE. coli Top10FTop10FTop10FTop10F’’’’virgen; Cvirgen; Cvirgen; Cvirgen; C----, control , control , control , control negativonegativonegativonegativo....
Anticuerpos Recombinantes
ELISA
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14126141261412614126 Z2Z2Z2Z2
Z3Z3Z3Z3 EaEaEaEa
M1M1M1M1 PN9801PN9801PN9801PN9801
Propiedades hemolíticas de los aislados V. harveyi y Vibrio spp.
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Carga Bacteriana en Tilapia
Granja BHT
(UFC/mL)
Vibrio
(UFC/mL)
1
5.7 x 104 80
4.1 x 104 75
2
4.7 x 103 69
1.6 x 105 58
Coliformes (NMP)
408.3
437.1
258.9
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Caso de Estudio 2
Calidad Sanitaria en Áreas Recreativas de Quintana Roo
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Evaluar de forma rápida y precisa
E. colienterococos
Presencia/ausencia por PCR:V. cholerae,
V. parahaemolyticusV. vulnificus
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Corredor Turístico Isla Blanca-Cancún-Tulúm
Monitoreos:2007-210
12 Cenotes 4 Lagunas8 Playas
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Indicadores de contaminación fecalen ambientes costeros de Q. Roo
Concentración bacteriana
Coliformes totales
E. coliEnterococos Vibrio
patogénico
Laguna NMP /100 ml
Nichupté 4, 083.0 20.2 186.9 +
Bojorquez (estación 1) 2, 167.0 10.0 225.5 +
Bojorquez (estación 2) 4, 674.3 62.6 823.0 +
Manatí 6, 910.3 157.9 179.1 ++
Chackmuchuck 1, 063.4 72.4 30.6 +
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Especie C1 C2 C3 C4 C5 C6 %
V. p. total + + + + + + 100
V. p. patogénico -
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
50
83
V. c. total
V. c. toxigénico
- + - - + + 50
- - - - - - 0
V. v. total - + - - + + 50
V. v. patogénico - + - - + - 33
Profundidad (m) 20 4,5 2,0 0,5 1,5 2,0
Ocurrencia de Vibrio spp. en agua subterránea y cenotes del noreste de Quintana Roo, México.
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Densidad promedio de indicadores microbiológicos en playas
turísticas del noreste de Quintana Roo, México.
Certificación de playas: NMX-AA-120-SCFI-2006 (100 enterococos/100 mL)
SSA-COFEPRIS (200 enterococos/100 mL)
Concentración bacteriana
Coliformes totales
E. coli Enterococos Vibrio patogénico
Playa NMP /100 ml
Los Niños 435.2 2.0 13.5 -
Tortugas 193.5 13.1 2.0 -
Las Perlas 45.0 10.6 <1 -
Isla Contoy 2.0 <1 3.0 -
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1000
600
500
300
200
100
PM Vp Vp Vp Vv Vv Vc Vc
450 269 500 205 504 588 564
pb
Total
Patogénico
Vp: V. parahaemolyticus
Vv: V. vulnificus
Vc: V. cholerae
C2
V. cholera
toxigénico
ausente
Rebolledo-Vieyra M. y Hernández-Zárate, G. Unidad de Ciencias del Agua: El Agua y la
Investigación Científica. En: Luis del Castillo et al. CICY: treinta años de labor científica y
educativa. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. Mérida, Yuc. México. 2010. 383-
388 pp. ISBN 978-607-7823-04-9 (Incluye Fe de erratas).http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/fe%20de%20erratas.pdf
http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/cicy_30_anos_de_labor_cientifica_y_educativa.pdf
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G R A C I A S …