MICROBIOLOGÍA DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS.LOS ALIMENTOS.
MÉTODOS DE ANÁLISIS MÉTODOS DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE E INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOSRESULTADOS
LA CONTAMI NACIÓN DE LA CONTAMI NACIÓN DE LO S A LIMENTO SLO S A LIMENTO S
¿Qué es un alimento contaminado?¿Qué es un alimento contaminado?
Es todos aquel producto que contiene Es todos aquel producto que contiene sustancias o elementos ajenos a su sustancias o elementos ajenos a su
composición natural, en concentración composición natural, en concentración o cantidad tal que pueden causar dañoo cantidad tal que pueden causar daño
a la salud del consumidor.a la salud del consumidor.
¿Cuántos t ipos de¿Cuántos t ipos de contaminación contaminación exis te?exis te?
Se reconocen tres tipos de contaminación: Se reconocen tres tipos de contaminación:
a)a) Contaminación biológicaContaminación biológica, cuando es , cuando es causada por bacteria y/o sus toxinas, causada por bacteria y/o sus toxinas, parásitos en su forma adulta o forma larvaria; parásitos en su forma adulta o forma larvaria; virus, hongos y sus toxinas naturales (hongos virus, hongos y sus toxinas naturales (hongos venenosos) y biotoxinas marinas.venenosos) y biotoxinas marinas.
b)b) Contaminación químicaContaminación química,, cuando es cuando es causada por sustancias químicas que llegan causada por sustancias químicas que llegan a los alimentos de forma accidental o por a los alimentos de forma accidental o por malas prácticas de los productores, malas prácticas de los productores, comercializadores o manipuladores en comercializadores o manipuladores en generalgeneral..
Ejemplos, de contaminación química:
• Contaminación por metales pesados: plomo, cadmio, mercurio, cobre, etc; al usar recipientes que contienen estos metales.
• Contaminación por plaguicidas aplicados en los productos agrícolas, cuando se aplican en exceso o a destiempo (no se respeta el número de días previos a la cosecha) venenos, insecticidas, sustancias químicas que se transportan o almacenan junto con alimentos.
• También se considera como contaminación química la aplicación de aditivos alimentarios no autorizados o el uso en exceso de los autorizados.
c)c) Contaminación físicaContaminación física, cuando es , cuando es ocasionada por cuerpos extraños al ocasionada por cuerpos extraños al producto, por lo general visibles; producto, por lo general visibles; ejemplos: astillas de madera, ejemplos: astillas de madera, excremento de roedores, larvas de excremento de roedores, larvas de insectos, trozos de metal o vidrio, insectos, trozos de metal o vidrio, tierra, arena, piedras pequeñas, etc.tierra, arena, piedras pequeñas, etc.
INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE AL INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE AL ESTUDIAR LA MICROFLORA ESTUDIAR LA MICROFLORA
ALIMENTARIA:ALIMENTARIA:
- Permite conocer las fuentes de contaminación del Permite conocer las fuentes de contaminación del
alimento que se analiza.alimento que se analiza.- Valorar las normas de higiene utilizadas en la Valorar las normas de higiene utilizadas en la
elaboración y manipulación de los alimentos.elaboración y manipulación de los alimentos.- Detectar la posible presencia de flora patógenaDetectar la posible presencia de flora patógena
que suponga un riesgo para la salud delque suponga un riesgo para la salud del
consumidor, siendo este uno de los objetivos másconsumidor, siendo este uno de los objetivos más
importantes en Microbiología Alimentaria.importantes en Microbiología Alimentaria.
- Establecer en qué momento se Establecer en qué momento se producen producen fenómenos de alteración en los fenómenos de alteración en los distintosdistintos alimentos, con el fín de delimitar su alimentos, con el fín de delimitar su períodoperíodo de conservación de conservación
EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LOS PRODUCTOS ALIMENTARIOS DE LOS PRODUCTOS ALIMENTARIOS SE CONSIDERAN, PRINCIPALMENTE:SE CONSIDERAN, PRINCIPALMENTE:
- Calidad higiénico-sanitaria.- Calidad higiénico-sanitaria.- Calidad comercial.- Calidad comercial.
EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS ESTA BASADO, ALIMENTOS ESTA BASADO, ESENCIALMENTE:ESENCIALMENTE:
- Muestreo- Muestreo- Criterio microbiológico- Criterio microbiológico- Elección de técnica analítica- Elección de técnica analítica- Interpretación de los resultados - Interpretación de los resultados analíticos analíticos
PUNTOS DE MUESTREO DE PUNTOS DE MUESTREO DE ALIMENTOSALIMENTOS
* MERCADOS
* KIOSCOS ESCOLARES
• COMEDORES POPULARES
• RESTAURANTES
• SERVICIOS DE ALIMENTACIÓN EN
TRANSPORTE TERRESTRE
* ETC.
MATERIAL PARA LA TOMA DE MATERIAL PARA LA TOMA DE MUESTRA:MUESTRA:
CoolerCooler Plumón indeleblePlumón indeleble Gel refrigeranteGel refrigerante Bolsas de Bolsas de
polietileno de primer polietileno de primer usouso
Frascos de vidrio Frascos de vidrio con tapa rosca con tapa rosca estéril.estéril.
Pinzas estérilPinzas estéril
Ficha de muestreoFicha de muestreo Guantes Guantes
descartable.descartable. Protector de cabelloProtector de cabello GuardapolvoGuardapolvo AlcoholAlcohol AlgodónAlgodón Cucharas estérilesCucharas estériles Termómetro Termómetro
ambientalambiental
¿QUE ALIMENTOS SE MUESTREA?¿QUE ALIMENTOS SE MUESTREA?
• ALIMENTOS DE ALTO RIESGO
(PREPARADOS)
(200 gramos aprox.)
* ALIMENTOS ENVASADOS
¿CUÁLES SON LOS ALIMENTOS DE ¿CUÁLES SON LOS ALIMENTOS DE ALTO RIESGO?ALTO RIESGO?
* JUGOS * ENSALADA DE VERDURAS
* REFRESCOS * ENSALADA DE FRUTAS
* CEVICHE * AJI AMARILLO MOLIDO
* MAYONESA * SANDWICHS
* AJOS MOLIDOS * EMPANADAS
* CAUSA RELLENA * ETC.
* CREMA DE PAPA A LA HUANCAINA
* ROCOTO MOLIDO C/S CEBOLLA CHINA
CRITERIO MICROBIOLÓGICOCRITERIO MICROBIOLÓGICO Es la aceptabilidad de un alimento basado enEs la aceptabilidad de un alimento basado en
la presencia o ausencia de un determinado la presencia o ausencia de un determinado
número de microorganismos, parásitos por número de microorganismos, parásitos por
unidad de masa, volumen, área o lote. unidad de masa, volumen, área o lote.
Utilizado para la inocuidad alimentária.Utilizado para la inocuidad alimentária.
NORMA MICROBIOLÓGICANORMA MICROBIOLÓGICA
-“Criterios Microbiológicos de Calidad Higiénico
Sanitaria e Inocuidad para los Alimentos y
Bebidas de Consumo Humano”
Resolución Ministerial Nº 615- 2003-SA/DM
-“Norma Sanitaria para el Funcionamiento de
Restaurantes y Servicios Afines”
Resolución Ministerial
Nº 363-2005/MINSA
““Norma Sanitaria para la Fabricación de Norma Sanitaria para la Fabricación de Alimentos a Base de Granos y Otros, destinados Alimentos a Base de Granos y Otros, destinados a Programas Sociales de Alimentación”. a Programas Sociales de Alimentación”. Resolución Ministerial Nº 451-2006-MINSA.Resolución Ministerial Nº 451-2006-MINSA.
GRUPOS DE GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDASALIMENTOS Y BEBIDAS SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIASUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA
1. Leche y Productos Lácteos.2. Helados y Mezclas para Helados.3. Productos Grasos.4. Productos deshidratados.5. Cereales, leguminosas y derivados6. Azúcares y mieles7. Productos de confitería.8. Productos de panadería, pastelería y galletería9. Alimentos formulados (regímenes especiales)
GRUPOS DE GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDASALIMENTOS Y BEBIDAS SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIASUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA
1. Carnes y productos cárnicos
2. Productos Hidrobiológicos
3. Huevo y oviproductos.
4. Especias,condimentos y salsas.
5. Frutas y Verduras.
6. Comidas y Platos Preparados.
7. Bebidas.
8. Estimulantes y Fruitivos.
9. Conservas
10.Semiconservas
CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA ALIMENTOS DE ALTO PARA ALIMENTOS DE ALTO
RIESGORIESGO
Comidas preparadas sin tratamiento térmico (ensaladas crudas, mayonesas, salsa de papa huancaína, ocopa, postres, jugos, otros).Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin tratamiento térmico (Ej. Ensaladas mixtas, palta rellena, sandwichs, ceviche, postres, refrescos, otros).
0Salmonella sp. en 25 g/ mL
10Escherichia coli
10Staphylococcus aureus
102Coliformes
105Aerobios mesófilos
mAgente microbiano
Límite por g/mL
Comidas preparadas con tratamiento térmico (ensaladas cocidas, guisos, arroces, asados, postres cocidos, arroz con leche, mazamorra, otros)
0Salmonella sp. en 25 g/ mL
<3Escherichia coli
10Staphylococcus aureus
10Coliformes
104Aerobios mesófilos
mAgente microbiano
Límite por g/mL
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISISPARA SU ANÁLISIS::
Toma de muestras, aprox. 200 g o Toma de muestras, aprox. 200 g o mLmL
Cuando se trata de alimentos Cuando se trata de alimentos sólidos, es necesario someterlos sólidos, es necesario someterlos previamente a una suspensión, previamente a una suspensión, utilizando un diluyente estéril.utilizando un diluyente estéril.
Diluyente:Diluyente: Agua peptonada salina Agua peptonada salina
Trituración de la muestra y obtener Trituración de la muestra y obtener una mezcla homogénea para lograr una mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los la distribución equilibrada de los gérmenes y sus toxinas.gérmenes y sus toxinas.
Ejm: Homogenizador -- StomacherEjm: Homogenizador -- Stomacher
(a base de paletas)(a base de paletas)
TÉCNICATÉCNICA PARA LA PREPARACIÓN DE PARA LA PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES:LAS DILUCIONES:
90 mLAPS
9 mL APS
10-1
10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL10 g de muestra
....
MÉTODO: CUALITATIVOMÉTODO: CUALITATIVO
PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g ó PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g ó mL de muestra.mL de muestra.
MÉTODO: CUANTITATIVOMÉTODO: CUANTITATIVO• Tubos múltiples: NMP/g ó mL de Tubos múltiples: NMP/g ó mL de
muestramuestra• Recuento en placa: Recuento en placa: ufc/g ó mLufc/g ó mL
a. Por incorporacióna. Por incorporación
b. Por superficieb. Por superficie
MÉTODO CUALITATIVOMÉTODO CUALITATIVO
ENSAYOS:ENSAYOS:
4.4. Salmonella sp.Salmonella sp.
5.5. Vibrio choleraeVibrio cholerae
6.6. Listeria monocytogenesListeria monocytogenes
MÉTODO CUANTITATIVOMÉTODO CUANTITATIVO
1. Tubos múltiples1. Tubos múltiples Coliformes totalesColiformes totales Coliformes fecalesColiformes fecales Escherichia coliEscherichia coli
2. Recuento en placa2. Recuento en placa
a. Mesófilos aerobiosa. Mesófilos aerobios
a. Mohosa. Mohos
a. Levadurasa. Levaduras
a. Enterobacteriasa. Enterobacterias
a.a. Clostrid. perfringens Clostrid. perfringens
b.b. Staphylococccus Staphylococccus aureusaureus
b.b. Bacillus cereus Bacillus cereus
AISLAMIENTO E AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE IDENTIFICACIÓN DE
Salmonella sp.Salmonella sp.- Preenriquecimiento en medio líquido no Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo.selectivo.- Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.- Aislamiento diferencial sobre medios sólidos Aislamiento diferencial sobre medios sólidos
selectivos.selectivos.- Confirmación bioquímica de las colonias Confirmación bioquímica de las colonias
sospechosas.sospechosas.- Confirmación serológica de las colonias Confirmación serológica de las colonias sospechosas.sospechosas.
DETECCIÓN DETECCIÓN DEDE Salmonella sp.Salmonella sp.
25g o mL de muestra
225 mLmedio de pre-
enriquecimiento (A.P.T.)
Caldo Rappaport-Vassiliadis
(10 mL)
Caldo Selenito/Cistina
Incubar a 35°C por 20 horas
Incubar a 42°C por 24 h junto con los controles (+) y (-)
Incubar a 35°C por 20 h junto con los controles (+) y (-)
Estriado en medios selectivos
10 mL0.1 mL 1 mL
(100 mL) (10 mL)
ó
Agar Verde Brillante/
Rojo Fenol
Agar XLD óAgar SS
Incubar a 35°C por 24 hSi no aparecen colonias típicas, reincubar 18-24 h más a
35°C
Seleccionar colonias típicas o sospechosas
Estriar en Agar Nutritivo e Incubar a
35°C por 18-24 h
CONFIRMACIÓNBIOQUÍMICA
Agar TSI
Agar Úrea
Rx. Voges Proskauer
Rx.Indol
Agar
LIA
(+): Forma ácido, c/s
gas y H2S (+)K/A
(+): Color púrpura
K/K
(-): No vira a amarillo
(-): No vira a rosado o
rojo brillante
(-): No forma
anillo rojo
CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA
Rx (+): Aglutinación
Salmonella sp.
Detección deβ-Descarboxilasa
(-): Mantiene color del
medio
• ISO 6579, 1993
Salmonella enteritidis
Salmonella O antiserum poly A-I & Vi
Incubar a 35°C por 24 h
SalmonellaSalmonella sp.sp. en el medio de cultivo Agar en el medio de cultivo Agar
XLDXLD
Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar XLD y en Agar XLD y Agar Bismuto SulfitoAgar Bismuto Sulfito
Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar Verde en Agar Verde BrillanteBrillante
Salmonella sp. Salmonella sp. en Agar Salmonella y Shigellaen Agar Salmonella y Shigella
NUMERACIÓN DE NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus
90 mLAPS 9 mL
APS 10-1
Inocular 1 mL de cada dilución por duplicado en placas Petri (14 mm) con Agar Baird Parker y esparcir con la espátula drigalsky.
10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL10 g de muestra
Incubar a 35ºC por 18-24 h
Si no hay crecimiento, reincubar a 35ºC por 24 h.
Seleccionar para la numeración, placas con un máximo de 200 colonias (típicas y/o atípicas))
....
1 mL 1 mL
+ 0,3 mL de inóculo del Caldo BHI
0,3 mL plasma de conejo con
EDTA
PRUEBA DE COAGULASA
Staphylococcus aureus
Incubar a 35°C
Examinar luego de 4-6 h y hasta un máx. de 24 h y verificar la formación de coágulo
No hay formación de coágulo
Formación de coágulo
Prueba de coagulasa (+)
Prueba de coagulasa (-)
Aislar 5 colonias típicas y atípicas y colocar cada una de ellas en caldo BHI
Incubar a 35°C por 24 h
ISO 6888-1, 1999
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus en Agar Baird Parker en Agar Baird Parker
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus Prueba de coagulasa Prueba de coagulasa
NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS VIABLESVIABLES
90 mLAPS 9 mL
APS 10-1
Inocular 1 mL de cada dilución en placas Petri por duplicado
10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL10 g de muestra
Incorporar el medio Agar Plate Count*, homogenizar y que se solidifique.
Incubar a 35ºC por 48 h
Seleccionar para la numeración placas con un máximo de 250 colonias
ICMSF Vol. 1, 2da. Ed. 2000
....
•Agregar a 100 mL de medio PCA, 2 mL de TTC al 0.5% .
(TTC= 2.3.5 triphenil tetrazolium chloride)
1 mL 1 mL
MESÓFILOS AEROBIOS MESÓFILOS AEROBIOS EN AGAR PLATE COUNTEN AGAR PLATE COUNT
MESÓFILOS AEROBIOS MESÓFILOS AEROBIOS EN AGAR PLATE COUNTEN AGAR PLATE COUNT
COLIFORMES TOTALESCOLIFORMES TOTALES
90 mLAPS 9 mL
APS
10-1
10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL10 g de muestra
Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas
Caldo lauryl sulfato
10 mL por tubo
Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:
Prueba Presuntiva
....
1 mL 1 mL
2 X X
Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas
Caldo verde brillante bilis lactosa
10 mL por tubo
Leer los tubos
COLIFORMES TOTALES
Positivos: gas y turbidez
Negativos a gas y turbidez
ISO 4831:2006
Prueba confirmativa
Escherichia coliEscherichia coli
90 mLAPS 9 mL
APS
10-1
10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL10 g de muestra
Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas
Caldo lauryl sulfato
10 mL por tubo
Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:
Prueba Presuntiva
....
1 mL 1 mL
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
Incubar a 44.5ºC por 24 - 48 horas
Caldo EC
10 mL por tubo
Leer los tubos
Sembrar en Agar EMB (Eosina azul de metileno)
Positivos: gas y turbidez
Colonias individuales, Bioquímica
Negativos a gas y turbidez
ICSMF - 2000
Prueba Confirmativa
Escherichia coli
INTERPRETACIÓN DE INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSRESULTADOS
Salmonella sp.Salmonella sp.
REPORTE:REPORTE:
AUSENCIA o PRESENCIA DE AUSENCIA o PRESENCIA DE
Salmonella sp.Salmonella sp. en 25 g de en 25 g de muestra.muestra.
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus
CÁLCULO:CÁLCULO:
21,32 (+)332A
56,0
34,72 (+)352T2
53,7
Promedio
1
Placa
9,31(+)328A
51,3
423 (+)
342T
Prueba de Coagulasa
-2-1
ufcPRE
CÁLCULO
Bioquímica
Selección de colonias
Nº de colonias/
dilución
Tipo de colonia
Nº de colonias x inversa del volumen usado x factor de la dilución= 53,7 x 10 x 10 = 5370
REPORTE:
54 x 102 u.f.c. de Stap. aureus / g de muestra
MESÓFILOS AEROBIOSMESÓFILOS AEROBIOS
190 x 10
RESULTADO
(obtener la media aritmética
x factor de la dilución)
1922
1
Placa
19x 102 ufc de mesófilos aerobios / g de muestra
188
-3-2-1REPORTE
Nº de colonias / dilución
COLIFORMESCOLIFORMES TOTALES TOTALES
150
TABLA
(NMP)
3-2-1123P.C.
15 x 10 NMP de
coliformes totales/ g de
muestra
233P.P.
REPORTESERIE
-3-2-1
Nº de tubos
positivos/
dilución
Tipo de Prueba
Escherichia coliEscherichia coli
202-1-1112Bioquí-mica
122P.C.
20 NMP de Escherichia coli / g de muestra
233P.P.
REPORTETABLA
(NMP)
SERIE
-3-2-1
Nº de tubos positivos/
diluciónTipo de prueba
CUADRO RESUMEN DE RESULTADOSCUADRO RESUMEN DE RESULTADOS
0
10
10
102
105
m
Límite por g/mL
AusenciaSalmonella sp. en 25 g
20Escherichia coli
54 x 102Staphylococcus aureus
15 x 10Coliformes
19 x 102Aerobios mesófilos
Agente microbiano Resultado
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
La muestra Nº 224, sobrepasa los La muestra Nº 224, sobrepasa los limites permisibles de limites permisibles de Staphylococcus Staphylococcus aureus, aureus, Coliformes y de Coliformes y de Escherichia Escherichia colicoli, según la Norma Sanitaria para el , según la Norma Sanitaria para el funcionamiento de restaurantes y funcionamiento de restaurantes y servicios afines. Comidas preparadas servicios afines. Comidas preparadas sin tratamiento térmico.sin tratamiento térmico.
R. M. Nº 363-005/MINSA.R. M. Nº 363-005/MINSA.
MUESTRAS DE ALIMENTOS
LAVADO DE MATERIALES
PREPARACIÓN DE MATERIALES
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
ANÁLISIS DE BEBIDAS GASIFICADAS
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO(DILUCIÓN DE LA MUESTRA)
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO(DILUCIÓN DE LA MUESTRA)
COLOCANDO LA MUESTRA DILUIDAEN LA PLACA PETRI
MÉTODO RAPIDO-PLACA PETRIFILMANÁLISIS DE COLIFORMES- E. COLI
INCUBACIÓN
COLIFORMES TOTALES y COLIFORMES TOTALES y Escherichia coliEscherichia coli
ANÁLISIS DE SALMONELLA
Bacillus cereus Bacillus cereus en Agar MYPen Agar MYP
Mohos y Levaduras en Agar Mohos y Levaduras en Agar OGYOGY