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TEMA 8: PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE METABOLITOSSECUNDARIOSDr. Pedro F. Mateos

I. METABOLITOS SECUNDARIOSDE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos secundarios sonmolécu las s in te t i zadas pordeterminados microorganismos,normalmente en una fase tardía de suciclo de crecimiento, cuyascaracterísticas son:

(i) No son necesarios para elcrecimiento del microorganismo quelos produce. En estado natural, susfunciones se hallan ordenadas a lasupervivencia de la especie, perocuando los microorganismos que losproducen se desarrollan en cultivo purolos metabolitos secundarios nodesempeñan esa misión.

(ii) Generalmente se producen comomezclas de productos muyrelacionados químicamente entre sí.Por ejemplo, una única cepa de unaespecie del género Streptomycesproduce 32 antraciclinas diferentes.

Diferentes tipos de tetraciclinas

(iii) Cada uno de estos productos esproducido por un grupo muy reducidode organismos.

(iv) La producción puede perdersefácilmente por mutación espontánea(degeneración de la raza), por lo queson muy importantes las técnicas de

c o n s e r v a c i ó n d e e s t o smicroorganismos.

De todos los productos tradicionalesobtenidos por fermentación, los másimportantes para la salud humana sonlos metabolitos secundarios. Donde seincluyen, además de los antibióticos,ciertas toxinas (micotoxinas),alcaloides (ácido lisérgico), factores decrecimiento vegetal (giberelinas) ypigmentos.

Los metabolitos secundarios mejorconocidos son los antibióticos, de losque se han descubierto más de 5000,cifra que aumenta a razón de unamedia aproximada de 300 por año,aunque la mayoría carecen de utilidadpues son tóxicos para los organismosvivos. Aproximadamente el 75% de losantibióticos conocidos son producidospor actinomicetos. Algunas especiesson excepcionales productores deantibióticos, por ejemplo Streptomycesg r y s e u s produce al menos 40antibióticos diferentes.

II. RELACIONES ENTRETROFOFASE - IDIOFASE

En el metabolismo secundario las fasesde crecimiento se denominan trofofase,fase de crecimiento logarítmico dondenormalmente no se producen losmetabolitos secundarios, e idiofase,fase estacionaria donde normalmentese producen los metabolitossecundarios. Aunque es unasimplificación pensar sólo en dosfases, esta simplificación nos permitecomprender mejor la fermentacciónindustrial de los metabolitossecundarios. Es decir, si nosotros

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queremos producir un metabolitosecundario primero debemos asegurarlas condiciones apropiadas durante latrofofase para un buen crecimiento ydespués, debemos alterar esascondiciones en el momento adecuadopara asegurar una excelente produccióndel metabolito secundario.

Relación entre trofofase e idiofase

Este retraso en la formación demetabolitos secundarios es uno de losprincipales mecanismos mediante elcual los microorganismos productoresde antibióticos evitan el suicidio,puesto que al comienzo de la faselogarítmica de crecimiento sonsensibles a su propio antibiótico, paraposteriormente, durante la idiofase,volverse resistentes al antibiótico queestán produciendo.

Los factores que ponen en marcha laproducción de metabolitos secundariosal final de la trofofase no se conocen;únicamente se sabe que estemecanismo se dispara normalmentecuando algún nutriente del medio se haagotado. En algunas ocasiones elnutriente responsable es una fuente deCarbono, en otras, sin embargo es elNitrógeno o el Fósforo. La explicación

puede ser que al faltar nutrientes sealteren los metabolitos primarios y seoriginen inductores de los enzimasencargados de la síntesis de losmetabolitos secundarios. Otraexplicación puede ser que al faltar lafuente de Carbono cesa la represiónpor catabolito, sintetizándose a partirde este momento los enzimasnecesarios para la biosíntesis de estosmetabolitos secundarios.

Cualquiera que sea el mecanismogeneral por el que se dispara elmetabolismo secundario al final de latrofofase, es un hecho que en estepunto hay unos cambios muy fuertesen la composición enzimática de lascélulas, apareciendo los enzimas queestán específicamente relacionados conla formación de metabolitossecundarios. Sin embargo, eindependientemente de este aspectogeneral del metabolismo secundario, seha puesto de manifiesto la existenciade sistemas de regulación que jueganun papel importante en la síntesis dedeterminados productos industriales.

III. EFECTO DE LOSPRECURSORES

Las manipulaciones, tanto del mediode cultivo como de las condicionesambientales que se llevan a cabodurante el screening secundario de unaforma sistemática, incluyen la adiciónde centenares de aditivos en los mediosde cultivo que puedan actuar comoposibles precursores del producto queestamos investigando. Ocasionalmentese encuentra un precursor queincrementa de forma notable laproducción de este metabolitosecundario. El precursor puede inclusodirigir la síntesis de un determinadoproducto de entre varios que seproducían anteriormente; es lo que seconoce como biosíntesis dirigida.

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Como ejemplos de precursores están elácido fenilacético en el caso de laproducción de bencil penicilina;determinados aminoácidos específicosen la producción de actinomicinas ytirociclinas; ácidos benzoicossustituidos en la formación denovobiocinas.

Precursores de metabolitos secundarios

En muchas fermentaciones, sinembargo, los precursores no muestranninguna actividad. Esto es debido aque su síntesis por el microorganismono es el factor limitante de laproducción del metabolito secundario.En estos casos, la adición de aditivosha revelado efectos dramáticos, tantoestimuladores como inhibidores en laproducción del metabolito secundariopor parte de una molécula noprecursora. Este efecto se debenormalmente a la interacción de estoscompuestos con los mecanismosreguladores del microorganismo

productor. Precisamente, estudiandoestos efectos se puso de manifiesto quelos mecanismos reguladores de losmicroorganismos ejercen un efectonotable en la producción de losmetabolitos secundarios.

IV. INDUCCION ENZIMATICA

A lo largo de los estudios sobre elpapel que el triptófano juega comoestimulador de la biosíntesis dealcaloides por Claviceps (Cornezuelodel centeno) se puso de manifiesto quela inducción enzimática juega un papelimportante en la producción demetabolitos secundarios.

Si bien el triptófano es un precursor enla biosíntesis de estos alcaloides, no esun factor limitante; ya que su efectoestimulador se debe en gran parte a lainducción de la síntesis de los enzimasque dan lugar a la síntesis de losalcaloides. Existen tres razones quehan llevado a esta conclusión:

(i) Los análogos del triptófano, que nose incorporan a la molécula delalcaloide, es decir, que no sonprecursores, estimulan la producciónde los alcaloides.

(ii) El triptófano se debe añadir durantela trofofase ya que si se añade durantela idiofase tiene poco efecto.

(iii) El triptófano añadido es absorbidopor la célula durante la fase decrecimiento y alcanza su mayorconcentración intracelular justo antesde la síntesis de los alcaloides.

Otro efecto de inducción similar es elde la metionina en la biosíntesis decefalosporina por Cephalosporiuma c r e m o n i u m . A pesar de que lametionina provee azufre al antibiótico,la estimulación de la formación de

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cefalosporina C se debe a un efecto deinducción. Se llegó a esta conclusiónya que la metionina debe añadirsedurante la trofofase; además, lametionina puede ser reemplazada porsu análogo norleucina que no tieneazufre en su molécula, por lo que suefecto no puede ser debido al hecho deaportar azufre.

La inducción también juega un papelmuy importante en determinar larelación entre los componentes de lamezcla que se produce en unafermentación. Por ejemplo, en lafermentación para la producción dees t r ep tomic ina s e p roducees t rep tomic ina y manós idoestreptomicina. La conversión demanósido es t reptomicina enestreptomicina se cataliza mediante elenzima a -D-manosidasa que esinducido por manano.

Inductores de metabolitos secundarios

V. REGULACION PORRETROALIMENTACION

La regulación por retroalimentacióntambién parece jugar un papelfundamental en el metabolismosecundario. Por ejemplo, elcloranfenicol al igual que lacicloheximida, penicilina y otrosantibióticos limitan su propiap r o d u c c i ó n a c t u a n d o p o rretroalimentación generalmente sobreel primer enzima de la ramificaciónque conduce a la síntesis de estemetabolito.

Otro caso de regulación porretroalimentación sucede cuando laruta metabólica ramificada, mediantela cual se sintetiza el metabolitosecundario, conduce a su vez a lasíntesis de un metabolito primario,como es el caso de la lisina y lapenicil ina en P e n i c i l l i u mchrysogenum. En un primer momentose encontró que la L-lisina disminuía laproducción de penicilina, pero no sesabía porqué; hasta que se descubrióque el a -aminoadipato es unintermediario en la biosíntesis de losdos, lisina y penicilina. La disminuciónen la formación de penicilina por lisinaestá causada por la inhibición porretroalimentación de la homocitratosintasa, que es el primer enzima en labiosíntesis de lisina.

Otro camino mediante el cual actúa laregulación por retroalimentación en laformación de metabolitos secundariosimplica la inhibición y la represión delas fosfatasas por fosfato. Muchasfermentaciones se inhiben porortofosfato (H3PO4) a concentraciones(>10 mM) que no son inhibidoras parael crecimiento. En algunos casos seexplica ya que los intermediarios de laruta metabólica del producto que nosinteresa están fosforilados, aunque el

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producto final no lo esté. Lasfosfatasas actuarían en estosintermediarios.

Un ejemplo lo tenemos en labiosíntesis de estreptomicina dondeactúan varias fosfatasas en laformación de estreptidina y en elúltimo paso, desfosforilación de laestreptomicina fosfato, donde elenzima que cataliza esta reaccióntambién está inhibida por el fosfatoinorgánico.

Biosíntesis de estreptomicina

VI. REGULACION CATABOLICA

La represión catabólica fue observadaen la industria de antibióticos muchoantes de que se conociera y seentendiera el significado general deeste fenómeno. Durante el desarrollode la producción de penicilina seobservó que la glucosa, que era unamagnífica fuente de carbono para elcrecimiento del microorganismo, eraun sustrato muy malo para laproducción de penicilina; sin embargo,se observó que la lactosa, que soportaun crecimiento muy pobre, es un buensustrato para la producción depenicilina. Por lo tanto, el medioclásico de Jarvis y Johnson lleva unamezcla de glucosa y lactosa.

Producción de penicilina

Los mecanismos moleculares de laregulación catabólica se esclarecieronen la década de los 70. Hoy sabemosque la regulación catabólica estámediada por el nivel intracelular de unnucleótido especial, el monofosfatocíclico de adenosina (AMPc), cuyonivel intracelular es inverso a laconcentración de glucosa en el mediode cultivo. Mientras existe glucosa enel medio de cultivo el nivel intracelularde AMPc es sumamente reducido,debido a que la glucosa inhibe laactividad adenilciclasa, enzima queinterviene en la síntesis de AMPc.Cuando la glucosa del medio se agota,la concentración intracelular de AMPcaumenta rápidamente. El AMPcsintetizado forma un complejo con unaproteína existente en la célula,denominada "proteína receptora deAMPc". Este complejo de proteínareceptora y AMPc actúa sobre el genpromotor al objeto de inducir lasíntesis de los enzimas necesarios parala utilización de otras fuentes decarbono distintas a la glucosa. Laglucosa inhibe gran cantidad demetabolitos secundarios: ácidogiberélico, ácido lisérgico, penicilina,

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cefalosporina,cloranfenicol, bacitracinaactinomicina.

La represión catabólica también juegaun papel importante en ladeterminación de la concentraciónrelativa de cada uno de los antibióticosde una misma familia química que seproducen en una fermentación. Este esel caso de la producción deestreptomicina por Streptomycesgryseus. Como ya hemos dicho, elmanano es el inductor de lamanosidasa que convierte la manósidoestreptomicina en estreptomicina; sinembargo, este enzima no se sintetiza sihay glucosa (>0,5%) en el mediodebido a la represión catabólica. Sólocuando la glucosa ha desaparecido seproduce el enzima que es inducido pormanano. En este caso la represióncatabólica juega un papel fundamentalen el porcentaje de manósidoestreptomicina producido en estafermentación.

VII. REGULACION POR ELESTADO O CARGA ENERGETICA

La producción de clortetraciclina sereduce en gran cantidad cuando existefosfato inorgánico en el medio. En lasfermentaciones para la producción declortetraciclina, la idiofase comienzacuando se agota el fosfato en el medio.Puesto que en la biosíntesis declortetraciclina donde intervienen 72intermediarios, ninguno de ellosfosforilado, este efecto del fosfato nose debe a la regulación porretroalimentación de fosfatasas. Sinembargo, es posible que estaregulación esté mediada por la cargaenergética ya que el contenido en ATPde dos cepas de S t r e p t o m y c e saureofaciens, una poco productora(200 µg/mL) y la otra muy productora(2000 µg/mL) de clortetraciclina,

difieren en que la cepa menosproductora tiene de 2 a 4 veces másATP que la más productora. En ambascepas la concentración de ATPaumenta en la trofofase y disminuye enla idiofase, durante la producción declortetraciclina.

VIII. INCREMENTO DE LAPRODUCCION DE METABOLITOSSECUNDARIOS

La mayoría de los controles descritosen este capítulo se eliminan mediantemanipulación ambiental o mediante laobtención de mutantes mal regulados.

1.- Manipulación ambiental

Catabolito: eliminación de la glucosadel medio.

Inducción : adición de manano almedio.

Carga energética: disminución defosfato en el medio.

Precursores: adición de precursores almedio.

2.- Selección de mutantes malregulados

A. Revertientes

La estrategia consiste primeramente enseleccionar las mejores cepasproductoras del antibiótico. Estas cepasse someten a mutación con un agentemutágeno (UV, luz ultravioleta o NTG,nitrosoguanidina). De los mutantesobtenidos se seleccionan aquellos queno sean productores del antibiótico (seseleccionan aquellas cepas que poseenuna proteína inactiva). Estos mutantesse vuelven a someter a mutación y seseleccionan aquellas cepas que sean denuevo productoras del antibiótico (se

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obtienen mutantes dobles desreguladosen un gen en el que actúa esa proteínainactiva).

Revertientes superproductores

B. Resistencia a análogos

La estrategia es la misma que ladescrita con los metabolitos primarios.Aunque en este caso el metabolitosecundario debe compartir la rutabiosintética con un metabolitoprimario.

Mutantes superproductores resitentes aanálogos

C. Mutasíntesis

Se realiza mediante la mutación en elgen que codifica para un precursor delantibiótico natural, con lo que seconsigue la síntesis de una molécula deantibiótico incompleta. Cuando seañade al medio el precursor que nopuede sintetizar el microorganismo,éste reanuda la producción delantibiótico natural. De esta manera sepueden obtener nuevos antibióticossimplemente añadiendo precursorescon estructuras ligeramente diferentes.

Mutasíntesis

+ UV - NTG ++C1---------->C1.1----------->C1.2

_____ P1 /

P1’ /A------>B----- \ \_____ P2


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