UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
MAESTRIA EN GESTIOacuteN SUSTENTABLE DE RECURSOS
NATURALES
ldquoDesarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten y produccioacuten del hongo
medicinal oreja de palo (Pycnoporus spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica
ecuatorianardquo
Trabajo de Investigacioacuten previo a la obtencioacuten del Tiacutetulo de Magiacutester en Gestioacuten Sustentable
de Recursos Naturales
Director Pineda Insuasti Julio Amilcar PhD
Autor Goacutemez Andrade William Edisson
Ibarra - Ecuador
2017
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DEDICATORIA
A mi esposa por ese optimismo que siempre me impulsoacute a seguir adelante y el
apoyo incondicional desde el inicio de mis estudios de la maestriacutea a mis hijos
Andreeacute y Juan Joseacute por todas las veces que no pudieron tener a su padre a tiempo
completo
A mis familiares y amigos que siempre tuvieron una palabra de apoyo para miacute
durante mis estudios
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AGRADECIMIENTO
A todas instituciones que aportaron para llevar a cabo esta investigacioacuten de manera
muy especial al Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) al
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) y a la Universidad Teacutecnica del Norte
(UTN)
Aquellas personas que compartieron sus conocimientos para hacer posible la
culminacioacuten de esta investigacioacuten De manera especial al Ing Julio Pineda Insuasti
PhD tutor de este trabajo por su ayuda y seguimiento al mismo
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UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
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DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
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RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
1
2
3
DEDICATORIA
A mi esposa por ese optimismo que siempre me impulsoacute a seguir adelante y el
apoyo incondicional desde el inicio de mis estudios de la maestriacutea a mis hijos
Andreeacute y Juan Joseacute por todas las veces que no pudieron tener a su padre a tiempo
completo
A mis familiares y amigos que siempre tuvieron una palabra de apoyo para miacute
durante mis estudios
4
AGRADECIMIENTO
A todas instituciones que aportaron para llevar a cabo esta investigacioacuten de manera
muy especial al Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) al
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) y a la Universidad Teacutecnica del Norte
(UTN)
Aquellas personas que compartieron sus conocimientos para hacer posible la
culminacioacuten de esta investigacioacuten De manera especial al Ing Julio Pineda Insuasti
PhD tutor de este trabajo por su ayuda y seguimiento al mismo
5
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
x
x
x
x
x
x
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
2
3
DEDICATORIA
A mi esposa por ese optimismo que siempre me impulsoacute a seguir adelante y el
apoyo incondicional desde el inicio de mis estudios de la maestriacutea a mis hijos
Andreeacute y Juan Joseacute por todas las veces que no pudieron tener a su padre a tiempo
completo
A mis familiares y amigos que siempre tuvieron una palabra de apoyo para miacute
durante mis estudios
4
AGRADECIMIENTO
A todas instituciones que aportaron para llevar a cabo esta investigacioacuten de manera
muy especial al Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) al
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) y a la Universidad Teacutecnica del Norte
(UTN)
Aquellas personas que compartieron sus conocimientos para hacer posible la
culminacioacuten de esta investigacioacuten De manera especial al Ing Julio Pineda Insuasti
PhD tutor de este trabajo por su ayuda y seguimiento al mismo
5
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
x
x
x
x
x
x
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
3
DEDICATORIA
A mi esposa por ese optimismo que siempre me impulsoacute a seguir adelante y el
apoyo incondicional desde el inicio de mis estudios de la maestriacutea a mis hijos
Andreeacute y Juan Joseacute por todas las veces que no pudieron tener a su padre a tiempo
completo
A mis familiares y amigos que siempre tuvieron una palabra de apoyo para miacute
durante mis estudios
4
AGRADECIMIENTO
A todas instituciones que aportaron para llevar a cabo esta investigacioacuten de manera
muy especial al Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) al
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) y a la Universidad Teacutecnica del Norte
(UTN)
Aquellas personas que compartieron sus conocimientos para hacer posible la
culminacioacuten de esta investigacioacuten De manera especial al Ing Julio Pineda Insuasti
PhD tutor de este trabajo por su ayuda y seguimiento al mismo
5
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
x
x
x
x
x
x
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
4
AGRADECIMIENTO
A todas instituciones que aportaron para llevar a cabo esta investigacioacuten de manera
muy especial al Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) al
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) y a la Universidad Teacutecnica del Norte
(UTN)
Aquellas personas que compartieron sus conocimientos para hacer posible la
culminacioacuten de esta investigacioacuten De manera especial al Ing Julio Pineda Insuasti
PhD tutor de este trabajo por su ayuda y seguimiento al mismo
5
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
x
x
x
x
x
x
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
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Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
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col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
5
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
INSTITUTO DE POSTGRADO
BIBLIOTECA UNIVERSITARIA
AUTORIZACIOacuteN DE USO Y PUBLICACIOacuteN A FAVOR DE LA
UNIVERSIDAD TEacuteCNICA DEL NORTE
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LA OBRA
La Universidad Teacutecnica del Norte dentro del proyecto Repositorio Digital
Institucional determinoacute la necesidad de disponer de textos completos en formato
digital con la finalidad de apoyar los procesos de investigacioacuten docencia y
extensioacuten de la Universidad
Por medio del presente documento dejo sentada mi voluntad de participar en este
proyecto para lo cual pongo a disposicioacuten la siguiente informacioacuten
DATOS DE CONTACTO
CEacuteDULA DE
IDENTIDAD
1001977030
APELLIDOS Y
NOMBRES
Goacutemez Andrade William Edisson
DIRECCIOacuteN Tena 8-20 y Tungurahua
EMAIL williamedissonyahooes
TELEacuteFONO FIJO 062607022 TELEacuteFONO
MOacuteVIL
0983000610
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
x
x
x
x
x
x
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
6
DATOS DE LA OBRA
TIacuteTULO Desarrollo de un proceso para el aislamiento conservacioacuten
y produccioacuten del hongo medicinal oreja de palo (Pycnoporus
spp) a partir de la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
AUTOR (ES) Goacutemez Andrade Willian Edisson
FECHA 09 de junio del 2017
SOLO PARA TRABAJOS DE GRADO
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE
OPTA
Magiacutester en Gestiograven Sutentable de los Recursos Naturales
ASESOR DIRECTOR Ing Julio Amilcar Pineda Insuasti (PhD)
2 AUTORIZACIOacuteN DE USO A FAVOR DE LA UNIVERSIDAD
Yo William Edisson Goacutemez Andrade con ceacutedula de ciudadaniacutea Nro 1001977030
en calidad de autor y titular de los derechos patrimoniales de la obra o trabajo de
grado descrito anteriormente hago entrega del ejemplar respectivo en formato
digital y autorizo a la Universidad Teacutecnica del Norte la publicacioacuten de la obra en
el Repositorio Digital Institucional y uso del archivo digital en la Biblioteca de la
Universidad con fines acadeacutemicos para ampliar la disponibilidad del material y
como apoyo a la educacioacuten investigacioacuten y extensioacuten en concordancia con la Ley
de Educacioacuten Superior Artiacuteculo 144
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7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
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Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
7
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
8
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
9
RESUMEN
En Ecuador no se conoce el protocolo de aislamiento conservacioacuten y produccioacuten a
escala laboratorio de la cepa nativa Pycnoporus sanguineus El cuerpo fructiacutefero
se recolecto en la ciudad del Tena misma que se encontraba en troncos en
descomposicioacuten de Pollalesta discolor La reproduccioacuten celular se realizoacute tanto
por medio de tejido como por esporas en un medio rico en PDA se encubaron a 22
ordmC durante seis diacuteas se procedioacute a la purificacioacuten de la cepa por la teacutecnica de
repique hasta lograr una cepa pura La identificacioacuten fue realizada por laboratorios
IDgen en la cual se determinoacute 99 de identidad en el fragmento ITS es Pycnoporus
sanguineus En el anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico se determinoacute que la especie tiene
un ELN de 4912 para el anaacutelisis de macro elementes se encontroacute en mayor
cantidad potasio 052 micro elementos como hierro 136 ppm Para la
conservacioacuten de la cepa se aplicoacute la teacutecnica de la liofilizacioacuten se preparoacute dos
medios de cultivo MEA y PDA se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego se
inocularon con la cepa nativa seleccionada se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC Los
tubos colonizados fueron liofilizados Para determinar la velocidad de crecimiento
de la cepa nativa se utilizoacute como medio de cultivo PDA y MEA en donde fue
colocada la cepa anteriormente liofilizada en el centro de la caja petri con la ayuda
de cinta meacutetrica se determinoacute la velocidad de crecimiento diariamente se incuboacute
durante siete diacuteas la mayor velocidad de crecimiento se observa en el medio de
cultivo MEA de 385 mmdiacutea Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que
005 existe una diferencia estadiacutesticamente significativa entre la media de
velocidad entre un nivel de medio y otro con un nivel del 950 de confianza
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
10
SUMMARY
In Ecuador is not known isolation Protocol-scale production and conservation
laboratory or the native strain of Pycnoporus sanguineus The fruiting body is
collected in the city of Tena same that was in trunks in decomposition of Pollalesta
discolor Cellular reproduction was carried out both by means of tissue and spores
in an environment rich in PDA incubate to 22 degC six days was purification or the
strain by the technique of tolling to achieve a pure strain The identification was
performed by laboratories IDgen 99 identity in the fragment was determined in
which ITS is Pycnoporus sanguineus The bromatological chemical analysis
determined that the species has an ELN of 4912 for the analysis of macro
elements found in most potassium 052 micro elements as iron 136 ppm For the
conservation of the strain was applied the technique of lyophilization it was
prepared two culture media MEA PDA was sterilized and served in 5ml tubes and
they were then inoculated with the native strain selected they were incubated for 7
days at 22 degrees Colonized tubes were lyophilized To determine the rate of
growth of the native strain was used as a PDA culture medium and MEA where was
placed the above freeze-dried strain in the center of the box petri with the help of
tape measure determined the speed of growth daily incubated for seven days the
higher speed of growth is observed in the culture medium MEA 385 mmday Since
the disagreement of the test F is less than 005 there is a statistically significant
difference between the average speed between a middle level and another the
950 confidence level
Palabras clave
Aislamiento biodiversidad caracterizacioacuten conservacioacuten fuacutengica liofilizacioacuten
Pycnoporus
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
11
ABREVIATURAS
BRGM Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos
EE Extracto Eteacutereo o grasa bruta
ELN Elementos Libres de Nitroacutegeno
FEL Fermentacioacuten Estado Liacutequido
FES Fermentacioacuten Estado Solido
IANCEM Ingenio Azucarero del Norte Compantildeiacutea de Economiacutea Mixta
LSD Diferencia Miacutenima Significativa
MAE Ministerio del Ambiente Ecuador
MAISFCI Modelo de Atencioacuten Integral de Salud Familiar Comunitario
e Intercultural
MEA Agar Malta Dextrosa
ODM Objetivos de Desarrollo del Milenio
PDA Agar Papa Dextrosa
SEMPLADES Secretaria Nacional de Planificacioacuten y Desarrollo
WFP Proyecto Mundial de Alimentacioacuten
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
12
IacuteNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN 9
SUMMARY 10
1 PROBLEMA 17
11 Introduccioacuten 17
12 Situacioacuten probleacutemica 18
13 Problema cientiacutefico 19
14 Objetivos de la investigacioacuten 19
15 Hipoacutetesis 20
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21
21 La salud un desafiacuteo global 21
211 Situacioacuten actual 21
212 Situacioacuten futura 21
213 Propuestas al desafiacuteo 21
22 Geacutenero Pycnoporus spp 22
221 Recoleccioacuten 22
222 Aislamiento 24
223 Identificacioacuten 26
224 Caracterizacioacuten 26
225 Conservacioacuten 27
23 Produccioacuten de Biomasa 30
231 Paraacutemetros de operacioacuten 30
232 Medios de cultivo 30
233 Incubacioacuten 31
24 Produccioacuten de metabolitos 32
241 Cinnabarina 32
242 Vainillina 33
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98
13
243 Enzimas ligninoliacuteticas 33
244 Inductores 34
25 Importancia industrial 36
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos 36
252 Control bioloacutegico 37
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico 37
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios 38
26 Marco legal 38
3 MARCO METODOLOacuteGICO 47
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa Pycnoporus
spp helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47
311 Materiales y meacutetodos 48
3111 Aislamiento 48
3112 Identificacioacuten 49
3113 Caracterizacioacuten 50
312 Resultados y discusioacuten 50
3121 Aislamiento 50
3122 Identificacioacuten 54
3123 Caracterizacioacuten 55
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus 56
321 Materiales y meacutetodos 56
322 Resultados y discusioacuten 57
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus 60
331 Materiales y meacutetodos 60
332 Resultados y discusioacuten 61
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos (BRGM) 65
14
341 Introduccioacuten 65
342 Ficha Pycnoporus sanguineus 67
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus 69
4 CONCLUSIONES 70
5 RECOMENDACIONES 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 71
7 ANEXOS 87
15
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten 23
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente 28
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de
Pycnoporus sanguineus 47
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus 48
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de
Pollalesta discolor 49
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno 51
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA 51
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo 52
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo 52
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus
sanguineus 53
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
56
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten 57
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten 58
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus 58
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada 59
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de
Pycnoporus sanguineus 60
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
62
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa 64
16
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp 24
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp 25
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL 35
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES 35
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada 61
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos
medios de cultivo 62
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio 63
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher 63
17
1 PROBLEMA
11 Introduccioacuten
Los hongos son imprescindibles para el funcionamiento de la vida Sin ellos la
acumulacioacuten de residuos orgaacutenicos formariacutea enormes cementerios de cadaacuteveres
vegetales y animales produciendo grandes trastornos en la naturaleza (Zeikus
1981) La cadena troacutefica se modificariacutea de tal manera que provocariacutea la
desaparicioacuten de muchas especies (de Diego Calonge 2009)
Pycnoporus spp ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina popular
de Aacutefrica y Ameacuterica para tratar numerosas enfermedades Los extractos de este
hongo son demostrados por poseer ingredientes bioactivos involucrados en
tratamiento antitumoral y actividades antioxidantes (Cao Zhang amp Xu 2014) Por
el potencial lignoceluliacutetico y los metabolitos secundarios de este hongo es
importante la buacutesqueda de sustancias antivirales antioxidantes antifuacutengicas y
antibacterianas (Smacircnia et al 2003) Se cuenta con el recurso natural pero no se
han realizado estudios de como producir y conservar la cepa nativa (Cruz Muntildeoz et
al 2015a)
Se pretende aportar con un banco de recursos geneacuteticos con la posibilidad de que
esta cepa sea utilizada en el sector farmaceacuteutico por su actividad bioloacutegica
antioxidante antifuacutengica y antibacterial (Smacircnia et al 1995) y en el sector textil
ya que produce un pigmento extraiacutedo llamado cinnabarin que se utiliza para la
decoloracioacuten parcial y completa de ciertos tintes (Schliephake Lonergan Jones amp
Mainwaring 1993) en el sector alimentario para la produccioacuten de vainilla (Zheng
et al 2007)
En teacuterminos econoacutemicos la implementacioacuten de este proyecto a escala industrial
generariacutea ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa
nativa ecuatoriana Pycnoporus spp Por ejemplo la vainilla natural producida por
el hongo tiene un costo en el mercado de 4000 USDKg ingresos que se quedariacutean
en manos de los productores nacionales Ademaacutes la creacioacuten de estas industrias
generariacutea fuentes de trabajo y ayudariacutea al aumento de la balanza comercial nacional
18
En teacuterminos ambientales el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de
compuestos recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su
sistema enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en
aserraderos (Kirk 1971) Adicionalmente el aislamiento y almacenamiento de la
cepa nativa de Pycnoporus spp en Bancos de Recursos Geneacuteticos con fines
industriales y acadeacutemicos promoveriacutea la preservacioacuten de la especie
En el aacutembito social se mejorariacutea el nivel educativo de la poblacioacuten en teacuterminos
de preservacioacuten y aprovechamiento de la biodiversidad fuacutengica de la cual no se
tiene maacutes conocimiento que los usos ancestrales (Hawksworth 1991) Ademaacutes
mejorariacutea la calidad de la salud de la poblacioacuten gracias a sus propiedades
medicinales ya comprobadas cientiacuteficamente por lo que su potencial en la
industria farmaceacuteutica es grande
La academia se veriacutea favorecida a su vez gracias a la recopilacioacuten de meacutetodos y
datos teacutecnicos necesarios para la conservacioacuten y almacenamiento de la cepa
facilitando el desarrollo de investigaciones de caraacutecter quiacutemico y biotecnoloacutegico
(Cruz 2004)
12 Situacioacuten probleacutemica
En el campo de la salud el no aprovechamiento de los metabolitos fuacutengicos
provocariacutea un caos en el tratamiento de ciertas enfermedades ya que muchos
medicamentos son producidos a partir de estos (Chang amp Miles 2004) Hay que
recordar el papel que desempentildea la penicilina descubierta por Fleming en 1928 a
partir del hongo Penicillium notatum para el tratamiento de las infecciones ( Valdeacutes
et al 1998) En la actualidad se conoce miles de sustancias medicinales producidos
por hongos y pronto saldraacuten maacutes incluso capaces de combatir el SIDA (Calonge
2009)
No obstante muchas especies de hongos estaacuten bajo amenaza de desaparecer
como consecuencia del deterioro o destruccioacuten de los ecosistemas (Hernaacutendez
Gonzaacutelez Hernaacutendez Herrera amp Camino 2014)
19
El Ecuador es un paiacutes pequentildeo pero uno de los maacutes biodiversos por su ubicacioacuten
espacial (Estrella Manosalvas Mariaca amp Ribadeneira 2005) El 18 de la
superficie nacional considerada como aacuterea protegida para la conservacioacuten de la
riqueza natural (MAE 2008) El aprovechamiento sostenible de la biodiversidad
nacional es promovido por el Plan Nacional para el Buen Vivir que enfatiza en el
bioconocimiento y su aplicacioacuten para la produccioacuten de nuevos bienes y servicios
ecoloacutegicamente sustentables suscitando al cambio de la matriz productiva
(Senplades 2009)
13 Problema cientiacutefico
Se evidencia limitado conocimiento en el manejo sustentable del geacutenero fuacutengico
Pycnoporus spp nativa ecuatoriana hacieacutendose necesario el establecimiento de
protocolos para aislamiento conservacioacuten purificacioacuten produccioacuten especiacutefica de
cepas nativas propagacioacuten o crecimiento celular en medios artificiales o naturales
y produccioacuten
Objeto
El proceso de produccioacuten y conservacioacuten de la especie nativa ecuatoriana de
Pycnoporus spp
Campo
Conservacioacuten de los recursos geneacuteticos microbianos
14 Objetivos de la investigacioacuten
Objetivo General
Desarrollar un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus mediante procesos que permitan la
conservacioacuten del recurso natural fuacutengico y su aprovechamiento de manera
sustentable
20
Objetivos especiacuteficos
Aislar identificar y caracterizar la especie fuacutengica de Pycnoporus
sanguineus
Desarrollar un protocolo para la conservacioacuten de la especie
Seleccionar el mejor medio de cultivo para la produccioacuten de Pycnoporus
spp a traveacutes de la velocidad de crecimiento lineal
Disentildear una ficha de cepas microbianas puras para su conservacioacuten en
el Banco de Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
15 Hipoacutetesis
Hipoacutetesis alternativa
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
Hipoacutetesis nula
Si se desarrolla un proceso a escala laboratorio para la produccioacuten de la especie
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus no se lograriacutea la conservacioacuten del
recurso y su aprovechamiento de manera sustentable
21
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21 La salud un desafiacuteo global
Es una realidad compleja a traveacutes de un enfoque interdisciplinario que supera
los liacutemites del paradigma positivista de la ciencia claacutesica (Alcaacutentara-Moreno
2008) depende de la interaccioacuten de muacuteltiples factores sociales poliacuteticos
econoacutemicos culturales y cientiacuteficos (Roberto Bricentildeo-Leoacuten 2000) y responde a
una condicioacuten histoacuterica ya que la visioacuten particular de la sociedad va cambiando con
el tiempo (Ritzer 2001)
211 Situacioacuten actual
Dentro de los objetivos del desarrollo sostenible (2015) el objetivoacute 3 comprende
garantizar una vida sana y promover el bienestar para todos en todas las edades La
participacioacuten mancomunada de los paiacuteses para cumplir los ODM ha desencadenado
en el movimiento contra la pobreza maacutes exitoso de la historia especialmente en
temas de salud y alimentacioacuten mundial
212 Situacioacuten futura
La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS 2013) ha pedido a los paiacuteses que
sigan invirtiendo en investigaciones de aacutembito nacional con el objetivo de poner
en marcha un sistema de cobertura sanitaria universal adaptado a las necesidades
particulares de cada paiacutes
213 Propuestas al desafiacuteo
Estudios de casos realizados en muchos paiacuteses demuestran la importancia que
tienen las investigaciones nacionales y mundiales en la mejora de la salud
investigaciones que abarcan desde la prevencioacuten y el control de enfermedades
especiacuteficas hasta la mejora del funcionamiento de los sistemas de salud
22
22 Geacutenero Pycnoporus spp
Entre muchos hongos de pudricioacuten blanca el geacutenero Pycnoporus spp es un
geacutenero representativo de la familia Polyporaceae que se encuentra ampliamente
distribuido a nivel mundial en zonas templadas y tropicales donde tiene gran
importancia en la regulacioacuten del ciclo de carbono (Zeikus 1981) Forma un grupo
cosmopolita de cuatro especies Pycnoporus puniceus Pycnoporus cinnabarinus
Pycnoporus sanguineus Pycnoporus coccineus (Lesage-Meessen et al 2011) A
principios de 1990 el geacutenero Pycnoporus se perfiloacute como una alternativa para la
consecucioacuten de compuestos enzimaacuteticos viables en la degradacioacuten eficiente de
biomasa y la obtencioacuten de metabolitos secundarios de intereacutes como antioxidantes
(Borderes Costa Guedes amp Tavares 2011a) antibacterianos (A Smacircnia et al
1995) y antiparasitarios (Correa et al 2005)
Pese a que los hongos del geacutenero Pycnoporus spp no son especies comestibles
su importancia radica en la capacidad de degradar eficientemente compuestos
lignoceluloacutesicos (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) lo que les confiere un
gran potencial para ser usados en procesos biotecnoloacutegicos de degradacioacuten de
residuos agriacutecolas hasta azuacutecares fermentables uacutetiles en la produccioacuten de etanol y
otros productos biotecnoloacutegicos de alto valor comercial (Call 1994 Zeikus 1981)
Diversas investigaciones han estudiado las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten
de compuestos sintetizados por este geacutenero y la influencia de diversos factores
logrando un mejor control del bioproceso y una mejor comprensioacuten del
metabolismo de Pycnoporus spp (Falconnier et al 1994 Lesage-Meessen et al
2011 Levasseur et al 2014 Liu et al 2015 Piscitelli et al 2011 Rivera-Hoyos et
al 2013)
221 Recoleccioacuten
Para la recoleccioacuten es necesario conocer de antemano las caracteriacutesticas
macroscoacutepicas del cuerpo fructiacutefero del hongo (Ortiz et al 2016) Pycnoporus spp
posee un basidioma en forma de abanico (flabeliforme) maacutes o menos aplanado de
color naranja intenso y un margen redondeado de color similar al resto del
23
carpoacuteforo su tamantildeo puede variar entre 3 a 10 cm de ancho y su carne variacutea de
corchoso a duro Se encuentra adherido al sustrato por la base y ocasionalmente
los bordes son cofluentes es decir que se peguen con los de los basidiomas
contiguos En la zona de unioacuten con el sustrato el basidioma es maacutes grueso
pudiendo alcanzar los 3 cm de grosor mientras en los bordes es maacutes delgado
alcanzando menos de 1 cm de grosor (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016
Papinutti 2013) Se puede observar a simple vista que el himenio de este geacutenero
posee poros por donde libera las esporas (Alexopoulos amp Beneke 1962) los cuales
pueden alcanzar entre 2-3 cm de diaacutemetro y una forma de redondeada u oblonga
(Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) En la figura 21 se pueden apreciar las
caracteriacutesticas generales del geacutenero
Figura 21 Carpoacuteforos de Pycnoporus spp sobre madera en descomposicioacuten
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Macroscoacutepicamente las especies son diferenciables entre siacute por ejemplo P
sanguineus tiene un color maacutes rojizo que su homologo P cinnabarinus ademaacutes
tiene una base estrecha que le da la apariencia de subestipitado mientras P
cinnabarinus es seacutesil Este uacuteltimo tiene a su vez una superficie pileacuteica libre o escasa
de vellosidades a diferencia de P fulgens con el cual suele asemejarse por la
24
coloracioacuten del carpoacuteforo (Asociacioacuten Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016 Papinutti
2013)
Pycnoporus spp suele encontrarse en sustratos lignoceluloacutesicos en
descomposicioacuten sobre los cuales crece naturalmente (Borderes Costa Guedes amp
Tavares 2011b) Una vez reconocido el hongo y recolectado su cuerpo fructiacutefero
se deben tomar apuntes acerca de los diferentes substratos en donde fue encontrado
(tierra madera en descomposicioacuten mantillo del bosquehellip) (Chanona-Goacutemez
Andrade-Gallegos Castellanos-Albores amp Saacutenchez 2007) las coordenadas y la
temperatura ambiental En la tabla 21 se listan algunos materiales lignoceluloacutesicos
de donde se han recolectado las cepas de Pycnoporus spp
Tabla 21 Sustratos vegetales donde crece Pycnoporus spp
Especie Material vegetal en descomposicioacuten Referencia
P sanguineus Madera de casuarina y mango (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Madera contaminada con petroacuteleo (Acosta-Urdapilleta Alonso-
Paz Rodriacuteguez Adame y col
2010 Quiroz-Castantildeeda y col
2009)
Troncos de palma (Achenbach y Blumm 1991)
Encino (Chanona-Goacutemez y col 2007)
Madera de Parkia oppositifolia (Esposito Innocentini-Mei
Ferraz Canhos y Duraacuten 1993)
P cinnabarinus Madera de pino (Eggert Temp y Eriksson 1996)
Troncos quemados (Guzmaacuten 1979)
P coccineus Eucalipto (Machuca y Ferraz 2001)
222 Aislamiento
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura (Cruz
Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
25
2000b Schliephake et al 1993) Es necesario haber adicionado cloranfenicol
(200 g l) a los medios de cultivo para evitar contaminaciones bacterianas
(Henrique Rosa y col 2003) Seguacuten Correa y colaboradores (2005) el MEA es el
medio oacuteptimo para el crecimiento micelial posterior a la purificacioacuten mientras que
Acosta-Urdapilleta y colaboradores (2010) afirman que es el Agar Harina Integral
de Trigo (HTIA por sus siglas en ingleacutes) Por su parte Cruz-Muntildeoz y
colaboradores (2015) aseveran que los medios de cultivo oacuteptimos son los que
contienen extracto del material vegetal de donde se recolectoacute el hongo En la tabla
22 se mencionan los principales medios de cultivo empleados para el aislamiento
de Pycnoporus spp
Tabla 22 Medios de cultivo reportados para el aislamiento de Pycnoporus spp
Especie Medio de cultivo Referencia
P sanguineus Agar Papa Dextrosa (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a E de F A
Smacircnia Smacircnia Juacutenior y Loguercio-
Leite 1998 Vikineswary y col 2006)
Agar Harina Integral de Trigo (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Cruz
Muntildeoz y col 2015a)
Agar Extracto de Malta (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010 Atteke
y col 2013 Cruz Muntildeoz y col 2015a
Machuca y Ferraz 2001 Schliephake y
col 1993 Uzan y col 2010)
Medios afines al material vegetal de
donde se recolectoacute (Agar Extracto de
Casuarina Agar Extracto de Mango)
(Cruz Muntildeoz y col 2015)
Medio Czapek-Dox con sulfato de
manganeso algunas veces adicionado
con extracto de semillas de guisantes
o salvado de trigo
(Boumlse 1946)
P
cinnabarinus
Agar Extracto de malta (American Type Culture Collection
2016a)
26
Especie Medio de cultivo Referencia
Agar Extracto de levadura (American Type Culture Collection
2016b)
Agar Papa Dextrosa (FuQuan y QiJin 2008)
223 Identificacioacuten
Microscoacutepicamente se pueden identificar cuatro tipo de hifas 1) las de los tubos
o poros que son de pared delgada ramificadas y se tintildeen con fioxina 2) las del
margen y el piacuteleo que son un poco maacutes gruesas no ramificadas no se tintildeen con
fioxina y usualmente tienen graacutenulo anaranjados que se disuelven en KOH 3) las
de la zona de transicioacuten y tubos que tienen grosor variable y se disponen en capas
y 4) las que se encuentran uacutenicamente en la zona de transicioacuten que son delgadas
con ramificaciones cortas y recurvadas (Papinutti 2013) Para la diferenciacioacuten
entre P sanguineus y P cinnabarinus es necesario saber que el primero tiene un
sistema de hifas dimiacutetico mientras el del segundo es trimiacutetico (Asociacioacuten
Micoloacutegica Fungiacutepedia 2016) Para evitar vacilaciones lo maacutes preciso es realizar
pruebas a nivel molecular mediante extraccioacuten del ADN ribosomal y su
amplificacioacuten secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes
(Cruz Muntildeoz et al 2015a)
224 Caracterizacioacuten
Para la determinacioacuten de las condiciones oacuteptimas de crecimiento y la produccioacuten
de metabolitos secundarios se toman discos (5 mm de diaacutemetro) de PDA con
micelio del borde radial de cultivos de 30 diacuteas de edad y se depositan en nuevas
cajas de petri con medio de cultivo acorde con lo que se quiera medir o producir se
incuba por 30 diacuteas maacutes a 23 degC con luz blanca continua (Curz et al 2015a) El
crecimiento micelial no de manera obligatoria estaacute relacionado con la produccioacuten
de metabolitos secundarios (Baumer Mas Diego Pacheco Morgado amp Furigo
2008) Los metabolitos primarios y secundarios producidos por el geacutenero
Pycnoporus spp variacutean dependiendo de la especie y condiciones de cultivo (Acosta
Paz Rodriacuteguez Adame amp col 2010) una vez extraiacutedos en alguacuten tipo de solvente
27
seguacuten el experimento ejecutado se identifican por cromatografiacutea de capa fina
mediante comparacioacuten de los frentes de retencioacuten (Cruz et al 2015a) cromatografiacutea
de gases o espectrometriacutea de masas (Teoh Don y Ujang 2011) En el anexo 3 se
nombran los principales metabolitos producidos por Pycnoporus spp
Es necesario realizarle a la cepa purificada ensayos de actividad enzimaacutetica para
identificar algunos usos potenciales a nivel industrial Como eacuteste geacutenero pertenece
a los hongos de pudricioacuten blanca se deben realizar ensayos de actividad
ligninoliacutetica celuloliacutetica hemiceluloliacutetica de acuerdo con el Manual de Micologiacutea
Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Forchiassin et al 2014) Las
enzimas ligninoliacuteticas maacutes abundantes en eacuteste hongo son las lacasas (Eggert et al
1996) lo que facilita su proceso de purificacioacuten Se habiacutea llegado a pensar que la
produccioacuten de peroxidasas extracelulares era nula (Machuca amp Ferraz 2001)
225 Conservacioacuten
La cepa debe ser almacenada en refrigeracioacuten a 4 ordmC para que no pierda su
viabilidad (Borderes et al 2011b Schliephake et al 1993) Aunque existen otros
meacutetodos que tambieacuten pueden emplearse Inmersioacuten en agua destilada inmersioacuten en
aceite mineral liofilizacioacuten congelacioacuten repique (Ortiz et al 2016) La
temperatura de congelacioacuten es de -80 degC en hielo seco o nitroacutegeno liacutequido y la de
liofilizacioacuten de 2 a 8 degC Cada vez que se vaya a usar la cepa limpie su envase con
etanol al 70 y transfiera aseacutepticamente (American Type Culture Collection
2016a 2016b Uzan amp col 2010) El periacuteodo de viabilidad para algunos hongos
conservados bajo este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith amp Onions 1994) En la figura
22 se observa un laboratorio apto para la obtencioacuten de recursos geneacuteticos fuacutengicos
28
Figura 22 Laboratorio del Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente
Fuente Cortesiacutea de Julio Pineda Insuasti (2016)
Meacutetodos a corto plazo que ayudan a la conservacioacuten de la cepa se aplica cuando
su uso es generalmente frecuente (Garciacutea amp Uruburuacute 1991) dentro de estos
meacutetodos se tendriacutea
El cultivo seriado consiste en resembrar al microorganismo cada cierto tiempo
en un medio adecuado este meacutetodo es vaacutelido para periacuteodos de 15 diacuteas se incrementa
la posibilidad de contaminacioacuten de la cepa (Mateos 2002)
La conservacioacuten por suspensioacuten en agua destilada es un meacutetodo sencillo
econoacutemico y seguro capaz de garantizar la supervivencia de cultivos fuacutengicos por
periacuteodos prolongados de dos hasta siete antildeos (Jong amp Birmingham 2001) Consiste
en suspender en agua esteacuteril ceacutelulas de cultivo como conidias esporas picnidios
esclerocidos (Bueno 1998)
La conservacioacuten con aceite mineral consiste en recubrir con aceite mineral
esteacuteril un cultivo que se encuentre en condiciones oacuteptimas de crecimiento micelial
y esporulacioacuten generalmente (Jong amp Atkins 1986) esta teacutecnica disminuye la
deshidratacioacuten del medio es utilizado en pequentildeas colecciones cuando la
liofilizacioacuten no resulta econoacutemica (Jong ampBirmingham 2001) Un amplio rango
de hongos a sobrevivido por este meacutetodo por un periacuteodo de 12 a 30 meses (Smith
et al 1994)
La desecacioacuten es un meacutetodo de conservacioacuten que reduce draacutesticamente el
metabolismo Sin embargo no todos los microorganismos sobreviven a estos
29
meacutetodos de secado por lo que se hace necesario antildeadir agentes protectores (leche
descremada glumato soacutedico al 10) La conservacioacuten en suelo es una teacutecnica que
ha sido usada ampliamente en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial (Jong et al 1985) Este meacutetodo es usado para
cultivos que producen esporas y estructura de resistencia las cepas pueden
almacenarse en diferentes sustratos como arena papel filtro El meacutetodo consiste en
esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente con una
pequentildea cantidad de inoacuteculo preserva la viabilidad en un periacuteodo de tres a ocho
antildeos (Jong et al 2001)
Meacutetodos a largo plazo son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento
de las ceacutelulas microbianas pero estas no han muerto Asiacute se garantiza el maacuteximo
de estabilidad geneacutetica (Garciacutea et al 1991) dentro de estos meacutetodos se tendriacutea
La liofilizacioacuten Es un proceso en el cual se congela el producto y posteriormente
se introduce en una caacutemara al vaciacuteo para realizar la separacioacuten del agua por
sublimacioacuten es otro de los meacutetodos de conservacioacuten de hongos por tiempo
prolongado Si bien es muy recomendado requiere contar con un liofilizador lo
que no siempre estaacute al alcance de todos los investigadores La liofilizacioacuten es un
proceso de conservacioacuten que tambieacuten involucra la deshidratacioacuten de las conidias o
cualquier otra estructura propagativa (Ames nd) El periacuteodo de viabilidad para
algunos hongos conservados por este meacutetodo es de 23 antildeos (Smith et al 1994)
La criocongelacioacuten se basa en la utilizacioacuten de una temperatura
extremadamente friacutea para poder disminuir de forma controlada las funciones vitales
del organismo que se pretende conservar y que eacuteste se conserve vivo pero
ldquodormidordquo durante un periacuteodo de tiempo muy elevado sin que pierda sus
propiedades su principio radica en que toda ceacutelula tejido u organismo sometido a
bajas temperaturas disminuye sus funciones vitales permaneciendo en estado de
dormancia por periacuteodos prolongados es decir sus actividades metaboacutelicas estaacuten
suprimidas (Pasarellt amp McGinnis 1992 Rico et al 2004)
30
23 Produccioacuten de Biomasa
La obtencioacuten de compuestos derivados de la produccioacuten de Pycnoporus spp se
realiza mediante procesos fermentativos que pueden llevarse a cabo en medios de
crecimiento liacutequidos (Fermentacioacuten en Estado Liacutequido FEL) o soacutelidos
(Fermentacioacuten en Estado Soacutelido FES) Investigaciones efectuadas por Acosta-
Urdapilleta y colaboradores (2010) indican que los metabolitos primarios y
secundarios producidos por el geacutenero Pycnoporus dependen de la especie y las
condiciones de cultivo del mismo
231 Paraacutemetros de operacioacuten
El nivel de humedad del sustrato ejerce un efecto significativo en el proceso de
FES recomendaacutendose una humedad del 70 (Annuar Sammantha Murthy amp
Sabanatham 2010) Asiacute mismo el aumento del oxiacutegeno en el ambiente favorece
la tasa y la extensioacuten de la degradacioacuten de la biomasa por parte de Pycnoporus spp
(Hatakka amp Uusi-Rauva 1983) lo que se traduce en un aumento de la
bioconversioacuten Por otro lado el pH del medio de cultivo estaacute directamente
relacionado con el crecimiento del micelio daacutendose un mayor descenso de pH en
medios que presentan mayor crecimiento micelial (Holler amp Brooks 1980) No
obstante la mayoriacutea de estos estudios han sido realizados en condiciones in vitro
no contemplando la influencia de factores que pueden modificar los resultados en
procesos a mayor escala (Behrentz amp Giraldo 1993)
232 Medios de cultivo
Las fuentes de carbono comuacutenmente usadas en los procesos de FEL son lactosa
maltosa glucosa fructuosa extracto de levadura harinas de algunos cereales entre
otros (Chegwin A amp Nieto R 2013 Suaacuterez Arango amp Nieto 2013) La glucosa y
la fructosa permiten obtener una alta densidad de biomasa pues son maacutes faacuteciles de
asimilar que la maltosa no obstante pueden ser inhibidores de reacciones
metaboacutelicas secundarias del hongo (Ander Eriksson y Yu 1983) Los
suplementos de medios de cultivo maacutes utilizados son tartrato de diamonio tartrato
31
disoacutedico KH2PO4 CaCl2H2H2O MgSO4middot7H2O FeSO4middot7H2O ZnSO4middot7H2O
MnSO4middotH2O CuSO4middot5H2O y extracto de levadura (Eggert et al 1996 Gocenoglu
yPazarlioglu 2014 Herpoeumll Moukha Lesage-Meessen Sigoillot amp Asther
2000a Levasseur e al 2014)
Pycnoporus spp puede cultivarse faacutecilmente a escala de laboratorio y en planta
piloto obteniendo altos rendimientos de produccioacuten a partir del uso de substratos
como almidoacuten extracto de malta maltosa metilcelulosa sacarosa dextrosa
caldos suplementados con extracto de levadura yo fosfoliacutepidos (Holler amp Brooks
1980 Oddou Stentelaire Lesage-Meessen Asther amp Colonna Ceccaldi 1999)
salvado de maiacutez salvado de trigo y salvado de arroz (FuQuan amp QiJin 2008
Levasseur et al 2014 Zimbardiet al 2016) tambieacuten se reporta el uso de residuos
agroindustriales como el bagazo de la cantildea de azuacutecar residuos de cultivo de
plaacutetano virutas de madera caacutentildeamo caacutescaras de algodoacuten hojas de palma de aceite
y residuos de frutas (Annuar et al 2010 Leŝtan Ŝtrancar amp Perdih 1990)
Existe una estrecha relacioacuten entre el aumento del crecimiento micelial del hongo
con el carbono total disponible en el medio de cultivo (Holler amp Brooks 1980) El
raacutepido crecimiento del hongo en medios pobres sobre todo cuando no se antildeade
ninguna fuente de carbono puede ser causado por la expansioacuten de su micelio como
estrategia para evitar la inanicioacuten (Levasseur et al 2014) Levasseur y
colaboradores (2014) sugieren que un alto contenido de lignina en el medio de
cultivo inhibe el crecimiento de P cinnabarinus en condiciones de cultivo en donde
la lignina es la uacutenica fuente de carbono disponible
233 Incubacioacuten
La mayoriacutea de estudios de estimacioacuten de la velocidad de crecimiento micelial
se realizan midiendo el diaacutemetro del micelio del hongo en las placas de petri sin
embargo el crecimiento tambieacuten se relaciona con la densidad de micelio en el
medio (Royse 1997)
FuQuan y QiJin (2008) estudiaron el crecimiento de Pcinnabarinus por FES en
bolsas con 075 kg de salvado de trigo y aserriacuten suplementado con sacarosa y
CaCO3 a una temperatura de crecimiento de 25 a 30 ordmC un pH 70 y una humedad
32
del sustrato del 60 al 65 logroacute una colonizacioacuten completa del micelio despueacutes
de los 26 a los 30 diacuteas y la obtencioacuten de carpoacuteforos transcurridos 32 diacuteas despueacutes
de la aparicioacuten de los primordios
Holler y Brooks (1980) estudiaron el crecimiento del micelio de P cinnabarinus
por FEL utilizando extracto de malta suplementado con NaNO3 K2HPO4
MgSO47H2O KCL y FeSO47H2O y sacarosa a partir de una suspensioacuten de
esporas y tacos de agar con micelio se cultivoacute a 28 ordmC por un intervalo de 4 diacuteas
El medio de levadura-extracto de almidoacuten mostroacute el mayor aumento de peso seco
del micelio (10638 mg) en comparacioacuten con el medio extracto de madera (0336
mg)
24 Produccioacuten de metabolitos
241 Cinnabarina
La produccioacuten de cinnabarina puede realizarse in vitro en medios soacutelidos y
liacutequidos o in vivo a partir de los basidiocarpos cuya obtencioacuten es maacutes faacutecil Las
mayores concentraciones de este pigmento se obtienen en Agar Papa Dextrosa
(PDA por sus siglas en ingleacutes) y Agar Extracto de Malta (MEA por sus siglas en
ingleacutes) mientras el mayor crecimiento micelial se obtiene en medios conformados
por los extractos de los materiales lignoceluloacutesicos de donde las cepas fueron
aisladas (Cruz Muntildeoz et al 2015b) Baumer y colaboradores (2008) indican que la
velocidad de crecimiento del hongo no implica necesariamente una mayor
produccioacuten de cinnabarina Investigaciones efectuadas por Acosta-Urdapilleta y
colaboradores (2010) sugieren que el mejor sustrato para producir cinnabarina en
primordios de P sanguineus es el aserriacuten de pino seguido por el de encino y el de
cedro sin importar la cepa utilizada En dichos experimentos el contenido promedio
del cinnabarina en cajas de petri fue de 6-9 mg g de micelio mientras en primordios
del hongo fue de 56 mgg de micelio y en cuerpos fructiacuteferos bien desarrollados de
68 mgg de carpoacuteforo La ventaja de usar basidiocarpos en vez de primordios para
la extraccioacuten de cinnabarina es la posibilidad de realizar hasta dos o maacutes cosechas
del hongo lo que requiere de 242 a 356 diacuteas Sin embargo el cultivo en caja de
petri permite obtener cinnabarina mucho maacutes raacutepido entre 7 a 15 diacuteas con una
33
mayor actividad antioxidante (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez M
Adame amp col 2010) Hay que evaluar la situacioacuten si la cinnabarina es requerida
para investigaciones conviene producir el hongo en cajas de petri pero si es
requerida para uso industrial conviene maacutes producir primordios o cuerpos
fructiacuteferos
242 Vainillina
El hongo P cinnabarinus fue cultivado por Falconnier y colaboradores (1994)
utilizando un medio que conteniacutea maltosa como fuente de carbono tartrato de
diamonio como fuente de nitroacutegeno y suplementos como KH2PO4 CaCl2 MgSO4
y extracto de levadura obteniendo una concentracioacuten en el medio de cultivo de 64
mgL de vainillina En comparacioacuten Oddou y colaboradores (1999) demostraron
que este hongo basidiomiceto presenta una mayor produccioacuten de vainillina (760
mgL) usando una mezcla compuesta por fosfoliacutepidos y glucosa obteniendo
ademaacutes una gran densidad de biomasa fuacutengica El proceso fermentativo se llevoacute a
cabo en un biorreactor agitado a una velocidad de 120 rpm con un flujo de aire de
093 vvm (voluacutemenes de aire unidad de volumen de medio por minuto) al principio
del proceso fermentativo y 028 vvm posterior a los tres diacuteas manteniendo una
temperatura constante de 30 ordmC Lo anterior respalda lo dicho por Leŝtan y
colaboradores (1990) quienes demostraron que la combinacioacuten de liacutepidos y glucosa
induce el crecimiento del micelio de algunos basidiomicetos (Ander et al 1983)
243 Enzimas ligninoliacuteticas
Zimbardi y colaboradores(2016) indicaron que las fuentes de nitroacutegeno maacutes
efectivas para la produccioacuten de lacasas de P sanguineus por FES son en orden
descendente NH4Cl peptona extracto de malta caseiacutena urea extracto de
levadura asparagina KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Siendo la mejor fuente
de carbono para la produccioacuten de lacasa el salvado de trigo Mariacutea Eugenia Eugenio
Carbajo Martiacuten Gonzaacutelez y Villar (2009) concluyeron que la produccioacuten de lacasa
34
por hongos no soacutelo depende de las fuentes de carbono y nitroacutegeno sino tambieacuten de
la concentracioacuten de nitroacutegeno del medio de cultivo
La obtencioacuten de celulasa a partir de este hongo fue estudiada por Onofre Santos
Kagimura y Mattiello (2015) quienes reportaron que P sanguineus fue cultivado
en bagazo de cantildea enriquecido con carboximetilcelulosa glucosa NaNO3
KH2PO4 MgSO4 KCl FeSO47H2O ZnSO4 y urea a una temperatura de 30 degC y
pH 55 presentando una actividad enzimaacutetica de la celulasa de 1632 plusmn 265 Umiddotgmiddot-
La tabla 13 y 14 especifican las condiciones de cultivo para la produccioacuten de lacasa
por Pycnoporus spp y sus respectivos rendimientos
244 Inductores
La adicioacuten de inductores enzimaacuteticos constituye una estrategia para aumentar la
produccioacuten de compuestos metaboacutelicos mediante la optimizacioacuten de las
condiciones de cultivo (Schliephake et al 1993)
Seguacuten Lomascolo y colaboradores (2003) la produccioacuten de lacasa fuacutengica es
influenciada por la presencia de inductores que regulan la siacutentesis de la enzima a
nivel transcripcional empero el efecto de cada compuesto y la concentracioacuten
oacuteptima para la produccioacuten de lacasa variacutea seguacuten las diferentes cepas fuacutengicas
Compuestos fenoacutelicos como como 25-xilidina se adicionan al medio de cultivo
para incrementar la produccioacuten de lacasa (Schliephake y col 1993) tambieacuten se
reporta el uso de aacutecido feruacutelico (Levasseur et al 2014 Lomascolo y col 2003)
etanol (Eggert et al 1996) alcohol veratriacutelico e iones Cu2+ Estos dos uacuteltimos son
los inductores maacutes comunes de actividad lacasa su efecto en la produccioacuten
enzimaacutetica por FEL ha sido maacutes estudiada que por FES (Piscitelli et al 2011
Rivera-Hoyos et al 2013) Por su parte el etanol a pesar de tener un efecto
inhibidor inicial en el crecimiento del micelio es un fuerte inductor de la expresioacuten
de lacasa en P cinnabarinus permitiendo obtener altos rendimientos Meza y
colaboradores (2003) estudiaron el efecto del etanol en la produccioacuten de lacasas de
P cinnabarinus en bagazo de cantildea de azuacutecar y encontraron que la adicioacuten de etanol
al inicio de la fermentacioacuten incrementa raacutepidamente la actividad enzimaacutetica 215
veces maacutes que el sustrato que no conteniacutea etanol alcanzando niveles maacuteximos de
35
129 UmiddotL-1 despueacutes de 15 diacuteas los cuales se mantienen constantes hasta la final de
la fermentacioacuten Por otro lado el alcohol veratriacutelico estimula la produccioacuten de
peroxidasas totales (Piscitelli et al 2011) mientras los compuestos que aportan
iones de manganeso como MnSO4 son especiacuteficos para manganeso peroxidasa
(MnP) (Pezzella Guarino amp Piscitelli 2015)Las tablas 23 y 24 muestran la
influencia de algunas sustancias inductoras en la produccioacuten de lacasa fuacutengica a
traveacutes de procesos FEL y FES respectivamente
Tabla 23 Produccioacuten de lacasa por Pycnoporus spp con inductores por FEL
EspecieCepa Inductor Actividad
enzimaacutetica
Condiciones
fermentacioacuten Referencia
P sanguineus Sin inductor 5 117 U L-1 pH 50 28 ordmC
150 rpm
(Lu y col 2007a)
25-xilidina 1 368 U L-1 pH 45 25 ordmC
125 rpm
(S Pointing Jones y
Vrijmoed 2000)
sacarosa-
asparagina
820 000 U L-1 28ordmC 200 rpm (Mariacutea Eugenia
Eugenio y col 2009)
P cinnabarinus 25-xilidina 9 600 U L-1 pH 45 30 ordmC 60
rpm
(Eggert y col 1996)
aacutecido feruacutelico 29 000 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Herpoeumll y col
2000a)
etanol 266 600 U L-1 30 ordmC 120 rpm
(Lomascolo y col
2003)
Los valores con unidades en rpm hacen referencia a la velocidad de agitacioacuten en
el biorreactor
Tabla 24 Produccioacuten de lacasas de Pycnoporus spp por FES
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P sanguineus Hojas de palma de
aceite urea
CaCO3
466 U gmiddot-1 Humedad 75-85
25 ordmC densidad
del inoculo 30
(Vikineswary y
col 2006)
Mazorca de maiacutez
CuSO4 NH4Cl
1386 U g-1 Humedad 41 mL
g-1 sustrato 26 ordmC
(Zimbardi y col
2016)
36
EspecieCepa
Componentes
principales del
sustrato
Rendimiento
obtenido
Condiciones de
fermentacioacuten Ref
P
cinnabarinus
Bagazo de cantildea
alcohol veratriacutelico
850 U middotgmiddot-1 Humedad 70
25 ordmC
(Meza Auria
Lomascolo
Sigoillot y
Casalot 2007)
Bagazo de cantildea
etanol gaseoso
900 U middotgmiddot-1 24 ordmC Flujo
suministro etanol
40 mL min-1
(Meza
Lomascolo
Casalot Sigoillot
y Auria 2005)
Duarte Tiba Santiago Garcia y Bara (2012) estudiaron el efecto de distintos
compuestos inductores en la produccioacuten de tirosinasa por P sanguineus en
condiciones de luminosidad como estrategia para disminuir la produccioacuten de lacasa
(la cual aumenta en la oscuridad) demostrando que sustancias como aacutecido de sodio
aacutecido salicilhidroxaacutemico y feniltiourea poseiacutean una actividad inhibitoria mientras
que L-tirosina fue el mejor inductor para la produccioacuten de esta enzima seguido de
L-dopa (L-dihidroxifenilalanina 34) aacutecido cafeico (aacutecido 34 dihidroxicinaacutemico)
aacutecido 2-(4-Hydroxyphenyl) propanoico y guayacol
25 Importancia industrial
En el anexo 4 se resumen los principales metabolitos producidos por Pycnoporus
spp y su uso
251 Degradacioacuten de compuestos xenobioacuteticos
Los hongos de pudricioacuten blanca pueden degradar compuestos de estructura
polifenoacutelica semejante a la lignina como los compuestos xenobioacuteticos gracias a la
accioacuten de enzimas extracelulares ligninoliacuteticas producidas por estas especies que
actuacutean despolimerizando unidades no repetitivas de fenilpropanoide ligadas por
varios enlaces carbono-carbono (S B Pointing 2001 Swamy y Ramsay 1999)
Compuestos xenobioacuteticos como los colorantes industriales constituyen
37
contaminantes persistentes debido a su origen sinteacutetico por lo que pueden daacutersele
a las lacasas de Pycnoporus spp aplicaciones en biorremediacioacuten (Bumpus y Aust
1987) Schliephake y colaboradores (1993) realizaron ensayos exitosos de
decoloracioacuten de efluentes textiles (con contenido de colorantes sinteacuteticos) dentro de
un biorreactor de lecho empaquetado inmovilizando el hongo P cinnabarinus en
una membrana de nylon para que produjera lacasas demostrando la capacidad del
hongo para tolerar residuos potencialmente toacutexicos y degradarlos
252 Control bioloacutegico
El uso de hongos antagonistas ha demostrado ser una eficiente opcioacuten para el
control bioloacutegico de fitopatoacutegenos causantes de diversas enfermedades en cultivos
vegetales (Fernaacutendez-Larrea 2001 Infante Martiacutenez Gonzaacutelez amp Reyes 2009)
Estudios realizados en P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a
Mycena citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de
cafeacute causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum
Jaramillo 2012) Viecelli y Stangarlin (2010) obtuvieron resultados similares
contra Pseudocercospora griseola causante de la enfermedad ldquomancha angularrdquo en
cultivos de friacutejol tras rociar la superficie de las hojas de la planta con el extracto
acuoso obtenido del micelio de P sanguineus
253 Obtencioacuten de compuestos de intereacutes farmaceacuteutico
Algunas especies de hongos de la familia Polyporaceae producen pigmentos
rojos o anaranjados derivados de aacutecidos polipoacutericos y terpenilquinones los cuales
son causales de la coloracioacuten naranja de los hongos Pycnoporus spp (Veliacutešek y
Cejpek 2011) Los principales compuestos producidos por P sanguineus son
poliporin cinnabarina aacutecido cinabariacutenico y tramesanguina (Henrique Rosa et al
2003) A Smacircnia y colaboradores (1995) demostraron que la cinnabarina tiene
propiedades antibacterianas (Gocenoglu amp Pazarlioglu 2014) capaces de inhibir el
crecimiento de bacterias como Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
38
Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus y miembros
del geacutenero Streptococcus siendo maacutes efectiva para el control de cocos
grampositivos que de bacilos Gram-negativos (E de F A Smacircnia et al 1998)
Ensayos utilizando P sanguineus evidenciaron la efectividad del ergosterol-58-
endoperoacutexido producido contra amastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis
(Correa et al 2005)
Es necesario saber que los metabolitos secundarios producidos por esta especie
presentan un gran potencial antioxidante y que su eficiencia de produccioacuten no
necesariamente estaacute relacionada con la velocidad de crecimiento micelial (Borderes
et al 2011a)
254 Produccioacuten de aditivos alimentarios
El aacutecido feruacutelico es un producto de la degradacioacuten de la lignina por hongos de
podredumbre blanca (Kirk 1971) Falconnier y colaboradores (1994) demostraron
el aacutecido feruacutelico de P cinnabarinus se puede biotransformar en vainillina y alcohol
vainiacutellico a traveacutes de una viacutea reductora o formar metoxihidroquinona a traveacutes de la
descarboxilacioacuten oxidativa La vainillina es una moleacutecula de alto valor comercial
aislada comuacutenmente de vainas de vainilla responsable del aroma y sabor de la
vainilla (Cid-Perez 2011) La demanda actual de alimentos producidos de forma
natural ha estimulado la buacutesqueda de medios alternativos de produccioacuten de
vainillina convirtiendo a los hongos del geacutenero Pycnoporus spp en una excelente
opcioacuten para la obtencioacuten de este aditivo alimentario (Falconnier et al 1994)
26 Marco legal
Seguacuten la Organizacioacuten de los Estados Ibero-americanos (OEI) los cambios y la
destruccioacuten de sus haacutebitats la contaminacioacuten ambiental la inadecuada poliacutetica
forestal la recoleccioacuten de cuerpos fructiacuteferos y la fragmentacioacuten de los ecosistemas
son las pesadillas de los hongos En las uacuteltimas deacutecadas han sufrido un descenso
laquocualitativo y cuantitativoraquo Por su laquopapel crucial en el funcionamiento de los
ecosistemasraquo y consciente de que las setas se han omitido en los programas de
39
conservacioacuten un grupo de micoacutelogos decidioacute realizar en 2003 la primera laquoLista
Roja preliminar de hongos en la Peniacutensula Ibeacutericaraquo que comprende hasta 67
taxones (subdivisiones de una especie) de hongos amenazados Es necesario hacer
una ley que tenga en cuenta los intereses de todos de los recolectores
acostumbrados a tomar sus setas y de la administracioacuten y comunidades autoacutenomas
que deben velar por la conservacioacuten de su patrimonio natural
Legislacioacuten internacional los seres humanos han dependido de la biodiversidad
y especiacuteficamente de los recursos geneacuteticos para producir innovar mejorar y
adaptarla a sus necesidades particulares Antes de la vigencia del Convenio sobre
la Diversidad Bioloacutegica (CDB) el acceso a los recursos geneacuteticos era libre
Normalmente las uacutenicas barreras para el acceso a estos recursos eran las distancias
y las fronteras geograacuteficas el desconocimiento de su existencia su poca adaptacioacuten
a otros ecosistemas su limitada aceptacioacuten o la falta de la verificacioacuten de su utilidad
por parte de otras culturas (Estrella Manosalvas Mariaca Ribadeneira 2005)
En el Convenio sobre diversidad bioloacutegica se define a los recursos geneacuteticos
como ldquomaterial geneacutetico de valor real o potencialrdquo y el material geneacutetico como
ldquotodo material de origen vegetal animal microbiano o de otra iacutendole que contenga
unidades funcionales de la herenciardquo
El principal objetivo de la Federacioacuten Internacional de Colecciones de Cultivo
(WFCC) la cual es un conjunto de comiteacutes comisiones y federaciones (COMCOF)
de la Unioacuten Internacional de Sociedades Microbiologiacutea (IUMS) Unioacuten
Internacional de Ciencias Bioloacutegicas (IUBS) es la promocioacuten y desarrollo de
cultivos de microorganismos y liacuteneas celulares La coleccioacuten de cultivos se debe
realizar de forma segura y de conformidad con las diferentes legislaciones y
regulaciones que controlan este tema en el proceso de aislamiento manipulacioacuten
almacenamiento y distribucioacuten de microrganismo y cultivos celulares hay muchas
etapas en las que se requiere conformidad con la ley regulaciones o convenciones
internacionales una coleccioacuten de cultivos deberiacutea tener conformidad en
Requerimientos en salud y seguridad
40
Clasificacioacuten de los microorganismos en funcioacuten de su riesgo
Regulaciones de cuarentena
Derechos de propiedad intelectual
Convencioacuten sobre diversidad bioloacutegica Informacioacuten segura suministrada al receptor
de los microorganismos
Regulaciones gubernamentales sobre el enviacuteo de cultivos
Control en la distribucioacuten de organismos peligrosos
Tratado de Budapest (para los depoacutesitos de patentes) (WFCC 2010)
Legislacioacuten nacional
Que los artiacuteculos 14 74 275 276 387 388 de la Constitucioacuten de la Repuacuteblica
reconoce el derecho de la poblacioacuten a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente
equilibrado que garantice la sostenibilidad y el buen vivir Declara de intereacutes
puacuteblico la preservacioacuten del ambiente la conservacioacuten de los ecosistemas la
biodiversidad y la integridad del patrimonio geneacutetico del paiacutes la prevencioacuten del
dantildeo ambiental y la recuperacioacuten de los espacios naturales degradados
(Constitucioacuten poliacutetica de la repuacuteblica del Ecuador)
Que el Art 86 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declara de intereacutes
puacuteblico a la conservacioacuten de los ecosistemas la biodiversidad y el patrimonio
geneacutetico del paiacutes a la recuperacioacuten de espacios naturales degradados al
establecimiento de un Sistema Nacional de Aacutereas Naturales Protegidas que
garanticen la conservacioacuten de la biodiversidad y el mantenimiento de los servicios
ecoloacutegicos
Que los Arts 89 242 y 248 de la Constitucioacuten Poliacutetica de la Repuacuteblica declaran
respectivamente que el Estado tomaraacute medidas orientadas a regular bajo estrictas
normas de bioseguridad la propagacioacuten en el medio ambiente la experimentacioacuten
el uso la comercializacioacuten y la importacioacuten de organismos geneacuteticamente
modificados que la organizacioacuten y funcionamiento de la economiacutea responderaacute
41
entre otros principios al de sustentabilidad y ratifica el derecho soberano del
Estado sobre la biodiversidad promoviendo su conservacioacuten y utilizacioacuten
sustentable con la participacioacuten de las poblaciones involucradas y de conformidad
con los convenios y tratados internacionales Que el Ecuador suscribioacute y ratificoacute el
Convenio sobre la Diversidad Bioloacutegica seguacuten consta en los Registros Oficiales
No 109 del 18 de enero de 1993 y el 146 del 16 de marzo de 1993 El cual regula
la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de la biodiversidad y sus componentes y
establece la participacioacuten justa y equitativa en los beneficios que se deriven de la
utilizacioacuten de los recursos geneacuteticos asociados reconociendo el derecho soberano
que ejercen los Estados sobre sus recursos bioloacutegicos Que el Estado ha suscrito y
ratificado varios Convenios Internacionales relacionados con la conservacioacuten de la
biodiversidad tales como la Convencioacuten sobre Humedales de Importancia
Internacional especialmente como Haacutebitat de Aves Acuaacuteticas o Convencioacuten de
Ramsar la Convencioacuten para la Proteccioacuten del Patrimonio Mundial Cultural y
Natural la Convencioacuten sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas
de Flora y Fauna Silvestres (CITES) Convenio Marco de Cambio Climaacutetico el
Tratado de Cooperacioacuten Amazoacutenica entre los maacutes relevantes Que estaacuten vigentes
en el Ecuador normas de aplicacioacuten regional de la Comunidad Andina de manera
especial las Decisiones de la Comisioacuten del Acuerdo de Cartagena Nos 344 345
391 y 486 relativas a la Propiedad Industrial la proteccioacuten a los Derechos de los
Obtentores de Variedades Vegetales y al Acceso a los Recursos Geneacuteticos Que la
biodiversidad constituye la base del capital natural del paiacutes capaz de proporcionar
un flujo constante de bienes y servicios cuya conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable
permitan satisfacer las necesidades humanas de consumo y produccioacuten y
garanticen el sustento de la vida Que la conservacioacuten y utilizacioacuten sustentable de
la biodiversidad son de intereacutes nacional por su importancia econoacutemica ecoloacutegica
geneacutetica social cultural cientiacutefica educativa recreativa y esteacutetica y por lo tanto
tiene un valor estrateacutegico para el desarrollo sustentable presente y futuro del
Ecuador Que siendo el Ecuador uno de los paiacuteses de mayor biodiversidad del
mundo catalogado como mega diverso constituye una prioridad para el paiacutes
proteger su riqueza bioloacutegica y cultural asociada para las generaciones presentes y
futuras ante la preocupante y considerable reduccioacuten y peacuterdida de la biodiversidad
42
como consecuencia de determinadas actividades humanas en el paiacutes Que es
indispensable expedir normas que rijan la conservacioacuten y uso sustentable de la
biodiversidad (Ley para la conservacioacuten y uso sustentable de la biodiversidad
1993)
CAPIacuteTULO VIII De la Investigacioacuten y Capacitacioacuten Forestales
Art 50- El Ministerio del Ambiente promoveraacute realizaraacute y coordinaraacute la
investigacioacuten relativa a la conservacioacuten administracioacuten uso y desarrollo de los
recursos forestales y de las aacutereas naturales del patrimonio forestal
Art 51- Para el cumplimiento de las actividades previstas en el artiacuteculo anterior
al Ministerio del Ambiente le corresponde
a) Crear centros de investigacioacuten sobre especies forestales nativas y exoacuteticas de
fauna y flora silvestres
b) Suscribir convenios relativos a la investigacioacuten capacitacioacuten y educacioacuten
forestales
c) Ejecutar programas de capacitacioacuten y adiestramiento en conservacioacuten
administracioacuten y desarrollo de recursos forestales y aacutereas naturales de patrimonio
del Estado
d) Establecer en coordinacioacuten con el Ministerio de Educacioacuten y Cultura y otras
entidades del sector puacuteblico programas de educacioacuten y divulgacioacuten relativas a los
aspectos mencionados en el literal anterior
e) Organizar cursos de capacitacioacuten forestal y de conservacioacuten conjuntamente
con el Servicio Ecuatoriano de Capacitacioacuten Profesional -SECAP- y otras entidades
y dependencias del sector puacuteblico o privado
f) Las demaacutes que le asignen esta Ley y los reglamentos (Ley forestal y
conservacioacuten de aacutereas 2004)
Toda esta riqueza biodiversa en el Ecuador corre gran peligro de que por falta
de una legislacioacuten que lo proteja sea amenazada por el intereacutes de convertir no en
43
elementos vitales para el Sumak Kawsay sino que apetecido por sus componentes
convertirlos en mercanciacuteas y llevarlos al mercado globalizado De hecho parte de
la destruccioacuten y desaparicioacuten de especies ha sido por falta de una legislacioacuten
responsable y soberana para la proteccioacuten de la biodiversidad asiacute como la
responsabilidad de los gobiernos de turno que no han visto a estos seres vivos como
titulares de derecho (Ley orgaacutenica de la biodiversidad 2011)
El Coacutedigo Orgaacutenico del Ambiente (COA) manifiesta en el Titulo III DE LOS
DERECHOS DEBERES Y PRINCIPIOS AMBIENTALES art5 derecho de la
poblacioacuten a vivir en un ambiente sano
El derecho a vivir en un ambiente sano y ecoloacutegicamente equilibrado
comprende
1- La conservacioacuten manejo sostenible y recuperacioacuten del patrimonio natural la
biodiversidad y todos sus componentes con respeto a los derechos de la naturaleza
y a los derechos colectivos de las comunas comunidades pueblos y nacionalidades
2- El manejo sostenible de los ecosistemas con especial atencioacuten a los
ecosistemas fraacutegiles y amenazados tales como paramos humedales bosques
nublados bosques tropicales secos y huacutemedos manglares y ecosistemas marinos y
marinos-costeros
3- La intangibilidad del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas en los teacuterminos
establecidos en la constitucioacuten y la Ley
4- La conservacioacuten preservacioacuten y recuperacioacuten de los recursos hiacutedricos
cuencas hidrograacuteficas y caudales ecoloacutegicos asociados al ciclo hidroloacutegico
5- La conservacioacuten y uso sostenible del suelo que prevenga la erosioacuten la
degradacioacuten la desertificacioacuten y permita su restauracioacuten
6- La prevencioacuten control y reparacioacuten integral de los dantildeos ambientales
7- La obligacioacuten de toda obra proyecto o actividad en todas sus fases de
sujetarse al procedimiento de evaluacioacuten de impacto ambiental
44
8- El desarrollo y uso de praacutecticas y tecnologiacuteas ambientalmente limpias y
sanas asiacute como de energiacuteas alternativas no contaminantes renovables
diversificadas y de bajo impacto ambiental
9- El uso experimentacioacuten y el desarrollo de la biotecnologiacutea y la
comercializacioacuten de sus productos bajo estrictas normas de bioseguridad con
sujecioacuten a las prohibiciones establecidas en la Constitucioacuten y demaacutes normativa
vigente
Los principios ambientales deberaacuten ser reconocidos e incorporados en toda
manifestacioacuten de la administracioacuten puacuteblica asiacute como en las providencias judiciales
estos principios son
Responsabilidad integral - Responsabilidad de quien promueve una
actividad que genere o pueda generar impacto sobre el ambiente
Mejor tecnologiacutea disponible y mejores praacutecticas ambientales - El estado
deberaacute promover a los sectores puacuteblicos y privados el desarrollo y uso de
tecnologiacuteas ambientalmente limpias y de energiacutea alternativa no
contaminantes y de bajo impacto que minimicen en todas las fases de una
actividad productiva
TIacuteTULO I DE LA CONSERVACIOacuteN DE LA BIODIVERSIDAD
Articulo 31- La conservacioacuten de la biodiversidad se realizaraacute in situ o ex situ
en funcioacuten de sus caracteriacutesticas ecoloacutegicas niveles de endemismo categoriacutea de
especies amenazadas de extincioacuten para salvaguardar el patrimonio bioloacutegico de la
erosioacuten geneacutetica
Articulo 32- Se promoveraacuten y regularaacuten las investigaciones cientiacuteficas in situ
y ex situ que comprendan actividades de extraccioacuten coleccioacuten recoleccioacuten
importacioacuten movilizacioacuten transportacioacuten exportacioacuten y disposicioacuten temporal o
final de especies de vida silvestre
Articulo 33- La biodiversidad terrestre insular marina y dulceacuiacutecola seraacute
conservada in situ Se procuraraacute el uso sostenible de sus componentes de forma tal
45
que no se ocasione su disminucioacuten a largo plazo para mantener su potencial de
satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras
Articulo 35- Para la proteccioacuten de la vida silvestre se establecen las siguientes
condiciones a las personas naturales y juriacutedicas
1 Conservar las especies de vida silvestre en su habitad natural prohibiendo
su extraccioacuten salvo las consideraciones para investigacioacuten repoblacioacuten de
especies con cualquier tipo de amenaza y las establecidas en este coacutedigo
2 Reconocer el uso tradicional y el aprovechamiento de las especies de vida
silvestre por motivos de subsistencia o por praacutecticas culturales medicinales
3 Promover investigaciones sobre vida silvestre para difundir el
bioconocimiento dentro del territorio nacional
Articulo 66- Son medios de conservacioacuten de especies de vida silvestre los que
se detallan a continuacioacuten
Viveros
Jardines botaacutenicos
Zooloacutegicos
Centros de criacutea y reproduccioacuten sostenible
Centros de rescate y rehabilitacioacuten
Bancos de germoplasma
Acuarios
TIacuteTULO IV RECURSOS GENEacuteTICOS Y SUS DERIVADOS
BIOSEGURIDAD BIOCOMERCIO
Artiacuteculo 72- Los derechos otorgados sobre los recursos bioloacutegicos no conceden
derecho alguno sobre los recursos geneacuteticos o sus derivados no sobre los
conocimientos colectivos asociados a estos Las investigaciones realizadas sobre
los recursos geneacuteticos deberaacuten ser sistematizadas y ser recopiladas por el Instituto
Nacional de Biodiversidad
Artiacuteculo 75- Las normas de bioseguridad regularaacuten los productos de la
biotecnologiacutea moderna con el objeto de contribuir a la conservacioacuten y el uso
46
sostenible de la biodiversidad y garantizar los derechos de la salud humana y el
ambiente
Articulo 80- La Autoridad Ambiental Nacional regularaacute el biocomercio para
lo cual deberaacute considerar los objetivos de la conservacioacuten de la biodiversidad la
sostenibilidad social econoacutemica y ambiental asiacute como la distribucioacuten justa de los
beneficios de conformidad con las disposiciones de este coacutedigo
En los uacuteltimos antildeos se ha observado la accioacuten paralela de numerosas
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales universidades
comunidades e individuos que han desplegado acciones en favor de la
biodiversidad del rescate de los conocimientos praacutecticas e innovaciones
relacionados a eacutesta y de la documentacioacuten o desarrollo de meacutetodos para la
conservacioacuten y utilizacioacuten sostenible de estos recursos entre otras acciones
El lograr la conservacioacuten y uso sostenible de la biodiversidad implica lograr
beneficios para el ser humano sin agotar el recurso y asegurar las posibilidades de
aprovechamiento de la biodiversidad para las proacuteximas generaciones En este
sentido la biodiversidad puede conservarse mediante dos estrategias
bull La estrategia de conservacioacuten in situ
bull La estrategia de conservacioacuten ex situ (Estrella amp col 2005)
47
3 MARCO METODOLOacuteGICO
31 Aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de la cepa nativa
Pycnoporus spp
El objetivo de este experimento es aislar identificar y caracterizar la cepa nativa
ecuatoriana del hongo Pycnoporus spp
Figura 31 Proceso para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten de Pycnoporus sanguineus
48
311 Materiales y meacutetodos
El trabajo experimental se realizoacute en el laboratorio de Biotecnologiacutea Fuacutengica del
Centro Ecuatoriano de Biotecnologiacutea y Ambiente (CEBA) en convenio con el
Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM) localizado en la Ciudad de Ibarra a 2241
msnm (UTM WGS84 17 N 816705 Este 36766 Norte) con una temperatura
promedio de 18 degC
3111 Aislamiento
La muestra de hongo Pycnoporus spp se recolectoacute de un bosque de la ciudad de
Tena a una altitud de 543 msnm UTM WGS84 18N 186566 Este 9891710 Norte
la misma se encontroacute creciendo naturalmente en troncos de la madera piguumle
(Pollalesta discolor) en proceso de descomposicioacuten
Figura 32 Ubicacioacuten de recoleccioacuten del hongo del geacutenero Pycnoporus
49
Figura 33 Pycnoporus sanguineus creciendo en troncos en descomposicioacuten de Pollalesta discolor
Para la presente investigacioacuten la reproduccioacuten celular se realizoacute tanto por medio
de tejido como por esporas en un medio rico en Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar
extracto de Malta (MEA) siguiendo la teacutecnica descrita por Pineda (2014) se
preparoacute el medio con agua destilada y se esterilizoacute por 15 minutos en autoclave a
15 PSI y 121 degC El medio esteacuteril se sirvioacute en caja petri y se procedioacute a inocular
con tejido y espora de la especie seleccionada (Pineda 2014) Las muestras
inoculadas se incubaron a 22 degC y se observoacute el crecimiento del hongo durante seis
diacuteas
3112 Identificacioacuten
La identificacioacuten fue realizada por el laboratorio especializado IDgen-
Identificacioacuten Molecular localizado en la ciudad de Quito Para ello se usoacute dos
muestras de cepas puras de la especie Pycnoporus previamente aisladas con coacutedigo
CEBA-T-PS-010116 son cultivos axeacutenicos de hongos creciendo en agar
Se realizoacute la identificacioacuten molecular de microorganismos (Extraccioacuten de ADN
Amplificacioacuten de barcode secuenciacioacuten estaacutendar ensamblaje de productos de
50
PCR y buacutesqueda en base de datos) El meacutetodo de determinacioacuten se realizoacute por
identificacioacuten molecular por barcoding
Los procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR se
describen en el detalle de protocolos (anexo 1) Los productos de PCR fueron
depurados previo a su secuenciacioacuten El producto de amplificacioacuten limpio y los
primeros ITS1 ITS4 ITS5 EF1-983F EF1-2218R fueron utilizados para la
secuenciacioacuten con el meacutetodo SANGER Se limpiaron y ensamblaron las secuencias
obtenidas con el programa bioinformaacutetico GENEIOUS y se compararon las
secuencias ensambladas con la base de datos de nucleoacutetidos de GenBank
3113 Caracterizacioacuten
La caracterizacioacuten del Pycnoporus sanguineus estudiada se realizoacute a traveacutes del
anaacutelisis quiacutemico bromatoloacutegico el cual se realizoacute en el laboratorio del INIAP
localizado en la ciudad de Quito Se realizoacute un anaacutelisis proximal macro y micro
elementos siguiendo las normas y meacutetodos de la institucioacuten
312 Resultados y discusioacuten
3121 Aislamiento
En la figura 34 se presenta los cuerpos fructiacuteferos de los hongos Pycnoporus
sanguineus que se recolectaron en la ciudad del Tena Ecuador los mismos que se
almacenaron en bolsa de polietileno y se llevaron al laboratorio
51
Figura 34 Geacutenero Pycnoporus spp guardado en una bolsa de polietileno
En la figura 35 se presenta el proceso de preparacioacuten del medio de cultivo para la
especie nativa
Figura 35 Preparacioacuten y esterilizacioacuten del medio rico en PDA y MEA
52
En la figura 36 y 37 se presenta el procedimiento para la obtencioacuten de esporas
tejido e inoculacioacuten de la especie nativa de Pycnoporus spp
Figura 36 Obtencioacuten de esporas del cuerpo fructiacutefero del hongo
Figura 37 Inoculacioacuten del medio con esporas del hongo
En la figura 38 se presenta el cultivo de Pycnoporus spp creciendo en un medio
rico luego de 6 diacuteas de incubacioacuten a 22 degC el mismo que se procedioacute a su
purificacioacuten por la teacutecnica de repique hasta lograr una cepa pura la cual fue
53
codificada como CEBA-T-PS-010116 y almacenada en el Banco de Recursos
Geneacuteticos Microbianos del CEBA
Figura 38 Muestras de crecimiento de la ceacutelula filamentosa de Pycnoporus sanguineus
(Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et al 2015a E de F A Smacircnia Smacircnia Juacutenior
amp Loguercio-Leite 1998 Vikineswary et al 2006) coinciden con la teacutecnica
utilizada en la presente investigacioacuten (Pineda 2014) realizar el aislamiento en un
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa mientras (Acosta et al 2010 Cruz Muntildeoz et
al 2015a) utilizaron como medio de cultivo Agar Harina Integral de Trigo asiacute como
(Acosta et al2010 Atteke y col 2013 Cruz Muntildeoz et al 2015a Machuca amp
Ferraz 2001 Schliephake et al 1993 Uzan et al 2010) manifiestan utilizar como
medio de cultivo Agar Extracto de Malta a esto antildeade (Cruz Muntildeoz et al 2015)
utilizar como medio de cultivo medios afines al material vegetal de donde se
recolectoacute y (Boumlse 1946) utiliza Medio Czapek-Dox con sulfato de manganeso
algunas veces adicionado con extracto de semillas de guisantes o salvado de trigo
Seguacuten (Cruz Muntildeoz et al 2015a Herpoeumll et al2000b Schliephakeet al 1993)
Se toma una pequentildea muestra de tejido del carpoacuteforo y se deposita en medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA por sus siglas en ingleacutes) o Agar Extracto de
Malta (MEA por sus siglas en ingleacutes) y se incuba por 35 diacuteas a 25 degC en ausencia
de luz Aunque el rango de crecimiento micelial puede oscilar entre 24 a 30 degC
Una vez desarrollado el hongo se hacen repiques hasta obtener una cepa pura
54
3122 Identificacioacuten
El ADN de cada una de las muestras fue extraiacutedo y con el fin de identificar la
calidad de la extraccioacuten se realizoacute una electroforesis Las extracciones de ADN
genoacutemico obtenidos evidencian una calidad alta y una concentracioacuten superior a 400
ng de ADN por cada 8 ul de extracto Se utilizoacute las extracciones de ADN
pertenecientes a las muestras para la amplificacioacuten del fragmento ITS Se puede
evidenciar que no existen productos de amplificacioacuten para las muestras por lo que
para estas se decidioacute amplificar un fragmento del factor de elongacioacuten 1 alfa (EF1a)
Adicionalmente se diluyeron las muestras hasta una concentracioacuten de 30nguL
para descartar procesos inhibitorios de la PCR debido a una elevada concentracioacuten
de ADN previo a su utilizacioacuten en el ensamblaje de la PCR
Se determina que la cepa nativa estudiada codificada como CEBA-T-PS-
010116 corresponde a la especie Trametes sanguinea en la longitud 652 949
de calidad y 99 de identidad en el fragmento ITS
En el meacutetodo utilizado para la identificacioacuten coincido con (Cruz Muntildeoz y col
2015) el cual manifiesta La identificacioacuten se realizoacute a nivel molecular para lo cual
se enviaron dos muestras de colonias puras (punta de hifa) al laboratorio de la
Estacioacuten Nacional de Epidemiologiacutea Cuarentena y Saneamiento Vegetal en
Quereacutetaro Quereacutetaro para la extraccioacuten del ADN ribosomal y su amplificacioacuten
secuenciacioacuten y alineacioacuten con las bases de datos del banco de genes del Centro
Nacional para la Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI EEUU)
De acuerdo con la base de datos Catalogue of Life la especie estudiada se
clasifica
Filo Basidiomicota
Clase Agaricomicetes
Orden Polyporales
Familia Polyporaceae
Geacutenero Pycnoporus
Especie sanguineus
55
Los sinoacutenimos para Pycnoporus sanguineus (L) (Murrill 1904) (nombre
vaacutelido) son Trametes sanguinea (L) (Lloyd 1924) Trametes sanguinea var
intermedia (Corner 1989) Trametes sanguinea var major (Corner 1989)
Trametes sanguinea var sanguinea (L) (Lloyd 1924) determinaacutendose que la
especie nativa ecuatoriana pertenece a la especie Pycnoporus sanguineus(Roskov
Y 2016)
3123 Caracterizacioacuten
De los resultados obtenido para el anaacutelisis proximal por el laboratorio del INIAP
se determina que la cepa nativa de Pycnoporus sanguineus tiene una humedad
1112 cenizas 209 EE (Extracto eteacutereo) 089 proteiacutena 1372 fibra
3418 ELN (Extracto libre de nitroacutegenos) 4912 Para el anaacutelisis de minerales
macro elementos se determinoacute que contiene calcio 027 foacutesforo 035 magnesio
006 potasio 052 sodio 001 Para micro elementos cobre 3ppm hierro 136
ppm manganeso 54 ppm zinc 58 ppm En la literatura se encuentra los
metabolismos secundarios asiacute tenemos que (Atteke et al 2013) (Berrio et al 2007)
(Camarero et al 2004) (Camarero et al 2005 ME Eugenio et al 2010) (Lu et al
2007b Machuca amp Ferraz 2001) (Madhavi amp Lele 2009 Munusamy et al 2008
Ramiacuterez-Cavazos et al 2014) (Sigoillot et al 2002 2004) (Xu et al 2000)
manifiestan la produccioacuten de lacasa ademaacutes antildeade (Boumlse 1946 Henrique Rosa et
al 2003) la produccioacuten de poliporina (Achenbach amp Blumm 1991 Acosta et al
2010 Cruz Muntildeoz et al 2015ordf Dias amp Urban 2009 A Smacircnia et al 2003 E de
F A Smacircnia et al 1998) manifiestan la produccioacuten de Cinabarina fenoxacina otra
consideracioacuten la hace (Achenbach amp Blumm 1991) el cual manifiesta la
produccioacuten O-acetyl-cinabarina pero ninguno de los autores anteriormente
mencionados manifiesta la caracteriacutesticas quiacutemicas a nivel proximal y de minerales
de la especie
56
32 Protocolo para la conservacioacuten de la especie nativa Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es desarrollar un protocolo para la conservacioacuten
de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus
Figura 39 Proceso para establecer un protocolo para la conservacioacuten de la especie
321 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue aislada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en tubos de 5 ml y luego
se inocularon con la cepa nativa seleccionada y se incubaron por 7 diacuteas a 22 degC
Los tubos colonizados fueron liofilizados en un equipo liofilizador de bandejas
marca VirTiswizard 20 a una temperatura de -40ordmC por 26 horas a una presioacuten de
57
vaciacuteo de 300 atm la cepa liofilizada fue depositada en el banco de recursos
geneacuteticos microbianos del CEBA (Pineda 2014) para su conservacioacuten
322 Resultados y discusioacuten
En la figura 310 se presenta el procedimiento para el cultivo de Pycnoporus
sanguineus en tubos se observa el crecimiento del micelio en los dos medios de
cultivo (MEA y PDA) a una temperatura de 22 ordmC durante 6 diacuteas
En la figura 311 y 312 se presenta el procedimiento para la liofilizacioacuten de las
muestras de Pycnoporus sanguineus como se observa se coloca los tubos de ensayo
con las cepas cultivadas en la bandeja y luego se carga el liofilizador el cual arranca
su operacioacuten con una temperatura de 15 ordmC disminuyendo la temperatura durante 8
horas hasta llegar -50 degC como se observa en la figura 311 disminuyendo 10 ordmC
cada hora durante 8 horas hasta llegar a ndash 50 ordmC luego empieza el proceso de secado
en el cual se aumenta la temperatura 10 ordmC durante 18 horas hasta llegar a 40 ordmC a
un presioacuten de vaciacuteo de menos 300 atm
Figura 310 Cultivo de Pycnoporus sanguineus en tubos para liofilizacioacuten
58
Figura 311 Proceso de liofilizacioacuten
Figura 312 Liofilizacioacuten de la cepa de Pycnoporus sanguineus
En la figura 313 se presenta la muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
como se observa luego de 26 horas en el liofilizador las muestras estaacuten totalmente
deshidratadas y listas para el protocolo de conservacioacuten
59
Figura 313 Muestra de Pycnoporus sanguineus liofilizada
Existen meacutetodos de conservacioacuten por liofilizacioacuten para otras especies en la cual
los autores solo recomiendan que es el mejor meacutetodo para conservacioacuten sin
embargo no se establece un procedimiento para realizar esta teacutecnica y mucho
menos se encontroacute informacioacuten sobre el proceso de liofilizacioacuten para la especie
Pycnoporus sanguineus en la presente investigacioacuten queda establecido el
procedimiento a seguir para conservar por esta teacutecnica la especie estudiada
Al conservar la especie a largo plazo se garantiza que por el deterioro o
destruccioacuten del ecosistema la especie no desaparezca aportando con la cepa nativa
en
Ambiental- el hongo podriacutea emplearse en la biodegradacioacuten de compuestos
recalcitrantes presentes en los efluentes contaminados gracias a su sistema
enzimaacutetico de ligninasas y en la degradacioacuten de residuos de madera en aserraderos
(Kirk 1971) P sanguineus revelan su actividad antifuacutengica frente a Mycena
citricolor hongo promotor de la enfermedad ldquoojo de gallordquo en cultivos de cafeacute
causaacutendole parasitosis y destruccioacuten hifal (Ojeda Gutieacuterrez amp Suescum Jaramillo
2012)
60
Econoacutemico - La implementacioacuten de este proyecto a escala industrial generariacutea
ingresos por concepto de venta de metabolitos producidos por la cepa nativa
ecuatoriana Pycnoporus sanguineus
Social - Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial farmaceacuteutico
En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la sangre eliminar
verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas menopaacuteusicos y
del vientre
33 Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la cepa de Pycnoporus
sanguineus
El objetivo de este experimento es seleccionar el mejor medio de cultivo para la
produccioacuten de la cepa nativa del hongo Pycnoporus sanguineus a partir de cepa
liofilizada
Figura 314 Proceso para determinar el mejor medio para la produccioacuten de Pycnoporus sanguineus
331 Materiales y meacutetodos
Cepa se utilizoacute las cepas del geacutenero Pycnoporus sanguineus del banco de
recursos geneacuteticos microbianos del CEBA la cual fue liofilizada en el experimento
anterior y codificada coacutemo CEBA-T-PS-010116
61
Disentildeo experimental la experimentacioacuten se planificoacute con un disentildeo
completamente al azar (DCA) con cinco reacuteplicas y completamente aleatorio El
factor de estudio fue el medio de cultivo con los niveles MEA y PDA como variable
de respuesta se establecioacute la velocidad de crecimiento lineal de la cepa del hongo
Los paraacutemetros de operacioacuten como la temperatura y la presioacuten se mantuvieron
contaste a 22degC y 101 325 Pa como factor de ruido se consideroacute el nivel de luz
Procedimiento se preparoacute los medios de cultivo MEA y PDA siguiendo la
teacutecnica descrita por Pineda (2014) se esterilizoacute y se sirvioacute en cajas petri y luego se
inocularon con cepa nativa de Pycnoporus sanguineus y se incubaron por 7 diacuteas a
22 degC se tomoacute las medidas de crecimiento (Pineda 2014)
332 Resultados y discusioacuten
En la tabla 31 se presenta la matriz de resultados experimentales como se
observa el tratamiento 1 tiene la mayor velocidad de crecimiento lineal medida en
mmdiacutea
Tabla 31 Velocidad de crecimiento de Pycnoporus a partir de cepa liofilizada
Tratamientos Velocidad de crecimiento
MEA PDA
1 392 292
2 383 292
3 375 283
4 383 275
5 392 283
Valor promedio (Ẋ) 385 285
Varianza (Ợ2) 000515 000515
Desviacioacuten estaacutendar (Ợ) 00717635 00717635
Coeficiente de varianza (CV) 186399 251802
62
Figura 315 Velocidad de crecimiento lineal de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
Tabla 32 Velocidad promedio de crecimiento de Pycnoporus sanguineus en dos medios de cultivo
MEDIOS Media Error tiacutep Intervalo de confianza 95
Liacutemite inferior Liacutemite superior
MEA 3850 032 3776 3924
PDA 2850 032 2776 2924
Figura 316 Desviacioacuten estaacutendar velocidad de crecimiento en dos medios de cultivo
385 a
285 b
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA
Vel
oci
dad
de
crec
iem
ien
to
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
MEA PDA MEA PDA PDA MEA PDA PDA MEA MEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Velocidad Promedio Limete superior Limete inferior
63
Anaacutelisis de varianza
En la tabla 33 se presenta el anaacutelisis de varianza que descompone la varianza de
Velocidad en dos componentes un componente entre-grupos y un componente
dentro-de-grupos La razoacuten-F que en este caso es igual a 485437 es el cociente
entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos Puesto que el valor-
P de la prueba-F es menor que 005 existe una diferencia estadiacutesticamente
significativa entre la media de Velocidad entre un nivel de Medio y otro con un
nivel del 950 de confianza
Tabla 33 Anaacutelisis de varianza para Velocidad por Medio
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razoacuten-F Valor-P
Entre grupos 25 1 25 48544 00000
Intra grupos 00412 8 000515
Total (Corr) 25412 9
Pruebas de Rangos Muacuteltiple para Velocidad por Medio (950 LSD)
Se aplica un procedimiento de comparacioacuten muacuteltiple para determinar cuaacuteles
medias son significativamente diferentes de otras La mitad inferior de la salida
muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias En la parte superior de
la tabla 34 se han identificado 2 grupos homogeacuteneos seguacuten la alineacioacuten de las Xs
en columnas No existen diferencias estadiacutesticamente significativas entre aquellos
niveles que compartan una misma columna de Xs El meacutetodo empleado
actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia
miacutenima significativa (LSD) de Fisher Con este meacutetodo hay un riesgo del 50 al
decir que cada par de medias es significativamente diferente cuando la diferencia
real es igual a 0
Tabla 34 Diferencia miacutenima significativa (LSD) de Fisher
Medio Casos Media Grupos Homogeacuteneos
PDA 5 285 X
MEA 5 385 X
64
Como se observa la mayor velocidad de crecimiento lineal se presenta cuando
se trabaja con MEA con una velocidad promedio de 385 mmdiacutea Identificando
que el mejor medio para la produccioacuten del hongo es el Agar Extracto de Malta
(MEA)
En la figura 317 se observar el crecimiento de la cepa y determinar la velocidad
de crecimiento lineal en los medios de cultivo estudiados
Figura 317Determinacioacuten de la velocidad de crecimiento de la Cepa
(Acosta-Urdapilleta et al 2010) manifiesta de que las velocidades maacutes altas de
crecimiento fueron de 9 mm diacutea utilizando sustratos hervidos encino lirio trigo y
avena y la menor velocidad 2 mm diacutea se dio con el tratamiento bajo cedro con
PDA obtiene velocidades de crecimiento de 17 a 35 mmdiacutea (Cruz Muntildeoz et al
2015) manifiesta que obtuvo velocidades de crecimiento de 48 mmdiacutea con
extracto de casuarina y 61 mmdiacutea con extracto de mango coincido con Acosta
(2016) en la velocidad al utilizar extracto PDA ya que en la presente investigacioacuten
obtuvimos velocidad de crecimiento 285 mmdiacutea sin embargo el mejor medio de
cultivo utilizado es MEA con 385 mmdiacutea
65
34 Ficha de cepas microbianas para su conservacioacuten en el Banco de
Recursos Geneacuteticos Microbianos (BRGM)
El objetivo de este acaacutepite es realizar una ficha para la conservacioacuten de la cepa de
Pycnoporus sanguineus
341 Introduccioacuten
Al determinar en queacute medio de cultivo tuvo mayor velocidad de crecimiento la
cepa seleccionada se deberiacutea tener un registro en un banco de recursos geneacuteticos
microbianos que garanticen la conservacioacuten de la cepa para en un futuro aprovechar
de manea sustentable el recurso fuacutengico
Ecuador posee un vasto territorio con una riqueza microbioloacutegica muy amplia y
poco estudiada por lo que la conservacioacuten de los recursos geneacuteticos propios de
nuestros ecosistemas resulta esencial para evitar la peacuterdida de biodiversidad y el
acceso a genomas y oportunidades diferentes a las de otras regiones geograacuteficas
Sin embargo nuestro paiacutes no posee auacuten una ley de Acceso a sus recursos geneacuteticos
ni tiene sistematizados los bancos donde estos recursos se conservan
El objetivo de establecer el banco de recursos geneacuteticos microbianos potenciales
para el desarrollo de la Biorefineria ecuatoriana mediante la identificacioacuten
aislamiento cultivo y conservacioacuten de cepas puras que permitan el maacuteximo
aprovechamiento de las materias primas utilizando como insumo la biodiversidad
ecuatoriana en el marco del desarrollo sostenible (Pineda 2016) banco de
recursos geneacuteticos microbianos es el reguardo inalterable del patrimonio geneacutetico
nacional de microorganismos Para esto se debe contar con infraestructura y
equipos de laboratorio contar con profesionales especialistas en el manejo
conservacioacuten y preservacioacuten de cepas nativas fuacutengicas A traveacutes de procesos de
liofilizacioacuten se conservan las cepas por un periodo determinado Respaldos de las
muestras y efectivas medidas de seguridad aseguraran que la cepa se mantendraacute en
condiciones oacuteptimas De esta manera se permitiraacute potenciar la innovacioacuten cientiacutefica
local y posesionar a Ecuador como un centro tecnoloacutegico siendo su principal
objetivo la conservacioacuten a largo plazo de cepas propios de la geografiacutea ecuatoriana
66
ya que estaacuten bajo permanente amenaza de desaparecer ya sea por acciones humanas
o situaciones naturales
Con la creacioacuten del banco de recursos geneacuteticos microbianos se lograriacutea
Preservar y proteger los recursos geneacuteticos
Contribuir y propiciar su uso ordenado racional y sustentable
Coadyuvar las acciones de recoleccioacuten aislamiento identificacioacuten
caracterizacioacuten potenciacioacuten uso y preservacioacuten
Difundir la importancia estrateacutegica de conservacioacuten del medio ambiente
entre a comunidad cientiacutefica y la poblacioacuten en general
Preservar proteger mejorar y promover el uso sustentable de la riqueza
geneacutetica del paiacutes
El hongo Pycnoporus sanguineus produce metabolitos con potencial
farmaceacuteutico En Ameacuterica Latina Aacutefrica y Asia utilizan el hongo para coagular la
sangre eliminar verrugas en la piel y paraacutesitos intestinales ayudar con problemas
menopaacuteusicos y del vientre (Acosta 2016) Los cientiacuteficos del banco brasilentildeo
estaacuten intentando domesticar o producir en laboratorios el hongo Pycnoporus
sanguineus ya que tiene fines terapeacuteuticos por ejemplo sentildeala que la
especie Pycnoporus sanguineus es usada por indiacutegenas amazoacutenicos para tratar
uacutelceras y caacutencer Y agrega que si se lograse su cultivo artificial con cepas
vigorosas podriacutea servir en otros laboratorios para investigaciones de caraacutecter
quiacutemico y biotecnoloacutegico por sus propiedades farmacoloacutegicas (BBC 2015) La
definicioacuten de la produccioacuten anual de hongo fresco se realiza teniendo en cuenta las
poliacuteticas y estrategias concebidas dentro del Plan Nacional de Desarrollo del
Ecuador Entre las estrategias se establece el fomento a la produccioacuten para el
consumo interno mediante el apoyo financiero y teacutecnico a pequentildeos y medianos
productores y a las comunidades campesinas (SEMPLADES 2009) El costo de
cepas de Pycnoporus sanguineus no se encontroacute sin embargo el costo para otras
especies es de 150 USD por lo que tener conservada las cepas no solo seriacutea rentable
sino tambieacuten se deja abierto para futuras investigaciones
67
342 Ficha Pycnoporus sanguineus
68
69
343 Registro de la cepa Pycnoporus sanguineus
Codigo
Bacteria Hongo x
Denominacion de la cepa utilizada por el depositante
Si x No
Si No x
Si No x
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Humanos Animales Plantas
CEBA-T-PS-010116TIPO DE MICROORGANISMO
Nombre cientiacutefico
iquestConoce el tipo de cepa
iquestEl microorganismo alberga un plagravesmido natural
iquestSe manipulo geneacuteticamente al microorganismo
DESIGNACIOacuteN DE LA CEPA
Pycnoporus sanguineus
INFORMACIOacuteN RELATIVA
William Goacutemez
Ecuador
Napo Tena UTM 18 S 186563 9891708
1472016
Fuente
Paiacutes de origen
Provincia Ciudad si es posible latitud y longitud
Fecha de recoleccioacuten
5102016
Datos de muestreo
Aislamiento de la cepa
Provincia Ciudad donde fue aislado
Si no aisloacute la cepa siacutervase indicar a los cientiacuteficos o
laboratorios que lo hicieron
Aislado por
Imbabura Ibarra
Dr Julio Pineda
William GoacutemezRecolectado por
Fecha del aislamiento
Evaluacioacuten del riesgo
Grupo de riesgo
Patoacutegeno para
Temperatura 23 ordmC Tiempo de encuvacioacuten
iquestEste microorganismo sobrevive a la congelacioacuten Si x No
Nombre
Institucioacuten
Direccioacuten
Teleacutefono
Fecha
Firma
26 dias
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO
Meacutetodo usado para la identificacioacuten de la cepa Secuenciacioacuten ADN
Motivo del deposito (Aplicaciones biotecnologicas control de calidad etc) Conservacioacuten
INFORMACIOacuteN ADICIONAL
Requerieintos especiales (Luz gas etc)
Medio de cultivo Agar malta
1522017
IFORMACIOacuteN DE LA PERSONA QUE DEPOacuteSITA
William Goacutemez
CEBA
Tena 8-20 y Tungurahua
williamedissnyahooes
983000610
70
4 CONCLUSIONES
Se establecioacute un protocolo para el aislamiento identificacioacuten y caracterizacioacuten
del hongo nativo Pycnoporus spp aislado de la ciudad del Tena lo cual
representa un aporte al desarrollo cientiacutefico y tecnoloacutegico
Por primera vez se desarrolla un procedimiento para la conservacioacuten de la cepa
nativa ecuatoriana de Pycnoporus sanguineus por liofilizacioacuten meacutetodo que
garantiza la conservacioacuten de la especie por maacutes de 23 antildeos y su manejo de forma
sostenible generando valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana
Se establecioacute que el mejor medio para la produccioacuten de la cepa pura de
Pycnoporus sanguineus es el Agar Extracto de Malta con una velocidad de
crecimiento lineal de 385 mmdiacutea lo cual representa un aporte al desarrollo de
las tecnologiacuteas de produccioacuten fuacutengica
Se presenta una ficha y registro de la cepa Pycnoporus sanguineus lo cual
permitiraacute generar valor agregado a la biodiversidad fuacutengica ecuatoriana y
principalmente la conservacioacuten de la especie
5 RECOMENDACIONES
Se recomienda aislar identificar y caracterizar nuevas especies nativas del
geacutenero Pycnoporus spp que permita incrementar el patrimonio del banco de
recursos geneacuteticos microbianos (BRGM)
Desarrollar la tecnologiacutea de produccioacuten de cepas nativas en las escalas de banco
y piloto con la finalidad de consolidar el Know How con posibilidades de
patentar los procedimientos
Desarrollar la tecnologiacutea a escala de laboratorio para la produccioacuten de biomasa
de cuerpo fructiacutefero de Pycnoporus spp con fines a su aplicacioacuten en la industria
farmaceacuteutica y enzimaacutetica
71
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87
7 ANEXOS
Anexo 1 Procesos de extraccioacuten y amplificacioacuten de los productos de PCR
88
89
90
91
92
93
Anexo 2 Resultados anaacutelisis bromatoloacutegico Pycnoporus sanguineus
94
Anexo 3 Metabolitos producidos por las especies de Pycnoporus
Metabolito Especie Referencia
Lacasas P cinnabarinus P coccineus
P sanguineus
(Atteke y col 2013 Berrio Plou
Ballesteros Martiacutenez y Martiacutenez 2007
Camarero y col 2004 Camarero Ibarra
Martiacutenez y Martiacutenez 2005 ME Eugenio y
col 2010 Lu y col 2007b Machuca y
Ferraz 2001 Madhavi y Lele 2009
Munusamy y col 2008 Ramiacuterez-Cavazos y
col 2014 Sigoillot y col 2002 2004 Xu y
col 2000)
Peroxidasas extracelulares
(Lignin Versaacutetil y
Manganeso Peroxidasa)
P cinnabarinus P coccineus (Levasseur y col 2014 Machuca y Ferraz
2001)
Celulasas
(β-glucosidasas
Xilanasas)
P cinnabarinus P coccineus (Bey Berrin Poidevin y Sigoillot 2011
Machuca y Ferraz 2001 Sigoillot y col
2002)
Celobiosa deshidrogenasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col 2002)
Galactosidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara Hayashi y
Mitsutomi 1981)
DDMP P sanguineus (Teoh y col 2011)
Poliporina P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col 2003)
Cinabarina (3-fenoxacina) P sanguineus P cinnabarinus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Cruz Muntildeoz y col 2015a Dias
y Urban 2009 A Smacircnia y col 2003 E de
F A Smacircnia y col 1998)
O-acetyl-cinabarina P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Acosta-
Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez Adame
y col 2010 Dias y Urban 2009 Gocenoglu
y Pazarlioglu 2014)
Tramesanguina P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz Rodriacuteguez
Adame y col 2010)
Aacutecido cinabariacutenico P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Pycnoporina P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
95
Metabolito Especie Referencia
2-amino-fenoxazin-3-ona P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Pycnosanguina eacuteter
fenoxacina
P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol P cinnabarinus P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991 Dias y Urban
2009)
5-6- dihidroergosterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol peroacutexido P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings Pilawa
Theobald y Berger 2001 Stentelaire y col
2000)
96
Anexo 4 Principales compuestos bioactivos obtenidos de Pycnoporus spp
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Lacasas Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Eggert y col 1996 Machuca y
Ferraz 2001 Sigoillot y col 2002
Xu y col 2000)
P sanguineus (Ramiacuterez-Cavazos y col 2014)
Antiinflamatoria P cinnabarinus (Madhavi y Lele 2009)
Biorremediacioacuten de aguas
residuales
P coccineus (Berrio y col 2007 Jaouani
Guilleacuten Penninckx Martiacutenez y
Martiacutenez 2005)
P cinnabarinus (Munusamy y col 2008)
Degradacioacuten de colorantes
sinteacuteticos
P cinnabarinus (Camarero y col 2005)
P sanguineus (Atteke y col 2013 Lu y col
2007b)
Blanqueo de pulpa para papel P cinnabarinus (Camarero y col 2004 Sigoillot y
col 2004)
P sanguineus (ME Eugenio y col 2010)
Peroxidasas
totales
Enzima ligninoliacutetica P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Lignin
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Manganeso
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
Versaacutetil
peroxidasa
Enzima ligninoliacutetica P cinnabarinus (Levasseur y col 2014)
β-glucosidasas Enzimas celulasas P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
P cinnabarinus (Bey y col 2011)
Xilanasas Enzimas celulasas P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoillot y col
2002)
P coccineus (Machuca y Ferraz 2001)
Celobiosa
deshidrogenasa
Enzima oxidasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Sigoilloty col
2002)
Galactosidasa Enzima hidrolasa P cinnabarinus (Bey y col 2011 Ohtakara y col
1981)
DDMP Antifuacutengico P sanguineus (Teoh y col 2011)
97
Metabolito Usotipo Especie Referencia
Poliporina Anmicrobiano P sanguineus (Boumlse 1946 Henrique Rosa y col
2003)
Cinabarina (3-
fenoxacina)
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010
Cruz Muntildeoz y col 2015a)
Antimicrobiana P sanguineus (E de F A Smacircnia y col 1998)
Antiviral P sanguineus (A Smacircnia y col 2003)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
O-acetyl-
cinabarina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Aacutecido
cinabariacutenico
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991
Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Antibacterial P cinnabarinus (Gocenoglu y Pazarlioglu 2014)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Tramesanguina Pigmento P sanguineus (Acosta-Urdapilleta Alonso-Paz
Rodriacuteguez Adame y col 2010)
Pycnoporina Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
3-1 fenoxacina Pigmento P sanguineus (Cruz Muntildeoz y col 2015a)
2-amino-
fenoxazin-3-ona
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
pycnosanguin
eacuteter fenoxazina
Pigmento P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Antitumoral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antimocrobiano P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
Antiviral P cinnabarinus (Dias y Urban 2009)
5-6-
dihidroergostero
l
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Ergosterol
peroacutexido
Esterol P sanguineus (Achenbach y Blumm 1991)
Vainillina Saborizante aromatizante P cinnabarinus (Falconnier y col 1994 Krings y
col 2001 Stentelaire y col 2000)
98