Lección 3 1
LECCIÓN 3. Caracterización mediante marcadores moleculares - ADN.
Lección 3 2
• Analizan directamente la molécula de ADN.• Detectan ciertas variaciones en la secuencia de ADN.
Base púrica
Base pirimidínica
Desoxirribosa
Grupo fosfato
Puentes de hidrógeno
Nociones generales sobre Marcadores Moleculares -ADN
Lección 3 3
ORIGEN DEL POLIMORFISMO.• Cambios en la secuencia primaria de ADN.• Cambios en la secuencia de reconocimiento de un enzima de
restricción, o de anclaje de un cebador.• Inserciones o deleciones entre las secuencias de reconocimiento de
los enzimas de restricción, o de anclaje del cebador.
Nociones generales sobre Marcadores Moleculares –ADN (2)
Lección 3 4
PCR (Polymerase Chain Reaction): Replicación “exponencial”, en condiciones in vitro, de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias concretas de bases (iguales o diferentes), situadas en
cadenas opuestas.
La replicación del ADN
Dirección de Síntesis
El despegue de los MM-ADN: PCR
Lección 3 5
1 ciclo
2 ciclo
1. Desnaturalización
2. Unión del cebador
21 copias3. Elongación
n ciclos 2n copias22 copias
PCR: Fundamento de la técnica.
Lección 3 6
1. Amplificación de fragmentos.2. Separación por electroforesis de los fragmentos
amplificados.3. Tinción y visualización.
PCR (2): Metodología
Lección 3 7
1.Amplificación de fragmentos.
Ingredientes Equipamiento
•ADN molde•ADN polimerasa•Cebadores •dNTPS
PCR (3): Metodología (2)
Lección 3 8
2. Separación por electroforesis de los fragmentos amplificados.
Mezclado con tampón de
carga
Cargado del gel Separación por electroforesis
PCR (4): Metodología (3)
Lección 3 9
3. Tinción y visualización.Visualización con luz UV
PCR (5): Metodología (4)
Lección 3 10
–[ADN molde]
–[ADN polimerasa]
–[Cl2Mg]
–Condiciones de la amplificación
PCR (6): Factores que influyen
Lección 3 11
Clasificación Marcadores Moleculares -ADN
• Métodos no basados en la P.C.R.– R.F.L.P.
• Métodos basados en la P.C.R.– Utilizando cebadores arbitrarios o semiarbitarios
• M.A.A.P.• Intermicrosatélites o I.S.S.R.• A.F.L.P.
– Utilizando cebadores diseñados específicamente• Microsatélites• C.A.P.S.• S.C.A.R.
• Métodos basados en la secuenciación– Secuenciación del ADN.
• Microarrays o Matrices• Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
Lección 3 12
6,9
a
c
d
b
8,0 2,5
10,5
1,5
2,51,1
8,0 2,5
e
f
1,5 9
9,0 Kb
12,0 Kbaa bb ddcc
8,0 Kb6,9 Kb
10,5 Kb
1,5 Kb
e
b
cd
a
e
ee ff
R.F.L.P. (Botstein et al., 1980)Fundamento de la técnica
Lección 3 13
R.F.L.P. (2): Resultados
Lección 3 14
Cortar, desnaturalizar e hibridar
3m
3p
3p
3m
Sitios de restricción
Cromosomas paternos
Cromosomas maternos
Descendiente
Los RFLP tienen una herencia codominante
R.F.L.P. (3): Resultados (2)
Lección 3 15
1. Corte mediante enzimas de restricción.2. Separación por electroforesis.3. Transferencia a filtro.4. Hibridación con sonda “marcada”.5. Visualización de los fragmentos donde se ha producido
hibridación.
R.F.L.P. (4): Metodología
Lección 3 16
1. Corte mediante enzimas de restricción
5’3’
3’5’C T T A A G
G A A T T C
Corte
Enzima de restricción EcoRI
3’ 5’5’ 3’G
C T T A AA A T T C
Extremos cohesivos
G
R.F.L.P. (5): Metodología (2)
Lección 3 17
2. Separación por electroforesis
4. Hibridación con sonda
marcada con isótopo radiactivo (32P) o
digoxigenina5. Visualización de los fragmentos hibridados:
autorradiografía (32P) o quimioluminescencia (digoxigenina)
3. Transferencia a filtro (Southern)
esponjasolución tampón
gel de agarosa
bloque papel absorbentefiltro de nitrocelulosa
gel
filtro con ADN
R.F.L.P. (6): Metodología (3)
Lección 3 18
• Utilizan 1 cebador arbitrario de entre 5 y 20 pares de bases• Se amplifican secuencias al azar• Si el cebador hibrida en dos secuencias diana en cadenas opuestas y a una distancia
adecuada para que en cada ciclo de elongación se llegue de uno a otro, se amplificará el fragmento entre las 2 dianas
D
D
MAAP (Caetano-Anollés, 1994): Fundamento de la técnica.
Lección 3 19
M 1 2 3 4 5 6 7 8
800 pb
Cebador de 10 bases de longitud
MAAP: RAPD (Williams et al., 1990): Resultados
Lección 3 20
Cebador de 5-10 bases de longitud
MAAP: DAF (Caetano-Anollés et al., 1991)Resultados
Lección 3 21
SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism)Primers: 13 a 15 bases• Forward: 5’ Núcleo de 14 bases + 3 nt. selectivos 3’ Núcleo: 5’ 10 bases aleatóreas + CCGG 3’ Nucleótidos selectivos: Variándolos se obtiene una “familia de
primers”• Reverse: Estructura similar con variaciones: Núcleo: 5’ 10 bases aleatóreas diferentes a las del Forward +
AATT 3’• Reglas para la construcción de los primer Que no formen horquillas u otras estructuras secundarias Que contengan 40–50% de GC
MAAP: SRAP (Li and Quirós, 2001)
Lección 3 22
Resultados:Dianthus chinensis, Dianthus barbatus and Dianthus superbus(Caryophyllaceae) planta ornamentales
MAAP: SRAP (Li and Quirós, 2001)
Lección 3 23
Esta metodología está optimizada para estudios en los que cada U.B.C. está formada por varios individuos que en principio sean idénticos.Ej: U.B.C. = variedad comercial
• PASO 1: Ensayar un elevado número de cebadores y seleccionar los que proporcionen buena amplificación.
• PASO 2: Realizar una nueva extracción de ADN y realizar una nueva amplificación con los mismos cebadores.
La metodología propuesta analiza la reproducibilidad global en un estudio de caracterización con MAAP.
RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (Vidal et al. 1999)
Lección 3 24
• PASO 3: Para cada amplificación, realizar un conteo de bandas.Para que una banda sea considerada presente, debe estar al menos en 4 de los 5 individuos ( por eso el interés de contar con varios individuos idénticos por U.B.C.)
• PASO 4: De las dos repeticiones, elegir una como “referencia” y otra como “comparada”La repetición que presente mayor número de bandas será considerada como la “referencia”.La otra será la “comparada”.
RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (2)
Lección 3 25
• PASO 5: Determinar los siguientes parámetros.Se recomienda hacer los cálculos para cada U.B.C., y luego hallar
el valor medio.– Falsos Negativos (FN) %: Bandas NO visibles en la repetición
“comparada” y SI en la “referencia” con respecto al número total de bandas.
– Falsos Positivos (FP) %: Bandas NO visibles en la repetición “referencia” y SI en la “comparada” con respecto al número total de bandas.
– Reproducibilidad: R = 100 – FN – FP.• También se puede hacer el estudio para diferentes tipos de
bandas:– Por tamaño: Grandes/Intermedias/Pequeñas.– Por intensidad: Bien definidas/Débiles.
RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (3)
Lección 3 26
• Ej variedades de vid
RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (4)
Lección 3 27
CACACACACACACACA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
GTGTGTGTGTGTGTGT ACACACACACACACACACACACAC
CACACACACACACACA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
GTGTGTGTGTGTGTGT ACACACACACACACACACACACAC
producto PCRcebador con anclaje en 5’
NNN(CA)n
(AC)nNNN
(CA)nNN
NN(AC)n
producto PCRcebador con anclaje en 3’
ISSR (Zietkiewicz et al., 1994)Fundamento de la técnica
Lección 3 28
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
800 pb
ISSR (2): Resultados
Lección 3 29
Corte con 2 enzimas de restricción
AATAATTC
GT
GAATTCAATTCTTAAGTTAA
Unión de adaptadoresTTAA
TA
AATTCTGAATCTTAAATTCT
GAATTTAAGA
GAATTTAAGA
GAATCTTAAATTCT
AATTCT
Amplificación selectiva1er ciclo
TATAATTCAATGTTAA
Cebadores AATTCT GAAT
AFLP (Vos et al., 1995): Fundamento de la técnica
Lección 3 30
AFLP (2): Resultados
Lección 3 31
Electroforesis
186 pb182 pb
174 pb
Individuo C
Individuo A
A
Individuo B
CB
TGTGTGTGTGGTGTGTGTG
ACACACACACCACACACAC
GTGTGGTGTGTGTG
CACACCACACACAC
Microsatélites (SSR/STMS) (Tautz, 1989)Fundamento de la técnica
Lección 3 32
M ITA RUT ALV OHA SUP MAT
213 pb
192 pb184 pb
Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.
Microsatélites (2)Metodologías para la separación de fragmentos
Lección 3 33
Detección del tamaño de los fragmentos de ADN mediante un secuenciador automático de ADN.
Microsatélites (3)Metodologías para la separación de fragmentos (2)
Lección 3 34
Microsatélites (4)Resultados con secuenciador automático
Lección 3 35
Microsatélites (5)Resultados con secuenciador automático (2)
Lección 3 36
Microsatélites (6)Resultados con secuenciador automático (3)
Lección 3 37
• Base de datos del Instituto Agrario di San Michele all’Adige
http://meteo.iasma.it/genetica/gmc.html
Microsatélites (7)Bases de datos internacionales
Lección 3 38
• Swiss Vitis Microsatellite Database (SVMD)
http://www1.unine.ch/svmd/
Microsatélites (9)Bases de datos internacionales (3)
Lección 3 39
• Sistema de Identificación de Variedades de Vid Españolas mediante Microsatélites (SIVVEM)(Universidad Politécnica de Madrid)
http://www.sivvem.monbyte.com/sivvem.asp
Microsatélites (10)Bases de datos internacionales (4)
Lección 3 40
POSIBLE APLICACIÓN: Averiguar los parentales de un determinado clon.
No Cultivar identificatioLoc. 1 Loc. 1 Loc. 2 Loc. 2 Loc. 3 Loc. 3 Loc. 4 Loc. 4 Loc. 5 Loc. 5 Loc. 6 Loc. 64 Albarín Blanco 150 150 228 234 241 255 165 165 187 193 243 2491 Agudelo 130 150 224 228 237 255 151 165 187 193 245 249
41 Espadeiro 136 150 232 234 237 241 151 165 187 187 243 245
Para estimar la probalidad de que la hipótesis sea cierta, se aplica el procedimiento de la “máxima verosimilitud”.
Microsatélites (11)
Lección 3 41
• Se parte de un fragmento de ADN genómico o cloroplástico amplificado mediante PCR.
• Se somete a digestión mediante enzimas de restricción• Se revela el polimorfismo por electroforesis
Detección de híbridos.Análisis con ADN genómico
Análisis poblacionalADN cloroplástico
CAPS [PCR-RFLP] (Konieczny & Ausubel, 1993)
Lección 3 42
• Muy utilizado:– Identificación de variedades.– Análisis poblacionales.
• ADN cloroplástico muy conservado en el reino vegetal poca variación intraespecífica la combinación PCR-RFLP evita esta limitación.
• Razones de su éxito:– Primers para amplificación del ADN cloroplástico “universales”.– La técnica RFLP no requiere radiactividad.
PCR-RFLP de ADN cloroplástico
Lección 3 43
Combinación cebador – enzima: K1K2-TaqI
Patrones mayoritarios y variantes para diferentes combinaciones de
cebador y enzimaHaplotipos: Combinaciones de
patrones obtenidos en el estudio
PCR-RFLP de ADN cloroplástico (2)
Lección 3 44
Clonación
Secuenciación
También RFLP; AFLP
GTAGTTCCTGCATCAAGGAC GTAGTTCCTGRAPD
CATCAAGGACGTAGTTCCTGtcgaccaaCATCAAGGACagctggtt SCAR
Es un marcador muy específico a partir de otro que proporciona un elevado número de bandas
SCAR (Paran & Michelmore, 1993)
Lección 3 45
• Consiste en detectar la secuencia primaria del ADN.• Metodologías principales:
– Maxam-Gilbert (1977)– Sanger (1977). Es más fácilmente automatizable, y en la actualidad hay
secuenciadores totalmente automáticos.• Bases del proceso:
– Se parte de fragmentos de ADN obtenidos bien de una librería de genes o genoteca, o de una reacción de PCR.
– Cada uno de estos fragmentos se usa como una plantilla para generar un conjunto de sub-fragmentos que difieren entre si, en longitud, en una sola base.
– Los sub-fragmentos se separan mediante electroforesis.– Se identifica la base que queda al final de cada sub-fragmento porque
previamente se ha teñido con fluorocromos.– Para secuenciar determinadas partes del genoma es necesario ensamblar varios
fragmentos.
Secuenciación del ADN
Lección 3 46
3’CTGATCGCGTGGTACACTGTCATCTGTCT5’GACTAG5’GACTAGC5’GACTAGCGC5’GACTAGCGCAGC5’GACTAGCGCA5’GACTAGCGCAG5’GACTAGCGCAGCA5’GACTAGCG5’GACTAGCGCACCAT
5’GACTAG5’GACTAGC
5’GACTAGCGC
5’GACTAGCGCAGC
5’GACTAGCGCA5’GACTAGCGCAC
5’GACTAGCGCAGCA
5’GACTAGCG
5’GACTAGCGCAGCAT
http://www.genome.gov/19519278#al-3 (How to sequence a human genome)
Diagrama del metodo SANGER.Secuenciación del ADN (2).
Lección 3 47
¿Y que hacemos con los que nos da el secuenciador?
Lección 3 48
Alineamiento múltiple
Comparación con bases de datos
Datos de secuenciación Ensamblado secuenciasADN Traducción a proteína
Comparación con bases de datos
Alineamiento con Proteínas similares
Características proteínas.Deducción de conclusiones
Los fundamentos de la bioinformática
Reconstrucción filogenética …
¿Y que hacemos con los que nos da el secuenciador? (2)
Lección 3 49
• EST (Expressed Sequence Tags)• ITS (Internal Transcriber Spacer)• Genes que codifican para el RNA ribosómico
– La taxonomía de las bacterias está basada en el gen 16S DNA
¿Qué secuenciar?
Lección 3 50
• Secuencias obtenidas a partir de ADN complementarios de diversos organismos, que representan por tanto fragmentos de genes que se están expresando activamente.
• Los EST se obtienen a partir de genotecas de ADN complementario (ADNc) obtenidos a partir de un ARNm.
Transcriptasa inversa
Degradación de ARNmSíntesis de la segunda cadena de ADN
GUACU AGUAGU ARNm
CATGAGUACU AGUAGU
TCATCAARNmADNc
CATGA TCATCAGTACT AGTAGT ADN duplexo
E.S.T. (Craig Venter,1991)
Lección 3 51
• El ADNc se secuencia de manera total o parcial dando origen al EST.
– Puede secuenciarse el extremo 5’: Se secuencia la parte codificante del gen– Puede secuenciarse el extremo 3’: Con frecuencia esto conlleva secuenciar
regiones no codificantes, pero de mayor variabilidad• Son secuencias cortas (10-600 bp) y de poca calidad, ya que la
secuencia corresponde a una única lectura de una de las cadenas (los errores incluyen no solo cambios de bases, sino inserciones y deleciones).
E.S.T. (2)
Lección 3 52
Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal– Estudios de diversidad genética.– Estudios de evolución genéticaSu mayor utilidad es que permite comparar una secuencia problema
para determinar:- Si es una región codificante- Si existe “splicing”* alternativo - Si existen posibles homólogos en otros organismos.
Las secuencias EST son fáciles de obtener, por lo que representan en la actualidad más de la mitad de las entradas del GenBank/EMBL,
*Es un proceso post-transcripcional de corte y empalme de ARN
E.S.T. (3)
Lección 3 53
• Es la región espaciadora interna del ADN ribosómico nuclear (18S-26S)• Existen 2 espaciadores en esta región: ITS-1 e ITS-2
18S rADN 5.8S rADN 26S rADNITS1 ITS2
El análisis conjunto de ambas regiones proporciona árboles filogenéticos con mejor resolución y más consistentes que cuando se utiliza una sola de las regiones ITS
I.T.S.
Lección 3 54
Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal– Estudios filogenéticos.– Han demostrado su utilidad para aclarar la filogenia en taxa de difícil
clasificación.– Se ha demostrado en algunos casos que tiene utilidad a niveles
taxonómicos infraespecíficos.
Aplicación en caracterización de recursos genéticos bacterianos.– Sirven para la identificación precisa de las cepas y para la descripción
de nuevas especies.Los genes que codifican para el ARN ribosómico se encuentran en todos
los organismos y están lo suficientemente conservados para tener validez en el estudio de relaciones evolutivas.
I.T.S. (2)
Lección 3 55
FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA• Son pequeños soportes, generalmente portaobjetos de vidrio o
membranas de nylon donde se fijan de manera ordenada fragmentos de “ADN diana”.
• En las propias matrices se produce la hibridación de pequeñas sondas o trozos de ADN (generalmente ADNc), que están marcadas con fluorescencia.– La hibridación se produce donde haya complementariedad de
bases.
Microarrays, matrices, arreglos o “chips”
Lección 3 56
Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal.– Identificación de secuencias génicas o de mutación génica (por
ejemplo un gen disfuncional frente a otro normal)– Determinación del nivel de expresión de los genes.– Abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico– Detección de SNP– Primera caracterización rápida del germoplasma– Construcción de mapas genéticos– Marcadores en mejora
Microarrays, matrices, arreglos o “chips” (2)
Lección 3 57
Microarrays, matrices, arreglos o “chips” (3)
Ejemplo de visualización de un Microarray.– Verde: Representa los puntos donde se hibridó
el genotipo cuyo ADN “se tiñó de verde”– Rojo: Representa los puntos donde se hibridó el
genotipo cuyo ADN “se tiñó de rojo”– Amarillo: Representa los puntos donde se
hibridaron ambos genotipos.– Negro: Representa los puntos donde no hubo
ningún tipo de hibridación.
Lección 3 58
Se trata de sustituciones nucleotídicas, que ocurren con una frecuencia relativamente alta en el genoma.
Ej: Maíz
Utilidad: Detectan el nivel de polimorfismo más elemental que existe. De gran interés para:
• Marcadores de caracteres de interés agronómico.• Identificación de variedades.
SNPs
Lección 3 59
Características MM-ADN
Puntos fuertes Puntos débiles
RFLP•Codominante•Reproducibilidad alta
•Complejidad técnica
MAAP •Simplicidad•Reproducibilidad baja•Dominante
ISSR•Simplicidad•Mejor reproducibilidad
•Dominante
AFLP •Polimorfismo muy alto•Dominante•Complejidad
STMS•Codominante•Polimorfismo muy alto•Reproducibilidad alta
•Diseño de cebadores exige secuenciación
Lección 3 60
Características MM-ADN (2)
Puntos fuertes Puntos débiles
SNP•Codominante•Altamente discriminante
•Difícil de poner a punto para un taxon dado
Secuenciación de diversos fragmentos
•Reproducibilidad muy alta•Máxima información (interesante para estudios filogenéticos)
•Complejidad técnica (contratar el servicio)•Costos elevados
Microarrays•Alto rendimiento•Exploración del genoma entero
•Precisa información sobre secuencias génicas (ADNc)•Complejidad técnica
DArT
•No requiere información sobre secuencias génicas•Alto rendimiento•Detecta cambios en una sola base
•Marcador dominante•Complejidad técnica
Lección 3 61
A A A A A A A AB B B B B B B B
NNNN S S S S
S SN N
alta baja
Diagrama para la selección de la técnica molecular más adecuada (2).
RAPD RAPDRAPD RAPD
SC-PCRSC-PCR
PCR-RFLPPCR-RFLP
PCR-RFLPAFLP AFLPAFLP
AFLPAFLP
AFLPAFLP
STMSSTMS STMS
STMS
STMS STMS STMSSTMS STMS STMS
* recursosdisponibles
nivel de variabilidad
primers
t limit
*
RFLP
RFLP
Lección 3 62