Las plaquetas median la destrucción de parásitos de malaria intraeritrocíticos y median la supervivencia a la infección.
Brendan J. McMorranTansania, Australia.
SCIENCE VOL 323 6 FEBRERO 2009
PRESENTA:
Edgar L. Martínez Salazar. Estudiante de Medicina IX semestre Universidad de Antioquia.
CONTENIDO
• Introducción• Artículo• Objetivo• Metodología• Resultados• Conclusiones
• Preguntas y discusión.
OBJETIVO• Explorar el papel plaquetario en el curso de la infección por
malaria en un modelo murino, P. chabaudi e Invitro usando el cultivo de P. falciparum humano.
• HIPÓTESIS• La primera infección por malaria mostraría una trombocitopenia
asociada a una respuesta inmune adaptativa mediada por plaquetas, mientras que la inmunidad por malaria que se adquiere en sitios endémicos podría estar explicada por el secuestro plaquetario a la vasculatura y estaría asociada más a complicaciones.
INTRODUCCIÓN• La inmunidad adaptativa • Respuesta inmune innata Limita el crecimiento del parasito
en el GR supervivencia• Primeros años de vida parasitemia/gravedad clínica.
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INTRODUCCIÓN• Primera barrera: GR• Trombocitopenia P. falciparum, P. vivax y P. chabaudi.• Trombocitopenia Gravedad y Parasitemia • Adhesión plaquetaria GRP• Plaquetas Enfermedades Infecciosas.
http://3.bp.blogspot.com/_8bm6OtHuayY/SpiBNNE06bI/AAAAAAAAANM/QqW-D3ZjaF8/s1600-h/plaquetas_www.arauto.uminho.pt.jpg
INTRODUCCIÓN
METODOLOGÍA
C57BL/6 fueron infectados con 150 ul P. chaubadi
Al alcanzar 5-15% Parasitemia., fueron cultivadas por punción retroorbital y diluidas en HEM precalentado.
Inocularon 100ul IV de GRP en ratones para experimento.
Recogen sangre de punción cardíaca y analizan
A las cohortes se les suministró ASA (25 mg/kg V.O.) o vehículo (salino) desde el día antes de la infección hasta 10 días después.
Infección experimental con P. chabaudi en los ratones.
METODOLOGÍACultivo de P. falciparum
Cepa de P. falciparum 3D7 Se mantuvo parasitemia entre 1 y 10% en eritrocitos AB+ humanos en atmosfera de 1% O2/5% CO2
Suplementó con: -1X glutamax, 0.2%- Albumax 4% combinada con suero
humano AB+- 10 mM D-glucose, 25 μg/mg- Gentamicina- 6 mM HEPES- Hipoxantina0.2 mM
METODOLOGÍAPreparación de plaquetas humanas lavadas.
Sangre humana
Centrifugación e Incubación 37 C°
Plasma rico en plaquetas es separado de otros componentes sanguíneos por centrifugación.
Las plaquetas se sedimentaron (1700g centrifugación, 7 min) y se resuspendieron en buffer de lavado
Nuevamente se sedimentaron (1500g 7 min) y resuspendieron en buffer.
Análisis plaquetario
Se confirmó la integridad y funcionalidad plaquetaria
Incubado por 15 minutos
Incubado por 15 minutos
METODOLOGÍAPlatelet incubation with P. falciparum cultures
Las plaquetas fueron pre-tratadas con componentes inhibitorios, antes de adicionarla a los parasitos.
Sincronización de parásitos en el estadio de trofozoito. Y diluido en sangre no infectada parasitemia de 0,5%
Las plaquetas fueron adicionadas al parasito en 1/5 del volumen de cultivo final
Un volumen equivalente de Buffer fue adicionado en cultivos de control,
METODOLOGÍATinción TUNEL en extendido de sangre periferica
Extendido de sangre
Se incubaron las laminas con mezcla enzimática etiquetada dUTP
4 h a 37°C
Marca con anticuerpos anti-BrdU
Lavado
Se incuban las laminas por 30 minutos en la oscuridad con biotina anti CD41 humano o anti CD41 raton
Evaluación microscópica x1000
Al menos se contaron 100 parasitos por extendido. Y fueron identificados como fragmentos de DNA si se teñian para TUNEL.
METODOLOGÍA
• Se indujo lisis con Fenilhuidrazina.• A los ratones se les injecto dos veces clorhidrato de fenilhidrazina
(PH) 0.06 mg/g • En dos días consecutivos con una diferecia de 24 h• Los animales fueron sacrificados en el día 7 despúes de la
primerea inyección y sus bazos fueron pesados.
Evaluación de cinética eritroidea
METODOLOGÍA• Immune status of Mpl-/- and C57BL/6 mice during P.
chabaudi infection.• Mice were infected with 1x104 infected RBC, cohorts
sacrificed at indicated days post infection and analysed for T-cells (CD3, CD3 and CD4, or CD4 and CD8 positive) and B-cells (B220 positive) by immunostaining and flow cytometry
METODOLOGÍACitometría de flujo de GR de ratón adheridos a plaquetas.
Citometría de flujo de GR humanos adheridos a plaquetas.
Análisis inmunológico de ratones infectados.
Análisis de citoquinas en plasma.
METODOLOGÍA
• % de crecimiento parasitario/función plaquetaria• Modelo de P. falciparum• Incubación de las plaquetas en antagonistas específicos• Agregamos diferentes componentes.• Para determinar los requirimientos de ADP un importante
regulador de la actividad plaquetaria, nosotros incubamos los cultivos de P. Falciparum+plaquetas con ADPasa, to remove estracellular ADP from culture medium.
RESULTADOS
(Mpl -/-)
10 veces menos plaquetas
C57BL/6
C57BL/6
MUERTE MUERTEP. chabaudi
P < 0.0001
RESULTADOS
• 5% C57BL/6• 50% Mpl −/−
• 20% C57BL/6• 100% de Mpl −/−
MUERTES
RESULTADOS• El número de plaquetas disminuyó concomitantemente con la
aparición de parásitos en la circulación periférica en ambos grupos.
(Mpl -/-) C57BL/6
RESULTADOSLa cinética eritropoyetica
RESULTADOS• Durante la inducción de lisis experimental tampoco se
observaron cambios en la cinetica eritrocitaria entre las cepas.
• Solución salina.• Clorhidrato de fenilhidrazina.
RESULTADOS
No hubo diferencias
RESULTADOS• ASA Inhibe Cicloxigenasa 1 y 2 Disminución de
tromboxano A2 Disminución de activación plaquetaria
• BAJA AGREGACIÓN
http://static.tantasalute.it/625X0/www/tantasalute/it/img/aspirina-compresse.jpg
RESULTADOS
RESULTADOS• Inhibición concentración dependiente.
Relación de cultivos P. falciparum/plaquetas
Reducción en esquizontes maduros en 5 horas y nuevos anillos en 21 a 29 horas
RESULTADOS• La activación plaquetaria mediada por ADP es mediada por
dos receptores metabothrophicpuronergic, P2Y1 y P2Y12. El antagonismo de P2Y1 abolio la actividad destructiva de la plaqueta sobre el parasito, pero no ocurrio al bloquear P2Y12.
RESULTADOS
1. Adenilciclasa activa PGE1Suprime actividad plaquetaria Suprime función inhibitora del crecimiento
2. La exposición a NO tuvo un efecto parecido.
3. Crecimiento parasitario normal plaquetas y ADPasa.
4. La activación plaquetaria mediada por ADP es mediada por dos receptores. El antagonismo de P2Y1 abolio la actividad destructiva de la plaqueta sobre el parasito, pero no ocurrio al bloquear P2Y12.
RESULTADOS• AspirinaP. chabaudi en los ratones Previno la inhibición del
crecimiento parasitario mediado por plaquetas• Aproximación clínica:• Voluntario donador de plaquetastomo aspirina oral 2 veces al dia
(4,2mg/kg) por una semana antes de donar la sangre para la purificación de plaquetas.
• Estas plaquetas fueron incapaces de inhibir el crecimiento de P. falciparum
RESULTADOS• Ratones infectados Plaquetas unidas a GRP
DOBLE
RESULTADOS• El CD41 (Ag plaquetario) en la superficie de GRP sirvio como
un marcador de la adhesión plaquetaria.• Los GRP se marcaron 3 veces más para CD41 comparado a los
GR no parasitados.
¿?
RESULTADOS• Humanos infectados: El numero de GRP unido a plaquetas
humanas fue dos veces y los GRP marcados con CD41 fueron el doble.
DOBLE
DOBLE
RESULTADOSEtapa tardía de infección:• Estadio de anillo: Flecha verde, teñidos solo con Hoechst.• Merozoitos extracelulares: Se tiñen con TUNEL Y Hoeschst Anticipa que el
merozoito morira.
RESULTADOS• En los ratones con bajas parasitemias (día 7), la coloración de
parasitos intraeritrociticos con TUNEL fue evidente, indicativo de la muerte de parasitos intraeritrociticos.
RESULTADOS• Se observaron 2 veces más muertes de parásitos
intraeritrociticos en ratones C57BL/6 que en Mpl -/-.
DOBLE
RESULTADOS• Diferencia entre las parasitemias de las dos cepas durante el
tiempo, mostrandose más altas en los días 9 y 10 para Mpl-/-.
RESULTADOS
• Parasitos intracelulares coloreados con TUNEL fueron tambien observados en cultivos de P. falciparum.
3 veces
marcado NO marcado
CONCLUSIONES• Las plaquetas median inihbición del crecimiento de cultivos de Plasmodium falciparum en GR• La mayoría de los parasitos observados durante la inhibición del crecimiento parasitario mediado por plaquetas
fueron trofozoitos y esquizontes maduros. La reducción en esquizontes maduros en 5 horas y nuevos anillos en 21 a 29 horas sugiere que las plaquetas estuvieron inibiendo el desarrollo de maduración de los parasitos.
• El crecimiento de P. falciparum es inhibido por plaquetas en una concentracion dependiente y mecanismo de activación-dependiente, que requiere ADP y activación a través del receptor P2Y1.
• La inhibición farmacológica de la función plaquetaria incrementa la suceptibilidad a la infección por malaria en los ratones aunque otros efectos indirectos de la aspirina no pueden ser excluidos.
• El mantenimiento de concentraciones altas intracelulares de ADM y GMP son mecanismos claves en suprimir la activación plaquetaria.
• La aspirina puede ser potencialmente peligrosa en infecciones por malaria.• Las plaquetas se unen selectivamente a los GRP.• La desstrucción del parasito mediada por plaquetas, tiene impacto en la parasitemia, lo que resulta en parasitemia
mayores para ratones Mpl -/- , lo que puede explicar su mayor suceptibilidad. • El mayor numero de parastios intraeritrociticos muertos en presencia de un numero normal de plaquetas in vitro e
invivo implica que las plaquetas destruyen directamente los parasitos de malaria.• La alta mortalidad en los ratones deficientes en plaquetas y la destrucción directa de P. falciparum por plaquetas
humanas indica que las plaquetas son importantes en el control de la infección por malaria. La trombocitopenia ocurre tempranamente en la infección en ambos humanos y ratones, antes de las formas graves de la enfermedad se desarrollen. Por lo tanto la principal efecto protector de las plaquetas podría ser en la fase temprana de la enfermedad. La modulación del crecimiento del parasito por plaquetas podría amortiguar la tasa de crecimiento del parasito y permitir el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. Este hallazgo es adicional al papel bien establecido de las plaquetas en la malaria cerebral. Nosotros hemos mostrado que la inhibición de la activación plaquetaria deroga el efecto protector, lo cual puede explicar el efecto deleterio de la aspirina puede tener en el desenlace de la malaria.