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Laboratorio en
Alergia-Inmunología
Dr. Tomás Velarde DomínguezAlergia e Inmunología Clínica
Medicina Interna
Octubre 2014.
Los determinantes de la salud
11%
49%
19%
27%
Contribución potencial a la reducción de la
mortalidad
Afectación actual de los gastos para la salud en USA
90%
8%
SISTEMA SANITARIO
ESTILO DE VIDA
AMBIENTE
BIOLOGÍA HUMANA
DEVER GEA An Epidemiological Model for Health Policy Analysis, 1976
CLAVES DE LA MEDICINA PERSONALIZADA
La persona adecuada
Determinar si una persona puede beneficiarse realmente de una prueba mejora el manejo de la enfermedad y permite reducir los costos asociados al proceso sanitario.
El exámen adecuado
Prescribir un exámen que no va a aportar valor al paciente supone dilatar los tiempos de la enfermedad e inducir a confusión al médico, con el consiguiente incremento de los costos sanitarios.
√ √
La interpretación adecuada
Una correcta y completa información permite sacar el máximo rendimiento al exámen y ayudar al médico con un elemento diagnóstico de gran valor al decidir cual es el tratamiento mejor de la enfermedad.
Importancia del laboratorio en el área de Alergia e Inmunología
Papel primordial que se incrementa día a día.
Pacientes hospitalizados y ambulatorios.
Mejor conocimiento de la patogénesis.
Biomarcadores diagnósticos, pronósticos y terapéuticos.
Incrementan procedimientos diagnósticos de rutina.
“Estándares de oro”.
MEDICINA PERSONALIZADA.
¿EL LABORATORIO ES UN AUXILIAR REAL?
FENOTIPOS ENDOTIPOS
Conceptos:
SensibilidadEspecificidadValor predictivo
positivoValor predictivo
negativo
Pacientes enfermos
Pacientes sanos
Prueba 1
Pacientes enfermos
Pacientes sanos
Sensibilidad alta
Especificidad alta
Prueba 2Pacientes todos enfermos
Falsamenteasignados
Sensibilidad alta
Especificidad baja
Pacientes enfermos
Prueba 3
Pacientes sanos
Sensibilidad bajaFalsamenteasignados Especificidad alta
Prueba Enfermo Sano
Positiva A B
Negativa C D
Total enfermosA+C
Total sanosB+D
PRESENCIA DE ENFERMEDAD
SENSIBILIDAD = A / A+C
ESPECIFICIDAD= D / B+D
Si la prueba es positiva
¿Realmente esta enfermo?
Valor predictivo positivo.- Posibilidad de padecer la enfermedad con un resultado positivo
Valor predictivo negativo.- Posibilidad de estar sano con un resultado negativo
Prueba Enfermo Sano
Positiva A B
Negativa C D
Total enfermosA+C
Total sanosB+D
PRESENCIA DE ENFERMEDAD
VPP = A/ A+B
VPN = D/ C+DLimitante es que dependen de la prevalencia de la enfermedad
Biometría hemática
Datos generales Cuenta diferencial
Valores absolutos
8,000 mmc
Valores relativos
> 300 eosinofilia sanguínea >10,000 linfocitosis< 2000 linfopenia
> 6,000 neutrofilia< 1500 neutropenia
Recuento leucocitario en la infancia.
Comportamiento a través del tiempo
Gpo. Etario Leucocitos % neutrofilos % Linfocitos
recien nacido 18,000 60 30
1 año 12,000 30 60
2 - 5 años 10,000 40 50
≥ 6 años 8,000 50 40
recien nacido 1 año 2 - 5 años ≥ 6 años0
10
20
30
40
50
60
70
% neutrofilos
% Linfocitos
Otros estudios auxiliares….
< 4% es positivo en infantes.N.A.R.E.S. (Rinitis no alérgica eosinofílicaB.E.A.R.S. (Rinitis no alérgica con eosinofilia nasal y sanguínea)
Reactante de fase aguda
Inmunodeficiencia humoral más frecuente : IgA ( 1/700 nacimientos)
Elevación > 2 desviaciones estándar IgE sugiere atopia
> 5 UI/ml en dos determinaciones : Deficiencia IgE
Célula presentadora de antígeno
Linfocito Th 0
TCR
α▬
β
CD 3
CD 4
CD 40 L CD 40 Linfocito
B
yyyyy IgG
IgM
IgE
IgAIgD
IL-13
IL-4
IL-5
Antígeno
CD 20
Cuadro clínico de Inmunodeficiencia combinada severa
TREC’s (Medición cuantitativa de los círculos de
ruptura del receptor de células T)
1 Millón de pruebas
14 casos de SICD
6 casos variantes SICD
40 niños con linfopenia de células T
Biomarcadores en Inmunodeficiencia Combinada Severa
Inmunodeficiencia común variable
20 – 40 años de edad
6 – 8 años en establecer el diagnóstico
Infecciones recurrentes
Autoinmunidad
Enfermedades pulmonares crónicas
Enfermedad inflamatoria intestinal (CUCI)
Granulomatosis sistémica
Hiperplasia linfoide maligna
Medición cualitativa de anticuerpos
Respuesta Postvacunación
IgG < 400 mg/dl
IgG < 200 mg/dl = Tratamiento con Inmunoglobulinas IV
PERFIL DE INMUNOGLOBULINAS
Respuesta inmune primaria1-2 semanas post-exposición al antígeno.
Primera fase IgM y después IgG
Respuesta inmune secundaria
Enérgica , inmediata y mediada por IgG
El papel del especialista en Alergología, bajo el conocimiento actual, es establecer el riesgo potencial de enfermedad alérgica, situación difícil de determinar, y que requiere un continuo entrenamiento y años de experiencia clínica.
Dr. Tomás Velarde Domínguez.
Tie
mp
o
RIESGO
Severidad de los síntomas (afección en calidad de vida)
Detección precoz de la enfermedad alérgica…
No sensibilizado
IgE normal IgE elevada Sensibilizado
Piel-digestivo-Respiratorio(Marcha Alérgica)
La marcha alérgica…..
IgE IgE IgE IgE IgE
Eccema
Dermatitis atópica
Trastornos gastrointestinales Sibilancias
Otitis mediaPoliposis nasal
RinitisRespirador oral
Asma
Dermatitis atópica persistenteProblemas respiratorios
mixtos
Cuantificación de IgE total
Niveles son ng/ml y se expresan en kU/L
UI = 2.4 ng
Estricto control genético
Varían con la edad
Influencias ambientales
Parasitosis
Exposición alérgica, tabaquismo, virosis, exposición a diesel
Elevación cuando están por arriba del percentil 95 para la edad
No significa alergia
Niveles muy elevados indican polisensibilidad o enfermedad alérgica severa
20-30% alérgico tiene IgE total normal
Marcadores en asma
Periostatina (promueve eosinofilia)
IL-5 IL-13 IgE total IgE específica
Alergeno Componentes Comentarios
Cacahuate Ara h1 Ara h 2 Ara h 3
Responsable de la sensibilización inicial
Ara h 8Ara h 2
Marcador de tolerancia ( aislado) Reducción en los requerimientos del reto oral
Huevo Gal d 1 Resistencia al calor
Gal d 2 OvoalbúminaModelo matemático: IgG/ IgG4 vs Gal d 1 + Gal d 2 = Alergia a huevo
Soya Gly m 4 Predictor de alergia
Carne res Tri a 19 Alta sensibilidad y especificidad
Veneno abeja
Api m 1 Fosfolipasa A 2
Veneno avispa
Ves v 5 Ves v 1 Combinación de ambos eleva la sensibilidad
1972RAST
(RADIOALERGOABSORBENCIAPRICK TEST
INTRADÈRMICA
RETO DIRECTO
TURBO RASTTecnologías Agilent, Santa Clara,
California
IMMULITESiemens Diagnóstico Médico,
Tarrytown, Nueva York
IMMUNOCAPPhadia, Uppsala, Suecia
PRUEBAS IN VIVO
In vivo vs In vitro (???)
No existe prueba estándar de oro para el diagnóstico a alergia por aeroalergenos.
Prueba alergia a alimentos y medicamentos: DOBLE CIEGO PLACEBO CONTROLADO
consume tiempo y riesgo de reacciones severas y graves.
Pruebas in vivo son más sensibles.
Pruebas in vitro son más específicas.
Pruebas in vitro
IgE específica
TEST LIBERACIÒN HISTAMINA
DEGRANULACIÒN ÒPTICA BASÒFILOS
MICROARRAYISOTÒPICAS
ELISA
FLUORESCEINA
QUIMIOLUMINISCENCIA
Inmunoensayo marcado-Antígeno- Anticuerpo- Analito
Depende del tipo de marca es la denominación de origen:
FLUROINMUNOENSAYO
RADIOINMUNOENSAYO
ENZIMOINMUNOENSAYO
QUIMIOINMUNOENSAYO
IMMUNOCAP
IMMULITE(ENZIMOQUIMIOINMUNOENSAYO)
Base del IMMUNOCAP
Unidades de masa arbitraria
Unidades internacionales de kilo de anticuerpos específicos por unidad de volúmen de la muestra (kUa/L)
1 UI = 2.42 mg s-IgE
Sistema de clases I-VI es obsoleto.
No son compatibles las técnicas entre si.
Der p1Der p 2
Partículas de excremento 5-10 micras
Potente alergeno
Inducen hipersensibilidad
¿Cuáles ALERGENOS probar?
RASTTURBO-RASTIMMUNOLITEIMMUNOCAP
Prick testIntradérmicasContactoProvocación
Estigmas típicos
AntecedentesSíntomas
DIAGNÓSTICO DE SENSIBILIZACIÓN ALÉRGICA ESPECÍFICA..
Anamnesis Exploración
Pruebas in vivo Pruebas in vitro
s- IgE = SENSIBILIZACIÓN
Características Prick test Immulite Immunocap Liberación mediadores
Sensibilidad ALTA ALTA MUY ALTA BAJA
Especificidad VARIABLE ALTA ALTA BAJA
Costo $ $$ $$$ $$$
Influido por medicamentos
SI NO NO SI
Influido por síntomas SI NO NO NO
Correlación con pruebas de provocación
BUENA BUENA BUENA POBRE
Eficiencia comparativaEnfoques . Laboratorio en Alergia . Dr Carlos D.Crisci 2011
S
SS
IgE
Identificar, aislar y purificar múltiples alérgenos.Técnicas de DNA recombinante (Nanotecnología)
Micromatrices ( microarrays)
Ello permite hablar de:
DIAGNÓSTICO MOLECULAR O DIAGNÓSTICO POR COMPONENTES (component-resolved-diagnosis CRD)
Interesantes expectativas.
Miniaturización del diagnóstico en Alergia.
Sueño de conocer la especificidad molecular IgE en cada paciente.
Diagnóstico refinado.
Múltiples perfiles de sensibilización.
Predecir reacciones severas y la evolución de las mismas.
Inmunoterapia más precisa
Dr. Blakely1893
Prueba cutánea
Von Pirquet1906
Toxina Caballo
Sir Henry DaleHistamina 1910
Dr Leonard Noon1910
Vacunas hiposensibilizantes
1966IgE
Ishizaka / Johansson
1908 Mantoux
1921 primer extracto estandarizado
1924Lewis y Grant
pruebas por punción
1970Pepys modifica la prueba cutánea
1967Pharmacia
1970Phadebast amylase
test
1971Allergon
B
1972Phadeba
st IgE test
1974Phadebast
Rast(IgEs)
1976Pharmacia DiagnosticIgE PRIST
1981Phadezym RAST
1986Wallac OyPhadiatop
1989Immunocap
1990Procordia /
Kaby
1995Fusión con
Upjohn 1995
Immunocap100
AutomáticoPharmacia &
Upjohn Diagnostic
1990Procordia /
Kaby
1997Varelisa Elias
Autoinmunidad Immunocap
2000Micromatices
2009ISAC
2010Phadia 2500 5000
2011
Quien tiene mayor posibilidad de alergia a alimentos
< 3 años
3 a 5 años
Adolescentes
Adultos
Ancianos
10% menores de 3 años
La más frecuente es la proteína de leche de vaca.
1% se presenta en adultos
No existen datos fidedignos en nuestro país ( México)
¿Considera dentro de la serología la posibilidad de reacciones cruzadas?
Huevo con leche
Leche con gluten
Plátano con huevo
Leche con plátano
Todas
No existe reacción cruzada
50% de los alérgicos al glúten tiene reacción cruzada con proteínas de leche de vaca (caseína)
Nomenclatura de los alérgenos ( Marsh,Lowestein.,Platts-Mills,1980)
Primeras 3 letras del género, primera de la especie y No. de identificación:
Felis domesticus 1: Fel d 1Ambrosia artemisiflora 1: Amb a 1
Isoalergeno: Tamaño, f, y > 67% secuencia a.a. Ejem: Amb a 1. 01
Isoforma: > 97% homología secuencial: Ejem: Amb a 1.01 01, Amb a 1.01 02
Epítope 1
Epítope 2
Sitio de corte enzimático
Epítope 1
Epítope 2
Secuenciales Conformacionales
La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.
Epítope 1 Epítope 2
La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.
La leche de vaca Centeno Quinoa
alfa y beta-caseína Cebada Levadura
Casomorfina El trigo de Polonia Tapioca
Leche Butyrophilin Alforfón Avena
Queso Americano Sorgo Café
Chocolate Mijo Maíz
Sésamo Escanda Arroz
Cáñamo Amaranto Papa
18 alimentos que reaccionan de forma cruzada con el gluten
Tipo I Dependiente IgE:
Anafilaxia y degranulación de
basóflosTipo II
REACCIÓN CITOTÓXICA
TIPOIII
SÍNDROME DE HEINERAnemia por déficit hierroNo crecimientoBroncoespasmoSangrado de tubo digestivo Hemorragia pulmonarHemosiderosisPrecipitinas a Leche
TIPO IV
Atrofia de vellosidades
Gal d 4 (lizosima
Gal d 1 Alta estabilidad térmica , difícil desnaturalizar, 11% proteína de la clara
Gal d 2 54% proteína clara. Resistente a la digestión por la pepsina a pH 1.2, lábil al calor y se desnaturaliza a 90 grados
Gal d 3 Ovotransferrina 12% clara, lábil al calor a 95 grados por 15 min.
Gal d 4 3.4% clara termolábil a 80 grados, resistente a pepsinas
Gal d 5 14% proteínas de la yema , relacionado s. ave-huevo, cruza con OVOTRANSFERRINA, termolábil a 90 grados 30 min.
Gal d 6 resiste calor, lábil a pepsina
Gal d 2 Ovoalbúmina
Gal d 1
(ovomucoide)
Gal d 3
Ovotransferrin
a
Gal d 5 alfalivetina
Gal d 6 (Vitelogenina)
Alergeno
Literatura experimental
Secuencia Pruebas Immunoblott
Prueba de función
(degranulación basófilos)
Prueba cutánea
Prueba reto conjuntival
Prueba reto
nasal
Prueba reto
bronquial
Reto oral
Datos epidemiología
Monitoreo tiempo real sensibilización IgE
Gal d 1
Gal d 2
Gal d 3
Gal d 4
Gal d 5
Gal d 6
Alergeno Literatura experimental
Secuencia Pruebas Immunoblott
Prueba de función
(degranulación basófilos)
Prueba cutánea
Prueba reto
conjuntival
Prueba reto
nasal
Prueba reto bronquial
Reto oral Datos epidemiología
Monitoreo tiempo real sensibilización IgE
Der p 1
Der p 2
Der p 3
Der p 4
Der p 5
Der p 6
Proteínas leche vaca
Betalactoglobulina.
Alfalactoglobulina.
Caseina-
Seroalbùmina-
Gamaglobulinas.
HUMANA VACAPROTEÌNAS TOTALES 0.89 3.30
CASEÌNA 0.25 2.60PROTEÌNAS DEL SUERO 0.70 0.67ALFALACTOALBUMINA 0.26 0.12BETALACTOGLOBULINA - - - 0.30
LACTOFERRINA 0.17 INDICIOSINMUNOGLOBULINAS 0.105 0.066
PROTEÌNAS DALTON
CASEINA 19,000 - 24,000
BETALACTOGLOBULINA 36,000
ALFALACTOALBUMINA 14,500
LACTOFERRINA 75,000 - 78,000
ALBUMINA SERICA 69,000
IgM 900,000 - 950,500
IgA 420,000
PESO MOLECULAR DE LECHE HUMANA
COMPOSICION PROTEICA
¿DIAGNOSTICO?
REACCIONES CRUZADAS
Alergeno Clase Fuera de rango Unidades de referencia
Clara huevo 2 1.03 kU/L
Leche 1 0.63 kU/L
Trigo 1 0.45 kU/L
Maíz 2 0.95 kU/L
Cacahuate 1 0.51 kU/L
Camarón 2 3.10 kU/L
Tomate 1 0.39 kU/L
Papa 1 0.44 kU/L
Nuez 1 0.48 kU/L
Zanahoria 1 0.63 kU/L
Apio 1 0.35 kU/L
Fresa 1 0.43 kU/L
Manzana 1 0.60 kU/L
Plátano 1 0.72 kU/L
Arroz 1 0.68 kU/L
Naranja 1 0.57 kU/L
Immunocap ® específico IgE total: 5929 UI/ML ( < 100 UI/ml)
Alergeno Clase Fuera de rango
Unidades de referencia
D.Pteronyssinyus 5 75.4 kU/L
D. Farinae 4 25.5 kU/L
Caspa de perro 3 4.12 kU/L
Pasto Bermuda 2 0.75 kU/L
Pasto timoteo 1 0.49 kU/L
Arce 2 1 kU/L
Aliso 1 0.68 kU/L
Cedro 2 1.74 kU/L
Roble blanco 2 0.78 kU/L
Olmo 2 1.06 kU/L
Olivo 1 0.53 kU/L
Lanaria 2 1.02 kU/L
Lengua vaca 1 0.37 kU/L
20
• 4 AÑOS 1 MES• 3 AÑOS CON RINITIS/ASMA/ECCEMA• TALLA BAJA (100 cm) PC<5
• 6 meses con ciclosporina (5 mg/Kg/d) se suspende por reducciòn dep.creatinina
• Prednisona 1mg/kg/d• Zafirlukast 20mg/dia• Difenhidramina 5 ml cada 6 hrs• Loratadadina 10 mg/día
• SCORE AD: 89
• TRACK: 20
• Bh 2300 eos/mmc
• IgE: 6956 UI/ml
·¿¿¿???=$%·
PACIENTE SENSIBILIZADO A MÚLTIPLES ALERGENOS, EL MÉDICO TIENE LA OBLIGACIÓN DE CONOCER LAS POSIBLES REACCIONES CRUZADAS…….
Dr. Tomás Velarde D
Enfermedad muy severa
Enfermedad poco severa
IgG 4 Caseína
Bos d 8 (caseína)
Extracto completo de Leche
Ara h 2 (cacahuate) *Mayor reacción e incremento en reactividad cruzada clínicamente relevante
Ara h1 Ara h 3 (cacahuate) *Incrementa el riesgo de ANAFILAXIA
Gal d 1 Incrementa riesgo de reacciones
Gal d 2 Gal d 3 menor riesgo al consumo huevo cocido
Historia clínica
PielDermatitis
atópica
Gastrico e Intestinal
Respiratorio
IgE Alimentos Leche Huevo Res Oláceas Pescado Soya
IgE Inhalables DPT DPF Perro Gato Pastos Arboles Malezas
> 3 años
< 3 años
Pruebas Immunocap basadas en la edad…………………….
“LA ALERGOLOGÍA ES UNA CIENCIA QUE SE PRACTICA COMO SI FUERA RELIGIÓN, COMO CIENCIA PUEDES TENER TONELADAS DE EVIDENCIA, SIN EMBARGO DEBES DUDAR DE LO QUE VEZ; Y EN MUCHOS CASOS NO TIENES EVIDENCIA, AÚN ASI CREES LO QUE VEZ.”
Pensamiento modificado de Carl Sagan
¡GRACIAS!
¡MUCHAS GRACIAS!
¿Algunas preguntas?