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INTERPRETANDO PERFILES DE ADN
Sinthia Pagano Siepierski PhD
ISHI 25 - GCLAITH Special Workshop
Phoenix, AZ
September 28, 2014
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Figure 2: Mark A et al (2004) Nature Reviews Genetics 5, 739-751
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¿Qué esperamos?
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Objetivos de este taller
• Explicar los picos falsos, pull up, picos stutter, microvariantes, degradación, efectos estocásticos, pérdida alélica, mutaciones y dar posibles soluciones.
• Establecer los distintos umbrales y parámetros del instrumento.
• Influencia de factores externos a los resultados.
• Comprender como afectan los puntos anteriores en la interpretación de una mezcla.
• Requerimientos para una correcta interpretación de perfiles STR.
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Validación
• Sensibilidad
• Reproducibilidad
• Precisión
• Heterocigosidad
• Valoración de mezclas
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Ilustración esquemética de la separación y detección de los alelos STRs en un Analizador Genético ABI Prism 310, 3100 u otro instrumento
multicapilar.
Figure 9.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
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cátodo
capilar
ADN
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Figure 6.3, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
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Laser
Ventana de detección
Laser
ADN
Capilar Fluorocromo
Life(2012) DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis
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Figure 13.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
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Calibración espectral ABI 310 Antes de la calibración espectral:
Después de la calibración espectral:
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En ABI 3500
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Picos falsos (artefactos)
• Ruido de fondo
• Spikes
• Burbujas
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Ruido
• Picos a lo largo de la línea de base no reproducibles
• Consecuencia de: • Fluctuaciones de
corriente • Burbujas de aire • Cristales de urea • Contaminación en la
muestra
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Spikes • Generalmente aparecen en todos
los colores y son más afilados que los picos corrientes
• Son consecuencia de la aplicación de altos voltajes en la electroforesis
• Resultan de la utilización de agua de baja calidad para la preparación del buffer y muestras. El problema desaparece cuando se utiliza agua de calidad HPLC
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Burbujas dye blob
Ocurren por problemas de disociación del fluorocromo del primer.
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• Se forman por un solapamiento en el espectro de emisión de los fluorocromos que se utilizan en el marcaje sobre todo si la muestra está sobreamplificada
• Altura menor que un alelo real y coinciden con los pares de bases de éste
• Se producen principalmente entre los fluorocromos que están más cercanos en el espectro de emisión
• Si el problema persiste hacer nueva matriz
Picos Pull-up
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Figure 15.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
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• Formación de stutters • Adición de nucleótidos • Microvariantes • Degradación • Inhibidores • Efectos estocásticos • Alelos nulos • Mutaciones • Patrones trialélicos
Bioquímica de los STRs
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Bandas stutters
Figure 6.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Picos que aparecen primordialmente una repetición menos que el alelo verdadero como resultado de ‘deslizamiento' de la cadena durante la síntesis de ADN
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Formación de stutters
n - 4 producto
stutter
n + 4 producto
stutter
Deleción causada por deslizamiento en la cadena copia inferior
Inserción causada por deslizamiento en la cadena copia superior
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• Son más pronunciados cuanto menor es la unidad de repetición Di>Tri>Tetra>Pentanucleótidos
• Menores a un 10% del pico alélico al que están asociadas
• Regiones de repeticiones largas generan más 'stutter'
• Cada producto de 'stutter' consecutivo es menos intenso
(alelo > repetición-1 > repetición-2)
• Picos de 'stutter' hacen más difíciles el análisis de las mezclas
Formación de stutters
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• Taq polimerasa suele añadir una A al extremo 3’ (adenilación).
• Para favorecer la adición se añade una etapa final de extensión (15 a 45 min a 60 ó 72ºC)
• Artefacto dependiente de secuencia y en especial de cantidad de ADN molde
• Especial atención en aquellos loci que tengan microvariantes como TH01 (9.3 y 10)
Bandas N y N + 1
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Concentraciones altas de ADN llevan a la adenilación incompleta
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Deletion of T
Microvariantes alélicas
• Definidos como alelos que no son múltiplos exactos de la repetición básica o variantes de secuencia de la repetición o ambos
• Alelos con unidades de repetición parciales designadas por el número de repeticiones completas y luego un punto decimal seguido del número de bases en la repetición parcial (Bar et al. Int. J. Legal Med. 1994, 107:159-160)
• Ejemplo: Alelo TH01 9.3: [TCAT]4 -CAT [TCAT]5
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Alelos off-ladder (OL)
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Variantes alélicas http://www.cstl.nist.gov/strbase/var_tab.htm
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Reporte de OL
Los alelos que son de menor tamaño que el alelo más bajo del ladder son reportados como “menor que X”
Los alelos que son de mayoar tamaño que el alelo más alto del ladder son reportados como “mayor que X”
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Degradación
Pérdida de alelos de mayor tamaño
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Muestra de referencia
Muestra de la evidencia
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Muestras no degradadas también pueden dar electroferogramas con pendientes negativas
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¿Cuán negativa tiene que ser una pendiente para indicar degradación?
– Experiencia, entrenamiento y práctica
Los controles positivos no
deben estar degradados
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Inhibidores de la PCR
• Telas
• Colorantes
• Hemoglobina
• Ácido húmico
• melanina
• ……… Efecto de inhibición del ácido húmico
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Inhibidores de la PCR
El inhibidor se une al primer El inhibidor se une a la Taq El inhibidor se une al ADN
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Inhibidores
• Los más preocupantes son lo que se coextraen con el ADN
• El mecanismo puede variar de acuerdo al tipo de inhibidor y a la secuencia del amplicón
• Efecto menos predictivo que la degradación
• Producen: – Desbalance de alelos
– Perdida alélica
– Pérdica del locus
– Baja sensibilidad
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An Investigation of the Effect of DNA Degradation and Inhibition on PCR Amplification of Single Source and
Mixed Forensic Samples Bruce McCord ; Kerry Opel ; Maribel Funes ; Silvia Zoppis ; Lee Meadows Jantz
Https://www.ncjrs.gov/App/Publications/abstract.aspx?ID=258707
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?
Efectos estocásticos
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Efectos estocásticos Muestra de referencia
Muestra de la evidencia
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Allelic Dropout
• Alturas de pico en evidencia muy bajas
– Mayoría por debajo de 150 rfu
• Alturas de pico en referencia mucho más altas
– Todas encima de 800 rfu
• Locus D13S317:
– Muestra de referencia: 8, 14
– evidencia: 8, 8
• Alelo 14: se perdió o no estaba?
1500
evidencia 150
Muestra de referencia
?
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Desbalance alélico
En un individuo heterocigoto los alelos tienden a ser amplificados aproximadamente en iguales proporciones
¿individuo heterocigoto o mezcla?
Por falta de ADN
Por mutaciones en la zona de anillamiento de los primers
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Alelos nulos • El alelo está presente en muestra de ADN pero no es
amplificado debido a un cambio nucleotídico en el lugar de enlace del primer
• Decaimiento alélico: puede llevar a confusiones porque las muestras heterocigotas aparecen como falsos homocigotos
• Dos grupos de primers de PCR pueden producir diferentes resultados en muestras que se originan de la misma fuente, fenómeno que debe tenerse en cuenta al utilizar bases de datos de ADN
• Se recomienda realizar estudios de concordancia antes del uso de nuevos kits de STR
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Mutaciones en la zona de unión de los primers
No mutación
Mutaciones en el centro del lugar de enlace del primer
Mutaciones en el extremo 3’ del lugar de enlace del primer
ALELO NULO
Box 10.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
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• Baja incidencia: 0,01 a 0,001% por locus
• Muy improbable que un mismo individuo presente este fenómeno en dos loci distintos
• Si no hay mutación somática: los diferentes fluidos de un mismo individuo se comportarán igual
Mutaciones en la zona de unión de los primers
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Importancia de los alelos nulos
12
12
14
Pplex 16
Identifiler
BASE DE DATOS DE
ADN
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Figure 7.2, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
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Impacto de la concentración de ADN en la amplificación de los STRs
Demasiado ADN: • Picos fuera de escala • Picos divididos (+/-A) • Desbalance entre locus
Muy poco ADN: • Desbalance de
heterocigotos • Pérdida alélica • Desbalance entre locus
Rango donde mejor trabajan kits STRs
• 0,5 a 2,0 ng
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Importancia de cuantificar ADN humano
• La amplificación de multiplex STR es más eficiente en un rango estrecho de concentración (0,5 a 2,0 ng)
• Todo el ADN es extraído al tratar una muestra biológica,
• por lo tanto el ADN no humano (bacteriano, fúngico, animales y plantas) es extraído conjuntamente con el ADN humano de interés
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Métodos disponibles • UV 280/254: baja sensibilidad y no es específico para
ADN humano • Semicuantificación en gel: no es específico para ADN
humano, poco sensible, se aprecia más la calidad que la cantidad del ADN
• Fluorescencia: no es específico para ADN humano, es sensible pero no provee información de la calidad del ADN
• Slot blot: específico para ADN humano, subjetivo, lleva mucho tiempo de trabajo manual
• Aluquant: poco sensible • RtPCR: específico para ADN humano, muy sensible, buen
rango dinámico
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Grupo óptico Real time instrumento
Real time: concepto general
Activador de
Emisión de luz
Bloque térmico
Detector de emisión de luz
Reacción de PCR
Plot fluorescencia vs ciclos de PCR
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Que se ve …
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Fase Geometrica E=1
Eficiencia de amplificación del 100%
Cinética de amplificación= 2n
P= T*(1 + E )n
Fase Geométrica
Fase Geometrica E=1
Fase Lineal
Plateau
Cinética de Amplificación
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Fase Geometrica E=1
P= T*(1 + E )n
Pn= Ti*2n Pn= Ti*2n
Fase Geometrica E=1
P = cantidad de producto generado a n ciclos T = cantidad de templado inicial E = eficiencia de la amplificación
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¿Por qué qPCR por real time?
• Reducción de la contaminación: no hay manipulación post PCR
• Alta sensibilidad
• Amplio rango dinámico (aprox 30pg a 100ng)
• Ensayos específicos
• Posibilidad de multiplex
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Log n° cópias
CT
CT
0 1 2 3 4 5 6 7
CT es directamente proporcional al log de cantidad inicial de DNA / RNA
Curva Standard de cuantificación absoluta
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Sistemas de detección
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Incremento en la fluorescencia por SYBR green
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● Versátil
● Bajo costo
● Alta sensibilidad
● Ideal para ensayos de discriminación (screening)
● Desventaja: Fluorescencia inespecífica, ajustar muy bien el sistema de amplificación, evitar fragmentos inespecíficos y dímeros de primer.
Características de SYBR Green
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Quencher R
Sondas TaqMan
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• Detección de productos de manera específica
• Detección simultánea de múltiples productos de amplificación (Multiplex)
• Diseño de sondas para cada sistema de análisis en particular
• Mayor número de aplicaciones, análisis de punto final
Características del sistema TaqMan
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Beacons moleculares
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Características de los beacons moleculares
• Aumento de la especificidad
• Capacidad de multiplex
• El diseño puede ser engorroso
• La sonda debe ser desnaturalizada del templado por debajo de 72º para que la Taq no la digiera durante la extensión
T annealing < Tm < T extensión
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Cebadores Scorpions
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Plexor
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Bajo número de copias (LCN)
• Cuando se trabaja con menos de 100pg de ADN genómico
• Cuando se trabaja por debajo del umbral estocástico donde el producto de PCR no es seguro ( 150-250 pg)
• Cuando hay que mejorar la sensibilidad de detección (34 ciclos en vez de 28 ciclos)
• Cuando hay muy pocas copias de ADN para asegurar una amplificación confiable
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Otros términos para LCN
• Bajo nivel de ADN
• Trazas de ADN
• ADN de contacto
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Estrategias para aumentar la sensibilidad
1. Aumentar el número de ciclos de PCR
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Aumento del número de ciclos de PCR
Figure 11.1, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
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Estrategias para aumentar la sensibilidad
1. Aumentar el número de ciclos de PCR
2. Purificación post PCR
3. Aumentar inyección capilar
4. Reducir el volumen de PCR
5. Nested PCR
6. Mejoramiento de los reactivos de PCR
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Utilización de amplicones reducidos:
mini STRs
Primer convencional
Primer convencional
Mini primer
Mini primer
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Mutaciones
16, 21 18, 20
16, 18
Mutación paterna
16, 21 18, 20
17, 18
Transmisión normal de alelos
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm
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Mutaciones
• Frecuencia de 1 en aproximadamente 1000 meiosis
• Mayor frecuencia de mutaciones paternas que maternas
• Frecuencias más altas de mutación: vWA, FGA, D18S51
• Frecuencias más bajas de mutación: TH01, TPOX, D16S539
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Buffers y componentes de la muestra
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¿Qué afecta la separación de los alelos?
• Recubrimiento del capilar
• Temperatura de corrida
• Formamida
• Buffer de electroforesis
• Polímero
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Flujo electroforético y flujo electroosmótico
Figure 6.4, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press
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Movilidad
• Es el tiempo que le lleva al fragmento de ADN moverse del punto de inyección al punto de detección.
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Factores a tener en cuenta en la preparación de la muestra
• Utilizar formamida de buena calidad para no afectar la conductividad
• Desnaturalización • Artefactos de la síntesis de los primers “dye blobs” • Prevenir el exceso de sales en la muestra debido a
la evaporación • Contaminación con iones metálicos • Purificación post PCR para reducir las sales
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• Hidrólisis produce formiato de amonio • El aire ioniza el formiato produciendo hidróxido de
amonio y ácido fórmico • Impurezas como el ácido fórmico (iones negativos más
pequeños), amonio, y otras impurezas: • Compiten con los fragmentos de ADN reduciendo la cantidad
de ADN inyectada • Baja la señal y aumenta el ruido • Degrada y descompone los fragmentos de ADN reduciendo
resolución y selectividad
La descomposición de la formamida altera la conductividad de la misma
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Porque utilizar formamida y no agua
• El ADN se puede descomponer en el agua • La formamida es más efectiva cuando se trabaja
con fragmentos grandes y altas concentraciones de ADN
• La formamida se evapora menos que el agua • La formamida a diferencia del agua mantiene el
ADN desnaturalizado
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Muestra preparada con formamida de mala calidad
Misma muestra preparada con formamida de buena calidad
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Efecto “Golden Gate”
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Reannealing: produce picos fantasmas
• Son consecuencia de la desnaturalización incompleta o de la rehibridación
• El ADN de doble cadena migra más rápido que el ADN de cadena simple por lo que el pico extra aparece delante del pico principal
• Comúnmente se visualizan en el estándar de tamaño pero pueden aparecer en otros colores
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La variación de la temperatura de corrida puede producir la rehibridización
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Desnaturalización incompleta del estándar
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Procesamientos post PCR
• La purificación post PCR reduce los niveles salinos permitiendo que más ADN sea inyectado al capilar
• Reprocesar una muestra luego de la PCR para concentrarla puede mejorar la señal
• También se remueven las burbujas dye blobs
• Disponibilidad en el mercado de distintos kits con columnas purificadoras
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Factores externos
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• Temperatura ambiente
– Pueden causar variaciones en la movilidad (excepto ABI3500)
– Ambientes muy húmedos: la temperatura afecta la conductividad eléctrica
• Limpieza
– Polvo
– La cristalización de la urea en el bloque puede causar obstrucciones, spikes, etc.
– La cristalización del polímero también puede causar obstrucciones
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Efecto de la temperatura
• Afecta la viscosidad del polímero y la separación de los fragmentos de ADN causando OL
• Puede afectar la conformación de estructuras secundarias en el ADN
• Se recomienda que la T no fluctúe en + 2ºC
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Limpieza
• La urea sublima generando compuestos iónicos que forman un camino a tierra
• De la misma manera si queda buffer o humedad bajo los viales forman un camino a tierra
• La ventana del capilar debe estar limpia para no afectar la lectura
• Los viales deben estar limpios porque podrían transferir ADN al capilar
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Factores instrumentales
• Sistema óptico
• Sistema capilar
• Derrames de la jeringa
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Sistema óptico
• La sensibilidad varía con el uso, con el diámetro del capilar, la limpieza del capilar y con la calibración del instrumento
• Monitorear la intensidad del laser ya que pierde intensidad con el tiempo
• Observar la relación señal ruido
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Ventana de detección
• Verificar limpieza de ventana
• Verificar alineación del capilar con la ventana
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Fluídos
• Efectos de burbujas, polvo, cristales de urea, derrames en la jeringa y en las férulas
• Cambios de viscosidad
• Agua en el bloque
• Burbujas
• temperatura
• Obstrucciones en el capilar
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• Remover las burbujas de los canales
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Cristales de urea
• Se forman al sublimarse la urea cuando hay derrames en las válvulas del bloque
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Matrices • Cambios en el buffer, sistema óptico, fluorocromos,
pueden afectar las calibraciones del software
• Una matriz de baja calidad puede dar una línea de base elevada asignándose demasiados picos
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Problemas con el capilar
• Materiales en la superficie capilar pueden producir flujo osmótico, ensanchamiento de las bandas de ADN e inconsistencias en la resolución
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Decaimiento alélicos causados por:
• Formamida de mala calidad • Conductividad causada por degradación de la urea • Agua en el polímero • Derrames de la jeringa • Excesos de sales que provocan renaturalización • Presencia de iones (detergentes o metales) • Capilar dañado • Daños en la ventana del capilar
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Si la baja resolución es permanente entonces:
• Problemas de adsorción en el capilar
• Iniciación de flujo electroosmótico
• Mala composición del buffer causa cambios en la conductividad
• Cambios de concentración en el polímero causan cambios en la viscosidad
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¿Qué se requiere para la correcta tipificación de los STRs?
Electrophoresis 2004, 25, 1397–1412. STR typing with ABI 310 and 3100
• Alta resolución espectral para distinguir los diferentes productos de PCR y que la detección de las microvariantes sea confiable
• Asignación de tamaño correcta en el rango de pares de bases estudiada
• Alta precisión entre corridas para permitir la comparación de perfiles
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Recolección de datos
Revisión de datos
Separación de colores
Asignación genotípica
Medida de los picos
Confirmación de resultados
Comparación con escalera alélica
Identificar los picos
Matriz
Estándar interno
Muestra de escalera alélica
GeneScan
Genotyper
EXPERIENCIA
GeneMapper
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¿Qué nos cuestionamos más frecuentemente en la
interpretación de los datos?
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• ¿Es un pico o ruido?
• ¿Es un alelo o un artefacto?
• ¿Homocigoto verdadero o heterocigoto con pérdida alélica?
• ¿Mezcla?
• ¿Es un perfil interpretable?
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150-200 RFU
30-50 RFU
Umbral estocástico
Umbral analítico
Figure 10.2, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press
Debajo de este valor los picos observados no pueden distinguirse fehacientemente del ruido del instrumento
Por encima de este valor es razonable asumir que no ha habido pérdida alélica de un alelo hermano heterocigoto
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¿Se puede utilizar este locus para la interpretación de resultados?
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¿Cómo determinar estos umbrales?
Línea de base en un blanco
• Primero determinar el umbral analítico (límite de detección) para el laboratorio y para cada instrumento utilizando la intensidad de señal (depende del instrumento)
• Generalmente 3 veces la desviación estándar del ruido o 2x Np-p
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Otros métodos
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¿Es necesario especificar umbrales para cada fluorocromo?
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Límite de cuantificación
• 10 veces la desviación estándar del ruido
• Se estima utilizando 7xNp-p (150-200 RFU)
• Por debajo de este valor las estimaciones de área o altura no son confiables
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Umbral estocástico
• Depende de la sensibilidad biológica
• Por encima de este valor se puede asumir que en este locus no ha habido pérdida alélica de un heterocigoto; un solo alelo en este locus puede considerarse homocigoto
• Es la intensidad de señal por debajo de la cual una cantidad particular de ADN no puede detectarse con certeza
• El umbral estocástico debe ser superior que el límite de cuantificación
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Determinación del umbral estocástico
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories
• Se establece en base a datos empíricos derivados del laboratorio y es específico para los sistemas de cuantificación, amplificación (kits) y detección empleados.
• Se evalúa las relaciones de alturas de picos en múltiples loci en una serie de diluciones
• El umbral estocástico es el valor de RFU por encima del cual es razonable suponer que, en un locus dado, no se ha producido la pérdida alélica de un alelo hermano
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El umbral estocástico también puede ser definido como la concentración en la cual un conjunto de relaciones de alturas cae por debajo del 60%
Relación de alturas: por encima de este valor, dos alelos heterocigotos pueden agruparse como posible genotipo
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¿Qué sucede con los datos que están por debajo del límite estocástico?
• Artefactos de la PCR y stutters adquieren importancia
• Aumenta el número de spikes
• Pueden aparecer picos –A
• Las burbujas de fluorocromos son más significativas
• Pueden aparecer picos de un segundo contribuyente
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Por debajo del umbral estocástico: los artefactos de la PCR, spikes y burbujas adquieren importancia
Figura 9: Thompson et al. Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defense review
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Determinación del PHR (equilibrio de heterocigotos Hb)
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories
• El PHR para un locus determinado se calcula dividiendo la altura del pico del alelo de menor RFU entre la altura del pico del alelo de mayor RFU, multiplicando este valor por 100 para expresarlo como porcentaje
• Pueden aplicarse distintos PHR para loci individuales o un solo PHR para todos los loci
altura pico 1 (RFU) PHR = x 100 altura pico 2 (RFU)
1 2
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Un individuo heterocigota para cierto locus teóricamente debería :
• Amplificar igualmente ambos alelos ya que se encuentran en la misma cantidad en el genoma
• Igual inyección capilar
• Relación de alturas de picos similares (100%)
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¿Qué puede causar desbalance?
• Poca cantidad de ADN
• Inhibición
• Degradación
• Amplificación preferencial
• Stutter elevado
• MEZCLA DE ADN: hay presentes más de un contribuyente
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Límite de linealidad
• Punto de saturación del detector del instrumento por lo que cantidades mayores del analito no producen una respuesta linear de la señal
• La cámara CCD al saturarse produce picos aplanados
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Efecto en la matriz de una muestra sobrecargada
![Page 125: INTERPRETANDO PERFILES DE ADN - s3.amazonaws.coms3.amazonaws.com/media.guidebook.com/service/zPuD64HNadbLAX… · • por lo tanto el ADN no humano (bacteriano, fúngico, animales](https://reader031.vdocumento.com/reader031/viewer/2022020414/5bc10a4909d3f2f2678cd39d/html5/thumbnails/125.jpg)
Rango dinámico comparativo de equipos ABI
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Diferencias entre instrumentos
• Diferencias de sensibilidad entre instrumentos debidas a: – Parámetros de inyección – Iluminación del capilar (un capilar vs multicapilar) – Intensidad del lazer
• Las diferencias de sensibilidad afectan los datos de cualquier sistema
• Estas diferencias deben ser corregidas estableciendo los umbrales correspondientes.
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Picos stutter
SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories
• En general, el criterio empírico está basado en las características cualitativas y/o cuantitativas de los picos. Por ejemplo, artefactos y spikes se distinguen de los picos alélicos por su morfología y/o reproducibilidad.
• Los stutters deben ser caracterizados por su medida relativa al pico del alelo al que están asociados.
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Cálculo del stutter
alelo
Stutter N-4
altura pico N-4 (RFU) Stutter % = x 100 altura pico alelo (RFU)
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Umbral stutter
• Aproximadamente 15%
• Por debajo de este valor un pico en posición stutter puede considerarse como tal en muestras de origen único o en determinados tipos de mezclas
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Alelos del componente mayoritario
Alelo del componente minoritario
Stutter componente minoritario o ambos
?
Interpretación de potenciales picos stutter en una mezcla
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Recomendación 6: si el perfil genético es una mezcla mayor/menor, donde los alelos menores son de la misma medida (altura o área) que los stutters de los alelos mayores, entonces los stutters y los alelos menores son indistinguibles. Bajo estas circunstancias los alelos en posisición stutter que no soportan la hipótesis Hp deben ser incluídos en la interpretación.
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Conclusión
• Los picos stutters son problemáticos cuando se trabaja con mezclas con bajas cantidades de ADN
• Los laboratorios deben decidir cuando es apropiado quitar los filtros para stutters en los análisis, principalmente si el componente minoritario tiene una altura similar que los picos stutters
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¿Cómo determinamos el número de contribuyentes a la muestra?
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Desbalance de los heterocigotos
Más de 2 alelos
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Extra bandas: ¿alelos reales o artefactos?
• Artefactos de la amplificación: bandas N + 1
• Artefactos de la detección: «pull-up»
• Artefactos producidos por la amplificación inespecífica de ADN no humano
• Contaminaciones extra/intra-laboratorio
• Fenómenos genéticos: trisomías, duplicaciones, traslocaciones, mutaciones somáticas, etc.
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• Traslocaciones, duplicaciones, trisomías, fenómenos de inestabilidad genética (cáncer)
• Fenómeno muy infrecuente que aparece en un solo locus
• Problemático si se da un fenómeno de mosaicismo
Anomalías cromosómicas
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm
Patrones trialélicos
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Si tenemos un patrón trialélico:
• Amplificar con un kit diferente; re inyectar la misma muestra no cambiará el resultado
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• Asociadas a muestras con contaminación bacteriana o animal (toma vaginales, restos óseos, …)
• Tienen una secuencia diferente a los alelos y por ello migran diferente, son picos únicos y normalmente tiene un pico fuera del rango alélico del locus donde se detectan.
Bandas inespecíficas de ADN no humano
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Los datos a tener en cuenta al momento de identificar el número de contribuyentes a una mezcla son:
– Número de alelos por locus
– Circunstancias del caso
– Posibilidad de individuos relacionados biológicamente en la mezcla
– Generalmente si son 2, 3 ó 4 alelos por locus, entonces serían 2 contribuyentes
– Si son 5 ó 6, entonces 3 contribuyentes
– Si son > 6 alelos por locus, entonces > 4 contribuyentes
Muy importante para realizar los cálculos estadísticos
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¿Puede utilizarse la relación X/Y en la amelogenina como indicador del número
de contribuyentes?
• En casos de agresiones sexuales con mezclas de 2 personas femenino/masculino
• Poca utilidad en mezclas masculino/masculino o mezcla mujer/varios masculinos
• Tener en cuenta que mutaciones en la zona de inserción de primers puede causar deleciones de X o Y
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• Si dos templados de ADN son mezclados entonces se espera que la razón/proporción de contribuyentes será preservada en la mezcla en cada locus
• Por lo tanto se puede suponer que el área de los picos en el electroferograma está relacionada con la cantidad inicial de los componentes
Estimar la proporción relativa de los individuos que componen la mezcla
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¿Podemos reducir el volumen de las reacciones
de PCR?
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Ventajas
• Se reduce el costo
• Aumento en la sensibilidad
• Aumento en la eficiencia
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Figura 8: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the AmpFlSTR Profiler Plus kit
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Figura 10: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the AmpFlSTR Profiler Plus kit
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Desventajas
• Limita el volumen de muestra en la reacción
• Potencial pérdida alélica en muestras con muy poco ADN
• Muestra con inhibidores: menos diluído al reducir volumen de PCR
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http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
Burbujas de colorante
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Sobreamplificación de un alelo
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Ladders mal alineados
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Contaminación
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Desbalance de picos, artefactos en bajo número de copias
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Sobreamplificación
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
pico debajo de burbuja “dye blob”
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Problemas de separación, burbujas en el capilar
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
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Current Spikes
Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf
Picos de corriente “spikes”
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