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Tesis Doctoral
Inmunobiología de MICA enInmunobiología de MICA enlinfocitos T: estímulos fisiológicos,linfocitos T: estímulos fisiológicos,
rutas de señalización yrutas de señalización yconsecuencias funcionales de suconsecuencias funcionales de su
expresiónexpresión
Molinero, Luciana Lorena
2004
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Molinero, Luciana Lorena. (2004). Inmunobiología de MICA en linfocitos T: estímulosfisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_MolineroCita tipo Chicago:
Molinero, Luciana Lorena. "Inmunobiología de MICA en linfocitos T: estímulos fisiológicos,rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión". Tesis de Doctor. Facultadde Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3711_Molinero
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Tesis Doctoral
Inmunobiología de MICA enlinfocitos T: estímulosfisiológicos, rutas de
señalización y consecuenciasfuncionales de su expresión
Lic. Luciana Lorena Molinero
Director: Dr. Norberto Walter Zwirner
w37ifiw
Laboratorio de Inmunogenética, Hospital de Clínicas"Joséde San Martín", Universidad de Buenos Aires
Marzo de 2004
A mi mamá y a mi papá
A Norberto, mi maestro en esta aventura, me introdujíste en el mundo de lainmunología. Me diste apoyo y consejos, me soportaste en las buenas y en las malas,¡no me imagino un director mejor! Y a pesar de lo que dicen todos, yo sabía decirchistes malísimos antes de conocerte.
A Leonardo, por abrirme las puertas del Laboratorio, presentarme a Norberto,y ser como una padre conmigo.
Al CONICET, por haberme dado su apoyo económico durante todos estos
A Gabriel y a Mónica, por transmitirme su pasión y eterno entusiasmo por laciencia.
A Merce, sos la mejor persona que conozco, tu eterna alegría y buen humorhicieron mucho más divertidas las largas horas en el laboratorio.
A Vicky, un ángel de buena (la verdad Norber, ¡qué buenas compañeras queme conseguiste!).
A Guille, por las charlas y valiosos consejos, y ¡que almuerzos más graciosos!Nunca va a haber otro como vos. A Nati, Flor, Marta, Rochy, Juli, Vir, Astrid, Karina,Gus, Juan que estos años fueron hermosos porque ustedes también estuvieron ahí,ayudando, contando anécdotas, y haciendo de la hora municipal una de las horas deldía mas jugosas e interesantes.
A la gente del lab viejo, que esta tesis no habría sido lo mismo sin ustedes: aYanina, a la Theiler (gran valor!), Juli, las Cecis, Ana Claudia, Paulo, Nati Pa. y Nati
Pe., a Monica, Nora y el Tucu. A Yoly y Nelly. A las secretarias Verónica y Ana. AlChulu.
A los que se fueron, pero solo del lab, pero no de mi corazón: Maribá (¡qué
chiflada, mamita!), a Laura, que siempre me saco las papas del fuego (¡gracias porcuidar a Min!), a Caro J. y a Vivi, a Sandra y Andrea. A Gigio, ¡qué bien que jugabasal fútbol, muerta!
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
A Nacho, que sos un maestro. Alguna vez nos tiraremos en paracaídas?
A mi amiga Lorena, que te extraño, y me gustaría poder compartir con voseste momento. Estos años de amistad compartida fueron los mejores años de mi vida.
Me apoyaste y creíste en mí más de lo que yo jamás hice. Gracias por abrirme tucorazón y tu hogar. Sos como una hermana para mí, y aunque estemos lejos, siemprevoy a estar cuando me necesites.
A mi banda de amigos excéntricos, que son parte de mi familia: a Mariana,que me da letra desde Finlandia con el MSN, a Horacio, de quien siempre quiseaprender su sabiduría orientai, a Héctor, que sos un padre. A Lautaro, que siempreme diste coraje para seguir adelante y a Vanesita, con tu gusto por ir contra lacorriente me obligás a recapacitar sobre el mundo, y de las razones por las quetodavía no estás en un psiquiátrico. A Cata, desde el Polo Norte, que desde nuestraépoca de estudiantes me alienta.
A Rodrigo y Fabricio, mis amiguetes siempre presentes, que me alientansiempre, filósofos de bar y gurúes, son soy afortunada de tenerlos cerca.
(sí, loco y todo, apasionado y renegado, pero cómo te quiero!).
A Mónica M., gracias por estos años de apoyo y reflexión.
A mis hermanas Cecilia, Valeria y Verónica, que son como mi pasado, mi
presente y mi futuro.
A mi mamá y a mi papá, que sin ellos esto nunca habría existido (yo, porempezar, claro), que me apoyaron todos estos años, que me nutrieron deconocimiento y fuerza.
A todos los que creyeron en mí, que me apoyaron, que me estimularon, quecompartieron sus historias conmigo,
gracias, millones de gracias
y sobre todo, gracias por hacerme reír, que creo es mi mayor cualidad.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Parte o la totalidad de las siguientes publicaciones forman parte de la presente Tesis
Doctoral.
Codominant expression of the polymorphic MICA alloantigens encoded by genes
in the HLA region
L. L. Molinero, C. Y. Marcos, F. Mirbaha, L. Fainboim, P. Stastny ¿r N. W. Zwirner*
European Journal of Immunogenetics, .29 (2002):315-319.
Activation-induced expression of MICA on T lymphocytes involves engagementof CD3 and CD28
L. L. Molinero, M. B. Fuertes, G. A. Rabinovich, L. Fainboim, 8: N. W. Zwirner
Journal of Leukocyte Biology 71 (2002):791-797
Up-regulated expression of MICAand proinflammatory cytokines in skin biopsies
from patients with seborrhoeic dermatitis.
L. L. Molinero, M. Gruber, J. Leoni, A. Woscoff, ¿r N. W. Zwirner.
Clinical Immunology 106 (2003):50-54
Up-regulated expression of MICA on activated T lymphocytes involves Lck and
Fyn kinases and signaling through MEKI/ERK,p38 MAP kinase, and calcineurin
L. L. Molinero, M. B. Fuertes, L. Fainboim, G. A. Rabinovich, 8.-.N. W. Zwirner
Journal of Leukocyte Biology 73 (2003):815-822
Luciana L Molinero Tesis Docloral
Indice
Abreviaturas
Resumen en castellano
Resumen en inglés
IntroducciónMoléculas no clásicas del Complejo Mayor de Histocompatibilidadde clase I HumanoGenética y Genómica de MICATranscripto y proteína de MICAPolimorfismo de MICAMICAy transplanteControl de la transcripción de MICAReceptores de MICA: NKGZDOtros ligandos de NKGZDInducción de MICA frente a estímulos de estrés biológicoMICA y tumoresActivación linfocitariaProgramas de Activación Celular y DiferenciaciónTransducción de señales a través del TCRSeñalización a través del receptor de IL-2
Objetivos
Materiales y Métodos1. Reactivos
2. Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periférica(CMSP)
3. Aislamiento de linfocitos T CD4+y CD8+4. Activación de linfocitos
a. Fítohemaglutininab. Cultivo Mixto Linfocitarioc. Estimulación con AcMo anti-CD3 y AcMo anti-CD28d. PMA
e. Citoquinas y polarización a perfil Th1 o Th2f. PMA e Ionomicina
5. Ensayos de Transwell6. Ensayos de línfoproliferación7. Transfección de células HeLa8. Extracción de proteínas
a. lisados proteicos totalesb. Extractos nucleares para ensayos de EMSAc. Extractos nucleares y citoplasmáticos para Western Blot
Indice
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
9. Cuantificación de proteínas 3310. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDSy 33
Western BlotAnticuerpos para Western Blot 35
11. Ensayo de Retardo de la Movilidad Electroforética (EMSA) 35a. Oligonucleótidos utilizados para EMSA 35b. Anillado del olígonucleótido simple cadena 35c. Marcación y purificación del oligónucleótido doble cadena 36d. Ensayo de Retardo en la Movilidad Electroforética 36
12. Cítometría de Flujo 37a. Anticuerpos para inmunomarcación 37b. Inmunomarcación de superficie 37c. Detección de viabilidad por exclusión de ioduro de
propidio 38d. Tinción de células apoptóticas con ioduro de propidio 38e. Inmunomarcación intracitoplasmática para IFN-y 38
13. Purificación de ARN 3814. RT-PCR 3915.Transferencia de ADN a membrana e hibridación con sonda 40
marcada con 32P
16. Ensayos de Citotoxicidad 41
Resultados 42Capítulo I: Expresión de MICA en linfocitos T activados porestímulos fisiológicos 43
a. Inducción de la expresión de MICA en linfocitos T porestimulación con células alogeneicas 43b. Efecto del bloqueo de la señal 1 y de la seña12 sobre laexpresión de MICA 45c. Activación de linfocitos T por microagregacíón del complejoTCR/ CD3 y por la molécula coestimulatoria CD28 46Conclusiones parciales 52
Capitulo II: Mecanismos de transducción de señales involucradosen la inducción de MICA en linfocitos T activados 53
a. Mediadores intracelulares involucrados en la expresión deMICA en linfocitos T activados por microagregación delcomplejo TCR/ CD3 53b. Mediadores intracelulares involucrados en la expresión deMICA en linfocitos T activados por microagregación de la 56molécula CD28
c. Rol de las quínasas Jak y p7056sobre la expresión de MICA 59Conclusiones parciales 61
Capitulo III: Factores de Transcripción involucrados en la expresiónde MICA: rol de NF-KB 62
a. Efecto de la sulfasalazina sobre la inducción de la expresiónde MICA 62
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
b. Sitio de unión NF-KBen el primer intrón de MICAc. Regulación de MICA por NF-KBen células HeLa.Conclusiones parciales
Capítulo IV: Rol de cítoquinas sobre la expresión de MICA enlinfocitos T
a. Inducción de la expresión de MICA en CMSPs por lacitoquina mitogénica IL-2b. Mecanismos de transducción de señales involucrados en laexpresión de MICA en linfocitos T activados por IL-2c. Efecto de IL-4 sobre la expresión de MICAd. Expresión de MICA en células Th1 y Th2Conclusiones parciales
Capitulo V: Expresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4+activados con PMA e Ionomicina
a. Expresión de MICA en linfocitos T CD4+purificados vs.linfocitos T CD4+presentes en CMSPs activados con PMA eIonomicinab. Citotoxicidad de células NK contra linfocitos T CD4+activados con PMA e IonomicinaConclusiones parciales
Discusión
Conclusiones
Bilbliografía
656768
69
78
8082
83
99
102
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
Abreviaturas
Ac anticuerpo NK célula citotóxicaAcMo anticuerpo monoclonal naturalAg antígeno PHA fitohemaglutininaAP-1 proteína activada -1 PKC proteína quinasa CAut autólogo PMA forbol-12-mirístato-13CI control de isotipo acetatoCMH complejo mayor de PTK proteína tirosina
histocompatibilídad quinasaCMH-p complejo mayor de Rapa rapamícina
histocompatibilidad unido a SB 83202190pépüdo SEM error estándar
CMSPs células mononucleares de SFB suero fetal bovinosangre periférica Sz sulfasalazina
CPA célula presentadora de TCR receptor del la célula Tanfigeno
CSA ciclosporina AERK quinasa regulada por
señales extracelularesHLA antígeno leucocitarío
humanoIKB inhibidor de NF-KBIFN interferónIg inmunoglobulinaIL- interleuquinaJak quinasa lanusINK quinasa del amino terminal
de c-JunKIR receptor inhibidor de
citotoxícidadLAK célula NK activada con
linfoquinaLck proteína tirosina quinasa
específica de linfocitosMAPK proteína quinasa activada
por mitógenoMEK1 quinasa de ERK]MIC cadena relacionada con la
molécula de clase I delCMH
NF-KB factor nuclear de la
cadena kappa delinfocitos B
NFAT factor nuclear delinfocitos T activados
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
RESUMEN
lNTRODUCCIÓN: La interacción de MlCA con el receptor activador de citotoxicidad
NKGZD (expresado en células NK y linfocitos T yó y aB CD8‘), desencadena una respuestacitotóxica contra células que expresan MlCA. MlCA se induce por estímulos de estrés,infecciones, neotransformación o linfocitos T activados con fitohemaglutinina. OBJETIVOS:a) estudiar la expresión de MlCA en linfocitos T activados con estímulos fisiológicos; b)investigar los mecanismos moleculares involucrados y; c) investigar las consecuenciasfuncionales de dicha expresión. RESULTADOS: Por Western Blot, RT-PCR y citometría de
flujo se observó que MlCA se induce en linfocitos T presentes en células mononucleares desangre periférica (CMSPs) por estimulación con células alogeneicas, por microagregación delcomplejo TCR/ CD3 o por coestimulación con la molécula CD28 y PMA. Los niveles deexpresión de MlCA alcanzaron una meseta a los 4-7 días post-estímulo. Empleandoinhibidores farmacológicos, observamos que la expresión de MlCA inducida por lamicroagregación del complejo TCR/CDB, o la coestimulación a través de CD28 y PMAinvolucran a Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p7056 y Jak. Asimismo, la
inhibición farmacológica de NF-KBbloqueó la expresión de MlCA en linfocitos T activados
de la misma manera. Detectamos un sitio de unión KBlocalizado en el primer intrón del gende MlCA, y por ensayos de supershzftobservamos que esta secuencia une a los dímerosp65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de linfocitos T activados.Asimismo, la sobreexpresión de RelA en células HeLa por transfección transitoriaincrementó los niveles de MlCA, confirmando que la expresión de dicho gen es regulada por
NF-KB.Además, por Western Blot observamos que CMSPs estimuladas con las cítoquinas
mitogénicas lL-2 e IL-4, lo mismo que linfocitos T polarizados hacia un perfil Th] o Th2inducen la expresión de MlCA. Linfocitos T CD4‘ purificados y activados con PMA e
Ionomicina, pero no linfocitos T CD4+presentes en CMSPs, expresan MlCA en su superficie.Por ensayos de transwell,observamos que este fenómeno se debe a un factor soluble liberadopor CMSPs activadas. Además, linfocitos T CD4‘ activados con PMA e lonomicina son
blancos de citotoxicidad por células NK autólogas activadas con lL-2 (LAK). El bloqueo de lainteracción MICA-NKGZD con AcMo anti-MlCA mostró que MlCA juega un rol menor endicha respuesta. CONCLUSIONES: MlCA se induce en linfocitos T activados por estímulos
fisiológicos e involucra a la señalización de Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK,
p7056k,Jak y al factor de transcripción NF-KB. La expresión de MlCA en superficie de
linfocitos T tiene un rol menor en la lisis por células NK activadas. En esta tesis se describen
por primera vez algunas de las vías de transducción de señales y un factor de transcripcióninvolucrados en la expresión de MlCA. Los resultados presentados sugieren además que lainteracción MICA-NKGZD podría constituir un nuevo mecanismo de regulación de larespuesta inmune adaptativa.
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
ABSTRACT
INTRODUCTION: The interaction between MICA and the cytotoxicity activating receptor
NKGZD (expressed in NK cells and CD8‘ (¡[3and yó T cells) triggers a cytotoxic response
against MICA expressing cells. MICA is induced by stress stimuli, infections,neotransformation or phytohemagglutinin in T cells. OBJECTIVES: a) to study MICAexpression in T cells activated with physiological stimuli, b) to investigate the molecularmechanisms involved, and c) to explore the functional consequences of that expression.RESULTS:We activated T cells present in peripheral blood monononuclear cells (PBMCs)byallogeneic stimulation, microaggregation of TCR/ CD3 complex or the costimulatorymolecule CD28 with anti-CD3 mAb or anti-CD28 mAb in the presence of PMA. All of these
stimuli induced MICA expression, as assessed by Western blot, RT-PCRand flow cytometry,reaching a maximum at 4 to 7 days after stimulation, depending on the stimulus. Usingpharmacological inhibitors we next investigated the signal transduction pathways involvedin MICA induction triggered by TCR/CD3 crosslinking or costímulation through CD28 inthe presence of PMA. We found that several signaling pathways like Lck/ Fyn, ERK1/2, p38MAPK, calcineurin, Jak and p7056are involved in MICA inductionz. By pharmacological
inhibition of NF-KB, we found that MICA expression was dependent on NF-KB, most
probably through a KBbinding sequence located in the first intron of the MICA gene. ByEMSA and supershift assays we found that this sequence bound RelA/p50 and p50/p50NF-KBdimers present in nuclear extracts of activated T cells. Pharmacological blockade of
NF-KBalso inhibited MICA expression in HeLa cells and overexpression of RelA in these
cells increased MICA expression, suggesting that NF-KB regulates MICA expression.
Mitogenic cytokines, like lL-2 and IL-4, were able to induce MICA expression in T cells. This
molecule was also induced in Thl or Th2 polarized cells. We observed that PMA/ lonomycinstimulation induced surface MICA expression on purified CD4‘ T cells, but not on CD4+T
cells present in PBMCs, more likely due to a soluble factor secreted by activated PBMCs.PMA/lonomycin activated CD4+ T cells became targets of cytotoxicity by syngeneic IL-2activated NK cells (LAK), but not of resting NK cells. Blocking MlCA-NKGZD interaction
with an anti-MICA mAb, developed in our laboratory, showed that MICA plays a marginalrole in this cell death. CONCLUSIONS: MICA is induced in T cells by physiological stimuli
through the activation of Lck/Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p7056signal
transduction pathways, as well as the transcription factor NF-KB.MICA expression on thesurface of CD4“ T cells play a marginal role as target of cytotoxicity by activated NK cells. ln
this Thesis some of the signal transduction pathways and a transcription factor involved inMICA expression are described for the first time. Also, the results suggest that MICANKGZD interaction may be a novel mechanism of regulation of the adaptive immuneresponse.
INTRODUCCIÓN
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
MSMMoléculas no clásicas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase
I Humano
La respuesta inmune adaptativa se dispara mediante la interacción entre el
receptor de las células T (TCR) y una molécula del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH), que presenta a un péptido unido (Viret, 1999). Las
moléculas de clase I clásicas del CMH presentan un péptido nanomérico derivado de
la degradación de proteínas citoplasmáticas por el proteasoma. En humanos hay tres
tipos de moléculas clásicas, denominadas HLA-A, -By -C, que están codificadas en la
región del CMH en el brazo corto del cromosoma 6. Su expresión es ubicua, se
asocian a Bz-microglobulina y son altamente polimórficas (Viret, 1999). Existe otro
grupo de moléculas de clase I del CMH, denominadas moléculas no clásicas o de
clase Ib del CMH, cuyos genes, HLA-E, -F y -G, codifican para proteínas que son
estructuralmente homólogas a las moléculas clásicas. Estas moléculas no clásicas
mapean en el CMH y son oligomórficas. HLA -E es tan ubicua como HLA-A, -B y -C
y presenta péptidos hidrofóbicos derivados de las secuencias líder de HLA-A, -B, -C
y -G. (Bahram, 2000). HLA-F y -G tienen un patrón de expresión bastante más
restringido. Otra molécula no clásica, HFE (o HLA-H) está involucrada en el
metabolismo del hierro (Cardoso, 2003).
Existen otras proteínas de clase I no clásicas, pero que se encuentran
codificadas fuera del CMH. De éstas, sólo CD1 posee funciones de presentación de
antígeno (Ag). Esta molécula presenta Ag lipídicos o glucolipídicos derivados de
micobacterias al TCR aB (Dutronc, 2002). Por otro lado, FcRn es la encargada del
transporte de inmunoglobulinas del lumen al intersiticio de intestino y en placenta
(Ghetie, 2002).
Recientemente se identificó una nueva familia de genes localizada dentro del
CMH, a la que se denominó MIC (MHC class 1 related Qhain, Bahram, 1994). Esta
familia está compuesta por dos genes funcionales, MICA y MICB, y cinco
pseudogenes MICC, MICD, MICE, MICF y MICG (Fig. 1, Bahram, 2000).
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
"¡CB NICO HICE
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Figura 1. Los genes y pseudogenes MIC están situados a lo largo de la región de clase I del CMH.Cada exón codifica para un dominio de la proteina: L, péptido Líder; TM, región transmembrana; Cyt,cola citoplasmática; UT, región no traducida 3' (Bahram, 2000).
Genética y Genómica de MICA
Los genes MICA y MICB, de 11.722 y 12.930 pb, respectivamente. Son
inusualmente largos comparados con los genes del HLA, que tienen una longitud
promedio de 3,5 kpb (Bahram, 1996a y b). Sin embargo, la estructura genómica
general semeja aquella de los genes de clase I del CMH, donde distintos dominios
están codificados por distintos exones (Barclay, 1999).
Además de humanos, el gen de MICA se halla en otros primates, como así
también en cabra, puerco, vaca, perro y hamster, aunque no se encontró en el
genoma de ratón (Bahram, 1994). Sorprendentemente, el grado de identidad de
secuencia entre humanos y primates (70%)es mucho menor que entre las secuencias
de clase I respectivas (más del 95%), demostrando que este gen evoluciona muy
rápidamente (Steinle, 1998).
Transcripto y proteína de MICA
El gen de MICA codifica para un ARNm de 1.382 nucleótidos (nt) que
contiene un marco de lectura abierta de 1.149 nt, originando un polipéptido de 383
Introducción
6
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
aminoácidos y 43 kDa (Bahram, 1994). Esta longitud varía de acuerdo al número de
repeticiones de alanina del segmento transmembrana de diferentes alelos. El gen de
MICB genera un transcripto de 2.376 nt y un marco de lectura abierto de la misma
longitud que MICA, con quien comparte un 83% de similitud de secuencia
aminoacídica. MICA y MICBson glucoproteínas que comparten solamente 21%, 19%
y 34% de identidad con otros genes de clase I del CMH en los dominios
extracelulares a1, a2 y a3, respectivamente (Bahram, 1996c). La proteína MICA
recién sintetizada contiene un pépüdo líder de translocación al retículo
endoplasmatico, tres dominios extracelulares 0L],a2 y 0.3, un segmento hidrofóbico
de transmembrana y una cola citoplasmática relativamente corta (42 aminoácidos,
Bahram, 1994). En células epiteliales polarizadas se observó que la cola
citoplasmática dirige a esta molécula a la superficie basolateral (Suemizu, 2002). El
dominio a3 carece de la secuencia de unión al correceptor CD8. La presencia de 8
sitios de N-glucosilación en MICA y 5 en MICB, contrasta con el único sitio de
glucosilación de las moléculas clásicas de clase I, el que a su vez está ausente en
MICA y MICB (Bahram, 1994). La proteína MICA nativa esta altamente glucosilada,
lo que incrementa su peso molecular de 43 (péptido desnudo) a 65 kDa (proteína
madura, Groh, 1996).A diferencia de otras moléculas de clase I, MICA no requiere de
Bz-microglobulina ni del procesamiento antigénico o de las proteinas TAP para su
expresión en superficie (Groh, 1998;Zwirner, 1998).
La gran divergencia entre MICA y MICB reside dentro de los respectivos
exones del segmento transmembrana. A diferencia de MICB, MICA posee
variaciones en el número de repeticiones de la secuencia en tándem CCI", que
codifica para diferente número de alaninas (Mizuki, 1997). Basado en el número de
estas repeticiones, los alelos se denominaron A4, A5, A6, A9 A10 y A5.1. Este último,
también denominado alelo MICA*008, es idéntico a A5 excepto que posee una
inserción (G) que genera un codón de terminación prematura dentro de la región
transmembrana (0ta, 1997).
OQOGG.UCQOOÓQOQ.OOOOOCCOOOOOOOOÓOOOOOOQOOOÓOCOOOÓ
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
En 1999 se cristalizó la porción extracelular del alelo MICA*001 (Fig. 2, Li,
1999)y se pudo observar que efectivamente el bolsillo de posible unión de péptido es
muy angosto (10 Á) como para contener un ligando, comparado a los 18 Á del
bolsillo de las moléculas clásicas de clase I del CMH. La estructura obtenida confirmó
que MICA no se une a Bz-microglobulina.
Figura 2. Estructura cristalográfica de MICA. (A) La estructura de los dominios 0.1, a2 y a3responden a la estructura general de las moléculas de clase I del CMH, pero (B) el bolsillo formadopor los dominios al y a2 es demasiado angosto para contener un péptido, comparado con la moléculaclásica HLA-B27 (Li, 1999).
Polimorfismo de MICA
Los genes de las moléculas de clase I clásicas del CMH son los más
polimórficos entre los genomas de vertebrados (Bahram, 2000). Hasta la fecha se han
descripto más de 558 alelos para HLA-B, 303 para HLA-A, y 150 para HLA-C
(ht_tp:¿¿www.anthonynolan.org.uk¿HIG¿index.html). La mayoría de ellos son
variaciones no sinónimas. Esta extraordinaria diversidad permite a estas moléculas, a
nivel poblacional, presentar un número virtualmente infinito de péptidos antigénicos
a los linfocitos T (Hill, 1998).
En cambio, los genes de clase Ib del CMH son oligomórficos, con 6 alelos
descriptos para HLA-E, 2 alelos para HLA-F y 15 alelos para HLA-G. En ese contexto
es sorprendente que MICA posea más de 60 alelos descriptos hasta la actualidad
h : www.anthon nolan.or .uk HIG index.html), la mayoría de los cuales
varían en posiciones nucleotídicas no redundantes, con predominancia en los
dominios a2 y a3. La naturaleza de la fuerza selectiva para semejante polimorfismo
es aún un motivo de especulación.
Introducción
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
Además de las variaciones en el número de residuos de alaninas en la porción
b‘ansmembrana y el alelo MICA*008con una porción transmembrana truncada, el
alelo MICA*010codifica para una proteína inestable que es retenida en el interior de
la célula (Li, 2000). Los alelos más frecuentes en diferentes grupos étnicos son
MICA*008, seguido por MICA*OOZ,004 y 010, dependiendo de las poblaciones. Los
genes MIC parecen no ser esenciales para la vida, ya que una deleción en la región
del CMH produjo que 0,1024%de la población japonesa carezca completamente del
gen de MICA y el gen de MICB contiene un codón de terminación prematuro
(Komatsu-Wakui, 1999). A diferencia de las graves consecuencias de la ausencia de
genes funcionales de clase I o clase II del CMH, los individuos MIC-/- son
aparentemente normales.
MICAy transplante
Si bien no se sabe cuál es el rol del polimorfismo de MICA, este fenómeno ha
atraído la atención de la comunidad científica de histocompatibilidad por su posible
rol como aloanh’geno. Nosotros hemos observado que el gen de MICA se expresa en
forma codominante (Molinero, 2002), y se han encontrado anticuerpos dirigidos
contra ciertos alelos de MICA en sueros de pacientes con rechazo de transplante de
riñón, corazón y pulmón (Zwirner, 2000).Asimismo, se ha observado una correlación
entre la presencia de anticuerpos anti-MICA y el rechazo agudo de transplantes
renales (Sumitran-Holgersson, 2002). Los aloanticuerpos depositados en las células
endoteliales del órgano transplantado podrían activar mecanismos efectores del
rechazo tales como la lisis por complemento y la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo (Ac), que en última instancia conducirían al rechazo del aloinjerto.
Control de la transcripción de MICA
A diferencia de los genes de las moléculas clásicas de clase I del CMH, MICA
y MICB no se expresan en forma ubicua. Se encontraron transcriptos de MICA
principalmente en fibroblastos y células epiteliales (Bahram, 1994),y su proteína fue
detectada en fibroblastos, queratinocitos, monocitos, células endoteliales y células del
epitelio gastrointestinal, pero no en células de linaje linfoide (Zwirner, 1999; Groh,
Introducción
9
ÓOQÓQ...OOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOGOOOOOOOO
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
1996).Además, a diferencia del incremento transcripcional y traduccional que tienen
los loci de clase I y II del CMH inducido por interferones (IFN) de tipo I y II, los
niveles de ARNm y de proteínas de MICA y MICB no son afectados por estas
citoquinas (Groh, 1996; Zwirner 1999). Esto se debería a que la estructura del
promotor de MICA y MICB es muy diferente a la de los genes de clase I del CMH,
donde no se encontraron sitios respondedores a IFN (Bahram, 2000). Sin embargo,
MICA y MICB poseen un elemento de respuesta a choque térmico, que es común a
muchos genes que se inducen frente a estrés, el prototipo de los cuales es el gen de
HSP70, codificado también en el CMH (Sargent, 1989). Consecuente con esto, se
observó un incremento de la expresión de MICA y MICB en respuesta a choque
térmico en líneas celulares de origen epitelial (Groh, 1996;Groh, 1998).
Receptores de MICA: NKGZD
En 1998 se postuló que MICA interactuaba con el receptor TCR yó V71 de una
subpoblación de linfocitos T 76. Se observó que dicha interacción inducía la
citotoxicidad sobre líneas celulares de epitelio intestinal que expresan MICA en
respuesta al choque térmico (Groh, 1998).Este mecanismo es independiente de TAP
y del proteasoma y fue inhibido por anticuerpos monoclonales (AcMo) anti-TCR yó o
AcMo anti-MICA. Esto llevó a postular que MICA funcionaría como una señal de
peligro en células en estado de estrés (Matzinger, 2002) y que su interacción con
linfocitos T 76citotóxicos contribuiría a la homeostasis de epitelios (Fíg. 3)
Estímulo de estrés
Lisis: homeostasisCélula epitelialde epitelios
Iinfocito T ys V81
Figura 3. MICA interacciona con el TCR 78V81 y funciona como sensor de estrés celular.
Introducción
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Sin embargo, en 1999, Bauer y colaboradores (Bauer, 1999) demostraron que
NKG2D (un receptor huérfano de células NK), es el principal receptor de MICA. El
gen de NKG2D es miembro del grupo de genes NKG2, localizado en el brazo corto
del cromosoma 12 en humanos, y en el cromosoma 6 de ratón. NKGZA a F son genes
que codifican para proteínas de transmembrana de tipo II con un dominio de lectinas
tipo C. NKG2D es el miembro más divergente de esta familia, ya que comparte sólo
el 20% de identidad de secuencia con los otros miembros, quienes poseen más de 90
% de homología entre sí.
En humanos, NKG2D se expresa en células de potencial citotóxico, como los
linfocitos T aB CD8+,linfocitos T 76 y células NK (Bauer, 1999). En ratones también se
encuentra en macrófagos (Diefenbach, 2000). El gen de NKG2D codifica para una
proteína de 42 kDa que requiere de la molécula transductora de señales DAPIOpara
su correcta localización en la superficie celular (Bauer, 1999). La co-cristalización de
MICA con NKG2D mostró que un homodímero de NKG2D se une a un monómero
de MICA (Fig. 4, Li, 2001a). Sin embargo, no todos los alotipos de MICA se unen con
la misma fuerza a NKG2D. Aquellos alelos que poseen una valina en la posición 129
(MICA*004,008, 016, entre otros) presentan una afinidad reducida con respecto a
aquellos alelos que tienen una metionina en la misma posición (MICA*001y 007,
Steinle, 2001).
NKGZD
Figura 4. Representación de la interacción entre MICA y NKG2D. (Li, 2001)
Introducciónr
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
La interacción entre MICA y NKG2D, lo mismo que la expresión de NKG2D
en todos los linfocitos T 76, llevó a cuestionar la naturaleza de la interacción entre
MICA y el TCR 76 V71. Sin embargo, Wu y colaboradores (Wu, 2002) demostraron
que la proteína MICA recombinante soluble se une a ciertos TCR 76V61 expresados
en forma ectópica en células carentes de NKG2D.
Otros ligandos de NKG2D
NKG2D es un receptor bastante promiscuo, y en sólo tres años se describieron
varios ligandos (Fig. 5). Posteriormente al descubrimiento de su interacción con
MICA se encontraron otros ligandos de NKG2D, tanto en humanos como en ratones,
todos ellos relacionados estructuralmente con las moléculas de clase I del CMH.
Además de MICA y MICB, en humanos se encuentran las moléculas unidas a
glucosil-fosfaüdíl-inositol (CPI) ULBP-l a -4 (E16 binding protein, Cosman, 2001,
Chalupny, 2003),y en ratón se encuentran el antígeno menor de histocompatibilidad
H60, la familia de moléculas unidas a GPI Raelot a e (retinoic acid early inducible
genes, Cerwenka, 2000), y MULTI (homólogo murino de los ULBPs humanos,
Carayannopoulos, 2002; Diefenbach, 2003). A semejanza de MICA y MICB, todos
estos ligandos se inducen en respuesta a estrés y ninguno se une a Bz-microglobulína.
La cristalización conjunta de NKG2D con ULBP-S (Radaev, 2001) y Rae-1B (Li, 2002a)
demostró que la interacción de NKG2D con sus ligandos responde a un modelo de
ajuste inducido.
Humano e‘v
dominio tipo Iectina
dominios a1 ya2 de clase l deCMHdominio a3 de clase I deCMHanclaje a membrana deglícosilfosfatidil ¡nositoi
Figura 5. NKG2D reconoce a un grupo diverso de ligandos relacionados estructuralmente con lasmoléculas de clase I del CMH tanto en ratones como en humanos. Linfocitos T CD8“:linfocitos T 76,
Introducción
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células NK y macrófagos murinos utilizan a NKGZDpara reconocer a MICA, MICB, ULBP-l, -2,-3y -4en humanos, y a H60, Rae1a, [3,y, 6, e, y MULT-l en ratón (Gleíner, 2003).
Inducción de MICA frente a estímulos de estrés biológico
Debido a que MICA es una molécula inducible por estrés, se evaluó su
expresión en respuesta a estrés biológicos, tales como infecciones y enfermedades
con perfil inflamatorio. Células endoteliales y fibroblastos infectados con
citomegalovirus humano (CMV) incrementan los niveles de MICA, y la interacción
de estas células con linfocitos T CD8+CD28' singeneicos desencadena una respuesta
citotóxica y la síntesis de citoquinas (IL-2, IPN-y, TNF-a e IL-4) en forma NKGZD
dependiente (Groh, 2001). Sin embargo, esta respuesta no se observó con linfocitos
alogeneicos, lo que llevó a postular que la interacción MICA-NKGZDen linfocitos T
CD8+CD28-podía funcionar como una señal coestimulatoria de la señal primaria del
TCRque reconoce un péptido viral presentado por una molécula de clase I del CMH
(Fig. 6).
Molécula declase I del HLA
Lisis: destrucciónCélula endotelialde células infectadasFibroblasto Infección con
CMV I IIL-2, IFN-Iy, TNF-(X, IL-4
_ , , , . E ProlíferaciónLinfoc1to T c1totox1co Respuesta citotóxicaCD28' CD8+TCRaB
Figura 6. Coestimulación del linfocito T CD8“CD28' a través del sistema MICA-NKGZD.
Por otra parte, los linfocitos T yó V72 V62, muchos de los cuales expresan al
receptor NKGZD, son capaces de reconocer antígenos fosfatados, y poseen un rol
destacado en la respuesta inmune contra la bacteria intracelular Mycobacterium
tuberculosis. Células dendríticas (CD) infectadas con esta bacteria inducen la
expresión de MICA en su superficie celular. Como consecuencia de la interacción
entre estas CD y los linfocitos T 76V72V62, éstos incrementan la producción de IL-2
e IFN-y y la respuesta citotóxica contra las CD en forma MICA- y NKGZD
Introducción
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dependiente (Das, 2001). Por lo tanto, la interacción MICA-NKGZD tendría un rol
potenciador de la respuesta inmune contra micobacterias.
Asimismo, se observó que células dendríticas estimuladas con IFN de tipo I
aumentaban los niveles de MICA en su superficie (Jinushi, 2003a). Esto parecería una
paradoja en vista de la ausencia de elementos respondedores a IFN en el promotor
del gen de MICA. Sin embargo, se observó que en realidad tanto el INF-a y como el
IFN-B promueven la síntesis de IL-15, la verdadera responsable de la expresión de
MICA (Jinushi, 2003b). Las CD activadas con IFN-a aumentan las respuestas
efectoras de células NK (capacidad citolítica y producción de IFN-y), en una forma
dependiente de la interacción física entre MICA y NKGZD (Jinushi, 2003a). Durante
la infección con el virus de la hepatitis C (HCV) se observó que el virus previene la
síntesis de IL-15 inducida por IFN de tipo I, por lo que la célula infectada es incapaz
de expresar MICA y de estimular la respuesta antiviral de las células NK (Jinushi,
2003b).Esto constituiría un mecanismo de escape viral a la respuesta inmune.
Por otro lado, Escherichiacolienteropatogénica se une a través de AfaE a CD55
en la superficie de líneas celulares epiteliales, promoviendo la expresión de MICA
(Tieng, 2002). Las células así infectadas promueven la síntesis de IFN-y por parte de
una línea celular NK (Fig. 7). Asimismo, se observó que biopsias de intestino de
pacientes con enfermedad de Crohn, una patología caracterizada por altos niveles de
citoquinas Th1 inflamatorias, poseen niveles de MICA elevados comparados con
biopsias de individuos sanos. Estos resultados, junto con la evidencia de que E. coli
enteropatogénica se encuentra unida a células epiteliales de pacientes con la
enfermedad de Crohn en estadíos tempranos, llevaron a postular un rol del par
MICA-NKG2Den la producción de citoquinas inflamatorias por parte de células NK
y linfocitos T, lo que exacerbaría la enfermedad.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Q.Lisis de células en estrés
Célula epitelial en estréspor contacto conE. coli enteropatogénica
-—> IPN-ly
Célula NK
Figura 7. MICA estimula una respuesta cítotóxica y secresíón de citoquinas en células NK a travésde NKGZD.
En la artritis reumatoidea, caracterizada por infiltrados linfocitarios,
mediadores inflamatorios e hiperplasia sinovial debida a una proliferación agresiva
de sinoviocitos y macrófagos, se observó la presencia de linfocitos T CD4+ CD28
citotóxicos (raros en individuos sanos) que expresaban al receptor NKGZD.Por otro
lado, los sinoviocitos de la región inflamada expresaban MICA,y la interacción entre
los sinoviocitos y los linfocitos T CD4+ CD28- NKGZD+ promovía la respuesta
inflamatoria (Groh, 2003).
Concordante con la hipótesis de un incremento de la expresión de MICA en
enfermedades con perfil inflamatorio, nosotros observamos una correlación entre la
severidad de la dermatitis seborreica, la síntesis de citoquinas inflamatorias y la
expresión de MICA en biopsias de piel de estos pacientes (Molinero, 2003).
Estos datos muestran que la interacción de MICA con sus receptores,
principalmente NKG2D, funciona como un sistema de inmovigilancia de células que
han sufrido un estrés biológico, tanto una infección como un entorno inflamatorio.
MICA y tumores
Además de su inducción por estímulos de estrés, MICA se expresa en altos
niveles en células que tienen elevadas tasas de proliferación, mientras que las células
que no proliferan tienen bajos niveles de MICA (Groh, 1998). MICA se expresa en
varios tumores de fenotipo epitelial (Groh, 1999), melanomas (Pende, 2002) y
leucemias (Salih, 2003). En todos los casos se observó una importante respuesta
citotóxica de células NK in vitro contra estos tumores, dependiente de NKGZD. La
Introducción
[.ÓÓÓÓÓÓÓÓ.ÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓCCÓÓ.ÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓÓG
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respuesta antitumoral/dependiente de NKGZD involucra no solo la interacción de
MICA, sino también a los ULBPs. Muchos tumores que no expresan MICA expresan
los ULBPs, y la interacción de éstos con NKGZD desencadena una respuesta
citotóxica contra las células tumorales (Pende, 2002, Salih, 2003).
El rol de NKGZD como molécula clave en la respuesta antitumoral in vivofue
confirmado por un elegante y contundente trabajo realizado en ratones por el grupo
de Raulet (Diefenbach, 2001). En este trabajo, se observó que la expresión ectópica de
los ligandos de NKGZD RaelB y H60 en tumores promueve un fuerte rechazo del
tumor, mediado por células NK y linfocitos T CD8+. Asimismo, se generó una
respuesta de memoria de los linfocitos T CD8+contra el redesafío del tumor, incluso
si el nuevo tumor expresaba sólo los niveles endógenos de los ligandos de NKGZD.
Ese mismo año, y también en ratones, se reportó que NKGZD era crucial para la
respuesta antitumoral de linfocitos T yó contra tumores cutáneos inducidos por
carcinógenos (Girardi, 2001). En otro trabajo se demostró que la expresión ectópica
de Raelot induce la respuesta antitumoral mediada por células NK, a pesar de que
estos tumores poseen altos niveles en membrana de moléculas de clase I de CMH
(Fig. 8, Cerwenka, 2001).
Lisis de células tumoralesInmunovigilancia antitumoral
Célula tumoral(alta tasa proliferativa)
Célula NK
Figura 8. Inmunovigilancía antitumoral de células NK a través del sistema MICA-NKGZD.
De la misma manera que se describieron todos estos mecanismos
antitumorales desencadenados por NKGZD, también surgieron mecanismos de
evasión a esta respuesta. Un trabajo realizado en humanos demostró que pacientes
con diferentes tipos de tumores que expresaban MICA en su superficie no eran
rechazados como era de esperarse (Groh, 2002, Salih, 2003). La respuesta a este
fenómeno se debe a que estos tumores liberan MICA soluble al torrente sanguíneo,
Introducción
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que interactúa con NKG2D en la superficie de células NK y de linfocitos T CD8+,e
induce la endocítosis del receptor y la consecuente disminución de la expresión de
esta molécula. Es probable que el mecanismo empleado por estos tumores sea a
través de metaloproteasas, ya que se observó que la adición de un inhibidor de las
mismas a líneas tumorales incrementaban los niveles de MICA en superficie (Salih,
2002)
En artritis reumatoidea se observó el mismo fenómeno de liberación de MICA
para evadir la respuesta inmune, pero en este caso los elevados niveles de TNF-a e
IL-15 debido a la naturaleza inflamatoria de la patología, prevenían la disminución
de la expresión de NKGZD (Groh, 2003).
Estos son algunos de los casos que demuestran que NKGZD y sus ligandos
juegan un rol clave en la respuesta inmune antitumoral. En líneas generales, MICA
funciona como un sensor de la homeostasis celular, marcando células en estado de
estrés o neotransformadas, que son perjudiciales para el organismo.
En concordancia con la hipótesis de que células con una alta tasa proliferativa
inducen la expresión de MICA, se observó que linfocitos T CD4+y CD8+estimulados
con el mitógeno fitohemaglutinina inducen la expresión de MICA (Zwirner, 1998).
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Activación linfocitaria
El montaje de la respuesta inmune depende de la cuidadosa regulación de la
activación linfocitaria. Para este fin, los linfocitos T requieren de dos señales para
activarse completamente. La primera señal deriva de la interacción entre el complejo
CMH-péptido antigénico y el TCR. La segunda señal, denominada coestimulatoria,
' en linfocitos T vírgenes está dada principalmente por el par receptor-ligando CD28
CD80/CD86 (Fig. 9). La coestimulación es crítica para la activación completa de los
linfocitos T vírgenes, el sustentamiento de la proliferación celular, la prevención de la
anergia y/o apoptosis, la inducción de la diferenciación a célula efectora y de
memoria, y la cooperación célula-célula (Kane, 2002,Frauwirth, 2002).
Linfocito T
CD28 - CD80/CD86 Célula Presentadorade antígeno
Figura 9. La activación del linfocito T requiere de la señal 1, derivada de la interacción del TCR conel CMH-péptido, y de la señal 2 o coestimulatoria, proveniente de la interacción entre las moléculasCD28 con CD80 y CD86.
Como ya dijimos, la señal 1 involucra al TCR, que es un receptor clonotípico
conformado por un heterodímero oc/B asociado a otras tres unidades invariantes
diméricas: CD3ys, CD368 y un homodímero CD3 E,(Alberola-Ila, 1997). El complejo
CD3 es el encargado de transducir señales al interior de la célula luego de que el
dímero a/B interaccionó con el Ag en el contexto de una molécula del CMH. Este
efecto puede ser mimetizado por anticuerpos anti-receptor (Abastado, 1995).
Introducción
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Programas de Activación Celular y Diferenciación
La señalización en linfocitos T depende de la duración de la interacción entre
el linfocito T y la CPA (Valitutti, 1995;Valitutti, 1999). La duración de la estimulación
a través del TCR representa la fuerza motriz para la activación, la diferenciación y en
última instancia la muerte del linfocito T (Lanzavecchia, 1999). Los linfocitos T
vírgenes requieren un estímulo de unas 20 horas para establecer un fuerte
compromiso proliferativo (Iezzi, 1998). Este alto umbral de activación se debe a una
maquinaria de señalización ineficientemente acoplada (Cai, 1997; Bachmann, 1999).
En linfocitos T vírgenes la microagregación de la molécula coestimulatoria CD28
recluta microdominios de membrana que contienen quinasas y adaptadores que
amplifican los procesos de transducción de señales desencadenados por el TCR
(Alegre, 2001). Esto permite que el umbral de activación sea alcanzado más
rápidamente y a menores dosis de Ag que en ausencia de coestimulación (Viola,
1999; Iezzi, 1998). A diferencia de los linfocitos T vírgenes, las células T de memoria
tienen un bajo umbral de activación porque su maquinaria de transducción de
señales está perfectamente acoplada (Cai, 1997; Bachmann, 1999). Por otro lado, una
estimulación excesiva de linfocitos T conduce a una muerte celular inducida por
activación, un estadío final que puede ser evitado por la microagregación de CD28,
que aumenta los niveles de la molécula antiapoptótica Bcl-xL (Kerstan, 2004).
Después de completar el primer ciclo de mitosis, las células T activadas se dividen
aproximadamente cada 10 horas, dando origen a un gran número de células.
Mientras los linfocitos T se dividen en condiciones de continua estimulación a través
del TCR y por citoquinas, las células se diferencian progresivamente y adquieren la
capacidad de producir citoquinas efectoras (Gett, 1998; Bird, 1998). Esto lleva
paulatinamente a la polarización hacia un perfil Thl o Th2, la que es promovida,
respectivamente, por IL-12 e IL-4 (Trinchieri; 1998, Seder, 1994; Coffman, 1999;
O’Garra, 1998). La polarización es promovida también por la fuerza y duración la
estimulación a través del TCR (Constant, 1995; Kundíg, 1996). Durante la
polarización del linfocito T se expresan factores de transcripción característicos de
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linaje, tales como T-bet para células Th1 o GATA3 y c-Maf para células Th2 (Zheng,
1997; Szabo, 2000; Ho, 1998).
Transducción de señales a través del TCR
Una de las primeras consecuencias bioquímicas de la unión del TCR al
complejo CMH-péptido es la activación de la proteína tirosina quinasa (PTK) específica
de linfocitos (Lck), que interacciona físicamente con los correceptores CD4 y CD8
(Hermiston, 2002). Para actuar, Lck debe ser defosforilada por la fosfatasa CD45. Una
vez que Lck es activada, fosforila sustratos claves, incluyendo motivos especializados
de la cadena CD3 (Singer, 2002). La fosforilación de estos motivos de activación de los
inmimorreceptores basados en tirosina (ITAM), que se encuentran en cada una de las
subunidades del complejo CD3, crea sitios de anclaje para los dominios de
homología 2 de Src (SH2) en tándem de la PTK ZAP-70, que está unida al
homodímero CD3E_.Como resultado del reclutamiento de ZAP-70, el TCR es
efectivamente dotado con una función PTK,capaz de fosforilar numerosas proteínas,
y activar varias cascadas de segundos mensajeros (Kane, 2000). Estas incluyen, entre
otras, a la fosfolipasa c-yl (PLC-71, cuya activación inicia la vía de los
fosfatidilinositoles -PIP2-, que promueve el incremento de calcio intracelular y de
diacilglicerol -activador de la proteínaquinasa C, PKC),Vav (un factor intercambiador
para guanosin-trifosfatos, que facilita la reorganización del citoesqueleto), y
componentes de las vías de señalización de las proteínas quinasas activadas por
mitógenos (MAPK), tales como ERK, INK y p38 (Fig. 10, Singer, 2002).
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IN PKC fi. PLC-y j \
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Calcineurina l I STATSl INK
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ERKl/ERKZ
NFATJ, l p38 MAPKI
, l t l l
Nudeo NFA‘] Factores de transcripción: Fosdun (AP-1)
I- Activuión de genesProgresión en el ciclo celular
Figura 10.Algunos de los mecanismos de transducción de señales desencadenados por la activacióndel linfocito T. NFAT-P, fosfo-NFAT.
Activadón de gene (citoquinas).Inducción de IL-2 e IL-ZR
Hay tres grupos principales de MAPK en mamíferos: las proteínas quinasas
reguladas por señales extracelulares (ERK, Schaeffe, 1994), las quinasas p38 (Hang, 1999)
y las quinasas del NHz-terminal de C-Iun (INK, Davis, 2000; Chang, 2001). La p38 MAPK
y la INK también son llamadas proteínas quinasas asociadas a estrés (SAPK) por su
capacidad de activarse ante estímulos de estrés y citoquinas inflamatorias tales como
TNF-oc e IL-1 (Dong, 2002).
La vía de ERK está generalmente implicada en la regulación de ciclo celular y
diferenciación. Hay dos isoformas de ERK, ERKI y ERKZ, de 44 y 42 kDa,
respectivamente (Boulton, 1991). Durante la activación de linfocitos T, la vía de ERK
es necesaria para la respuesta proliferativa y la diferenciación a un perfil Th2
(Yamashita, 1999).
Por otro lado, las quinasas p38 MAPK y INK1 son muy importantes para
definir el destino de células de perfil proinflamatorio Th1. La p38 MAPK media la
producción de IFN-y inducida por las citoquinas pro-inflamatorias IL-12 e IL-18 en
células Thl (Yang, 2001; Zhang, 2000). Los inhibidores de p38 MAPK (813203580y
83202190) bloquean la producción de IFN-y en forma dosis dependiente, pero no
ejercen ningún efecto sobre la producción de IL-4 en células Th2 (Rincón, 1998).Por
otro lado, las isoformas de INK, INKI y JNK2, se expresan en linfocitos T activados,
pero no en linfocitos T quiescentes (Weiss, 2000).Una vez expresadas, la actividad de
INK es relevante para la generación de un perfil Thl, ya que JNKI inhibe la síntesis
Introducción
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de las cítoquínas de perfil Th2 IL-4, IL-5 e IL-10 (Dong, 1998),y JNKZ es esencial para
la síntesis de IFN-y (Yang, 1998).
Estas vías de señalización conducen en última instancia a la activación de
factores de transcripción, tales como el factor de transcripción de la cadena Kde linfocitos
B (NF-KB), la proteína activada-1 (AP-1) y los factores nucleares de activación del Iinfocito
T (NFAT), que promueven la transcripción de genes claves para el desarrollo de
funciones efectoras del linfocito T.
La vía de señalización de NF-KB es blanco característico de procesos de
neotransformación y cítoquínas inflamatorias, tales como TNF-a e IL-1 (Li, 2002b).
En mamíferos hay 5 proteínas de la familia NF-KB/Rel: RelA (p65), RelB, c-Rel, p50 y
p52. Estas proteínas forman homo- o heterodímeros, de los cuales los formados por
RelA, RelB y c-Rel tienen actividad transactivadora, mientras que los homodímeros
p50-p50 y p52-p52 poseen funciones silenciadoras de la transcripción, a menos que se
unan a Bcl-3 (Kane, 2000). Los factores de transcripción diméricos NF-KB/Rel se
encuentran secuestrados en el citoplasma por su inhibidor IKB. Un estímulo
activador de la vía induce la fosforilación de IKBpor el complejo multimérico quinasa
de Ich (IKK), compuesto por las subunídades IKKa, IKKB (sensibles al inhibidor
sulfasalazína) e IKKy, y posterior degradación de IKBpor el proteasoma (Fig. 11,
Ghosh, 1998; Barkett, 1999). Una vez liberados, los dímeros NF-KB se translocan al
núcleo y promueven la transcripción génica. El mecanismo de regulación de NF-KB
es de retroalimentación negativa, ya que uno de los genes blanco de la transcripción
de este factor es el gen de IKBa,el que una vez sintetizado vuelve a secuestrar a NF
KB hacia el citoplasma (Verma, 1995). Por ello, luego de un estímulo agudo se
generan dos ondas de reclutamiento de NF-KBa los promotores de los genes blancos
(Saccaní, 2001).
La activación de NF-KBdurante la estimulación de los linfocitos T requiere
tanto de la microagregación del complejo TCR/CD3 como de la coestimulación a
través de la molécula CD28. Estos eventos activan a la PKCG, la PKC de mayor
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relevancia en linfocitos T, que a su vez activa al complejo IKK (Fig. 11, Sen, 2002; Li,
2002b).
INDUCCIÓN DE GENES
Figura 11. La activación del complejo TCR/CD3 y de la molécula coestimulatoria CD28 activan la vía (leNF-KB.
La familia de factores de transcripción NFAT es regulada por calcio y
calcineurina, mientras que las proteínas AP-l (compuestas por c-Fos y c-Iun), son
reguladas por la PKC, Ras (activadora de la Víade ERK)y INK.
Las proteínas NFAT contienen dominios regulatorios en su extremo amino
terminal, los que controlan la localización subcelular y la activación transcripcional
de estas moléculas (Aramburu, 1998). En células en reposo, este dominio esta
altamente fosforilado. Luego de la activación linfocitaria, NFAT es defosforilada por
la calcineurina, una fosfatasa dependiente de calcio y blanco de los fármacos
inmunosupresores ciclosporina A y FK506, lo que le permite translocar al núcleo y
ejercer su actividad transactivadora (Aramburu, 1998).Muchos genes, tales como IL
2, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y y TNFa requieren para su inducción de la
interacción cooperativa entre NFAT y AP-1 (Macián, 2001).
Introducción
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
Señalización a través del receptor de IL-2
Uno de los eventos claves de la activación de los linfocitos T es la producción
de la citoquina mitogénica interleuquina 2 (IL-2). IL-2 tiene un rol muy importante
tanto en la proliferación celular como en la protección contra la muerte celular, por
activación de mecanismos antiapoptóticos (Ellery, 2002).Esta citoquina actúa a través
del receptor IL-2R, que está formado por las subunidades a (CD25), By yc(Kasaian,
1989). Las subunidades [3y yc,que son componentes funcionales de otros receptores
de citoquinas, forman un receptor de afinidad intermedia para IL-2, el que está
expresado en forma constitutiva en linfocitos T vírgenes (Takeshita, 1992). Al
asociarse con la subunidad a, se convierten en el receptor de IL-2 de alta afinidad
(Arima, 1991). La expresión de la subunidad a es inducida en linfocitos T vírgenes
como consecuencia de la señalización a través del TCR, lo que aumenta la
sensibilidad de la célula a IL-2,y la robustez de la respuesta inmune (May, 1998).
La proliferación de linfocitos T inducida por IL-2 depende críticamente de la
activación de Iakl y Jak3, que esta asociada a la subunidad ycdel IL-2R (Boussiotis,
1994). Esta quínasa esta ausente en linfocitos T vírgenes, pero su expresión, al igual
que CD25, es inducida en respuesta a señales derivadas del entrecruzamiento del
TCR (May, 1998). La activación de Iak3 inducida por IL-2 genera señales de
proliferación a través del transductor de señales y activador de Ia transcripción 5 (STATS,
Kawahara, 1995). Por otro lado, la señalización de IL-2 involucra a la fosfatidil inositol
3 quínasa (PI3K), quien a su vez activa a la quínasa p7056(Monfar, 1995). La adición
de rapamicina inhibe la activación de la quínasa p7056y la entrada en la fase S del
ciclo celular de linfocitos T estimulados con IL-2, inhibiendo la progresión en el ciclo
celular (Kuo, 1992). Asimismo, IL-2 activa a las quinasas INK, p38 y al factor de
transcripción NF-KB(Ellery, 2002, Arima, 1992).
Luciana L. Molincro Tesis Doclorul
OBJETIVOS
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Objetivos
Considerando que
MICA se induce en linfocitos T activados con el mitógeno PHA,
pero se desconoce si este gen puede índucirse en respuesta a estímulos
fisiológicos,
se desconocen los mecanismos íntracelulares involucrados en la
inducción de la expresión de MICA,
se proponen como objetivos del presente trabajo de Tesis
1. Estudiar los estímulos fisiológicos capaces de inducir la expresión de MICA en
linfocitos T.
2. Estudiar rutas de transducción de señales involucradas en la inducción de
MICA en linfocitos T activados.
3. Estudiar factores de transcripción que promuevan la síntesis de MICA.
4. Estudiar las consecuencias funcionales de la expresión de MICA en linfocitos
T activados.
MATERIALESY
MÉTODOS
Materiales VMétodos
1. Reactivos
Las drogas U0126, 58202190 y rapamícína fueron adquiridos a Calbiochem (La Jolla,
CA, EEUU). AG490 y PP] fueron adquiridas a Biomol Research Laboratories (Plymouth
Meeting, PA, EEUU). Las drogas fueron disueltas en DMSO a 5, 2, 1, 25, y 10 mM,
respectivamente. La ciclosporina (CSA)fue gentilmente provista por Novartis, Buenos Aires,
Argentina. El FK506 (Fujisawa Ireland, Kerry, Ireland) fue gentilmente provisto por Gador,
Argentina. La sulfasalazina (SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, EEUU) se diluyó en
DMSO a 0,5 M. Las concentraciones empleadas en cada se ensayo se especifican en cada
experimento.
2. Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP)
Se extrajo sangre de donantes voluntarios sanos, se diluyó al medio con solución
isotónica de cloruro de sodio a temperatura ambiente y se sembró sobre un colchón de Ficoll
PaqueTMPLUS (Amersham Bíosciences, Uppsala, Suecia). Se centrifugó a 2.000 rpm durante
20 min a temperatura ambiente en una centrífuga de rotor basculante y se colectó la nube de
células mononucleares de sangre periférica (CMSPs). Las células se lavaron 2 veces con PBS
(150 mM de NaCl, 1,7 mM de KH2P04, 5,2 mM de NazHPO4 pH 7,4). Posteriormente se
realizó el recuento de células con azul de Tripan (colorante vital) en una cámara de
Neubauer. Las células se resuspendíeron a razón de 106células/ml en medio RPMI 1640
(Hyclone, Logan, Utah, EEUU) con 10% de suero fetal bovino (SFB, Natocor, Villa Carlos
Paz, Argentina) o 10% de suero humano de dadores masculinos normales de grupo
sanguíneo A (SHA), 100 ug/ml de estreptomícina y 100 U/ml de penicilina, 45 ug/ml de
piruvato de sodio (Sigma) y 2 mM de L-glutamina (Sigma). Al RPM] con todos los aditivos y
SFB se lo denominó RPMI/SFB, y al RPMI con todos los aditivos y SHA se lo llamó
RPMl/SHA.
3. Aislamiento de linfocitos T CD4+y CD8+
Se purificaron linfocitos T CD4+ o T CD8+ por selección positiva a partir de CMSPs
sin estimular o provenientes de cultivos alogeneicos empleando AcMo anti-CD4+ o anti
Materiales y Métodos\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ ..
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
CD8‘ adsorbidos a perlas magnéticas (Dynabeads, Dynal, Oslo, Noruega), de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Las perlas magnéticas fueron lavadas 2 veces con 2 % de SFBen
PBS,luego de lo cual se le agregó la suspensión celular a razón de 107células/ ml y se incubó
durante 20 mín a temperatura ambiente en un agitador orbital. Utilizando un dispositivo
magnético, se separaron las células CD4+ o CD8+ y se realizaron 3 lavados con 2 % de SFBen
PBS. Finalmente, las células se resuspendieron en RPMl/SFB si iban a ser utilizadas para
cultivo celular, o en buffer de lisis, para análisis por Western Blot. La eficiencia de purificación
fue siempre mayor al 95 %, y fue determinada por citometría de flujo.
4. Activación de linfocitos
a. Fitohemaglutinina
La fitohemaglutinina (PHA, SIGMA) se diluyó a 1 ¡Lg/ul en RPM] 1640 y se empleó a
razón de 1 pg/ ml en RPMl/SFB para estimular CMSPs a 37 °C en atmósfera húmeda con 5%
de C02 durante 3 a 5 días, dependiendo del experimento.b. Cultivo Mixto Linfocitario
Se co-cultivaron dos poblaciones celulares de CMSPs de donantes voluntarios sanos
histoincompatibles. Las células estímuladoras fueron resuspendidas en RPMI 1640y tratadas
con 0,02 mg/ ml de mitomicina C (SIGMA) durante 30 min a 37 °C, lavadas 2 veces con PBSy
resuspendidas a razón de 106células/ ml en RPMl/SHA. Se agregó la población de CMSPs
respondedoras (no tratadas) resuspendidas a razón de 106células/ml en RPMl/SHA y se
cultivaron a 37 uCen atmósfera húmeda con 5% de C02 durante 3 a 8 días, de acuerdo a cada
experimento.
Para los ensayos de bloqueo se utilizaron los AcMo anti-HLA clase l monomórfico
W6/ 32, AcMo anti-HLA DR L243, y el AcMo 8124 (control negativo, generado contra
lumazina sintetasa de Brucellaabortus -Goldbaum, 1993-)todos como líquido ascítico diluidos
1/ 1000.Asimismo, se preincubaron células estímuladoras con 20 ug/ ml de AcMo antí-CD86
(clon FUN-1, Pharmingen, San Diego, CA, EEUU) durante 30 min a temperatura ambiente,
luego de lo cual se agregaron las células respondedoras. Las células fueron cultivadas
durante 7 días a 37°Cen atmósfera húmeda con 5% de C02.
c. Estimulación con AcMo anti-CD3 y AcMo anti-CD28
Para la estimulación con anticuerpos, se utilizó 25 ng/ ml de AcMo de ratón
estimulante anti-CD3 humano (clon SK7, Becton Dickinson), o 500 ng/ ml del AcMo de ratón
Materiales y Métodos.¡m cccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccn
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
estimulante anti-CD28 humano (clon L293, Becton Dickinson) en presencia de 0,5 o 1 ng/ ml
de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, SIGMA), originalmente disuelto en DMSO a 25
ng/ ul. Como control de isotipo se utilizó la dilución correspondiente del AcMo BIZ4
purificado. Las CMSPs fueron cultivadas durante 3 días a 37°Cen atmósfera húmeda con 5%
de C02.MPara estimulación con dosis mitogénicas de PMA se utilizó una concentración final de
10 ng/ ml. Las CMSPs fueron cultivadas durante 7 dias a 37°Cen atmósfera húmeda con 5%
de C02.
e. Citoguinas y polarización a perfil Thl o Th2
La interleuquina 2 (IL-2, R&D Systems, Minneapolis, MN) se utilizó a razón de 8
ng/ml, a menos que se especifique lo contrario. Las CMSPs fueron cultivadas durante 3 a 5
días (especificado en cada experimento). La interleuquina 4 (IL-4, Becton Dickinson, San Jose,
CA, EEUU)se utilizó a razón de 5 ng/ ml, a menos que se especifique lo contrario, cultivando
las CMSPs durante 3 a 10 días (especificado en cada experimento).
Para los experimentos de polarización, las CMSPs se cultivaron durante 6 días a 37°C
en atmósfera húmeda con 5% de C02 en condiciones de polarización a perfil Thl con 1
ug/ml de PHA, 2 ng/ml de interleuquina 12 (IL-12,Becton Dickinson) y 100 ng/ml AcMo
anti-IL-4 (Becton Dickinson), o bien en condiciones de polarización hacia un perfil Th2 con 1
pg/ml de PHA, 5 ng/ml de interleuquina 4 (IL-4, SIGMA) y 2 ¡Lg/ml de AcMo anti-IL-12
(Becton Dickinson).
f. PMA e Ionomicina
La PMA se utilizó a 10 ng/ ml y la ionomicina (SIGMA) se empleó a 1 ug/ m], a partir
de una solución madre de 1 mg/ml en DMSO. Las CMSPs se cultivaron durante 3 días a
37°Cen atmósfera húmeda con 5% de C02.
5. Ensayos de Transwell
Para los ensayos de Transwell se utilizaron "insertos" (Nunc Brand Products,
Naperville, IL, EEUU) de 10 mm con membrana de policarbonato de 0,4 um, que se posaron
dentro de una fosa de placas de 24 fosas. Los linfocitos T CD4+purificados se cultivaron en
la fosa interna a razón de 1-2 x 106células/ ml, y las CMSPs se cultivaron en la fosa externa a
Materiales y Métodostttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttth
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
razón de 1-2 x 106células/ml, ambos estimulados con 10 ng/ml de PMA y 1 pg/ml de
lonomícina.
6. Ensayos de linfoproliferación
Se cultivaron 1 x 105CMSPs en 100 ul de RPMl/SFB en placas de 96 fosas de fondo en
U durante 3 a 6 días (dependiendo del experimento) y se agregó 1 uCi de [3H]-timidina (New
Englands Nuclear Life Science, Boston, MA, EEUU) durante las últimas 18 h del cultivo. En
el caso del cultivo mixto linfocitario, se incubaron 1 x 105CMSPs respondedoras y 1 x 105
CMSPs estímuladoras en 200 ul de RPMI/SHA durante 5 días en placas de 96 fosas de fondo
en U y se agregó 1 pCi de [3H]-tímidina durante las últimas 18 h del cultivo. Se cosecharon
las células en papel de lana de vidrio (Whatmann) en un cosechador de células Pakcard
Filtermate (Packard Instruments, La Grange, IL, EEUU), se secaron y se les agregó 2 ml de
solución de centelleo (4 g de PPO y 100 mg de POPOP disueltos en 1.000 ml de tolueno). La
radioactividad fue analizada en un contador de centelleo B (Beckton-Díckinson) y los
resultados expresados como cpm promedio de cultivos por triplicado i desvío estándar. Para
los ensayos de inhibición de la proliferación, el porcentaje de inhibición de la proliferación
fue calculado como 100 - 100 x (Cpmx'cpmflusal)/(Cpmmnx'Cmensal),siendo x el tratamiento
utilizado en dicho ensayo, max el estímulo con AcMo en ausencia de droga o el estímulo
alogeneico en ausencia de AcMo bloqueante, mientras que basal fue, dependiendo del
experimento, CMSPs sin tratar, CMSPs en presencia de Ac CI o bien un cultivo de células
autólogas. El análisis estadístico fue realizado aplicando el test de análisis de varianza con la
corrección de Bonferroni, empleando el programa de computación GraphPad lnStat version
3.05 para Windows 95 (GraphPad Software, San Diego, CA, EEUU).
7. Transfección de células HeLa
Se realizó el protocolo de transfección transitoria con LipofectamineTM 2000
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) de acuerdo a las instrucciones provistas por el fabricante.
Se cultivaron células HeLa en medio DMEM con alta glucosa con 10% de SFB, 100 pg/ rnl de
estreptomicina y 100 U/ml de penicilina, 45 pg/ml de piruvato de sodio y 2 mM de L
glutamina (DMEM completo). El día previo a la transfección se plaquearon 1 x 105células en
500 pl de medio de cultivo sin antibióticos en una fosa de una placa de 24 fosas de tal modo
Materiales y Métodos
3]
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
que estuviesen a 90-95% de confluencia al momento de la transfección. Para cada fosa a ser
transfectada se utilizaron 0,9 ug de ADN (0,8 ug de CMV-RelA o pCEFL, y 0,1 ug de CMV-[3
gal) en 50 ul de DMEM y se mezcló suavemente. Se diluyeron 2 pl de Lípofectamine"'M2000
en 50 ul de DMEM y se dejó reposar 5 min. Se combinó la mezcla de ADN y de
LipofectamineTM2000 y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente,
se agregaron los 100 pl de la mezcla sobre las células, que se cultivaron durante 48 h a 37 °C
en atmósfera húmeda con 5% de C02. Finalmente, las células se levantaron de la placa por
tripsinización y se utilizaron para análisis por WesternBlot.
Los plásmidos CMV-RelA (codifica para el factor de transcripción NF-KBp65(RelA)
bajo el promotor constitutivo CMV), pCEFL-HA (vector vacío) y CMV-Bgal (codifica para la
enzima B-galactosidasa) fueron cedidos por la Dra Mónica Costas (Instituto de
Investigaciones Médicas "Alfredo Lanari”, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos
Aires).
8. Extracción de proteínas
a. Lisados proteicos totales
Tres millones y medio de células fueron lavadas 3 veces con PBS, centrifugadas a
2.000rpm durante 10 min a temperatura ambiente y resuspendidas en 60 pl de bufierde lisis
(TBS -0,15 M de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,4-, una dilución 1/100 de un cóctel de
inhibidores de proteasas (SIGMA)y 1% de 3-[(3-cloroaminopropil)dimetilamino]-1-propano
sulfonato -CHAPS, SlGMA-). Los extractos se incubaron durante 1 h a 4 °C, se centrifugaron
a 14.000rpm durante 15 min y el sobrenadante se trasvasó a un tubo nuevo. Se tomaron 47 ul
de los extractos y se diluyeron con 3 ul de 0,2 M de ditiotreitol (D'l'l') y 10 pl de buffer de
siembra (7 ml de 4X buffer de apilamiento, 3 ml de glicerol, 1 g de SDS, 2 mg de azul de
bromofenol -BPB-).
b. Extractos nucleares para ensayos de EMSA
Cinco millones de células se lavaron 2 veces con PBS,se centrifugaron a 2.000 rpm y
se resuspendieron en 200 pl de PBS y 800 pl de Solución A (10 mM de Hepes, 1,5 mM de
MgClz, 10 mM de KCl pH 7,9, una dilución 1/ 100 de un cóctel inhibidores de proteasas
(SIGMA) y 0,5 mM de DTI").Luego se incubaron en hielo durante 10 min y se agregaron 50
pl de NP-40 10%, se agitó por inversión y a los 2 min se centrifugó a 10.000 rpm durante 20
seg a 4 °C. El sedimento (núcleos) se lavó con 1 ml de Solución A y se centrifugó nuevamente
Materiales y Métodos
32
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
a 10.000 rpm durante 20 seg a 4°C. Se resuspendió el sedimento en 100 ul de Solución B (10
mM de Hepes, 1,5 mM de MgClz, 0,2 mM de EDTA, 20 % de glicerol, 0,42 M de KCl pH 7,9,
una dilución 1/ 100 de un cóctel de inhibidores de proteasas (SIGMA)y 0,5 mM de DTF), y se
incubó a 4 °C con agitación durante 15 min. Se centrifugó a 10.000rpm durante 20 min a 4°C.
Se trasvasó el sobrenadante y se agregaron 2 volúmenes de Solución C (10 mM de Hepes, 60
mM de KC], 20 % de glicerol, 0,25 mM de EDTA, 0,125 mM de EGTA pH 7,9, una dilución
1/ 100 de un cóctel de inhibidores de proteasas (SIGMA) y 0,5 mM de D'IT). Los extractos
nucleares obtenidos se separaron en alícuotas y se guardaron a -70 °C.
c. Extractos nucleares y citoplasmáticos para Western Blot
Tres a cinco millones de células se lavaron con PBSfrío y se agregaron 200 pl de bufler
hipotónico (10 mM de Tris-HCI, 0,2 mM de MgClz pH 6,7, una dilución 1/100 de un cóctel de
inhibidores de proteasas -SlGMA-), y se incubaron durante 5 min en hielo. Se rompieron las
células por pipeteo (100 veces) y se centrifugó a 1.500 rpm durante 10 min a 4°C. Se trasvasó
el sobrenadante (fracción citosólica) a un tubo nuevo, y el sedimento (núcleos) se lavó 2 veces
con PBS. Se resuspendió el sedimento con 100 ul de buffer de lisis nuclear (20 mM de Tris
HCl pH 6,7; 70 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 1% de Triton X-100; 0,5% de
NP-40, una dilución 1/ 100 de un cóctel de inhibidores de proteasas -SlGMA-) y se incubó
durante 30 min en hielo. Posteriormente, se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 min a 4 “C, y
se trasvasó el sobrenadante a un tubo nuevo (fracción nuclear). Para el ensayo de Western
Blot se combinaron 47 ul de cada una de las fracciones con 3 pl de 0,2 M de D'I'l' y 10 ul de
bufferde siembra.
9. Cuantificación de proteínas
Se cuantificó por duplicado la concentración de proteínas con el reactivo comercial
MicroBCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, lL, EEUU) de acuerdo a las instrucciones
del fabricante, utilizando una dilución 1/ 100 de las muestras disueltas en agua.
10. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y Western Blot
Se utilizó el método discontinuo en placa descripto por Hames (Hames, 1981),con un
gel de separación de 8%, 10%, o 12 % de poliacrilamida (1,6, 2,0 o 2,4 ml de
acrilamidazbisacrilamida 30:0,8, respectivamente, 1,5 ml de buffer separador 4X -1,5 M de
Materiales y Métodos
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
Tris-HC], 0,4% de SDS pH 8,8-, 20 pl de 10% de persulfato de amonio, 4 pl de TEMED y
Hzodd c.s.p. 6 ml), según el peso molecular de la proteína a ser resuelta, y un gel de
apilamiento de 3% de poliacrilamida (292,5 pl de acrilamida: bisacrilamida 3020.8,550 pl de
buffer de apilamiento 4X -0,5 M de Tris-HC], 0,4% de SDS pH 6,8-, 13 ul de 10% de persulfato
de amonio, 3 pl de TEMED y Hzodd c.s.p. 2.200 pl). Se sembraron marcadores de peso
molecular Mark12TMMW Standard (lnvitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) y 20 pg de extractos
proteicos disueltos en bufferde siembra por calle. Se llevó a cabo la corrida electroforética en
bujj‘erde corrida (3,02 g de Tris base, 14,4 g de glicina, 1 g de SDS y HzOdd c.s.p. 1 litro) a 150
V hasta que el frente de corrida alcanzó el límite del gel, en una cuba de electroforesis Mini
Protean ll (Bio-Rad, Hercules, CA). Las proteínas separadas por electroforesis fueron
transferidas a una membrana de PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciences),utilizando bufier
de transferencia (3,02 g de Tris base, 14,4 g de glicina, 200 ml de metanol y Hzodd c.s.p. 1
litro), durante 75 min a 250 mA en una cuba de transferencia MiniTransBlot (Bio-Rad). Se
comprobó la transferencia de proteínas a la membrana por tinción con Ponceau S 0.1% en 1%
de ácido tricloroacétíco. Se comprobó la igualdad de carga proteica en cada calle por tinción
del gel con azul de Coomassie (50 % v/v de metano], 10 % v/v de ácido acético, 0,05 % p/ v
de Coomassie Blue R-250 -Bio-Rad-) durante 1 h a temperatura ambiente, y decolorado
durante 16 h con solución decolorante (5% de metanol y 7% de ácido acético en Hzodd).
Las membranas fueron bloqueadas con leche descremada (Bio-Rad) al 5% en TBS
durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente, se realizaron 3 lavados (el primero de 15 min y
los siguientes de 5 min) con TBS-T (TBS con 0,1 % de Tween 20). Se incubó el Ac primario
diluido en TBS-Tcon leche descremada al 1% desde 1 h hasta 16 h, dependiendo del Ac, a
temperatura ambiente. Posteriormente las membranas fueron lavadas 5 veces con TBS-T
(primer lavado de 15 min y los siguientes de 5 min) e incubadas durante 1 h con el Ac de
detección (lg de cabra anti-lgG de ratón o anti-lgG de conejo conjugados a la peroxidasa de
rabanito (HRP, Bio-Rad) en leche descremada al 1% en TBS-T. A continuación, las
membranas se lavaron 5 veces con TBS-Ty se revelaron por quimioluminiscencia empleando
el reactivo ECLTM(Amersham Biosciences), de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y
placas Biomax light (Kodak, San Pablo, Brasil). La intensidad de cada banda observada en la
placa fue cuantificada por análisis densitométrico con el programa Scionlmage (Scion
Corporation, Frederick, Maryland, EEUU).
Materiales y Métodos
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Anticuerpos para Western Blot
Se utilizó una dilución 1/ 5.000 de sueros de conejo anti-MICA (combinación de los
sueros #620 y #621, generados previamente contra péptidos correspondientes a los
aminoácidos 42-60 y 140-160,respectivamente, de la secuencia traducida de MICA, Zwirner,
1998), una dilución 1/ 1.000 de Ac anti-fosfo-ERK (IgG de ratón, Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, EEUU), una dilución 1/ 3.000 de Ac anti-ERK (IgG de conejo, Santa Cruz
Biotechnology), y una dilución 1/ 1.000 de los siguientes Ac: AcMo anti-fosfoTirosina-HRP
PY20 (IgG de ratón, Santa Cruz Biotechnology), Ac anti-IKBa (IgG de conejo, Santa Cruz
Biotechnology), Ac anti-p65(RelA) (IgG de conejo, Santa Cruz Biotechnology), Ac anti-NF-KB
p50 (IgG de conejo, Santa Cruz Biotechnology), Ac anti-GATA-3 (IgG de conejo, Santa Cruz
Biotechnologies), Ac anti-fosfo-STATS (IgG de conejo, Santa Cruz Biotechnologies), AcMo
anti-STATS (IgG de ratón, de Santa Cruz Biotechnologies) o Ac anti-fosfo-STATI (IgG de
conejo, de Santa Cruz Biotechnologies).
11. Ensayo de Retardo de la Movilidad Electroforética (EMSA)
a. Oligonucleótidos utilizados para EMSA
KB-MICA: NFKBS' (5’-GAGTAGGGGCCCT CC'I'I'TCT-3’) y NFKB3' (5'-AGAAAGG
AGGGC CCCTACTC-3').
M (Santa Cruz Biotechnologies):¡(B-consS'(5'-AG'I'TGAGGGGACTTCC CAGGC
3') y KB-cons3' (5'-GCCTGGGAAGTCCCCTCAACI‘-3').
CCAAT del promotor del gen de fibronectina: CCAATS' (5'-GATCCCGGAGCCC
GGGCCAATCGGCGCA-3'), CCAAT3' (5'-TGCGCCGATTGGCCCGGGCTC
CGGGATC-B').
b. Anillado del oligonucleótido simple cadena
Se realizó el anillado de los oligonucleótidos simple cadena mencionados
combinando 10 ug de cada uno de los pares de oligonucleótidos, 5 ul de bufier de anillado
10X (500 mM de Tris-I-ICl pI-I 7.5; 10 mM de espermidina; 100 mM de MgClz; 50 mM de DTI“)
y H20 c.s.p. 50 ul. Se incubó durante 5 min a 85 °C y se dejó enfriar lentamente en el mismo
recipiente hasta que la temperatura llegó a 40 °C. El tubo se pasó a heladera y cuando la
temperatura llegó a 10 °C se pasó a hielo, obteniéndose el oligonucleótido doble cadena (dc).
Materiales y Métodos
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
c. Marcación y purificación del oligonucleótido doble cadena
Se mezclaron 150 ng de oligonucleótido dc con 2,5 ul de bufl'erT4PNK 10X (Promega,
Madison, WI, EEUU), 0,5 pl de T4PNK, 50 pCi de [32P]-y-ATPy I-Izo c.s.p. 25 pl, y se incubó a
37 °C durante 60 min. Se separó el oligonucleótido dc de las isoformas simple cadena y del
[32P]-y-ATPlibre por electroforesis en gel con 20% de poliacrilamida en TBE 1X (10,8 g de Tris
base, 5,5 g de ácido bórico, 4 ml de 0,5 M de EDTA, pH 8,0 y Hzodd c.s.p. 1.000 ml). Para la
siembra del gel, se agregaron 10 pl de glicerol a la mezcla de oligonucleótidos. Como
marcador de corrida se sembró un mezcla de BPB/Xileno-cianol/glicerol (BPB/XC)en una
calle adyacente. Se corrió a 200 V durante 2 h en una cuba DUAL ADIUSTABLE SLABGEL
(Unitec. B.S.Scientific Co., Del Mar, CA, EEUU). Se abrieron los vidrios y se pasó el gel a un
papel Whatmann. Se cubrió el gel con un plástico adherente (Rolo-Pack), se detectó la
posición del oligonucleótido dc con una placa autorradiográfica y se escindió la porción del
gel correspondiente con un bisturí. Se trasvasó a un microtubo, se cubrió con solución de
elución (0,5 M de acetato de amonio, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA y 0,1 % de
SDS) y se incubó a 37 °C durante toda la noche. Se precipitó el ADN con 2 o 2,5 volúmenes
de etanol 100% durante 1 h a -70 °C. Se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 min a 4 °C. Se
descartó el sobrenadante y se lavó dos veces con 1 ml de etanol 80%. Se secó el sedimento y
se resuspendió en 150 ul de Hzodd.
d. Ensayo de Retardo en la Movilidad Electroforética
Se mezclaron 5 ug de extractos nucleares disueltos en 10 pl de solución C con 100 ng
de poly(dIodC: dIodC) y 1 ng de oligonucleótido marcado, en un volumen final de 20 ul. Se
incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Para los ensayos de supershifise incubaron
los extractos nucleares con 100 ng de poly(dIodC: dIodC) y 1 pl de los Ac TransCruz Gel
Supersluft anti-p65(RelA), anti-p50 y anti-p52 (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a
temperatura ambiente. Posteriormente se agregó el oligonucleótido dc marcado. En el caso
de los ensayos de competencia, se agregaron 50, 100 o 200 ng de oligonucleótido dc sin
marcar. Las mezclas obtenidas se sembraron en un gel con 6% de poliacrilamida en solución
0,25 X TBE. En una calle adyacente se sembró BPB/ XC. Se sometió a una electroforesis a 150
V durante 2 h 30 min. Se secó el gel 1 h a 80 °C en una secadora de geles Gel Dryer 583 (Bio
Rad) y se reveló la radioactividad con placas autorradiográficas KODAK BIOMAXTMLIGHT
(Kodak).
Materiales y Métodos
36
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
12. Citometría de Flujo
a. Anticuerpos para inmunomarcación
Para la detección de MICA se utilizó 10 ul de suero de conejo #622 sin diluir
generado contra un péptido correspondiente a los residuos aminoacídicos 140-160 de la
secuencia traducida de MICA (Zwirner, 1998). Como control negativo se utilizó suero de
conejo normal. También se utilizó el AcMo anti-MICA D7 generado en nuestro laboratorio
(Ingb, Fuertes, 2002 y 2003). Dicho AcMo fue obtenido por inmunización de ratones de la
cepa Balb/c con la proteína recombinante soluble MICA*008.Alternativamente, se utilizaron
10 ug/ ml de los AcMo anti-MICA y anti-MICB (IgGl, Cosman 2001) donados gentilmente
por el Dr Cosman, Immunex, Seattle, EEUU. Para la detección de CD154 se utilizó 100 pg/ ml
del AcMo anti-CD154 (Ancell, Bayport, MN, EEUU). Como Ac control de isotipo se utilizó la
dilución correspondiente del AcMo BI24purificado. Como Anticuerpo secundario se utilizó
una dilución 1/60 de IgG de cabra contra IgG de conejo, o contra IgG de ratón, conjugada
con FITC (Cappel, Aurora, Ohio, EEUU).
b. Inmunomarcación de superficie
Se utilizaron 500.000 células por tubo. Las células se lavaron con PBScon 1% de SFBy
0,1% de NaNa (PSA). Posteriormente se incubaron 15 min a 37 °C en PBSy 10% suero normal
de cabra, para bloquear las uniones inespecíficas. Las células se centrifugaron a 1.000 xg
durante 5 min. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 pl de suero
de conejo sin diluir o 50 pl de AcMo disuelto en PSA. Se incubó durante 30 min en hielo, se
centrifugó y se lavó 2 veces con 200 ul PSA. Las células se resuspendieron en 20 ul de una
dilución 1/ 60 del anticuerpo secundario conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC)
diluido en PSA y se incubó durante 30 min en hielo y oscuridad. Las células se lavaron 2
veces con 200 pl de PSA, y se resuspendieron en 400 pl de PBSy 0,1% de NaNa. Las muestras
se leyeron en un citómetro de flujo Ortho Cytoron (Ortho Diagnostic, Raritan, N], EEUU).
Los datos obtenidos fueron analizados con el programa WinMDI 2.8 (http://facs.scripps.
edu).
En el caso de la inmunomarcación para CD3, CD4, CD8 y CDl4 (Becton Dickinson) se
realizó la marcación empleando el primer anticuerpo marcado con FITC, de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
Materiales y Métodos
37
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
c. Detección de viabilidad por exclusión de ioduro de propidio
Las células se tiñeron en 500 ul de una solución de 50 ug/ ml de ioduro de propidio
en PBS y se leyeron inmediatamente en el canal de fluorescencia 2 (FL-2) de un citómetro
Ortho Cytoron (Ortho Diagnostic). Los datos obtenidos fueron analizados con el programa
WinMDI 2.8.
d. Tinción de células apoptóticas con ioduro de propidio
Se lavaron 1 x 106 células 2 veces con PBS y se incubaron de 3 a 16 h a 4 °C en
oscuridad con 1 ml de solución de hipodiploidía (100ug/ml de ioduro de propidio disuelto
en 0,1% de citrato de sodio y 0,1 % de Tritón X-100). Las partículas se analizaron en un
citómetro de flujo Ortho Cytoron (Ortho Diagnostic), y los resultados fueron analizados con
el programa WinMDl 2.8.
e. Citometría de flujo para tinción intracitoplasmática de IFNfi
Las células se lavaron con 1 ml de PBS.Se centrifugaron a 2.000 rpm durante 10 min y
se fijaron con 100 ul de 4% de paraformaldehido en PBS a pH 7,4 (PFA) durante 20 min a
temperatura ambiente. Se centrifugaron a 2.000 rpm durante 10 min y se lavaron con 1 ml de
PBS. Las células se resuspendieron en 100 pl de bufferde permeabilización (BP:0,5 ml de 10%
de saponina, 9,5 ml de PSA) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Se
centrifugó a 2.000 rpm durante 10 min, se descartó el sobrenadante y se lavó con 1 ml de BP.
Las células se resuspendieron en 50 ul de BP y se agregaron 10 ul de AcMo anti-lFNy-RPE
(lQProducts, Holanda) o control de isotipo yl-RPE (lQProducts, Holanda). Se incubó durante
30 min a temperatura ambiente y se lavaron con BP. Posteriormente, se lavó con 1 ml de
PSA, se resuspendieron en 100 pl de PSA y se agregaron 100 ul de 2% de PFA pH 7,4. Las
muestras fueron procesadas en un citómetro de flujo Ortho Cytoron (Ortho Diagnostic. Los
resultados fueron analizados con el programa WinMDl 2.8.
13. Purificación de ARN
Todo el material utilizado para ARN fue esterilizado por autoclave realizando dos
ciclos de 30 min.
Se extrajo el ARN total de las células utilizando el reactivo Trizol® (GIBCO BRL,
Carlsbad, CA, EEUU). Se incubaron 5-10 x 106 células/ml de Trízol® durante 2-3 min a
temperatura ambiente y se agregaron 200 ul de cloroformo. Se agitó vigorosamente durante
15 seg y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Se centrifugó a 12.000xg durante
Materiales y Métodostttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt h
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
15 min y la fase acuosa se transfirió a un microtubo nuevo, al que se agregaron 500 pl de
isopropanol. Se centrifugó a 4 °C durante 10 min a 12.000 xg. Se lavó el sedimento con 500 pl
de etanol 70% y se centrifugó a 4 °C durante 5 min a 7.500 xg. Se secó el sedimento y se
disolvió en 25 ul de H20 con dietil pírocarbonato (DEPC). Se diluyeron 2 ul en 80 ul de HzO
DEPC y se cuantificó la concentración de ARN por absorbancía a 260 nm (1.0
Absorbanciazsonmpara ARN simple cadena= 40 ug/ ml) en un espectrofotómetro Genequant
(Amersham Biosciences). El ARN se almacenó a -70 °C para evitar su degradación.
14. RT-PCR
Se utilizó el reactivo comercial Advantage T”RT-for-PCR (CLONTECH, Palo Alto, CA,
EEUU) de acuerdo a las indicaciones provistas por el fabricante. Se tomó 1 ug de ARN y se lo
llevó a un volumen de 12,5 pl con Hzo DEPC. Se agregó 1 ul de oligo(dT)13,se calentó a 70 °C
durante 2 min y se transfirió a hielo rápidamente. Se agregó a cada tubo de reacción las
siguientes soluciones: 4 ul de bufferde reacción 5X, 1 pl de mezcla de dNTPs (10 mM de cada
uno), 0,5 pl de inhibidor de RNAsa recombinante y 1 ul de transcriptasa reversa del virus
Moloney de leucemia murina (MMLV).Se incubó a 42 °C durante 1 h y se detuvo la reacción
por calentamiento a 94 °C durante 5 min. Se diluyó a un volumen de 100 ul con 80 ul de H20
DEPC. La preparación de ADNc se guardó a -20 °C.
Las reacciones en cadena para la polimerasa (PCR) fueron normalizadas contra el gen
de [3-actina usando el oligonucleótido B-Act 5' (5’-TGACGGGGTCACCCACAC
TGTGCCCATCTA-3') y el oligonucleótido B-Act 3' (5'-CTAGAAGCATITGCGGTG
GACGATCGAGGG-3'). Las reacciones de PCR se realizaron con 2,5 ul de bufi'erde PCR 10X,
0,75 ul de MgClz 50 mM, 0,2 ul de dNTPs (25 mM cada uno), 0,75 ul de oligonucleótido B-Act
5’ 10 mM, 0,75 ul de oligonucleótido B-Act 3' 10 mM, 0,3 ul de Taq polymerase 5 U/ul (T
plus, lnbio-Highway, Tandil, Argentina), 5 ul de ADNc y Hzo c.s.p. 25 pl, en un
termociclador PTC-100 (MJ Research, Watertown, MA, EEUU). Las condiciones de la PCR
fueron: 2 min a 94 °C, seguido por 30 ciclos de 45 seg a 94 °C, 45 seg a 66 °C, 2 min a 72 °C y
una extensión final de 10 min a 72°C. Para la PCR para MICA se amplificaron los exones 2 y
3 con los oligonucleótidos MA109C (5'-GAGCCCCACAGTCTTCGTTAT-3') y MA173 (5’
CCTGACGTTCATGCCCAA-3'), en una reacción con 2,5 pl de buffer de PCR 10X, 0,75 ul de
50 mM de MgClz, 0,2 ul de dNTPs (25 mM de cada uno), 0,75 pl de MA109C 10 uM, 0,75 pl
Materiales y Métodos\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ \\.
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
de MA979C 10 uM, 0,3 ul de Taq polímerasa 5 U/ul, 5 uL ADNc y Hzo c.s.p. 25 ul. Las
condiciones de PCR para MICA fueron las siguientes: 94 °C durante 5 min, 66° durante 5
min, 62 °C durante 2,5 min, 30 ciclos a 94 °C durante 1 min, 66 °C durante 1 min, 72 °C
durante 1 min y una extensión final a 72 °C durante 5 min, en un termociclador PTC-100.Los
productos de amplificación fueron resueltos en geles de agarosa 1% en TBE 1X.
15. Transferencia de ADN a membrana e hibridación con sonda marcada con
azp
Los productos de amplificación de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de
agarosa al 1% en TBE 1X a 80 V durante 30 min. Posteriormente, se incubó el gel en NaOH
0,4 N durante 20 min a temperatura ambiente. Se transfirió por capilaridad a una membrana
de Nylon Hybond+ (Amersham Biosciences) durante 16 h a temperatura ambiente. La
membrana se lavó con SSPE 2X (6M de NaCl, 0,4 M de NaHzPO4, 40 mM de EDTA) durante
10 min. Se fijó el ADN a la membrana con UV empleando un horno UV Stratalinker
(Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). La membrana se prehibridó en un tubo cónico de 50 ml al
que se le agregaron 3 ml de solución de prehibridización (6x SSPE -18M de NaCl, 1,2 M de
NaHzPO4 y 120 mM de EDTA-, solución de Denhardt 5x -O,1%de Polivinilpirrolidona, 0,1%
de Ficoll 400 y 0,1% de BSA (Fracción V)-, 0.5% de SDS y 100 pg/ ml de ADN de esperma de
salmón), a 42 °C durante 30 min. En forma simultánea, se realizó la marcación de las sondas
con 0,5 pl de T4PNK, 2,5 ul de buffer T4PNK 10 X, 50 uCi de [32P]Jy-ATP, 3 pmol de
oligonucleótido (sonda para MICA: 5'-ACACGGAACGGAAAGGACC-3'; sonda para [3
actina: 5'-CGCAAAGACCTGTACGCCAA-3') y Hzodd c.s.p. 25 pl, a 37 °C durante 30 mín.
Posteriormente, se agregó la sonda marcada a la solución de prehibridación y se incubó
durante 1 h a 42 °C. Finalmente se lavó durante 10 min a temperatura ambiente en SSPE1 M,
0,1% de SDS (3 M de NaCl, 200mM de NaHzPO4, ZOmM de EDTA, 0.1% de SDS). luego se
lavó durante 15 min a temperatura ambiente en TMAC (3 M de TMAC, 50 mM de Tris base,
2 mM de EDTA, 0,1% de SDS, solución de Denhardt 5x) y finalmente durante 20 min a 58 °C
en TMAC. Se envolvió la membrana en film adherente y se expuso 16 h contra un film
Kodak X-OMAT XKl (Kodak).
Materiales y Métodos
40
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
16. Ensayos de Citotoxicidad
Se utilizaron células NK presentes en CMSPs como células efectoras, cultivadas
durante 4 o S días en ausencia o en presencia de 8 ng/ ml de lL-2. Como células blanco se
emplearon linfocitos T CD4‘ purificados por selección positiva, como se describe más arriba,
estimulados durante 24, 48 o 72 h con 10 ng/ml de PMA y 1 ug/ml de Ionomicina. La
relación célula efectora: célula blanco (EzB)utilizada fue de 50:1. Se realizó la incubación de
las células blanco con 51CrO4Na2en solución acuosa (51Cr,Amersham Biosciences) a razón de
0,1 mCi/106 células, durante 1 h en baño de agua a 37°C. Las células se lavaron 3 veces con
RPMI-1640suplementado con 10% de SFB,y se incubaron con las células efectoras durante 5
h a 37 °C (volumen total: 2001,11).Posteriormente, se cosecharon 100 ul de los sobrenadantes
de cultivo y se cuantificó la radiación en un contador y (Clinigamma, LKB,Wallac, Turku,
Finlandia). Los resultados obtenidos fueron transformados en % de lisis, utilizando la
fórmula:
%delisis: ——cme_CPmLEx 100mw, —cmeE
donde X es la muestra, LE es la liberación espontánea de las células blanco en ausencia de
células efectoras y MAX es la liberación máxima de 100 ul de células blanco tratadas con 100
ul de 2% de Tritón X-100. En todos los casos la liberación espontánea fue menor al 20% de la
liberación máxima.
En algunos ensayos, se preincubaron las células blanco marcadas, con distintas
concentraciones de diferentes anticuerpos (100 ug/ ml de AcMo anti-MICA D7 o AcMo
control de isotipo 8124, dilución 1/ 1000 de ascitis de AcMo W6/32) durante 30 min a
temperatura ambiente. A continuación, estas células blanco fueron incubadas con las células
efectoras como fue descripto previamente y los resultados fueron expresados como % de
lisis.
Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente mediante un análisis de
varianza (ANOVA) con corrección de Student-Newman-Keuls, utilizando el programa
GraphPad lnStat 3.05.
Materiales y Métodos
4]
Luciana L. Molinero Tesis Docloral
RESULTADOS
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
Capitulo I: Expresión de MICA en linfocitos T activados por estímulos
fisiológicos
a. Inducción de la expresión de MICA en linfocitos T por estimulación
con células alogeneicas
Los linfocitos T vírgenes requieren dos señales para su activación: la señal 1,
desencadenada por la interacción entre el complejo mayor de histocompatibilídad
péptido (CMH-p) y el complejo TCR/CD3, y la señal 2 o coestimulatoria, dela cual la
interacción entre las moléculas CD28 y B7 (CD80 y CD86) es la mejor estudiada
(Alegre, 2001).
Previamente, se había demostrado por Western Blot que linfocitos T CD4+ y
CD8+estimulados con PHA expresan MICA (Zwirner, 1998). Estos precedentes nos
llevaron a investigar si estímulos fisiológicos de activación línfocítaria también
inducen la expresión de esta molécula en linfocitos T. Para ello se realizaron
estimulaciones alogeneicas unidireccíonales con células mononucleares de sangre
periférica (CMSPs) de dadores sanos histoincompatibles (Fig. 12). Se realizó un
análisis cínético de la expresión de MICA por Western Blot durante el estímulo
alogeneico. Se observó que dicho estímulo indujo la expresión de MICA en forma
progresiva, con un máximo a los 7 días de cultivo (Fig. 12a). No se detectó MICA en
CMSPs al día 0 de estímulo. La estimulación con células autólogas por 7 días mostró
una señal tenue comparada con el cultivo de células alogeneicas (Fig 12b, panel
izquierdo). Como control de la activación se evaluó la proliferación linfocítaria por
incorporación de [3H]-tjmidina a los 6 días de cultivo, obteniéndose un índice de
estimulación de 31,1 (45.591i 7.612 cpm para el cultivo alogeneico y 1.468 i 189 para
el control autólogo).
A continuación se analizó el fenotipo de las células que componen al cultivo
alogeneico de 6 días por cítometría de flujo. Los datos mostraron que el 87% eran
células CD3+, de las cuales 67% eran CD4+ y el 33 % restante eran CD8+. Los
monocitos, que expresan MICA constitutivamente (Zwirner, 1998), representaron
menos del 0,04% de la suspensión celular (no mostrado). Considerando que los
Resultados
43
DOQOOCOOOOOÓ000.000.000.000.OOOOOÓODOOOOOOOOOCOOOQ
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
linfocitos T CD4+ y T CD8+ son las poblaciones celulares más abundantes durante
una respuesta alogeneica nos propusimos analizar la expresión de MICA en dichas
subpoblaciones. Con este fin se estimularon CMSPs con células alogeneicas por 7
días, se separaron los linfocitos T CD4+o T CD8+con perlas magnéticas acopladas a
AcMo anti-CD4 o anti-CD8, se prepararon lisados y se evaluó la expresión de MICA
por Western Blot (Fig. 12b). Se observó que MICA se expresa tanto en linfocitos T
CD4+ como en linfocitos T CD8+.
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Figura 12. Inducción de la expresión de MICA en linfocitos T activados con células alogeneicas. (a)Análisis cinético de la expresión de MICA por Western Blot de lisados de CMSPs estimuladas concélulas alogeneicas (Alo CMSPs) durante 3 a 8 días (panel superior). Como control positivo de laexpresión de MICA se muestran CMSPs activadas con 1 ug/ ml de PHA (PHA) durante 5 días. Comocontrol negativo se muestran lisados de CMSPs a día 0 de cultivo (dO).La flecha indica la banda de 65kDa correspondiente a MICA. La intensidad de cada banda fue cuantificada por análisisdensitométrico, y los resultados se expresaron en unidades arbitrarias (UA, panel inferior). (b)Expresión de MICA en linfocitos T CD4+ y T CD8+ estimulados durante 7 días en un cultivoalogeneico. Se realizó un Western Blotcon lisados de CMSPs estimuladas con células alogeneicas por 7días y posteriormente se aislaron linfocitos T CD4+con perlas magnéticas acopladas a AcMo anti-CD4(Alo CD4) y linfocitos T CD8+ con perlas magnéticas acopladas a AcMo anti-CD8 (Alo C08). Comocontroles se utilizaron lisados de CMSPs de un cultivo autólogo (Aut) y lisados de CMSPs de uncultivo alogeneico de 7 días (Alo). Los resultados son representativos de 3 experimentosindependientes realizados con CMSPs de diferentes dadores sanos y en diferentes combinacionesalogeneicas.
Resultados
44
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
a. Efecto del bloqueo de la señal 1 y de la señal 2 sobre la expresión de
MICA
Con el objeto de investigar el rol de las señales 1 y 2 sobre la expresión de
MICA durante un estímulo alogeneico, se utilizaron AcMo para inhibir las
interacciones entre el TCR y el CMI-I-p, y entre CD28 y CD86. Para bloquear la
interacción entre el TCR y el CMH-p se utilizó un AcMo anti-HLA clase I (W6/ 32) y
un AcMo anti-HLA-DR (L243). Para inhibir la estimulación desencadenada por la
interacción entre CD28 y CD86 se utilizó un AcMo anti-CD86. Como control se
evaluó el efecto de dichos AcMo sobre la respuesta proliferativa. Se observó una
marcada disminución en la incorporación de [3H]-timidina en CMSPs estimuladas
con células alogeneicas en presencia de los AcMo W6/ 32, L243 y anti-CD86 (Fig. 13a
y 13c),pero no en presencia de AcMo control de isotipo. Sin embargo, la expresión de
MICA inducida durante un cultivo alogeneico sólo fue levemente afectada por la
presencia de estos AcMo (Fig. 13b y 13d).
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
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Figura 13. El bloqueo de la activación alogeneica afecta mínimamente la inducción de MICA. Seanalizó el efecto del bloqueo de la señal 'l en CMSPs activadas con células alogeneicas (Alo) con elAcMo anti-HLA de clase I (W6/ 32) o con el AcMo anti-HLA DR (L243)sobre la incorporación de PH]timidina (a) y sobre la expresión de MICA analizada por Western Blot (b). Se analizó el bloqueo de laseñal 2 en CMSPs activadas con células alogeneicas (Alo) con el AcMo anti-CD86 (oc-CD86)sobre laincorporación de [3H]-timidina (c) y sobre la expresión de MICA evaluada por Western Blot(d). Comocontrol negativo del bloqueo se utilizó un Ac control de isotipo (CI) y como control negativo de laestimulación se realizaron estímulos con células autólogas (Aut). La flecha indica la banda de 65 kDacorrespondiente a MICA. La intensidad de cada banda de (b) y (d) fue cuantificada por análisisdensitométrico y los resultados expresados en unidades arbitrarias (UA, panel inferior). Losresultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes realizados con CMSPsdediferentes dadores sanos y en diferentes combinaciones alogeneicas.* P<0,001vs. Alo.
b. Activación de linfocitos T por microagregación del complejo
TCR/CD3 y de la molécula coestimulatoria CD28
Los resultados descriptos hasta este momento indican que el estímulo
alogeneico induce la expresión de MICA, aunque el bloqueo de las señales 1 y 2 no
son suficientes para suprimir dicho efecto. Sin embargo, durante el transcurso de
dicho estímulo se generan varias interacciones moleculares entre células que podrían
compensar el efecto del bloqueo. Por ello, estudiamos el rol de la activación de
Resultados
46
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
linfocitos T directamente a través de la microagregación del complejo TCR/ CD3 o de
la molécula coestimulatoria CD28 sobre la expresión de MICA.
Se estimularon CMSPs con AcMo anti-CD3 o con AcMo anti-CD28 en
presencia de dosis submitogénicas de PMA, se evaluó la respuesta linfoproliferativa
por incoporación de [3H]-timidina y la expresión de MICA por Western Blot (Fig. 14).
Se observó que ambos estímulos activaron fuertemente la linfoproliferación, con un
índice de estimulación de 61,9 y 122,8 para el AcMo anti-CD3 y el AcMo anti-CD28 y
PMA, respectivamente (Fig. 14a y 14€). El análisis por Western Blot mostró que tanto
la activación mediada por el AcMo anti-CD3 como por el AcMo anti-CD28 y PMA
indujeron la expresión de MICA 3,3 y 19,4 veces, respectivamente (Fig. 14b y 14d).
Con el objeto de evaluar si la inducción era a nivel transcripcional, se analizaron los
niveles de expresión de ARNm de MICA por RT-PCRe hibridación con una sonda
específica. Se observó un incremento en los niveles de ARNm para MICA en CMSPs
estimuladas con AcMo anti-CD3 y en CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD28 y
PMA (Fig. 14e).
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
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llFigura 14. Inducción de la expresión de MICA en CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 o AcMoanti-CDZS y PMA. Se estimularon CMSPs con AcMo anti-CD3 (cx-CD3)o con Ac control de isotipo(CI) y se midió la respuesta proliferativa por incorporación de [3H]-timidina (a) y la expresión deMICA por Western Blot (b). Se estimularon CMSPs con AcMo anti-CD28 (oc-CDZS),1 ng/ ml de PMA(PMA), AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA (a-CDZS/ PMA) o con Ac control de isotipo (CI) y seanalizó la respuesta proliferativa por incorporación de [3H]-timidina (c) y expresión de MICA porWestern Blot (d). La flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA. La intensidad de cadabanda en (b) y (d) fue cuantificada por análisis densitométrico y los resultados expresados enunidades arbitrarias (UA, panel derecho). Además, se estimularon CMSPs como en los casosanteriores, se extrajo ARN, se realizó una RT-PCR y posterior hibridación con una sonda específicapara MICA marcada con 32P(e, panel superior). Las reacciones de PCR se normalizaron contra Bactina (e, panel inferior). Como control positivo de la RT-PCR se utilizó ARN de la línea celular deadenocarcinoma de colon HCT116, que expresa constitutivamente MICA. Asimismo, se utilizó ARNde CMSPs de día O (dO). Los resultados son representativos de 3 experimentos independientesrealizados con CMSPs de diferentes dadores sanos.* P<0,001 vs. AcMo anti-CD3; **P<0,001 vs. AcMoanti-CD28 y PMA.
Resultados
48
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOQOOOOOOOOOOOO
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
A continuación se realizó un análisis cinético de la inducción de MICA en
CMSPs activadas con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA. Mientras que la
respuesta proliferativa, medida por incorporación de [3H]-timidina,alcanzó un pico a
los 4 días de cultivo con ambos estímulos (Fig. 15a), se observó que la expresión de
MICA se indujo en forma sostenida, alcanzando una meseta a los 4 días de estímulo
con AcMo anti-CD3 (Fig. 15b), o a los 3 días de estímulo con AcMo anti-CD28 y PMA
(Fig. 15c).
a
A 15 ,wcm 75 +on-CD28/PMA«e Om ¿r OPMA.°—1o e 50 mcoza>< ¿í
E E MO - o u0123456789 0123456789
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20
CÓ 1 2 3 4 5 6 7 8 9
día
Figura 15. Análisis cinético de la expresión de MICA en CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 ocon AcMo anti-CD28 y PMA. (a) Se realizó un análisis cinético de la respuesta proliferativa porincorporación de [3H]-timidina de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 (eL-CD3)o con control deisotipo (CI, panel izquierdo), o bien de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD28 (cx-CD28),1 ng/ mlde PMA (PMA), o AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml dePMA (a-CD28/ PMA, panel derecho). (b) Se analizóla expresión de MICA por Western Bloten lisados de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 (on-CD3,panel izquierdo) o con AcMo anti-CD28 y 1 ng/ml de PMA (a-CD28/ PMA, panel derecho) de 0 a 9días. La flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA. (c) La intensidad de cada banda en(b) fue cuantificada por análisis densitométrico, y los resultados expresados en unidades arbitrarias(UA). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes realizadoscon CMSPs de tres dadores sanos diferentes.
Resultados
49
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Con el objeto de investigar si la expresión de MICA se induce en la superficie
de linfocitos T activados, se evaluó por citometría de flujo la expresión de esta
molécula en CMSPs activadas con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA (Fig.
16). Sólo el 35 % (7 de 20) de los donantes expresaron MICA en superficie de
linfocitos T presentes las CMSPS activadas con ambos estímulos. De éstos, los
resultados mostraron que más del 45% de los linfocitos T activados con AcMo anti
CD3 expresaron MICA en la superficie celular al cabo de 3 días de cultivo. De
acuerdo al parámetro de tamaño ("Fonuard scatter”), algunas de estas células
mostraron un tamaño característico de células quiescentes, mientras que otras eran
blastos. En el caso de los linfocitos T activados con AcMo anti-CD28 y PMA, más del
50% expresaron MICA en su superficie, y la mayoría eran blastos. Linfocitos T
tratados con un Ac control de isotipo, AcMo anti-CD28 o PMA produjeron
resultados similares a los obtenidos con células no estimuladas (datos no mostrados).
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
a3.08%
FW-SC
FL1 = NRS FL1 = MICA
o:
182% '- 31.62%
FL1 = NRS FL1 = MlCA
103
15.79%
FW-SCFW-SC
03 910'FL1 = NRs FL1 = MICA
Figura 16. Inducción de la expresión de MICA en CMSPs estimuladas por 3 días con AcMo antiCD3 o AcMo anti-CD28 y PMA. Se analizó la expresión de MICA en superficie por citometría de flujoen CMSPs no estimuladas (a y b), CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 (c y d) y CMSPsestimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA (e y f). Las células fueron marcadas con suero de conejonormal (NRS; a, c y e) o con suero de conejo anti-MICA #622 (b, d y f). Los datos son presentados endos dimensiones con FL-1 en el eje de las abscisas y tamaño en el eje de las ordenadas. Los datosmostrados corresponden a linfocitos T quiescentes y activados (blastos), obtenidos de una ventana deun gráfico de tamaño vs. granularidad. El porcentaje de células en cada panel es expresado en elinserto. El punto de corte se estableció con el NRS utilizado para la citometría de flujo. Los resultadospresentados son representativos de aquellos experimentos en los que se observó expresión de MICAen superficie de linfocitos T de CMSPs de diferentes dadores sanos.
o)
Resultados
51
\J
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Conclusiones garciales
MICA se induce en linfocitos T CD4+ y T CD8+ activados durante el
transcurso de una estimulación alogeneica (Fig. 12).
Este proceso ocurre por varias vías que operan en forma simultánea y se
compensan mutuamente debido a que el bloqueo de las interacciones entre
el CMH-p y el TCR o la interacción entre las moléculas coestimulatorias
CD28 y CD86 durante el estímulo alogeneico afecta mínimamente la
expresión de MICA (Fig. 13).
Dos de las vías que inducen la expresión de MICA en linfocitos T activados
son las señales derivadas de la microagregación del complejo TCR/ CD3 en
presencia de células accesorias, y la coestimulación a través de la molécula
CD28 (Fig. 14).
La expresión de MICA inducida por la activación linfocitaria involucra la
activación transcripcional del gen, debido a que se detectó un aumento en
los niveles de ARNm específico (Fig. 14).
Esta activación a nivel transcripcional se traduce en un aumento sostenido
en los niveles de proteínas totales de MICA en los linfocitos T activados
(Fig, 14 y 15) y en un aumento en la expresión de MICA en superficie
celular en un 35% de los dadores (Fig. 16).
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Capitulo II: Mecanismos de transducción de señales involucrados en la
inducción de MICA en linfocitos T activados
a. Mediadores intracelulares involucrados en la expresión de MICA en
linfocitos T activados por microagregación del complejo TCR/CD3
Las tirosina-quinasas Lck y Fyn son activadas inmediatamente después de la
microagregación del complejo TCR/ CD3. Con el objeto de investigar el rol de estas
quinasas sobre la expresión de MICA inducida por la estimulación con AcMo anti
CD3, se bloqueó su actividad con el inhibidor farmacológico PP1 (Hanke, 1996). Se
observó por citometría de flujo de núcleos teñidos con ioduro de propidio que las
concentraciones de PPI empleadas en nuestros experimentos no indujeron apoptosis
en linfocitos T quiescentes o activados con AcMo anti-CD3 (datos no mostrados).
Como era esperado, PPI produjo una fuerte inhibición en la respuesta proliferativa
de CMSPs activadas con AcMo anti-CD3 (Fig. 17a). Ensayos de Western Blot
revelados con un AcMo anti-fosfotirosina confirmaron que PP1 inhibió la actividad
de las tirosina-quinasas de células estimuladas con AcMo anti-CD3 (Fig. 17b).
Asimismo, se observó por Western Blotque PPI inhibió fuertemente la expresión de
MICA en CMSPs activadas con AcMo anti-CD3 (Fig. 17c).
a-CD3 C a-CD3
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a-CD3 mw M W
Figura 17. La inhibición de Lck/Fyn en linfocitos T estimulados con AcMo anti-CD3 previene lainducción de la expresión de MICA. Se analizó la respuesta proliferativa por incorporación de PH]timidina (a), la fosforilación en fosfotirosinas por Western Blot (b) y la expresión de MICA por WesternBlot (c) de CMSPs estimuladas por 72 h (a y c) o 15 min (b) con AcMo anti-CD3 (oz-CD3)en ausencia
Resultados
53
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
(-) o en presencia de 1, 10 o 20 uM de PPI. Como control negativo se analizaron CMSPs tratadas conAc control de isotipo (CI). A la izquierda de (b) se indica la posición de los marcadores de pesomolecular. Los resultados presentados corresponden a un experimento representativo de tresexperimentos independientes con CMSPs de diferentes dadores sanos. “ P<0,001vs. a-CD3.
Debido a que la inhibición de eventos tempranos de la activación del linfocito
T a través del complejo TCR/ CD3 afectan la expresión de MICA, se decidió evaluar
el rol de algunos mediadores intracelulares que se encuentran río abajo de la
señalización de Lck y Fyn. Primero, se emplearon inhibidores de las quinasas de
MEKI/ERK] (U0126, Favata, 1998), y p38 MAPK (SB202190;Fukunaga, 1997), y la
fosfatasa calcineurina (Ciclosporina A, -CsA- y FK506; O’Keefe, 1992). Se demostró
por ensayos de exclusión de ioduro de propidio y de tinción de núcleos con ioduro
de propidio, que las concentraciones de U0126,SB202190,CsA y FK506empleadas no
tenían efectos tóxicos o apoptóticos sobre las células estimuladas (datos no
mostrados). El inhibidor U0126bloqueó completamente la respuesta proliferativa de
los linfocitos T estimulados con AcMo anti-CD3, mientras que SB202190inhibió la
linfoproliferación del 85 al 92%, dependiendo del experimento (Fig. 18a). Asimismo,
ambas drogas inhibieron la inducción de la expresión de MICA en linfocitos T
estimulados con AcMo anti-CD3 (Fig. 18b). Análisis densitométricos de los Western
Blots mostraron que U0126 inhibió la expresión de MICA entre un 78 y un 100%,
mientras que el bloqueo ejercido por SB202190fue del 84 al 93%, dependiendo del
experimento. Fosfo-ERK, la especie activa de ERK, se detectó solamente a tiempos
cortos luego de la activación con AcMo anti-CD3 (15 y 30 min), mientras que a las 72
h, momento de evaluación de la expresión de MICA, los niveles de fosfo-ERKfueron
mínimos (Fig. 18€). Dicha fosforilación se abolió en presencia de U0126. A dosis
crecientes de los inhibidores U0126 y SB202190el efecto sobre la expresión de MICA
fue completo (Fig. 19a y 19h).
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
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a-CD3
Figura 18. La inhibición de MEKI, p38 MAPK y calcineurina previenen la expresión de MICA enCMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3. Las células fueron estimuladas por 72 h con AcMo antiCD3 (cx-CD3)en ausencia (-) o en presencia de 20 ¡4M de U0126 (inhibidor de MEKI), 10 uM deSB202190 (inhibidor de p38 MAPK, SB), y 1 uM de CSA o FK506 (inhibidores de calcineurina).Posteriormente se cosecharon, y se utilizaron para ensayos de proliferación (a) o análisis de laexpresión de MICA por Western Blot (b). Como control negativo, las CMSPs se trataron con Ac controlde isotipo (CI) o se cultivaron en ausencia de Ac por 72 h (RPMI).La intensidad de cada banda en (b)fue cuantificada por análisis densitométrico y expresada en unidades arbitrarias (UA, panel inferior).La efectividad del tratamiento con U0126 fue analizado por Western Blot con Ac anti-fosfo-ERK (pERK) y Ac anti-ERK (ERK) en lisados de células tratadas por 15 min, 30 min o 72 h con AcMo antiCD3 en ausencia (-) o en presencia (+) de 20 pM de U0126 (c). Los niveles basales de ERK y fosfo-ERKfueron analizados en células no tratadas (Basal). Los resultados presentados corresponden a unexperimento representativo de tres experimentos independientes realizados con CMSPs de diferentesdadores sanos. * P<0,001 vs. oc-CD3.
La inhibición de la calcineurina con CsA y FK506también produjo una fuerte
reducción de la respuesta proliferativa de linfocitos T estimulados con AcMo anti
CD3 (inhibición del 64 al 75% para CSA,y del 71 al 93% para FK506, dependiendo del
experimento, Fig 18a). A su vez, ambos compuestos inhibieron parcialmente la
expresión de MICA (Fig. 18b), indicando que la calcineurina también participa en
Resultados
55
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
dicha inducción en linfocitos T activados a través del receptor T. Concentraciones
crecientes de ambos inhibidores fueron incapaces de suprimir completamente la
expresión de MICA (Fig. 19c y 19d).
a U0126 [pM] 0 1 5 20 b 88202190 [pM] 0 1 10 50
CsA [pM]
—>
Figura 19. Efecto dosis-dependiente de U0126, SB202190,CsA y FK506 sobre la expresión de MICAen CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3. Las células se estimularon por 72 h con AcMo anti-CD3(oc-CD3)en ausencia o en presencia de diferentes concentraciones de U0126, 83202190, CsA o FK506,yse analizó la expresión de MICA por WesternBlot.La flecha indica la banda de 65 kDa correspondientea MICA. Los resultados presentados corresponden a un experimento representativo de tresexperimentos independientes realizados con CMSPsde diferentes dadores sanos.
b. Mediadores intracelulares involucrados en la expresión de MICA en
linfocitos T activados por microagregación de la molécula CD28
Debido a que las quinasas Lck y Fyn, ERKl/ 2 y la p38 MAPK también
participan de la señalización inducida por la microagregación de la molécula
coestimulatoria CD28, se evaluó el rol de las mismas sobre la expresión de MICA en
CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA (Fig. 20). Aunque sólo se observó
un efecto inhibitorio de la respuesta proliferativa a la dosis máxima de PPI (20 HM,
Fig. 20a), el efecto inhibitorio sobre la expresión de MICA fue dramático incluso a 1
HM (Fig. 20b). En forma similar, U0126 y 88202190 inhibieron moderadamente la
respuesta proliferativa (del 16% al 18% para U0126, y del 28% al 34% para SB202190,
dependiendo del experimento, Fig. 20d). Sin embargo, ambas drogas mostraron un
marcado efecto inhibitorio sobre la expresión de MICA: del 45 al 68% para U0126 y
del 67 al 100% para SB202190, dependiendo del experimento (Fig. 20e). Como
control, se evaluó la capacidad de PP1 y U0126 para inhibir la fosforilación en
tirosina (Fig. 20€) y la fosforilación de ERK (Fig. 20f), observándose que ambos
fenómenos fueron parcialmente inhibidos por la acción de los fármacos. A diferencia
Resultados
56
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
de lo observado en células estimuladas con AcMo anti-CD3, los niveles de
fosforilación de fosfo-ERK fueron elevados tanto a los 15 min de estímulo como a las
72 h de cultivo con AcMo anti-CD28 y PMA, incluso en presencia de U0126 (Fig. 20f).
El empleo de dosis mayores de U0126 y SB20219O mostró un efecto dosis
dependiente sobre la inducción de MICA en células activadas con AcMo anti-CD28 y
PMA (Fig. 21).
Como era de esperarse, calcineurina, que no se activa luego de la
microagregación de CD28, no está involucrada en la inducción de la expresión de
MICA inducida por la estimulación a través de CD28 y PMA en linfocitos T, ya que
los efectos ejercidos por CSAy FK506fueron mínimos sobre la respuesta proliferativa
(5 a 10% de inhibición para CSA y 4 a 15% de inhibición para FK506, Fig. 20d), y
sobre la expresión de MICA (11 a 24% de inhibición con CSA y 7 a 13% de inhibición
para de FK506, Fig. 20e). El empleo de dosis 10 veces superiores de CSA o FK506 (10
pM) no fue suficiente para bloquear la inducción de la expresión de MICA en
linfocitos T activados con AcMo anti-CD28 y PMA (datos no mostrados).
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
a b a-CDZSIPMA C a-CDZB/PMA
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Figura 20. La inhibición de Lck/Fyn, MEK1 y p38 MAPK pero no de calcineurina, previene laexpresión de MICA en CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA. Se estimularon CMSPs conAcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA (oc-CD28/PMA) por 72 h en ausencia (—)o en presencia de 1, 10 y20 uM de PPI. Se midió la respuesta proliferativa por incorporación de [3H]—timidina(a) y la expresiónde MICA por Western Blot (b). Se analizó por Western Blot el efecto inhibitorio de PP1 sobre lafosforilación en tirosina en lisados de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CDZS y 1 ng/ ml de PMApor 15 min e incubadas en ausencia (—)o en presencia de 1 o 10 uM de PPI (c). A la izquierda se indicala posición de los marcadores de peso molecular. Como control negativo en (b) y (c) se utilizaronCMSPs cultivadas en ausencia de Ac (RPMI). Se estimularon CMSPs con AcMo anti-CD28 y 1 ng/ mlde PMA (oc-CD28/ PMA) por 72 h en ausencia (—)o en presencia de 20 uM de U0126 (U0126), 10 uM de58202190 (SB), 1 uM de ciclosporina A (CSA) y 1 uM de FK506 (FK506), se cosecharon, y se utilizaronpara ensayos de proliferación por incorporación de [3H]-timidina (d) o se analizó la expresión de
Resultados
58
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
MICA por Western Blot, y como control negativo se analizaron lisados de CMSPs estimuladas conAcMo anti-CD28 (a-CD28), o con 1 ng/ ml de PMA (PMA) (e). La intensidad de cada banda fuecuantificada por análisis densitométrico y expresada en unidades arbitrarias (UA, panel inferior). Laefectividad del tratamiento con U0126 fue analizada por Western Blot con Ac anti-ERK (ERK) o Acanti-fosfo-ERK (p-ERK) en lisados de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA por 15 min, 30min o 72 h en ausencia (-) o en presencia (+) de 20 HM de U0126 (f). Los niveles basales de ERK yp-ERK se analizaron en células no tratadas (Basal). Los resultados son representativos de tresexperimentos independientes realizados con CMSPs de diferentes dadores sanos. * P<0,05 vs. (xCD28/ PMA; **P<0,001, vs. a-CD28/ PMA.
a U0126luMl 0 20 50100 b SBZOZ190[pM] o 1 1o 50
Figura 21. Efecto dosis-dependiente de U0126y 58202190 sobre la expresión de MICA en CMSPsestimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA. Se estimularon CMSPSpor 72 h con AcMo anti-CD28 yPMA en ausencia (-) o en presencia de diferentes concentraciones de U0126 y SB202190,y se analizó laexpresión de MICA por Western Blot. La flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA.Los resultados presentados corresponden a un experimento representativo de tres experimentosindependientes realizados con CMSPsde diferentes dadores sanos.
c. Rol de las quinasas Jak y p7056sobre la expresión de MICA
Un evento clave para la progresión en el ciclo celular del linfocito T activado
por las señales 1 y 2 es la síntesis y secreción de IL-2. Teniendo en cuenta los
resultados obtenidos y descriptos en las figuras 12 a 21, se emplearon inhibidores
farmacológicos de rutas de señalización río abajo del receptor de IL-2con el objeto de
investigar si la expresión de MICA está regulada por esta citoquina. Mediante el
empleo de dosis subapoptóticas del inhibidor de las quinasas Jak2/Jak3 AG49O
(Meydan, 1996; Sharfe, 1995), se observó que este fármaco inhibió la respuesta
proliferativa de CMSPs estimuladas tanto con AcMo anti-CD3 como con AcMo anti
CD28 y PMA en forma dosis dependiente (Fig. 22a). De manera similar, rapamicina,
un inhibidor de la quinasa p7056,también bloqueó la incorporación de [3H]-timidina
al cultivo de células estimuladas con AcMo anti-CD3 o con AcMo anti-CD28 y PMA
(Fig. 22h). Ambos fármacos inhibieron en forma dosis-dependiente la expresión de
MICA en CMSPS activadas con AcMo anti-CD3 o con AcMo anti-CD28 y PMA (Fig.
22 c-e).
Resultados
59
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
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Figura 22. La inhibición de la señalización a través de las quinasas Jak y p7056previene la expresiónde MICA en CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA. Se estimularonCMSPs por 72 h con AcMo anti-CD3 (oc-CD3) o con AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA (aCD28/ PMA) en ausencia (-) o en presencia de 25 o 50 HMde AG490 (a y c) o con 1 uM de rapamicina(Rapa; b y d). Posteriormente, las células se cosecharon y se emplearon para ensayos de proliferaciónpor incorporación de [3H]-timidina (a y b) y análisis de la expresión de MICA por Western Blot (c y d).Además, se analizó el efecto dosis-dependiente de rapamicina sobre la expresión de MICA en CMSPsestimuladas por 72 h con AcMo anti-CD3 (oz-CD3)o AcMo anti-CD28 y PMA (a-CDZS/ PMA) ycultivada con diferentes dosis de rapamicina (e). Como control negativo se utilizó Ac control de
Resultado.
60
Luciana L Molinero Tesis Doctoral
isotípo (Cl). La flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA. Los resultados sonrepresentativos de tres experimentos independientes realizados con CMSPs de diferentes dadoressanos. * P<0,001 vs. a-CDS, y “ P<0,001 vs. a-CD28/ PMA.
Conclusiones parciales
. La expresión de MICA inducida por la microagregación del complejo
TCR/ CD3 en presencia de células accesorias utiliza las vías de transducción de
señales de Lck/Fyn, MEKl-ERKI/ 2, p38 MAPK y calcineurina (Fig. 17, 18 y
19).
o La expresión de MICA inducida por la coestimulacíón de linfocitos T a través
de la molécula coestimulatoria CD28 en presencia de dosis submitogénicas de
PMA utiliza las vías de señalización de Lck/Fyn, MEKl-ERKI/ 2, p38 MAPK,
pero no de calcineurina (Fig. 20 y 21).
o Parte de los efectos observados sobre la expresión de MICA inducida por la
microagregación del complejo TCR/ CD3 o por la coesu'mulación a través de la
molécula CD28 son mediados por rutas de señalización que dependen de IL-2
(Fig. 22).
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Capitulo III: Factores de Transcripción involucrados en la expresión de
MI CA: rol de NF-KB
NF-KBjuega un rol crítico durante la activación de linfocitos T. Este factor de
transcripción es activado transitoriamente luego del entrecruzamiento del TCR en el
transcurso de una respuesta inmune adaptativa (Kuo, 1999; Ballard, 2001).
Basándonos en que MICA se expresa en linfocitos T activados, nos propusimos
analizar si NF-KBjuega algún rol en la regulación de la expresión de esta molécula.
a. Efecto de la sulfasalazina sobre la inducción de la expresión de MICA
Con el objeto de investigar la participación de NF-KBsobre la expresión de
MICA, se estimularon CMSPs con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA en
presencia de dosis crecientes del inhibidor famacológico de IKK, sulfasalazina (Sz;
Wahl, 1998; Weber, 2000, Fig. 23). Previamente, por ensayos de exclusión de ioduro
de propidio se observó que dosis superiores a 5 mM de Sz eran tóxicas para las
CMSPs (datos no mostrados). Se observó un efecto inhibitorio dosis-dependiente
sobre la respuesta proliferativa (Fig. 23a) y sobre los niveles de expresión de MICA
medidos por Western Blot (Fig. 23b). El efecto inhibitorio máximo se alcanzó con 0,5
mM de Sz. El efecto de la droga sobre la linfoproliferación y la expresión de MICA
también fue observado en CMSPs activadas con dosis mitogénicas de PMA (Fig. 23a
y 23c), lo que indica que la activación de PKCGtambién podría estar involucrada en
la expresión de MICA en linfocitos T. Con el objeto de investigar si la Sz ejerce su
efecto a nivel transcripcional, se realizó una RT-PCRy posterior hibridación con una
sonda específica para MICA a partir de ARN de CMSPs estimuladas con AcMo anti
CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA en ausencia o en presencia de Sz (Fig. 23d). Se
observó que el incremento de niveles de ARNm de MICA en CMSPs estimuladas con
AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA fue inhibido en presencia de Sz. Estos
resultados sugieren que NF-KB podría estar involucrado en la regulación de la
transcripción de MICA en linfocitos T activados por la microagregación del complejo
TCR/ CD3 o de la molécula coestimulatoria CD28.
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
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e 40 CI oc-CDB PMAE30 Fm T' I O-Cír ¡(D-d‘- Sz mM32o y ( )
10
o _ LO m _ MICA *o cï o“ c; o“ E—_ — oc
Sz (mM) Sz (mM) Sz (mM)
(x-CD3 a-CDZ8/PMA PMA
da-CDZB
PMACI oc-CDS
SzO,5mM - - + - +
B-act
MICA ->
Figura 23. La sulfasalazina inhibe la respuesta proliferativa y la expresión de MICA en CMSPsactivadas por la microagregación del complejo TCR/CD3 o de la molécula coestimulatoria CD28.Seestimularon CMSPs por 72 h con AcMo anti-CD3 (oz-CD3),AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA, enausencia (-) o en presencia de 0,1, 0,5 o 1 mM de Sz. Alternativamente, se estimularon CMSPs con 10ng/ ml de PMA, en ausencia o en presencia de 1 mM de Sz. Se analizó la respuesta proliferativa porincorporación de [3H]-timidina (a) y la expresión de MICA por Western Blot (b y c). Como controlesnegativos, se analizaron células incubadas en medio (RPMI) o en presencia de Ac control de isotipo(CI). Para analizar el efecto de Sz sobre la transcripción de MICA se estimularon CMSPs con AcMoanti-CD3 o AcMo anti-CD28 y PMA en ausencia (-) o en presencia (+) de 0,5 mM de Sz y se analizaronlos niveles de ARNm de MICA por RT-PCRy posterior hibridación con una sonda específica marcadacon 32P. Las reacciones de PCR fueron normalizadas contra B-actina (B-act). Los resultados sonrepresentativos de tres experimentos independientes realizados con CMSPsde diferentes dadores.
Se ha demostrado que NF-KBpresenta ciclos de activación y desactivación en
respuesta a estímulos específicos, tales como TNF-a (Hoffmann, 2002) o LPS
(Saccani, 2001). Con el objeto de estudiar la cinética de activación de NF-KBdurante
la activación linfocitaria, se evaluó por Western Blot la degradación de IKBocy la
translocación de las subunidades p65(RelA) y p50 al núcleo luego de la estimulación
Resultados
63
OOOÓOO0.000.0000000ÓCOOOOOOOOOCOOOOOOOOQÓÓOOÍ’...
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
con AcMo anti-CD3 o con AcMo anti-CD28 y PMA. CMSPs estimuladas de esta
manera mostraron dos olas de activación de NF-KB:una a tiempos cortos post
estímulo (30 min-2 h), y otra a las 72 h (Fig. 24a y 24h). Como control se evaluó la
efectividad de la Sz sobre la translocación de p65(RelA)al núcleo y la degradación de
IKBOLen CMSPs activadas, observándose que ambos fenómenos fueron inhibidos por
el fármaco (Fig. 24c y 24d).
ot-CDS a-CDZB/PMA
a-CD3 a-CDZB/PMA
.E EE .C. .c E 4: .Eo 5 5 v N o 5 5 v N
o m N LO N rx 0') N co N ¡x
ífiwmwfifimfi «final
a-CDB a—CD28/PMAE 2E E E E z 2
_ e e e E oc-CD3 a-CD28/PMAszlmM’*003NmogNm ——Sz .. + _ +
**&fifiawwwp65(RelA)-> W
Figura 24. Cinética de activación de NF-KBy efecto de Sz sobre CMSPs activadas con AcMo antiCD3 o AcMo anti-CD28 y PMA. (a) Análisis cinético de la degradación de IKBCXpor Western Blot enlisados totales de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 (cx-CD3)o AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml dePMA (a-CD28/ PMA). (b) Análisis cinético de la translocación al núcleo de NF-KBpor Western Blotpara p65(RelA) y p50 de extractos nucleares de CMSPs estimuladas con AcMo anti-CD3 (oz-CD3)o conAcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA (cx-CD28/PMA). (c) Efecto dosis-dependiente de la Sz sobre ladegradación de IKBOLanalizada por Western Blot de lisados totales de CMSPs pre-incubadas con 0,5 , 2o 5 mM de Sz y estimuladas por 30 min con AcMo anti-CD3 (oc-CD3)o con ACMo anti-CD28 y 1ng/ m1de PMA (a-CD28/ PMA). (d) Se realizó un Western Blotpara p65(RelA) de extractos nuclearesde CMSPs estimuladas por 30 min con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA enpresencia de 1 mM de Sz. Los resultados son representativos de dos experimentos independientesrealizados con CMSPs de diferentes dadores sanos.
Posteriormente decidimos investigar si NF-KBregula la expresión de MICA
en forma directa, o indirecta, induciendo la expresión de otro factor de transcripción
Resultados
64
lOQOÍOO0.00CO‘ÓOOOÓ0.0ÓOOODOOOOOO0.000000QOOQ‘ÜO‘OCIO
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
que a su vez induce la expresión de MICA. Por lo tanto, agregamos la Sz a las
CMSPs a diferentes tiempos post-activación con AcMo anti-CD3 o AcMo anti-CD28 y
PMA. Los resultados obtenidos mostraron que el efecto inhibitorio de la Sz fue
independiente del momento de adición del fármaco (Fig. 25).
OL-CD28/a-CD3 pMA
.c .c .r: .csz _> l O Ñ e I o a 2
Figura 25. Efecto directo de la acción de la sulfasalazina sobre la expresión de MICA en CMSPsactivadas. Análisis de la expresión de MICA por WesternBlotde lisados de CMSPs estimuladas por 72h con AcMo anti-CD3 (oc-CD3)o con AcMo anti-CD28 y 1 ng/ ml de PMA (a-CD28/ PMA) cultivadosen ausencia (-) o en presencia de 0,5 mM de Sz al comienzo de la estimulación (0), o agregada a las 24o 48 h post-estimulación. La flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA. Los resultadosson representativos de dos experimentos realizados con CMSPsde diferentes dadores sanos.
b. Sitio de unión NF-KBen el primer intrón de MICA
Los resultados obtenidos apuntan a un efecto directo de la sulfasalazina sobre
la transcripción del gen de MICA, por lo que el mismo podría contener una secuencia
de unión de NF-KB.Para evaluar esta hipótesis se analizó la secuencia del gen y su
región promotora (a partir de la posición -2800) en busca de posibles sitios de unión
de NF-KB. Mediante este análisis se encontró un sitio KB en la posición +582,
localizado en el primer intrón de MICA (Fig. 26), al que denominamos ¡(B-MICA.
í Ï 52 E3 E4E5 E6l ll Ü HH HH H
T 1+1 1+2 13 14 1+5
NF-KB
Figura 26. Diagrama representativo del gen de MICA mostrando la localización del sitio de uniónde NF-KBen el primer intrón. P: promotor; E: exón; I: intrón; NF-KB:posible sitio de unión de NF-KB.
Con el fin de investigar la funcionalidad del sitio ¡(B-MICA, se realizaron
ensayos de retardo de la movilidad electroforética en gel de poliacrilamida (EMSA)
Resultados
65
’OOCOOOCOCOOOOÓOOOOOOCCOOOGOOOOOOOOÓ.CCOOQ.00COCO.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
empleando un oligonucleótido sintético que contiene la secuencia ¡(B-MICA y
extractos nucleares de CMSPs estimuladas por 72 h con AcMo anti-CD3 o con AcMo
anti-CD28 y PMA, en ausencia o en presencia de Sz. En estos experimentos se
observó la formación de varios complejos sensibles al tratamiento con Sz (Fig. 27).
Para corroborar la especificidad de unión de los complejos a la secuencia ¡(B-MICA,
se realizaron ensayos de competición con un exceso de oligonucleótido KBconsenso
(KB-cons) o con un oligonucleótido conteniendo una secuencia no relacionada
(CCAAT).Se observó que la unión de dos complejos al oligonucleótido KB-MICAera
desplazada por el oligonucleótido KB-cons(indicados por flechas en la Fig. 27), pero
no por el oligonucleótido CCAAT, confirmando la especificidad de unión de
miembros de la familia de factores de transcripción NF-KBa la secuencia KB-MICA.
< OligonucleótidoÉ competidor
m g ¡- VJo o C-9 c? 5 8011 8 eSz -+-+¿l.¿l
n.e.—>—>n.e.
n.e.
Figura 27. Unión de NF-KB al sitio ¡(B-MICA. Se realizaron ensayos de retardo de la movilidadelectroforética (EMSA) utilizando el oligonucleótido doble cadena que porta el sitio KBderivado delgen MICA (KB-MICA)marcado con 32Py extractos nucleares de CMSPs estimuladas por 72 h conAcMo anti-CD3 (oc-CD3)o AcMo anti-CD28 y PMA (a-CD28/ PMA) en ausencia (-) o en presencia de0,5 mM de Sz (+). Como control, se analizaron extractos nucleares de células incubadas con Ac controlde isotipo (CI). Para los experimentos de competición se utilizaron extractos nucleares de CMSPsactivadas con AcMo anti-CD28 y PMA por 72 h, los que fueron preincubados con 50, 100 y 200 vecesde exceso de masa de oligonucleótido doble cadena NF-KB consenso (KB-cons)no marcado o unoligonucleótido doble cadena no relacionado (CCAAT). Las dos flechas indican las bandasdesplazadas por el oligonucleótido KB-cons,pero no por el CCAAT. n.e.: no específico. Los resultadosson representativos de tres experimentos realizados con CMSPsde diferentes dadores sanos.
Resultados
66
lovato.centavo...oooooooobsoooooooooooooooooocoooo
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Para identificar la composición de los complejos se realizaron ensayos de
supershift.Para ello se preincubaron extractos nucleares de CMSPs estimuladas por
72 h con AcMo anti-CD28 y PMA, con Ac específicos contra distintos componentes
de NF-KB.Se observó que el Ac anti-p65(RelA) produjo un mayor retardo en la
movilidad del complejo de mayor peso molecular (Fig 28). El Ac anti-p50 generó un
retardo tanto en la banda del complejo de mayor movilidad como en la banda del
complejo de menor movilidad (Fig 28). Estos resultados indican que el complejo de
mayor peso molecular contiene a p50 y a p65(Re1A),mientras que el de menor peso
molecular contiene solamente a p50. El Ac dirigido contra p52 no generó ningún tipo
de retardo, lo que sugiere que este integrante de NF-KBno se une a la secuencia KB
MICA durante la activación de linfocitos T.
í0EíIDCD
9a a-p50 a-p52
p65(ReIA)/p50->p50/p50->
Figura 28. Composición de los complejos NF-KBunidos al oligonucleótido ¡(B-MICA.Se realizaronensayos de supershift con el oligonucleótido ¡(B-MICA marcado con 32P y extractos nucleares deCMSPs estimuladas por 72 h con AcMo anti-CD28 y PMA preincubados en ausencia (-) o en presenciade Ac anti-p65(Re1A), Ac anti-p50 o Ac anti-p52. Los resultados son representativos de tresexperimentos realizados con CMSPs de diferentes dadores sanos.
c. Regulación de MICA por NF-KBen células HeLa.
Con el objeto de investigar si NF-KBtambién regula la expresión de MICA en
células tumorales, se estudió el efecto de la Sz sobre la expresión de MICA en células
HeLa, que expresan altos niveles de MICA (Groh, 1996, Zwirner, 1998). Por Western
Blot se observó que Sz inhibió en forma dosis dependiente la expresión de MICA
(Fig. 29a). A diferencia de los linfocitos de sangre periférica, la línea celular HeLa es
Resultados¿saw .,>¡ n «Mm-«mw m manu».
67
l
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
susceptible de ser transfectada con alta eficiencia, por lo que se realizaron
transfecciones transitorias con un plásmido que codifica para p65(RelA). Los
resultados obtenidos indican que la sobreexpresión de p65(RelA) incrementó los
niveles de expresión de MICA (Fig. 29h).
a bSz (mM)
ReIA-> - +
Figura 29. NF-KBregula la expresión de MICA en células HeLa. Se analizó la expresión de MICA porWestern Bloten lisados de células HeLa cultivadas con 0, 0,5, 1 y 2 mM de Sz por 72 h (a), o en célulasHeLa transfectadas por 48 h con un plásmido que sobreexpresa p65(RelA). Como control negativo detransfección se utilizó el vector vacío (-). Los resultados son representativos de tres experimentosindependientes.
Conclusiones parciales
. La expresión del gen de MICA en linfocitos T activados es inhibida a nivel
transcripcional y proteico por el inhibidor de la Vía de NF-KBsulfasalazina
(Fig. 24 y 25).
. En la posición +582 del gen de MICA, localizada dentro del primer intrón, hay
un sitio de unión de NF-KBcapaz de unir al heterodímero p65(RelA)/ p50 y al
homodímero p50/ p50 (Fig. 26, 27 y 28).
. La expresión de MICA en células HeLa también es regulada por NF-KB,
debido a que dicha expresión es sensible a sulfasalazina y a que la
sobreexpresión de p65(RelA) aumenta la expresión de MICA (Fig. 29).
Resultados
68
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Capítulo IV: Rol de citoquinas sobre la expresión de MICA en
linfocitos T
a. Inducción de la expresión de MICA en CMSPs por la citoquina
mitogénica IL-2
Como observamos previamente, la citoquina IL-2 podría estar involucrada en
la expresión de MICA luego de la activación de linfocitos T (Fig. 22). Para evaluar si
IL-2 es capaz de potenciar la expresión de MICA en linfocitos T activados, se
cultivaron CMSPs con AcMo anti-CD3 por 72 h en presencia de IL-2 y se evaluó el
efecto de esta citoquina sobre la respuesta proliferativa y la expresión de MICA (Fig.
30).Se observó que la adición de IL-2 incrementó tanto la respuesta linfoproliferativa
(Fig. 30a) como la expresión de MICA (Fig. 30b). El cultivo de CMSPs con IL-2 sola
tuvo un efecto mínimo sobre los niveles de MICA (Fig. 30b). Asimismo, se investigó
la capacidad de IL-2 de restaurar la expresión de MICA en CMSPs estimuladas con
AcMo anti-CD3 y tratadas con CsA. Se observó que la adición de IL-2 al cultivo de
CMSPs tratadas con AcMo anti-CD3 y CSA restauró tanto la respuesta proliferativa
(Fig. 30€)como la expresión de MICA (Fig. 30d).
OOOOOÓOOÓO‘OOOOOOCOOOOOOQOOOOOOOOOOOOQOOOOOOOOOOOÓ
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
a-CD350 —5* _ 10S, CI IL-2 IL-2
¿í 30 g 6E W“ una8 1o * 2
* oo- lL-2 IL-2 '__L'2
CI a_CDs CI Ot-CD3 IL-2
C d a-CD3
53‘ 60 CSA 30C)
; 40 CI — — IL-2 5 20V winkE 20 1o8 ** w m W O
0 - IL-2
— — IL-2 _C.A_- CsA '_____s—Cl a-CD3 C' “'CD3
Figura 30. IL-2 regula la expresión de MICA en CMSPs activadas con AcMo anti-CD3. Seestimularon CMSPs con AcMo anti-CD3 por 72 h en ausencia (-) o en presencia de 8 ng/ ml de IL-2 yse midió la respuesta proliferativa por incorporación de [3H]-timidina (a) y la expresión de MICA porWestern Blot (b, panel izquierdo). Asimismo, se analizó la acción de IL-2 en CMSPs activadas conAcMo anti-CD3 y tratadas con 1 uM de CsA sobre la respuesta proliferativa (c) y sobre la expresión deMICA por Western Blot (cl,panel izquierdo). La intensidad de cada banda en (b) y (d) fue cuantificadapor análisis densitométrico, y los resultados expresados en unidades arbitrarias (UA, b y d, panelesderechos). Como control se utilizaron CMSPs estimuladas con Ac control de isotipo (CI). Losresultados presentados corresponden a un experimento representativo de dos experimentosindependientes con CMSPs de diferentes dadores sanos. *P<0,05 vs. a-CD3, **P<0,001 vs. a-CD3.
Con el objeto de investigar en forma directa el rol de IL-2 sobre la expresión
de MICA en linfocitos T, se cultivaron CMSPs en presencia de dosis crecientes de
esta citoquina. Se realizó un análisis cinético de la respuesta linfoproliferativa y de la
inducción de la expresión de MICA por Western Blot (Fig. 31a y b). La respuesta
linfoproliferativa fue notoria a 8 ng/ ml de IL-2, tanto a 3 como a 5 días de cultivo
(Fig. 31a). Asimismo, se observó un incremento de la expresión de MICA en CMSPs
estimuladas con 8 ng/ ml de IL-2 recién al cabo de 5 días de cultivo (Fig. 31b).
Comparado con el estímulo con AcMo anti-CD3 (Fig. 3Gb),se observó una inducción
más lenta de la expresión de MICA, que podría deberse a la falta de expresión de la
Resultados
70
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
subunidad de alta afinidad (CD25) del receptor de IL-2 en linfocitos T vírgenes
(Taylor, 1985).
Un análisis cinético de la expresión de CD25 en superficie de linfocitos T
activados con PHA mostró que entre las 18 y las 24 h el 50% de las células CD3+
expresan CD25 (Fig. 31e). A partir de estos resultados se estimularon las células con
PI-IApor 18 h con el objeto de inducir la expresión del receptor de alta afinidad de
IL-2, se lavaron, se cultivaron por 48 h en presencia de IL-2 y se midió la respuesta
linfoproliferativa y la expresión de MICA. El tratamiento durante 48 h con lL-2 en
CMSPs preactivadas con PHA incrementó la respuesta proliferativa (Fig. 31d) y la
expresión de MICA analizada por Western Blot (Fig. 31e). Si bien este estímulo fue
capaz de inducir los niveles totales de MICA, no fue suficiente para inducir la
expresión de MICA en la superficie celular de linfocitos T CD4+ purificados,
preactivados con PHA y estimulados con IL-2 por 48 h (Fig. 31f). Como control, se
observó que IL-2 produjo un incremento en la expresión en superficie de CD154 en
CMSPs preactivadas con PHA y estimuladas con IL-2, tal como fue descripto por
otros autores (Skov, 2000). Los experimentos realizados con CMSPSestimulados de
igual manera mostraron los mismos resultados (datos no mostrados).
OOOOOOÓOOOOOOOOOO0......OOOOOOOQOOOOOOOOO0.000...
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
b+3“ 3d 5d+5d ——
20 o 0.8 8 o 0.8 a IL-2(ng/m|)
1° e m 4- MICA
ó á é é
IL-2 (ng/ml)
60" * PHAÉso 6‘50g 94o RPMI _ ¿-2
33° *25 20‘
É 3 103 MICA-bCu u 0o 12 24 36 48 ¡L2PHA(h) ;
f RPMI PHA
a RPMI g PHAI- e _' PHA/IL-2
S E E
o 103 10‘ o D10u 10' 1o? 1n= 10‘102GR-FL
Figura 31. IL-2 induce la expresión de MICA en linfocitos T presentes en CMSPs. Se midió larespuesta proliferativa por incorporación de [3H]-timidina (a) y la expresión de MICA por WesternBlot(b) en CMSPs estimuladas con 0, 0,8 y 8 ng/ ml de IL-2 durante 3 y 5 días. Se analizó por citometría deflujo la expresión de CD25 en superficie de células CD3+ provenientes de CMSPs activadas con 1ug/ ml de PHA (c). También se estimularon CMSPs por 18 h con PHA, se lavaron y posteriormente seincubaron por 48 h en ausencia (-) o en presencia de 8 ng/ ml de IL-2 (IL-2). Se midió la respuestaproliferativa por incorporación de [3H]-timidina (d) y la expresión de MICA por Western Blot (e).Como control se emplearon células sin estimular (RPMI).Se midió por citometría de flujo la expresiónde MICA con el AcMo D7 (línea punteada) en superficie en linfocitos T CD4+purificados en ausencia(RPMI) o en presencia de PHA por 18 h, lavados y estimulados por 48 h en ausencia (PHA/-) o enpresencia de IL-2 (PHA/ILZ) Línea punteada: AcMo anti-MICA D7; línea llena: AcMo control deisotipo; línea fragmentada: AcMo anti-CD154. Los resultados presentados corresponden a unexperimento representativo de tres experimentos independientes con diferentes dadores sanos.*P<0,001 vs. RPMI.
ResultadosWII»:anmwmmwmmmxwxzmmnwmwmn>> (
72
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
b. Mecanismos de transducción de señales involucrados en la expresión
de MICA en linfocitos T activados por IL-2
Como consecuencia de la interacción de IL-2 con su receptor, se transduce al
interior de la célula una gran cantidad de señales a través de las quinasas Iakl/Iak3,
Lck, p38 MAPK, p7056,que activan diversos factores de transcripción, tales como
STATS y NF-KB,entre otros (Ellery, 2002). Con el objeto de evaluar el rol de estas vías
de señalización sobre la expresión de MICA inducida por IL-2, se preactivaron
CMSPs con PHA por 18 h, se lavaron y se cultivaron por 48 h con IL-2 en presencia
de los inhibidores de las vías de señalización de Iak3 (AG490), ERK1/2 (U0126),p38
MAPK (SB202190), p7056quinasa (rapamicina), Lck (PPI) y NF-KB (Sz). Se observó
que todos los inhibidores tenían un marcado efecto tanto sobre la respuesta
proliferativa (Fig. 32a) como sobre la expresión de MICA (Fig. 32b). Como era
esperable, se comprobó que tanto PPI como AG490 inhibieron la fosforilación de
STATS inducida por IL-2 (Fig. 32€). Además, ensayos de EMSA con el
oligonucleótido ¡(B-consenso mostraron que Sz inhibió el retraso electroforético de
extractos nucleares de CMSPs tratadas con PHA e IL-2 (Fig. 32d).
Tesis DoctoralLuciana L. Molinero
Q) U' 'U 2:5
IL-2
e? Boi 81 '- N
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IL2 E IL2 E e 8 g D. U)_ ao, n- N cr (D ¡r [lE v ‘- m ' ' <0 <0. (D fl.o: . . < a IL-2
, i P Ap-STAT5—> H
Figura 32. La inhibición de la señalización a través de Jak3, p38 MAPK, p70Séquinasa, Lck y NF-KBpreviene la expresión de MICA en CMSPs activadas con IL-2.Se midió la respuesta proliferativa (a)y la expresión de MICA (b, la flecha indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA) en CMSPspreactivadas con PHA por 18 h, lavadas, estimuladas por 48 h en ausencia (-) o en presencia de 8ng/ ml de IL-2 (IL-2), y cultivadas en ausencia (—)o en presencia de 50 uM de AG490 (AG490), 10 uMde SB202190(SB),1 uM de Rapamicina (Rapa), 10 uM de PPI (PPl) y 0,5 mM de sulfasalazina (Sz). Laflecha en (b) indica la banda de 65 kDa correspondiente a MICA. El panel inferior en (b) muestra elanálisis densitométrico del Western Blot.Por Western Blotse midió el efecto inhibitorio de AG490 y PPIsobre la fosforilación de STAT5 (p-STATS, c, panel superior) en CMSPs preactivadas por 18 h conPHA (PHA) y estimuladas por 15 min en ausencia (-) o presencia de 8 ng/ ml de IL-2 (IL-2),y tratadasen ausencia (-) o en presencia de 50 uM de AG49O(AG490) o 10 pM de PPI (PPI). Como control semidieron los niveles totales de STAT5 (c, panel inferior). Por ensayos de EMSA se midió el efectoinhibitorio de Sz sobre la capacidad de unión de NF-KBal oligonucleótido KB-consmarcado con 3213yextractos nucleares de CMSPs preactivadas con PHA por 18 h (PHA), lavadas y cultivadas por 48 h enausencia (-) o en presencia de 8 ng/ml de IL-2 (IL-2),y tratadas en ausencia (-) o en presencia de 0,5mM de Sz (Sz, d). Como control se utilizaron células no estimuladas (RPMI). Los resultadospresentados corresponden a un experimento representativo de tres experimentos independientesrealizados con CMSPs de diferentes dadores sanos. *P<0,001 vs. PHA+IL-2.
Resultados,,,,,,,,“Mmmm,m»wwmnmWWW,“ mms.
74
jOOOCOOOOÜOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOOG
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
c. Efecto de IL-4 sobre la expresión de MICA
IL-4 ejerce su acción mitogénica sobre linfocitos T en forma independiente a
IL-2 (Habetswallner, 1988), por lo que se decidió analizar el efecto de esta citoquina
sobre la expresión de MICA. Se estimularon CMSPs a diferentes dosis y tiempo. A
diferencia de IL-2,no se observó ningún aumento en la respuesta proliferativa o en la
expresión de MICA a todas las dosis (5-25 ng/ ml) y tiempos analizados (5-10 días,
datos no mostrados). Los linfocitos T vírgenes tienen bajos niveles de receptor de IL
4, pero sus niveles aumentan rápidamente luego de la activación linfocitaria (Spits,
1987;Kubo, 1999). Para observar mejor la acción de esta citoquina sobre la expresión
de MICA se preactivaron CMSPs con PHA por 18 h, se lavaron y se incubaron con
IL-4. Al cabo de 48 h de cultivo se analizó la respuesta proliferativa por
incorporación de [3H]-timidina y la expresión de MICA por Western Blot.Se observó
que la adición de IL-4 produjo un incremento tanto en la respuesta proliferativa (Fig.
33a, panel izquierdo) como en los niveles totales de MICA (Fig. 33a, panel derecho).
Posteriormente, se evaluó la capacidad de IL-4de potenciar la expresión de MICA en
linfocitos T activados con AcMo anti-CD3. Se observó que el tratamiento conjunto de
AcMo anti-CD3 e IL-4 no incrementó significativamente la respuesta proliferativa
(Fig. 33h, panel izquierdo), pero aumentó la expresión de MICA. (Fig. 33h, panel
derecho). Por lo tanto, IL-4 es capaz de inducir la expresión de MICA en CMSPs
activadas.
C'a100 * :8
rr 80 “Z3 60 PHA z 4° fi5' RPMI E 3° C' ' 'L'4É. 40 ' IL-4 a. 20O
o 0- |L-4 - IL-4
RPMI PHA Cl a_CD3
Figura 33. IL-4 induce la expresión de MICA en CMSPs activadas. (a) Efecto de la IL-4 sobre larespuesta proliferativa y la expresión de MICA en CMSPs preactivadas con PHA. Se incubaronCMSPs con PHA por 18 h, se lavaron e incubaron por 48 h en ausencia (-) o en presencia de 5 ng/ mlde IL-4 (IL-4).Se midió la respuesta proliferativa por incorporación de [3H]-timidina (panel izquierdo)y la expresión de MICA por Western Blot (panel derecho). (b) Efecto de IL-4 sobre la respuestalinfoproljferativa (panel izquierdo) y la expresión de MICA (panel derecho) en CMSPs estimuladas
Resultados
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Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
con AcMo anti-CD3. Se cultivaron por 72 h CMSPs en presencia de AcMo anti-CD3 en ausencia (-) oen presencia de 5 ng/ ml de IL-4 (IL-4). Como control negativo se cultivaron células sin estimular(RPMI) o cultivadas con un AcMo control de isotipo (CI). La flecha indica la posición de la banda de65 kDa correspondiente a MICA Los resultados presentados corresponden a un experimentorepresentativo de dos experimentos independientes realizados con CMSPs de diferentes dadoressanos. *P<0,001 vs. PHA.
d. Expresión de MICA en células Th1 y Th2
Con el objeto de evaluar si la expresión de MICA se observa tanto en células
Th1 como en células Th2, se cultivaron CMSPs en condiciones de polarización hacia
un perfil Th1 (cultivo con PHA, IL-12 y AcMo anti-IL-4) o Th2 (PHA, IL-4 y AcMo
anti-IL-12) durante 6 días. Se observó que ambas condiciones de estimulación
indujeron la expresión de MICA, aunque las CMSPs estimuladas en condiciones Thl
mostraron mayor expresión de MICA que CMSPSestimuladas en condiciones Th2,
que a su vez expresaron más que CMSPs estimuladas con PHA solamente (Fig. 34a).
Se corroboró la polarización hacia el perfil Th1 por un aumento en la fosforilación de
STATI (Fig. 34h) y un aumento en la expresión de IFN-y intracelular (datos no
mostrados), y la polarización hacia un perfil Th2 por un incremento en la expresión
del factor de transcripción GATA3 (Fig. 34€). En todos los estímulos las células
proliferaron sin diferencias significativas entre tratamientos (Fig. 34d). Sin embargo,
en ninguno de los tratamientos se detectó la expresión de MICA en superficie de
CMSPsestimuladas (datos no mostrados).
- PHA Th1 Th2a daoMICA-b waym M
bp-STATH
cpm(x10‘3)
—\N(9 ooo l
oigrwfigÁi- PHA Th1 Th2
C
GATA3—> w m
Figura 34. La polarización hacia perfiles Thl y Th2 inducen la expresión de MICA en linfocitos Tpresentes en CMSPs. Se analizó por Western Blot la expresión de MICA (a), la fosforilación de STAT1(p-STATI, b), GATA3 (c) o la respuesta proliferativa (d) en CMSPs cultivadas en presencia de 1 pg/ mlde PHA (PHA); 1 pg/ ml de PHA, 2 ng/ ml de IL-12 y 100 ng/ m1de AcMo anti-IL-4 (Th1); 1 ug/ m1de
Resultados
76
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
PHA, 5 ng/ml de IL-4 y 2 ug/ml de AcMo anti-lL-‘lZ (Th2). En (a) la flecha indica la banda de 65 kDacorrespondiente a MICA; (b) la flecha marca la banda de 91 kDa correspondiente a STATl; y en (c) laflecha señala la banda de 50 kDa correspondiente a GATA3. Los resultados presentados correspondena un experimento representativo de tres experimentos independientes realizados con CMSI’s dediferentes dadores sanos.
Conclusiones parciales
IL-2 potencia la expresión de MICA inducida por la estimulación con AcMo
anti-CD3 (Fig. 30).
IL-2 induce la expresión de niveles totales de MICA en linfocitos T, pero no es
suficiente para inducir MICA en superficie (Fig. 31).
Lck/Fyn, Jak3, p38 MAPK, p7056quinasa y NF-KBestán involucradas en la
expresión de MICA en CMSPs estimuladas con IL-2 (Fig. 32).
IL-4 induce la expresión de MICA en CMSPs preactivadas con PI-IAy potencia
el efecto estimulador del AcMo anti-CD3 (Fig. 33).
Células cultivadas en condiciones Th1 expresan mayores niveles de MICA que
células cultivadas en condiciones Th2 (Fig. 34), aunque en ninguna condición
se observó la expresión de MICA en superficie.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Capitulo V: Expresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4+
activados con PMA e Ionomicina
a. Expresión de MICA en linfocitos T CD4+purificados vs. linfocitos T
CD4+presentes en CMSPs activadas con PMA e Ionomicina
Al comienzo de nuestro estudio empleamos un suero de conejo anti-MICA
para detectar MICA en superficie celular, pero el Ac control negativo presentaba una
señal basal alta (Fig. 16). Para resolver este inconveniente se produjo en nuestro
laboratorio un AcMo anti-MICA (D7, Fuertes, 2002 y 2003). Sin embargo, las
estimulaciones con AcMo anti-CD3 y AcMo anti-CD28 interferían en las citometrías
de flujo con la señal obtenida con el AcMo anti-MICA (datos no mostrados). Por lo
tanto, se utilizó el AcMo anti-MICA para analizar la expresión de MICA en superficie
de CMSPs estimuladas con PMA e Ionomicina (P+I), estímulos químicos que simulan
los procesos desencadenados a través de las moléculas CD3 y CD28 (Truneh, 1985).
En un 80% de los casos evaluados (12 de 15) se observó que CMSPSestimuladas por
72 h con P+I no expresaron MICA en superficie (Fig. 35a, panel izquierdo). Sin
embargo, se observó que, en el 70% de los casos (11 de 16), linfocitos T CD4+
purificados y estimulados por 72 h con P+I expresaron MICA en su superficie celular
(Fig. 35a, panel derecho). Estos resultados se observaron en 5 experimentos
independientes, en los que se analizó el efecto de P+I sobre la expresión de MICA en
superficie de linfocitos T CD4+ purificados y linfocitos T CD4+ presentes en CMSPs
provenientes de un mismo dador. Debido a que el AcMo D7 reconoce tanto MICA
como MICB, se investigó la expresión de ambas moléculas con AcMo específicos
(Cosman, 2001), observándose que linfocitos T CD4" activados con P+I expresaron
MICA, pero no MICB, en superficie (Fig. 35b).
>OOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO00.000.00.00...
l
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
CMSPs CD4"
GR-FL GR-FL
n = 15 n = 16 n = 3
Figura 35. La estimulación con PMA e Ionomicina induce la expresión de MICA en superficie delinfocitos T CD4+purificados pero no en linfocitos T CD4+presentes en CMSPs. (a) Se analizó porcitometría de flujo la expresión de MICA (AcMo anti-MICA D7: línea negra) en linfocitos presentes enCMSPs y linfocitos T CD4+ purificados con perlas magnéticas, cultivados en ausencia (-) o enpresencia de 10 ng/ ml de PMA y 1 ug/ ml de Ionomicina por 72 h (P+I). Los datos mostradoscorresponden a linfocitos T quiescentes y activados (blastos), obtenidos de una ventana de un gráficode tamaño vs. granularidad. (b) Se purificaron linfocitos T CD4+con perlas magnéticas, se estimularonpor 72 h con 10 ng/ ml de PMA y 1 ug/ ml de Ionomicina y se marcaron con el AcMo anti-MICA D7(línea fragmentada), con un AcMo anti-MICA específico (línea llena) o con un AcMo anti-MICBespecífico (línea punteada). El histograma gris corresponde a la marcación con Ac control de isotipo.n: número de experimentos realizados con CMSPs de distintos donantes.
A continuación se investigó si la ausencia de expresión de MICA en superficie
de linfocitos T CD4+activados con P+I en presencia de CMSPs era debida a un factor
soluble o al contacto célula-célula. Para ello se cultivaron linfocitos T CD4+
purificados y CMSPs separados por una membrana semipermeable (transwell,Fig.
36a), ambos estimulados con P+I. El contacto con el medio de CMSPs activadas
produjo una disminución del 25 al 100%, dependiendo del experimento, en la
expresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4+ purificados (Fig. 36b). Estos
datos sugieren la presencia de un factor soluble liberado por CMSPs activadas que
inhibe la expresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4+.
Resultados
79
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Events
GR-FL
Figura 36. Un factor soluble secretado por CMSPs activadas con PMA e Ionomicina inhibe laexpresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4‘rpurificados. (a) Diagrama del transwell:en elcompartimiento interior se estimularon linfocitos T CD4+purificados con perlas magnéticas por 72 hcon 10 ng/ ml de PMA y 1 ug/ ml de Ionomicina, mientras que en el compartimiento exterior secultivaron CMSPs singeneicas estimuladas de la misma manera. (b) Se analizó la expresión de MICAen linfocitos T CD4+purificados y activados con P+I en ausencia (línea negra continua) o en presencia(línea fragmentada) de CMSPs activadas de igual manera. El histograma gris representa al Ac controlde isotipo. Los resultados presentados corresponden a un experimento representativo de dosexperimentos en los que las CMSPs activadas no expresaron MICA en superficie, mientras que loslinfocitos T CD4+singeneicos purificados y estimulados sí expresaron MICA en superficie.
b. Citotoxicidad de células NK contra linfocitos T CD4+ activados con
PMA e Ionomicina
Considerando la posibilidad de que la expresión de MICA en linfocitos T
activados participe en la lisis por parte de células NK, se evaluó si los linfocitos T
CD4+activados con P+I eran susceptibles a la lisis por las células NK. Para este fin se
realizaron ensayos de liberación de 51Cr,en los que observamos que las células NI<
presentes en CMSPs sin estimular no indujeron la lisis de linfocitos T CD4+
singeneicos quiescentes (datos no mostrados) o activados por 72 h (Fig. 37a). El
bloqueo de la interacción entre las moléculas de clase I del CMH y los receptores
inhibitorios KIR con el AcMo anti-HLA de clase I W6/ 32 (Fig. 37a), permitió
observar un incremento del 18,9 i 3,3% en la lisis de linfocitos T CD4+activados. Esta
lisis no se inhibió cuando se bloqueó la interacción entre MICA y NKGZD con el
AcMo anti-MICA D7 (Wó/ 32 + D7, Fig. 37a). Posteriormente, evaluamos el efecto de
Resultados
80
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
las células NK presentes en CMSPs activadas durante 4 o 5 días con IL-2 (LAK)como
efectoras de lisis de linfocitos T CD4+ activados con P+I por 72 h. En estos
experimentos observamos que se indujo la lisis del 34,6% i 7,4% (Fig. 37b). A
continuación, realizamos una cinética de activación de los linfocitos T CD4+ y
analizamos su susceptibilidad a la lisis por células LAK. Observamos que la
susceptibilidad a la lisis se incrementó con el tiempo de activación de los linfocitos T
CD4+, siendo del 4,3 i 1,6% a las 24 h, 25,9 i 7,2% a las 48h y 34,6 i 7,4% a las 72 h,
aunque se observó una gran variabilidad de la respuesta dependiendo de los
individuos (Fig. 37c).
40 0m 2 6° ° n eo H'3 30 en o 12 ° A
.\° 20 e” ° .\°20 o 20 170
10 o °° ‘.0 o I“ o e A: AW6132 W6l32 W6/32 NK LAK 24 h 48 h 72 h
+ CI + D7
n=8 n=8 n=9 n=4 n=5 n=9
Figura 37. Linfocitos T CD4‘ activados con P+I son blanco de citotoxicidad de células NK activadas(LAK), pero no de células NK quiescentes. (a) Se purificaron linfocitos T CD4’ con perlas magnéticas,se estimularon por 72 h con 10 ng/ ml de PMA y 1 pg/ ml de Ionomicina y se utilizaron como célulasblanco para citotoxicidad de células NK presentes en CMSPs (relación Efector2Blanco = 50:1), enausencia (-) o en presencia de AcMo anti-HLA clase l (W6/ 32), o AcMo anti-HLA clase I y Ac controlde isotipo (W6/32+CI), o AcMo anti-HLA clase I y AcMo anti-MICA (W6/32+D7). (b) Linfocitos TCD4‘ purificados y activados como en (a) fueron utilizados como células blanco de células NKestimuladas en ausencia (NK) o en presencia de 8 ng/ ml de IL-2 por 4-5 días (LAK) en una relaciónEfectorzBlanco = 50:1. (c) Linfocitos T CD4‘ purificados fueron estimulados con 10 ng/ ml PMA y 1pg/ ml de Ionomicina por 24, 48 o 72 h y posteriormente utilizados como blancos de citotoxicidad porcélulas LAK (relación Efector:Blanco = 50:1).Las barras de error en (a) corresponden al error estándarde cada grupo de datos.
Finalmente, se evaluó el rol de la interacción MICA-NKG2D en la
citotoxicidad de linfocitos T CD4+ por células LAK, mediante el bloqueo de dicha
interacción con el AcMo anti-MICA (D7, Fig. 38). A pesar de no ser estadísticamente
significativa, el empleo del AcMo anti-MICA mostró una tendencia a la inhibición de
la citotoxicidad mediada por células LAK sobre linfocitos T CD4+activados, a todos
los tiempos de estimulación con P+I analizados (% de lisis D7 vs. CI: -5,18 i 5,6% vs.
1,96 :t 5,6% a las 24 h; 18,84 :I:7,2 % vs. 24,30 i 6,4% a las 48 h; 26,06 :t 5,6% vs. 29,97 :t
6,7% a las 72 hs).
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
MCD-h
O
°/oLisis O
24 h 48 h 72 h
25.85 18.84 24.30 50 34.57 26.06 29.97
IQ 40w'J 30°\° 20
- D7 Cl - D7 CI - D7 Cl
n=4 n=5 n=9
Figura 38. La interacción MICA-NKGZD tiene un efecto menor sobre la citotoxicidad de linfocitosT CD4+activados producida por células LAK. Se purificaron linfocitos T CD4“ con perlas magnéticasy se estimularon con 10 ng/ ml de PMA y 1 ug/ml de Ionomicina por 24, 48 o 72h. Posteriormente seutilizaron como blancos en ensayos de liberación de 51Crcon CMSPs activadas con IL-2 por 4-5 díascomo células efectoras, en ausencia (-) o en presencia de AcMo anti-MICA (D7) o Ac control de isotipo(CI). Relación EfectorzBlanco = 50:1. Arriba de cada columna se muestra el % de lisis promedio paracada tratamiento. Las barras de error corresponden al error estándar de cada grupo de datos.
Conclusiones parciales
Linfocitos T CD4:+activados con PMA e Ionomicina en presencia de CMSPs no
expresan MICA en superficie en el 80 % de los dadores analizados (Fig. 35).
Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina expresan
MICA -pero no MICB- en superficie en el 70 % de los dadores analizados (Fig.
35).
Un factor soluble liberado por CMSPs activadas inhibe la expresión de MICA
en superficie de LT CD4+ (Fig. 36).
Linfocitos T CD4+activados con PMA e Ionomicina no son susceptibles a lisis
por células NK, pero se vuelven susceptibles a la lisis por células LAK (Fig.
37).
Los linfocitos T CD4+ son más susceptibles a la lisis por células LAK en
función del tiempo de activación con P+I (Fig. 37).
La interacción MICA-NKGZDparece jugar un rol menor en la citotoxicidad de
células LAK contra linfocitos T CD4+activados (Fig. 38).
Resultados
82
DISCUSIÓN
Discusión
Como antecedente de este trabajo de Tesis se había demostrado que la
expresión de MICA se induce en linfocitos T CD4+ y T CD8+ estimulados con PI-IA
(Zwirner, 1999). En este trabajo demostramos por Western Blot que MICA se induce
en linfocitos T CD4+ y T CD8+ estimulados con CMSPs alogeneicas de dadores
histoincompatibles. El análisis cinético mostró que se alcanza un pico de expresión a
los 7 días de estímulo (Fig. 12). Este patrón de expresión coincide con el pico de
proliferación de linfocitos T en cultivos alogeneicos (Salomon, 1984). La señal
correspondiente a MICA no fue detectada en CMSPs sin estimular, aunque
previamente esta molécula había sido detectada en monocitos (Zwirner, 1998y 1999).
Esta discrepancia aparente podría deberse a que los monocitos constituyen menos
del 10% de las CMSPs aisladas por gradientes de centrifugación en Ficoll-Paque.
Experimentos de Western Blot realizados con una masa equivalente de proteínas de
monocitos (aislados del resto de CMSPS por adherencia a placa) a la cantidad de
proteínas de monocitos presentes en un cultivo de CMSPs y sembradas en los geles
de poliacrilamida de la figura 12 mostraron que los niveles de MICA estaban por
debajo del límite de detección del sistema (datos no mostrados). Por otra parte, a los
7 días de cultivo alogeneico no se recuperan monocitos de la placa de cultivo (menos
del 0,04% de las células recuperadas fueron CD14+, el marcador característico de
monocitos).
Para investigar cómo el entrecruzamiento de receptores de superficie modulan
la expresión de MICA durante un estímulo alogeneico, se realizaron experimentos de
bloqueo utilizando un AcMo anti-HLA de clase I, un AcMo anti-HLA de clase II, y
un AcMo anti-CD86 (Fig. 13). No se realizaron experimentos de bloqueo para CD80
porque esta molécula se expresa en CPA sólo a los 3 o 4 días después del encuentro
con el linfocito T, mientras que CD86 se expresa en forma constitutiva (Coyle, 2001).
Asimismo, experimentos preliminares confirmaron que el bloqueo con AcMo anti
CD80 inhibía sólo de un 20 a un 30% la respuesta proliferativa (datos no mostrados).
Por lo tanto, CD86 parece ser más importante como molécula coestimulatoria en
nuestro sistema. En todos los casos de bloqueo analizados, los niveles de MICA
Discusión
84
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
permanecieron inalterados, a pesar de que se observó una profunda inhibición de la
respuesta proliferativa (Fig. 13). Las posibles causas de esto podrían ser: a) la
microagregación del TCR/ CD3 y de CD28 no están involucradas en la expresión de
MICA durante un estímulo alogeneico, sino que son otros los receptores
participantes, o b) el complejo TCR/ CD3 y la molécula CD28 son partícipes de la
expresión de MICA durante un estímulo alogeneico, pero en los experimentos de
bloqueo la señalización por uno u otro receptor se compensan mutuamente. En este
aspecto, la disociación de la respuesta proliferativa de la expresión de MICA podría
indicar que rutas de señalización diferentes, pero parcialmente superpuestas, serían
responsables de la progresión en el ciclo celular y de la expresión de MICA.
Con el objeto de investigar la participación directa del complejo TCR/ CD3 y
de la molécula coestimulatoria CD28 sobre la expresión de MICA, se estimularon
CMSPs por entrecruzamiento del complejo TCR/ CD3 o de la molécula
coestimulatoria CD28 en presencia de CPA autólogas. Estos estímulos indujeron la
expresión de MICA, tanto a nivel transcripcional como traduccional (Fig. 14),
demostrando que la señalización a través de estos receptores participa en la
expresión de MICA. Sin embargo, no podemos descartar que la señalización a través
de otros receptores coestimulatorios tales como ICOS (Watts, 1999), SLAM (Cocks,
1995) CD154 (Watts, 1999), u otras moléculas de superficie puedan contribuir a la
inducción de la expresión de MICA.
El hecho de que las células expresan altos niveles de MICA aún después de
haber superado el pico de proliferación (Fig. 15) puede reflejar dos fenómenos: a) que
la inducción de MICA haya cesado, y que la proteína posea una vida media larga de
tal manera que se acumule en la célula, o b) que la cantidad de proteína sea constante
porque la tasa de síntesis de la misma se compensa con su tasa de degradación.
Mediante un análisis computacional con el programa Expasy(herramienta ProtPamm,
http://au.expasy.org/tools/protparam.html) observamos que la vida media de la
proteína de MICA sería mayor a 30 h (datos no mostrados). Si bien este dato es una
aproximación matemática, apoya la idea de que la proteína de MICA tiene una vida
media larga, y que se acumula en la célula. Una causa posible para dicha
acumulación podría ser que el linfocito T activado acumula MICA dentro de la célula
Discusión
85
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
hasta recibir una señal que la envíe a la superficie, funcionando como una señal de
alarma para las células NK y otras células que expresen NKGZD.La interacción entre
MICA y NKGZDpodría desencadenar una respuesta citotóxica contra los linfocitos T
activados, contribuyendo a la homeostasis de la respuesta inmune por eliminación de
células efectoras.
Los linfocitos T activados por la microagregación del complejo TCR/ CD3, o
bien a través de la molécula coestimulatoria CD28 en presencia de células accesorias,
inducen la transcripción y la expresión de la proteína de MICA (Fig. 15). Sin
embargo, la expresión de MICA en la superficie celular se observó solamente en el
35% de los dadores estudiados (Fig. 16). Una hipótesis para explicar esta posible
discrepancia podría ser que la expresión de MICA en superficie de linfocitos T
requiera de dos señales: una para su síntesis y otra para su correcta expresión en
superficie. En este contexto, algunos de los dadores, en apariencia sanos, podrían
estar cursando una infección o una inflamación subclínicas que tornarían a los
linfocitos más proclives a la expresión de MICA en superficie. Alternativamente, la
ausencia de expresión de MICA en la superficie podría deberse a la escisión de MICA
por metaloproteasas (Salih, 2002).En este sentido, se ha observado que los linfocitos
T activados pueden estimular a los macrófagos para la síntesis de metaloproteasas
(Goetz, 1996), las que podrían escindir a MICA de la superficie celular, y liberarla
como molécula soluble al medio de cultivo.
Los linfocitos T activados a través del complejo TCR/ CD3 y de la molécula
coestimulatoria CD28 activan una gran cantidad de vías de transducción de señales.
Uno de los primeros eventos desencadenados por estos estímulos es la activación de
las quinasas Lck y Fyn (Denny, 2000). En presencia de células accesorias, la
inhibición de estas quinasas en linfocitos T activados por el entrecruzamiento del
complejo TCR/ CD3 previno fuertemente la inducción de la expresión de MICA (Fig.
17). Como Lck y Fyn activan la ruta de señalización de Ras-Raf-MEKl/ERKl en los
linfocitos T estimulados a través del complejo TCR/ CD3 (Alberola-Ila, 1997),
investigamos la participación de esta ruta de señalización en la expresión de MICA.
El empleo del inhibidor de MEK1 U0126 (Favata, 1998) indica que la expresión de
Discusión
86
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
MICA requiere de una vía de señalización funcional de Ras-Raf-MEK-ERK(Fig. 18h).
De acuerdo con observaciones previas que indican que una estimulación temprana
pero no sostenida de ERK es suficiente para la activación de linfocitos T (Zhu, 1999;
DeSilva, 1998), nosotros observamos la presencia de la especie activa de ERK, fosfo
ERK,sólo a tiempos cortos de estimulación con AcMo anti-CD3, la cual resultó crítica
para la inducción de MICA (Fig. 18 y 19).
Otra ruta de señalización activada por Lck y Fyn es la de p38 MAPK
(Alberola-Ila, 1997, Schafer, 1999). Nosotros confirmamos la participación de esta
quinasa en la respuesta proliferativa de linfocitos T estimulados con AcMo anti-CD3
y demostramos que la p38 MAPK es un mediador intracelular importante para la
expresión de MICA en linfocitos T activados a través del complejo CD3 (Fig. 18).
Asimismo, el entrecruzamiento del TCR/ CD3 también activa a la fosfatasa
dependiente de Ca2+/calmodulina calcineurina (Rao, 1997; Liu, 1992). Dos
inhibidores diferentes de la calcineurina (CSAy FK506)inhibieron tanto la respuesta
proliferativa como la expresión de MICA en linfocitos T activados con AcMo anti
CD3 (Fig. 18 y 19), confirmando que esta fosfatasa participa en la activación de la
expresión de MICA.
Las quinasas Lck y Fyn, MEKl/ERK, y p38 MAPK son activadas por la
coestimulación a través de CD28 en presencia de células accesorias (Holdorf, 1999;
Michel, 1998; Carey, 2000; Zhang, 1999; August, 1995). Nosotros demostramos que
todos estos mediadores intracelulares están involucrados en la expresión de MICA
inducida por la microagregación de CD28 en presencia de dosis submitogénicas de
PMA (Fig. 20). El fuerte efecto que ejercen los inhibidores de las vías de Lck/Fyn,
p38 MAPK y de ERKI/ 2 sobre la expresión de MICA contrasta con el efecto leve que
tienen sobre la respuesta proliferativa. Estos datos sugieren que los linfocitos T
poseen rutas alternativas que se compensan mutuamente para iniciar la progresión
del ciclo celular luego de la microagregación de la molécula CD28 en presencia de
PMA. Sin embargo, el bloqueo de cualquiera de estas rutas tiene un impacto
profundo sobre la expresión de MICA. De hecho, la activación a través de CD28 y
PMA parece ser más poderosa que la activación a través de la microagregación del
complejo CD3. Esto puede verse no sólo en la magnitud de la respuesta proliferativa,
Discusión
87
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
sino también a nivel de la activación de ERKI/ 2 (fosfo-ERKI/ 2, Fig. 18c vs. 20f),
donde la especie activa de ERK está presente a las 72 h de cultivo en células
estimuladas con AcMo anti-CD28 y PMA, pero no se observa en CMSPs activadas
con AcMo anti-CD3. Si bien el inhibidor U0126 previno la fosforilación de ERK1/2 a
tiempos cortos de estimulación, no se observó su efecto a tiempos largos,
probablemente por inactivación del mismo durante un cultivo tan prolongado. De
igual manera, fue necesaria una mayor dosis de este inhibidor para abolir
completamente la expresión de MICA en células estimuladas con AcMo anti-CD28 y
PMA que en células estimuladas con AcMo anti-CD3 (50 uM vs. 20 uM, y Fig. 21a vs.
19a, respectivamente). Asimismo, se observó un mayor número de proteínas
fosforiladas en tirosina a los 15 min de estímulo con AcMo anti-CD28 y PMA que en
células estimuladas con AcMo anti-CD3 (Fig. 17b vs. 20c). Todo esto sugiere que el
estímulo a través de la microagregación de la molécula CD28 en presencia de PMA
es más potente que el estímulo desencadenado por la microagregación del complejo
TCR/CD3.
El efecto mínimo de CsA y FK506 sobre la proliferación de células
coestimuladas a través de CD28 en presencia de PMA concuerda con resultados
previos en los que se muestra que este estímulo posee un efecto marginal sobre la
activación de la vía de la calcineurina (Geginat, 2000).De esta manera, el empleo de
CSA y FK506 no tuvo efecto sobre la expresión de MICA en células activadas con
AcMo anti-CD28 y PMA (Fig. 20e).
Las citoquinas IL-2, IL4 e IFN-y son producidas por linfocitos T luego de 1a
microagregación del complejo TCR/ CD3 y de la coestimulación a través de la
molécula CD28. La interacción de las mismas con sus receptores en la superficie de
los linfocitos T promueve la activación de las quinasas Jak, (IL-2e IL-4 activan a Iakl
y Iak3, mientras que IFN-yactiva a Jakl y Iak2) que a su vez activan a los factores de
transcripción STAT (IL-2 activa a STAT3 y STATS, IL-4 activa a STAT6 e IFN-y activa
a STATI, Ivashkiv, 1995). Por otro lado, la quinasa p7056, que participa en la
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
progresión en el ciclo celular, es activada por las citoquinas IL-2 e IL-4 (Ellery, 2002;
Kelly-Welch, 2003). Nosotros observamos que las vías de Jak/STAT y la quinasa
p7056participan en el aumento de la expresión de MICA luego de la microagregación
del complejo TCR/ CD3 y del entrecruzamiento de la molécula coestimulatoria CD28
en presencia de PMA (Fig. 22). Debido a que el IFN-y no participa de la señalización
a través de p7056 (Quesniaux, 1993), probablemente la expresión de MICA sea
inducida a través de efectos parácrinos/ autócrinos de las citoquinas IL-2e IL-4.
Finalmente, no podemos descartar la posibilidad de que los agentes
farmacológicos empleados en nuestros experimentos afecten otros blancos
intracelulares que participan en la expresión de MICA en linfocitos T. Sin embargo, el
empleo de este tipo de estrategias posee la ventaja sobre la transfección transitoria de
líneas celulares de que pueden ser empleados sobre células normales en reposo, tales
como los linfocitos T.
Los resultados presentados hasta ahora constituyen los primeros en dilucidar
los mediadores intracelulares involucrados en la expresión de MICA.
NF-KB, junto con NFAT y AP-1, poseen un rol clave en la activación de
linfocitos T (Rothenberg, 1996; Kuo, 1999; Ballard, 2001). En particular, el rol de NF
KBdurante la coestimulación es bien conocido (Kane, 2002). En el presente trabajo,
nosotros probamos por primera vez que el factor de transcripción NF-KBjuega un rol
crítico en la expresión de MICA inducida por la activación de linfocitos T (Wahl,
1998; Weber, 2000). Primero, demostramos un fuerte efecto inhibitorio dosis
dependiente del inhibidor específico sulfasalazina sobre la respuesta proliferativa y
sobre la expresión de MICA en linfocitos T activados por la microagregación del
complejo TCR/ CD3 o por la coestimulación a través de CD28 en presencia de PMA
(Fig. 23). También se observó un incremento en los niveles de expresión de la
proteína MICA en CMSPs estimuladas con dosis mitogénicas de PMA, un éster de
forbol que activa a la PKC (Fig. 23c). Dicho aumento fue bloqueado por la adición de
sulfasalazina, lo que indica que la expresión de MICA inducida por PMA se produce
a través de PKC. Considerando que la PKC más importante en linfocitos T es la
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
PKCG,y que la misma es la única que está directamente involucrada en la activación
de NF-KBa través de las IKK (Li, 2002; Kane, 2002; Sen, 2002), es muy probable que
esta isoforma de la PKC esté involucrada en la expresión de MICA en linfocitos T
activados.
El efecto observado de la sulfasalazina sobre la expresión de MICA se produce
a nivel transcripcional, dado que la adición de este fármaco al cultivo inhibió el
incremento observado en los niveles de ARNm de MICA tanto en linfocitos T
activados a través de la microagregación del complejo TCR/ CD3 como de la
coestimulación de CD28 en presencia de dosis submitogénicas de PMA (Fig. 23d).
Por lo tanto, concluimos que el factor de transcripción NF-KBactúa a nivel de la
transcripción del gen de MICA.
NF-KB es un factor de transcripción que posee una cinética de activación
cíclica en respuesta a estímulos tales como LPS o TNF-a (Saccani, 2001; Hoffmann,
2002).Esto se debe a que un estímulo genera ciclos de degradación y síntesis de IKBa,
por lo cual este inhibidor endógeno secuestra o libera a NF-KBdependiendo del
tiempo de estímulo. Nosotros observamos que la estimulación a través del TCR o de
la molécula coestimulatoria CD28 genera ciclos de degradación y síntesis de IKBa,lo
que fue paralelo a la translocación al núcleo de las subunidades de NF-KBp65(RelA)
y p50 (Fig. 24a y 24h). Es probable que el primer ciclo de activación de esta ruta de
señalización conduzca a la síntesis de citoquinas y sus receptores (Li, 2002), y que
posteriormente la interacción entre los mismos en linfocitos T produzca un segundo
ciclo de activación del factor de transcripción NF-KB(Ballard, 2001; Kuo, 1999).
Posteriormente analizamos si NF-KBregula la expresión de MICA por un
mecanismo directo o indirecto. En este último caso, NF-KBpodría inducir en forma
temprana a otros factores de transcripción que podrían ser los responsables de
inducir la expresión de MICA. Observamos que la inhibición de la expresión de
MICA era independiente del momento de adición del inhibidor de NF-KBal cultivo,
por lo cual tanto la actividad NF-KB"temprana" (por ej. la dirigida por el complejo
TCR/ CD3) como la actividad tardía (por ej. la generada por citoquinas) están
involucradas en la expresión de MICA. Consecuentemente, supusimos que NF-KB
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
debía regular la expresión de MICA en linfocitos T activados a través de un
mecanismo de unión directa a un sitio KBlocalizado en el gen de MICA.
Con este fin, realizamos un análisis de búsqueda de posibles sitios de unión de
NF-KBa la secuencia del gen de MICA y encontramos un sitio KBlocalizado en el
primer intrón del gen de MICA, que abarca desde la posición +582 a la +591 (Fig. 26).
Mediante ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA)observamos que
dicha secuencia era capaz de unir a factores nucleares de la familia KBpresentes en
extractos nucleares de linfocitos T estimulados con AcMo anti-CD3 o AcMo anti
CD28 y PMA (Fig. 27). Por ensayos de supershifl observamos que a dicha secuencia se
unían los dímeros p65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de
linfocitos T activados (Fig. 28). La unión del dímero transactivador p65(RelA)/p50
presente en extractos nucleares de células activadas a la secuencia ¡(B-MICA,indica
que el factor NF-KBpodría estar involucrado en la transcripción del gen de MICA en
estas células. A pesar de que las células presentaron una banda mayoritaria
correspondiente al homodímero p50/ p50, existe la posibilidad de que este complejo
adquiera una actividad transactivadora a través de la unión al activador
transcripcional BCI-3(Dechend, 1999; Heissmeyer, 1999). Se ha demostrado que el
complejo p50/p50/Bcl-3 promueve la activación transcripcional de ciertos genes
blancos por mecanismos que involucran la unión a ADN (Bours, 1993). Aunque se
necesitan más evidencias para aclarar el rol de estos complejos NF-KB en la
regulación del gen de MICA, y el hipotético rol de BCI-3en los mismos, nuestros
descubrimientos apuntan a que la expresión de MICA en linfocitos T activados es
regulada por los complejos NF-KBp65(RelA)/ p50 y p50/ p50.
Por otra parte, la regulación de la expresión de MICA por el factor de
transcripción NF-KBtambién fue demostrada mediante experimentos de tansfección
transitoria de la línea celular HeLa con el plásmido de sobreexpresión de RelA (Fig.
29).
El factor de transcripción NF-KB está involucrado en la regulación de la
respuesta inmune innata y adaptativa (Kane, 2002, Li, 2002), que se encuentra
constitutivamente activado en varias células tumorales (Rayet, 1999, Darnell, 2002).
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Por otro lado, MICA se induce en respuesta a infección (Groh, 2001; Das, 2001) o
transformación neoplásica (Zwirner, 1998; Groh, 1996). Por lo tanto, nuestros
resultados proveen el primer nexo entre un factor de transcripción implicado en
estos eventos celulares y la inducción de la expresión de MICA.
Como mencionamos más arriba, la activación linfocitaria inducida por la
señalización de las citoquinas mitogénicas IL-2e IL-4 involucra la activación de la vía
de la quinasa p7056, sensible al inmunosupresor rapamicina (Ellery, 2002; Kelly
Welch, 2003). La adición del mismo a células estimuladas con AcMo anti-CD3 o con
AcMo anti-CD28 y PMA inhibió la expresión de MICA (Fig. 22). Estos resultados nos
llevaron a suponer que la expresión de MICA en células T podría ser producto de la
secreción de alguna de estas citoquinas. La adición de IL-2 a células estimuladas con
AcMo anti-CD3 potenció tanto la respuesta prolíferativa como la expresión de MICA,
demostrando que IL-2efectivamente promueve la expresión de MICA.
Asimismo, la adición de IL-2 revirtió el efecto inhibitorio de la CsA sobre la
respuesta prolíferativa y sobre la expresión de MICA en las células estimuladas a
través del complejo TCR/ CD3 (Fig. 30h). Estos datos confirman que el bloqueo de la
vía de calcineurina es suficiente para inhibir (en parte, al menos) la síntesis de IL-2
promovida por la microagregación del TCR (Dumont, 1998). Por otro lado, el
bloqueo parcial de la expresión de MICA por CsA y su restauración por la adición de
IL-2 exógena (Fig. 30b) sugiere que los mecanismos que conducen a la expresión de
MICA en linfocitos T durante la activación a través del complejo TCR/ CD3 son al
menos dos: uno desencadenado a través de la microagregación del TCR/ CD3, y otro
dependiente de la IL-2secretada en forma autócrina/ parácrina por el linfocito T.
Asimismo, cuando agregamos IL-2 a un cultivo de CMSPs, observamos un
incremento de la expresión de MICA a los 5 días de cultivo (Fig. 31b), una demora en
comparación con los 3 días necesarios para la síntesis de MICA inducida por AcMo
anti-CD3 (Fig. 30a). Aunque linfocitos T vírgenes no expresan CD25, la interacción de
IL-2 con su receptor de afinidad intermedia induce la síntesis de dicha subunidad,
retardando la robustez de la respuesta a través de este receptor (Ellery, 2002).
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
La activación de los linfocitos T con PHA indujo la expresión de CD25 (Fig.
31o). Al utilizar CMSPs preactivadas por 18 h con PHA (cuando ya hay niveles
significativos de CD25 en membrana), observamos que IL-2 induce la expresión de
MICA a las 48 h de cultivo. Sin embargo, si bien esta citoquina es suficiente para
inducir la expresión intracitoplasmática de MICA, no observamos expresiónen
superficie de esta molécula. Probablemente el linfocito T activado con IL-2 requiera
de otra señal (estrés, otras citoquinas, tales como IL-15 o TNF-a) para inducir la
expresión de MICA en superficie.
Cuando estudiamos las vías de transducción de señales disparadas por la
estimulación con lL-2, observamos que Lck, p38 MAPK, p7056,Iak3 y NF-KB son
necesarias para la inducción de la expresión de MICA en células estimuladas con IL-2
(Fig. 32). Dado que estas rutas también son necesarias para la síntesis de MICA en
linfocitos T estimulados a través del complejo TCR/ CD3 o de la coestimulación a
través de CD28, es probable que el efecto de los inhibidores se deba a dos
mecanismos: a) el bloqueo de estas rutas inhibe la síntesis de IL-2, y por lo tanto
bloquea al inductor de la expresión de MICA, y b) el bloqueo de la señalización a
través del IL-2Rque conduce a la expresión de MICA.
Además de IL-2, varias citoquinas, tales como IL-4, IL-7 e IL-15, promueven la
progresión del ciclo celular en linfocitos T (Walsh, 2004). Debido a que IL-4 también
emplea las vías de señalización a través de Jak3 (sensible a AG490) y de la quinasa
p7056 (sensible a rapamicina), evaluamos la acción de esta citoquina sobre la
expresión de MICA. La preactivación de linfocitos T con PHA, al igual que con IL-2,
promueve la síntesis de altos niveles del receptor de IL-4 (Spits, 1987). Nosotros
observamos que la estimulación con IL-4 de estas CMSPs preactivadas indujo la
expresión de MICA (Fig. 33a). Sin embargo, la adición de IL-4 a linfocitos T activados
a través del complejo TCR/ CD3 no incrementó significativamente la respuesta
proliferativa, a pesar de que potenció la expresión de MICA (Fig. 33h). Como IL-4
induce la progresión en el ciclo celular de una manera independiente a la síntesis de
IL-2, es probable que la acción conjunta de ambas citoquinas esté involucrada en la
expresión de MICA en linfocitos T activados.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Algunos autores han descripto a IL-2 como la citoquina mitogénica del perfil
de diferenciación proinflamatorio Thl, mientras que IL-4 funcionaría como la
promotora de la proliferación en células polarizadas a un perfil antiinflamatorio Th2
(Romagnani, 1997; Seder, 1994). Nosotros observamos que la expresión de MICA se
induce tanto en células polarizadas a un perfil Th1 como en células polarizadas a un
perfil Th2 (Fig. 34). Probablemente, la IL-2 sea la causante de la inducción de MICA
en células polarizadas a un perfil Th1, mientras que IL-4podría ser la inductora de la
expresión de MICA en células de perfil Th2. La presencia de fosfo-STATI en células
de perfil Th2 y de GATA-3 en células de perfil Th1 confirman que la polarización es
un evento relativamente ineficiente, ya que incluso en condiciones fuertemente
polarizantes hacia un perfil determinado algunas células adoptan características del
perfil opuesto (Lanzavecchia, 2000).
El receptor de la citoquina IL-15 comparte con el receptor de IL-2 las
subunidades IL-ZRBy yc (Grabstein, 1994),y recientemente se ha demostrado que IL
15, y no IL-2,es la citoquina con mayor actividad mitogénica sobre linfocitos T in vivo
(Li, 2001b). Debido a que lL-15 es capaz de inducir la expresión de MICA en células
dendríticas (Jinushi, 2003b), sería interesante analizar el efecto de dicha citoquina
sobre la expresión de MICA en linfocitos T.
Inicialmente, para detectar la expresión de MICA en superficie celular de
linfocitos T utilizamos un suero anti-MICA obtenido a partir la inmunización de
conejos con el péptido correspondiente a los aminoácidos 140 a 160 de la secuencia
de MICA (Zwirner, 1998). Sin embargo, en este sistema observamos que la señal
basal era muy alta (NRS, Fig. 16). Por esta razón se desarrolló en nuestro laboratorio
un AcMo anti-MICA denominado D7 que reconoce a MICA en superficie de varios
tipos celulares. Su anticuerpo control de isotipo presenta bajos niveles de señal
inespecífica (Fuertes, 2002 y 2003). Para analizar la expresión de MICA en superficie
de linfocitos T activados sin interferencias de los AcMo anti-CD28 y AcMo anti-CD3,
decidimos estimular las células con PMA e Ionomicina, que emulan las señales
derivadas del complejo TCR/ CD3 y de la molécula coestimulatoria CD28 (Truneh,
1985).
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Para nuestra sorpresa, en la mayoría de los ensayos los linfocitos T presentes
en CMSPs estimuladas con PMA e lonomicina no expresaron MICA en su superficie
(Fig. 35a, panel superior). Las células mononucleares de sangre periférica constituyen
una población celular heterogénea compuesta principalmente por linfocitos T CD4+y
T CD8", pero también hay, en menor proporción, monocitos (que se diferencian a
macrófagos en cultivo), linfocitos B, células NK y linfocitos T 76 (Janeway, 1999).
Sospechando que una de estas poblaciones celulares expresa un receptor o secreta un
producto soluble que interfiere con la expresión de MICA en superficie de linfocitos
T activados, analizamos la expresión de MICA en superficie de linfocitos T CD4+
purificados y activados con PMA e Ionomicina. Observamos que dichos linfocitos
expresaron en forma específica a MICA (y no MICB) en su superficie (Fig. 35a, panel
inferior, y 35b). Estos resultados sugieren que alguna de las poblaciones presentes en
las CMSPs sintetiza un factor que inhibe la expresión de MICA en superficie de los
linfocitos T CD4+.Por ensayos de transwellse observó que este inhibidor era un factor
soluble (Fig. 36), por lo que podría ser una metaloproteasa o una citoquina. En este
contexto, se ha descripto la participación de metaloproteasas en el clivaje de MICA
de la superficie de células tumorales (Salih, 2002). En nuestro caso, las
metaloproteasas podrían ser liberadas por macrófagos, ya que se observó que
macrófagos en contacto con linfocitos T activados son capaces de secretar estas
enzimas (Goetz, 1996).
Las células NK son morfológicamente linfocitos granulares grandes que
expresan múltiples receptores de activación e inhibición de citotoxicidad (Bakker,
2000). Estos receptores permiten a las células NK ejercer funciones de
inmunovigilancia de su entorno contra señales de alarma. Cuando ocurre un
desbalance en la señalización que favorece la activación de las células NK, se secretan
citoquinas y/o se liberan gránulos citotóxicos que promueven una respuesta
inflamatoria y la lisis de la célula blanco (Bakker, 2000).Considerando que las células
que expresan MICA en su superficie son blanco de citotoxicidad por células NK a
través de NKGZD (Bauer, 1999), nos propusimos investigar el rol de la expresión de
MICA en la superficie de linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina. Por
ensayos de citotoxicidad observamos que las células NK presentes en CMSPs no
Discusión
95
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
inducían la muerte a linfocitos T CD4+ singeneicos activados. El bloqueo de dicha
interacción con el AcMo anti-HLA de clase I W6/ 32 incrementó la citotoxicidad
contra los linfocitos T CD4:+activados (Fig. 37a), sugiriendo que esto se debía, en
parte al menos, a la interacción de los receptores inhibitorios KIR (presentes por las
células NK) con las moléculas de clase I del HLA (expresadas en los linfocitos T
CD4"). Sin embargo, la interacción MICA-NKG2D no mostró tener una participación
en esta citotoxicidad, como se pudo observar en el tratamiento conjunto de AcMo
anti-clase I del HLA y AcMo anti-MICA (Fig. 37a, W6/32+D7).
Por otro lado, las células NK activadas durante 4 o 5 días con IL-2,
denominadas LAK, adquieren una mayor capacidad citolítica (Cooper, 2001).
Nosotros observamos que las células LAK (presentes en CMSPSestimuladas con IL-2
durante 4 o 5 días) incrementaron su capacidad citolítica contra linfocitos T CD4+
activados con PMA e Ionomicina (Fig. 37h). Sin embargo, observamos una gran
variabilidad en la respuesta citotóxica dependiendo del dador (Fig. 37h). Esto podría
deberse a la diferencia entre individuos en el porcentaje de células NK en sangre
periférica (Mason, 1993; Werkmeister, 1985), y a la eficiencia de producción de las
células LAK.
Asimismo, observamos que a mayor tiempo de activación del linfocito T
CD4", mayor la susceptibilidad a las células LAK (Fig. 37€). Esto sugiere que el
linfocíto T activado está sintetizando una molécula que lo hace más susceptible a la
lisis por la célula LAK.
Pende y colaboradores (Pende, 2001) observaron que blastos T humanos
activados con PI-IA eran blancos de lisis por células LAK singeneicas en forma
NKGZD dependiente. Por otro lado, Rabinovich y colaboradores (Rabinovich, 2003)
demostraron que en ratones (donde no se encuentra MICA) NKGZDestá involucrado
en la lisis de linfocitos T activados por células LAK singeneicas. Estos resultados
sugieren que la interacción de NKGZDcon sus ligandos promueve la citotoxicidad
de los linfocitos T activados por células LAK autólogas. La participación menor de
MICA en la lisis de los linfocitos T activados por parte de las células LAK (Fig. 38) y
el hecho de que este fenómeno parece ser NKGZD dependiente (Pende, 2001,
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
Rabinovich, 2003), podría indicar que otros ligandos de NKGZD en humanos, tales
como los ULBPs, tienen algún rol en esta lisis.
Por otro lado, hay que destacar que no todos los alotipos de MICA se unen
con igual fuerza a NKGZD (Steinle, 2001). Seguramente un alotipo que se una con
mayor fuerza desencadenará más efectivamente una respuesta citotóxica que un
alotipo que se una más débilmente. Esto podría explicar en parte la variabilidad en el
bloqueo del AcMo anti-MICA (Fig. 38).
¿Cuál podría ser el significado de la expresión de MICA en linfocitos T
activados?
En los nódulos linfáticos se localizaron células NK (CDSÓb'ríte’.htCDlónu“) que
poseen características diferentes a las células NK que circulan en la sangre periférica
(CD560limCDlóbirsh‘, Cooper, 2001). Mientras que las células NK CD56dimtienen un
alto potencial citotóxico, las células NK CD56brishtson secretoras de citoquinas. Un
trabajo reciente demostró que estas células están en contacto con los linfocitos T en
ganglio (Fehniger, 2003) y que ambas poblaciones cooperan entre sí: la célula NK
utiliza la IL-2 sintetizada por el linfocito T para producir mayores cantidades de la
citoquina proinmflamatoria IFN-y, que a su vez promueve el destino del linfocito T
efector hacia un perfil Th1. Dado que la interacción MICA-NKGZD promueve la
síntesis de IPN-y en células NK, resta por investigar si la interacción MICA-NKGZD
entre el linfocito T y la célula NK de ganglio juega algún rol en este sistema.
Los linfocitos T se activan frente a un Ag, se expanden en forma clonal y se
diferencian a células efectoras. El proceso se desarrolla en el nódulo linfático
secundario. Una vez diferenciados, migran hacia el foco de infección, donde se están
reclutando varios tipos celulares, entre ellos las células NK. Las células NK de esta
zona se encuentran activadas por las citoquinas inflamatorias secretadas localmente
por macrófagos y células dendríticas (Cooper, 2004). Podría suceder que mientras
ambos tipos celulares están ejerciendo sus funciones en ese microentorno
inflamatorio, las células NK no sólo estén cumpliendo con sus funciones efectoras
conocidas (Cooper, 2001)sino que también estén sensando el estado de activación de
los linfocitos T. Este evento podría darse a través de la interacción del receptor
Discusión
97
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
activador de citotoxicidad NKGZD con sus ligandos MICA o los ULBPs. De esta
manera, si los linfocitos reciben una señal (por ej. una citoquina inflamatoria
producida localmente) que les permita expresar MICA en su superficie celular, se
transformaría en blanco de la citotoxicidad de las células NK.
Tesis Doctoral
CCNCLUSIONES
Conclusiones
En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que:
1) MICA, un ligando de un receptor activador de citotoxicidad de células NK,
linfocitos T aB CD8" y linfocitos T 76, se induce en linfocitos T CD4+ y T CD8+
activados durante el transcurso de una estimulación alogeneica. Este proceso ocurre
a través de varias vías que operan en forma simultánea y se compensan mutuamente.
Dos de las vías que inducen la expresión de MICA en linfocitos T activados son las
señales derivadas de la microagregación del complejo TCR/ CD3 en presencia de
células accesorias, y la coestimulación a través de la molécula CD28. La expresión de
MICA inducida por la activación linfocitaria involucra la activación transcripcional
del gen, lo mismo que un incremento en los niveles de la proteína. Sin embargo, sólo
se observó un aumento en la expresión de MICA en superficie celular en el 35% de
los casos analizados.
2) Como consecuencia de la microagregación del complejo TCR/ CD3 se
disparan varias vías de transducción de señales que llevan a la expresión de MICA
en linfocitos T activados. Estas rutas comprenden la activación de Lck/Fyn, MEKI
ERK]/ 2, p38 MAPK, Iak2/ 3, p7056y calcineurina. Por otro lado, la expresión de
MICA promovida por la coestimulación de linfocitos T a través de la molécula CD28
activa las vías de señalización de Lck/Fyn, MEKl-ERKI/ 2, p38 MAPK, Iak2/3 y
p7056,pero no de calcineurina.
3) Demostramos que NF-KB regula la expresión de MICA en linfocitos T
activados, probablemente a través la unión de los dímeros p65/ p50 y p50/ p50 al sitio
KBlocalizado en el primer intrón del gen. Por otro lado, la sobreexpresión de la
subunidad transactivadora p65(RelA) en células I-IeLa incrementa la expresión de
MICA.
Luciana L. Molinero Tesis Doctoral
4) La citoquina mitogénica IL-2 también induce la expresión de MICA, pero no
es estímulo suficiente para su expresión en superficie celular. En este evento
participan las rutas de señalización de Lck, ]ak3, p38 MAPK, p7056quinasa y NF-KB.
5) La citoquina mitogénica IL-4 también es capaz de inducir la expresión de
MICA en linfocitos T activados.
6) Linfocitos T polarizados a un perfil Thl o Th2 expresan MICA.
7) Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina de la
mayoría de los dadores analizados expresan MICA en superficie, pero no lo hacen si
están en presencia de CMSPs singeneicas activadas de la misma manera. Este
fenómeno se debe a un factor soluble liberado por las CMSPs activadas que inhibe la
expresión de MICA en superficie.
8) Linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina son susceptibles a lisis
por células NK activadas con IL-2 (LAK), pero no por células NI< en reposo. La
interacción MICA-NKGZDjuega un rol menor sobre esta citotoxicidad.
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